Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63260
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

استنادا إلى آلية تجميع مركب البروتين INAD ، في هذا البروتوكول ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة Drosophila TRP الذاتية.

Abstract

يعد النقل الضوئي لذبابة الفاكهة أحد أسرع مسارات الإشارات المقترنة ببروتين G المعروفة. لضمان خصوصية وكفاءة هذا الشلال ، ترتبط قناة كاتيون الكالسيوم (Ca2+) القابلة للنفاذ ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) ، بإحكام ببروتين السقالة ، وتعطيل D بدون جهد لاحق (INAD) ، وتشكل مركبا كبيرا من بروتين الإشارات مع كيناز البروتين C (ePKC) الخاص بالعين والفوسفوليباز Cβ / بدون مستقبلات المحتملة A (PLCβ / NORPA). ومع ذلك ، فإن الخصائص البيوكيميائية لقناة ذبابة الفاكهة TRP لا تزال غير واضحة. استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. أولا ، كان جزء الهيستيدين النقي (له) الموسوم NORPA 863-1095 مرتبطا بحبات Ni ويستخدم كطعم لسحب مركب بروتين INAD الداخلي المنشأ من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة. بعد ذلك ، تمت إضافة جزء من الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسوم باسم TRP 1261-1275 إلى حبات Ni للتنافس مع قناة TRP. وأخيرا ، تم فصل قناة TRP في supernatant عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذه الطريقة تجعل من الممكن دراسة آلية بوابة قناة ذبابة الفاكهة TRP من كل من الزوايا الكيميائية الحيوية والهيكلية. يمكن أيضا قياس خصائص الفيزيولوجيا الكهربية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP النقية في المستقبل.

Introduction

النقل الضوئي هو عملية يتم فيها تحويل الفوتونات الممتصة إلى رموز كهربائية للخلايا العصبية. وهو ينقل حصريا الأوبسينات وسلسلة الإشارات التالية المرتبطة ببروتين G في كل من الفقاريات واللافقاريات. في ذبابة الفاكهة ، باستخدام مجالات PDZ الخمسة ، ينظم تعطيل بروتين السقالة - بدون إمكانات لاحقة D (INAD) مجمع إشارات فوق جزيئي ، والذي يتكون من قناة محتملة للمستقبلات العابرة (TRP) ، و phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) ، وكيناز البروتين C (ePKC) (ePKC) 1. يضمن تكوين مجمع الإشارات فوق الجزيئية هذا التوطين الصحيح تحت الخلوي والكفاءة العالية وخصوصية آلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. في هذا المعقد ، تعمل قنوات TRP الحساسة للضوء كمؤثرات في المصب ل NORPA وتتوسط تدفق الكالسيوم وإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية. أظهرت الدراسات السابقة أن فتح قناة ذبابة الفاكهة TRP يتم بوساطة البروتونات ، أو تعطيل بيئة الدهون المحلية ، أو القوة الميكانيكية2،3،4. تتفاعل قناة Drosophila TRP أيضا مع calmodulin5 ويتم تعديلها بواسطة الكالسيوم عن طريق كل من ردود الفعل الإيجابية والسلبية 6,7,8.

حتى الآن ، استندت دراسات الفيزيولوجيا الكهربية على آلية بوابات ذبابة الفاكهة TRP والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) إلى بقع غشاء تم استئصالها ، وتسجيلات الخلايا الكاملة من المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة من النوع البري المنفصل ، والقنوات المعبر عنها بشكل غير متجانس في S2 أو SF9 أو HEK الخلايا2،9،10،11،12،13 ، ولكن ليس على القنوات النقية. كما أن المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP الكاملة الطول لا تزال غير واضحة. من أجل دراسة الخصائص الكهروفسيولوجية للبروتين النقي في بيئة غشائية معاد تشكيلها والحصول على معلومات هيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP كاملة الطول ، فإن الحصول على قنوات TRP كاملة الطول النقية هو الخطوة الأولى الضرورية ، على غرار المنهجيات المستخدمة في دراسات قناة TRP للثدييات14،15،16،17.

في الآونة الأخيرة ، استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD18,19,20 ، تم تطوير استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لأول مرة لتنقية قناة TRP من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة بواسطة حبات الستربتافيدين5. بالنظر إلى السعة المنخفضة والتكلفة الباهظة لخرز الستربتافيدين ، يتم تقديم بروتوكول تنقية محسن هنا يستخدم بروتين الطعم الموسوم والخرز النيفي منخفض التكلفة المقابل بسعة أعلى بكثير. ستساعد الطريقة المقترحة على دراسة آلية بوابات قناة TRP من الزوايا الهيكلية وقياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقناة TRP باستخدام البروتينات النقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنقية شظايا TRP الموسومة بضريبة السلع والخدمات وشظايا NORPA الموسومة به

  1. تنقية جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات
    1. حول بلازميد pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 إلى خلايا الإشريكية القولونية (E. coli ) BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl2 21. قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط لوريا بيرتاني (LB) وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتضخيم 10 مل من ثقافة البذر في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية.
    2. بعد أن تصل الكثافة البصرية (OD600) للخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية وإضافة 0.1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ؛ التركيز النهائي) للحث على التعبير الزائد عن البروتين المستهدف واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. بعد الإفراط في التعبير، كريات 1 لتر من الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي في 3,993 × غرام لمدة 20 دقيقة وإعادة تعليق في 40 مل من المخزن الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
    4. قم بتحميل الخلايا المعاد تعليقها في مجانس عالي الضغط مبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية. زيادة ضغط المجانس ببطء إلى 800 بار. افتح صنبور المدخل واسمح للخلايا المعاد تعليقها بالمرور بشكل دائري عبر صمام ذي شقوق ضيقة للغاية.
      ملاحظة: يتم تجانس الخلايا بواسطة قوى القص العالية الناجمة عن انخفاض الضغط الكبير والتجويف.
    5. قم بتحميل 5 مل من حبات الجلوتاثيون إلى عمود تدفق الجاذبية واغسل الخرز ب 50 مل من المخزن المؤقت PBS لما مجموعه ثلاث مرات.
    6. جهاز طرد مركزي للخلية من مجانس الضغط العالي عند 48,384 × جم. أضف المادة الفائقة من محللات الخلايا بالطرد المركزي (40 مل) إلى حبات الجلوتاثيون المتوازنة في عمود تدفق الجاذبية واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبات الجلوتاثيون كل 10 دقائق.
    7. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، افتح صنبور مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق من خلال. تجاهل جزء التدفق من خلال. شطف حبات الجلوتاثيون المتبقية مرتين مع 50 مل من المخزن المؤقت PBS.
    8. أضف 15 مل من المخزن المؤقت للتخفيف إلى حبات الجلوتاثيون واحتضنها لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
    9. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، قم بإلغاء جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وتحميله في عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير) ، والذي يتم توازنه باستخدام 50 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM DTT) المخزن المؤقت.
    10. حافظ على معدل تدفق الاستخلاص لعمود استبعاد الحجم إلى 3 مل / دقيقة. جمع البروتينات المطفأة بمعدل 5 مل / أنبوب.
    11. حدد ذروة البروتين المستهدف في عمود استبعاد الحجم عن طريق تحليل إشارات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتحقق من خلال تحليل SDS-PAGE gel (معلمات الرحلان الكهربائي: 150 فولت لهلام التراص ؛ 200 فولت لهلام الحل). وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق R250.
    12. ركز الجزء TRP 1261-1275 المنقى الموسوم بعلامة GST من عمود استبعاد الحجم إلى 1 مل باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 15 مل يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد على سطح المكتب.
    13. تحديد تركيز البروتين المركز باستخدام قانون بير لامبرت. قم بقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    14. احصل على معامل الانقراض عند 280 نانومتر عن طريق استيراد تسلسلات البروتين إلى برنامج Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). عادة ، تنتج زراعة 1 لتر من TRP 1261-1275 الموسومة بضريبة السلع والخدمات 1 مل من 600 ميكرومتر من البروتين (6 × 10-7 مول). انظر الجدول 1 للاطلاع على المواد اللازمة.
  2. تنقية جزء NORPA 863-1095 الموسوم
    1. قم بتحويل البلازميد pETM.3C NORPA 863-109520 إلى خلايا E. coli BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl2 21. تطعيم مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط LB وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتضخيم ثقافة البذر 10 مل في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية.
    2. بعد أن يصل OD600 من الخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية وإضافة 0.1 mM IPTG (التركيز النهائي) للحث على الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. بعد الإفراط في التعبير، بيليه 1 لتر من الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي في 3,993 × غرام لمدة 20 دقيقة وإعادة تعليق في 40 مل من العازلة ملزمة. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا المعاد تعليقها في مجانس عالي الضغط عند 4 درجات مئوية كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
    4. قم بتحميل 5 مل من حبات Ni-beads في عمود تدفق الجاذبية واغسلها ثلاث مرات باستخدام 50 مل من المخزن المؤقت للربط.
    5. جهاز طرد مركزي للخلية من مجانس الضغط العالي عند 48,384 × جم. أضف المادة الفائقة من محللات الخلايا بالطرد المركزي إلى حبات Ni-beads المتوازنة في عمود تدفق الجاذبية واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبات Ni كل 10 دقائق.
    6. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، افتح صنبور مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق من خلال. تخلص من الجزء المتدفق واغسل حبات Ni-Beads المتبقية مرتين باستخدام 50 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
    7. أضف 15 مل من المخزن المؤقت للإزالة إلى حبات Ni-beads واحتضنها لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق حبات Ni كل 10 دقائق.
    8. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اجمع جزء NORPA 863-1095 الموسوم بعلامة His-1095 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتحميله في عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير) ، والذي يتم توازنه باستخدام 50 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM DTT).
    9. حافظ على معدل تدفق الاستخلاص لعمود استبعاد الحجم إلى 3 مل / دقيقة. جمع البروتين المطفأ بمعدل 5 مل / أنبوب.
    10. حدد ذروة البروتين المستهدف في عمود استبعاد الحجم عن طريق تحليل إشارات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتحقق من خلال تحليل SDS-PAGE gel (معلمات الرحلان الكهربائي: 150 فولت لهلام التراص ؛ 200 فولت لهلام الحل). وصمة عار الجل باستخدام Coomassie الأزرق R250.
    11. ركز الجزء NORPA 863-1095 المنقى من عمود استبعاد الحجم إلى 1 مل باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 15 مل يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد على سطح المكتب.
    12. تحديد تركيز البروتين المركز باستخدام قانون بير لامبرت. قم بقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لجزء NORPA 863-1095 الموسوم عليه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    13. احصل على معامل الانقراض عند 280 نانومتر عن طريق استيراد تسلسلات البروتين إلى برنامج Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). عادة ، تنتج زراعة 1 لتر من شظية NORPA 863-1095 الموسومة 1 مل من 600 ميكرومتر من البروتين (6 × 10-7 مول). انظر الجدول 2 للاطلاع على المواد اللازمة.

2. إعداد رؤوس ذبابة الفاكهة

  1. جمع الذباب البالغ في أنابيب طرد مركزي مخروطية 50 مل باستخدام طريقة التخدير CO2 22,23 ؛ تجمد على الفور في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  2. بعد جمع عدد كاف من الذباب ، هز بقوة الأنابيب المخروطية المجمدة سعة 50 مل باليد لفصل أرجل الذباب ورؤوسه وأجنحته وأجسامه. انقل الخليط إلى ثلاثة غربال من الفولاذ المقاوم للصدأ مكدسة مسبقا مكدسة مسبقا (حجم شبكة 20/30/40 ، على التوالي) وهز المناخل.
  3. بعد ذلك ، نظرا لأن الرؤوس لا يمكنها المرور عبر غربال 40 شبكيا ، استخدم فرشاة لكنس رؤوس الذبابة من غربال 40 شبكيا ، ونقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  4. جمع الذباب ورؤوسهم باستمرار وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية حتى تصل إلى الكمية المطلوبة اللازمة للتجريب (0.5 جم). عادة ، لجمع 0.5 غرام من الرؤوس ، هناك حاجة إلى 35 مل من الذباب في أنبوب مخروطي 50 مل. انظر الجدول 3 للاطلاع على المواد اللازمة.

3. ذبابة الفاكهة TRP تنقية قناة

  1. يزن ما مجموعه 0.5 غرام من الرؤوس ويتجانس تماما في النيتروجين السائل باستخدام مدقة هاون مبردة مسبقا. قم بإذابة الرؤوس المتجانسة في مخزن مؤقت للتحلل 10x v / w (5 mL) ، واحتضنها في شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 20,817 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. اجمع المادة الفائقة الدوارة ("20817 g S" ، الشكل 4) وقم بمزيد من الطرد المركزي عند 100000 × g لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخدم السوبرناتانت الدوار لأسفل ("100,000 g S"، الشكل 4) لإجراء الفحص المنسدل التالي.
  3. أضف 1 مل من حبات Ni إلى عمود تدفق الجاذبية واغسل الخرز ب 10 مل من H2O (ddH2O) المقطر المزدوج عند 4 درجات مئوية ليصبح المجموع ثلاث مرات. قم بموازنة الخرز مع 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت ثلاث مرات عند 4 درجات مئوية.
  4. أضف 500 ميكرولتر من 600 ميكرومتر من بروتين NORPA 863-1095 الموسوم (3 × 10-7 مول) إلى عمود Ni واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
  5. افتح نقرة مأخذ الأعمدة لفصل الخرز وجزء التدفق. خذ جزء التدفق من خلال تحليل SDS-PAGE (NORPA F ، الشكل 4). في هذا القسم ، يتم تجميد بروتينات الطعم على حبات Ni.
  6. اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت (10 مل) عند 4 درجات مئوية واحتفظ بجزء الغسيل لتحليل SDS-PAGE (Wash 1 ، الشكل 4A). كرر الخطوات المذكورة أعلاه واحتفظ بالعينة لتحليل SDS-PAGE (Wash 2 ، الشكل 4A). في هذا القسم ، تتم إزالة بروتينات الطعم المفرطة على حبات Ni.
  7. أضف المادة الفائقة من تجانس رأس ذبابة الفاكهة بعد 100000 × g من الطرد المركزي إلى عمود Ni عند 4 درجات مئوية ، حيث تم تجميد جزء NORPA 863-1095 الموسوم به.
  8. احتضن السوبرناتانت مع حبات Ni-Beads عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق. ثم افتح اضغط على مأخذ الأعمدة لفصل الخرز وكسر التدفق من خلال.
  9. جمع supernatant لتحليل SDS-PAGE (تحلل رأس Dro F ، الشكل 4A). في هذا القسم ، يتم التقاط مجمعات بروتين INAD (INAD / TRP / ePKC) في متجانسات الرأس بواسطة شظايا NORPA 863-1095 المجمدة على حبات Ni.
  10. اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت (10 مل) عند 4 درجات مئوية وحافظ على supernatant من هطول الأمطار الجاذبية لتحليل SDS-PAGE (Wash 3 ، الشكل 4A). كرر الخطوات المذكورة أعلاه واجمع الفائق لتحليل SDS-PAGE (Wash 4 ، الشكل 4A). في هذا القسم ، تتم إزالة البروتينات غير المرتبطة على حبات Ni.
  11. أضف 500 ميكرولتر من 600 ميكرومتر من بروتين TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات (3 × 10-7 مول) إلى حبات Ni واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
  12. اجمع الكسر المقطوع من عمود الجاذبية (TRP E1 ، الشكل 4B) ، والذي يحتوي على قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية. كرر الخطوات المذكورة أعلاهوجمع كسر الاستخلاص (TRP E2 ، الشكل 4B). في هذه الخطوة، باستخدام شظايا TRP 1261-1275 الموسومة بضريبة السلع والخدمات كمنافس، يتم إخراج قنوات TRP من مجمعات بروتين INAD التي تم التقاطها (INAD/TRP/ePKC) على حبات Ni.
  13. اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للربط (10 مل ؛ الجدول 1) عند 4 درجات مئوية وجمع جزء الغسيل لتحليل SDS-PAGE (Wash 5 ، الشكل 4B).
  14. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإزالة (الجدول 1) إلى حبات Ni واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع كسر الاستخلاص من عمود تدفق الجاذبية (NORPA E1، الشكل 4B). كرر الخطوات المذكورة أعلاه ، وجمع كسر الاستخلاص (NORPA E2 ، الشكل 4B).
  15. باستخدام المخزن المؤقت للإزالة ، قم بإلغاء جزء NORPA 863-1095 الموسوم به مصحوبا بمجمعات البروتين INAD / ePKC. بعد ذلك ، أعد تعليق Ni-beads في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
  16. خذ حبات Ni-Beads المعاد تعليقها لتشغيل SDS-PAGE (ملطخة ب Coomassie blue R250) لتحليل كفاءة الإزالة وتقييم ما إذا كان المخزن المؤقت للعود يعمل (الخرز ، الشكل 4B). انظر الجدول 4 للاطلاع على المواد اللازمة.

4. تنقية عمود استبعاد الحجم لقناة ذبابة الفاكهة TRP

  1. قم بتثبيت عمود استبعاد الحجم (الدرجة التحليلية) على نظام تنقية البروتين. قم بموازنة العمود مع المخزن المؤقت للعمود (50 mM Tris-HCl pH 7.5 ، 150 mM NaCl ، 2 mM DTT ، 0.75 mM DDM) ، والذي يتم ترشيحه بواسطة مرشح 0.45 ميكرومتر.
  2. ركز جزء TRP E1 و E2 من الخطوة 3.14 باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 4 مل ، يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد.
  3. شطف حلقة العينة باستخدام المخزن المؤقت للعمود وتحميل العينة في حلقة العينة. حقن العينة في عمود استبعاد الحجم وتخلص من البروتينات بمعدل تدفق مناسب (0.5 مل / دقيقة).
  4. حدد ذروة البروتين المستهدف عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر وقم بتشغيل جل SDS-PAGE للكشف عن قناة ذبابة الفاكهة TRP الداخلية المنقاة (الشكل 5). انظر الجدول 5 للاطلاع على المواد اللازمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه المقالة ، يتم توضيح طريقة تنقية البروتين لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ (الشكل 1).

أولا ، يتم تطبيق التعبير عن البروتين المؤتلف وتنقيته للحصول على الطعم والبروتينات المنافسة. بعد ذلك ، يتم التعبير عن جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في خلايا E. coli BL21 (DE3) في وسط LB ويتم تنقيته باستخدام حبات الجلوتاثيون وعمود استبعاد الحجم (الشكل 2). تم التحقق من العينات باستخدام تحليل SDS-PAGE مع تلطيخ Coomassie Blue R250. في عملية تحضير عينة SDS-PAGE ، يتم خلط 30 ميكرولتر من عينة البروتين مع 10 ميكرولتر من صبغة تحميل 4x وغليها عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، يتم تحميل 15 ميكرولتر من العينة المسلوقة بشكل فردي في كل بئر. كما يتم التعبير عن جزء NORPA 863-1095 الموسوم به بالمثل في خلايا E. coli BL21 (DE3) في وسط LB ويتم تنقيته بواسطة Ni-beads وعمود استبعاد الحجم (الشكل 3). تتركز TRP 1261-1275 الموسومة بضريبة السلع والخدمات النقية وNORPA 863-1095 الموسومة به لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية.

ثانيا، تجمع رؤوس ذبابة الفاكهة وتتجانس في النيتروجين السائل باستخدام مدقة هاون مبردة مسبقا، ثم تذوب في مخزن مؤقت للتحلل 10x v/w (الجدول 4). يتم تحضين متجانس الرأس المذاب في شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ويتم طرده مركزيا عند 20,817 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يتم جمع المادة الفائقة الدوارة (20817 g S ، الشكل 4A) وطردها المركزي عند 100000 × g لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يستخدم السوبرناتانت الدوار الثاني (100,000 g S، الشكل 4A) للفحص اللاحق المنسدل.

وأخيرا، استنادا إلى مبادئ فحص السحب والمنافسة، تستخدم استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. يرتبط جزء NORPA 863-1095 المنقى ذو العلامات الخاصة به بحبات Ni-Beads ويستخدم كطعم لسحب مجمعات بروتين INAD الداخلية من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة . بعد ذلك ، تتم إضافة جزء TRP 1261-1275 المنقى بشكل مفرط للتنافس على قناة TRP من مجمعات INAD التي تم التقاطها على حبات Ni (TRP E1 ، TRP E2 ، الشكل 4B). وفي النهاية، يتم فصل قناة TRP المسحوقة عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط الموسوم بضريبة السلع والخدمات بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الشكل 5). في عملية تحضير عينة SDS-PAGE ، يتم خلط 30 ميكرولتر من عينة البروتين مع 10 ميكرولتر من صبغة تحميل 4x وغليها عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، يتم تحميل 15 ميكرولتر من العينة بشكل فردي في كل بئر. كمنتج ثانوي ، يمكن أيضا الحصول على مجمعات INAD-ePKC-NORPA 863-1095 عن طريق التخلص من حبات Ni بعد منافسة الببتيد TRP 1261-1275 (NORPA E1 ، NORAP E2 ، الشكل 4B). باستخدام هذه الطريقة ، فإن العائد النموذجي لقناة Drosophila TRP النهائية المنقاة من 0.5 جم من رؤوس الذباب هو 50 ميكرولتر من بروتين TRP 3 ميكرومتر (1.5 × 10-10 مول). إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من قنوات TRP النقية ، فقم بزيادة كمية رؤوس الذباب ، وحبات Ni ، وبروتين الطعم ، والمنافس في المقابل.

Figure 1
الشكل 1: الرسم البياني التخطيطي لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية . (أ) يتم تجميد بروتينات NORPA 863-1095 الموسومة على حبات Ni. (ب) يتم تجانس رؤوس ذبابة الفاكهة ويضاف السوبرنات المغزلي بعد الطرد المركزي 100000 × g إلى حبات Ni-beads المرتبطة ب NORPA ، حيث يعمل بروتين NORPA 863-1095 كطعم لالتقاط مجمعات بروتين INAD الداخلية (INAD / TRP / ePKC). (ج) يضاف الجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات للتنافس على قناة ذبابة الفاكهة TRP الداخلية المنشأ من مجمعات البروتين INAD التي تم التقاطها. (دال) يتم تنقية بروتين TRP المستنفد بواسطة عمود استبعاد الحجم لفصل الجزء الزائد من TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات. وتسلط الأسهم الحمراء الضوء على مواقع التفريغ لقناة TRP وجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تنقية بروتين TRP-CT 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات بواسطة حبات الجلوتاثيون وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. (أ) ملف تعريف تنقية بروتين TRP-CT 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات في عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير). يتم جمع الكسور في 5 مل / أنبوب. يتم جمع الكسور في موضع السهم (الأنابيب 44-48) وتركيزها للتنقية التالية لقناة TRP الذاتية. (ب) هلام SDS-PAGE الملون باللون الأزرق Coomassie R250 يظهر الجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات في تنقية تقارب حبات الجلوتاثيون وتنقية عمود استبعاد الحجم اللاحق. يسلط السهم الضوء على موضع جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات في جل SDS-PAGE. الاختصارات: P: بيليه من الإشريكية القولونية. BL21 (DE3) تحلل الخلايا بعد التجانس في المخزن المؤقت PBS والطرد المركزي عند 48,384 × g ؛ S: supernatant من الإشريكية القولونية. BL21 (DE3) تحلل الخلايا بعد التجانس والطرد المركزي عند 48,384 × g ؛ F: جزء التدفق من خلال بعد كسر S السابق المحتضن مع حبات الجلوتاثيون لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ؛ W1 و W2: كسر الغسيل الأول والثاني بمقدار 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت PBS ؛ B: يتم تحليل البروتين غير المطفأ على حبات الجلوتاثيون المعاد تعليقها بواسطة SDS-PAGE gel لتقييم كفاءة الاستخلاص ؛ E: جزء الاستخلاص من حبات الجلوتاثيون بواسطة المخزن المؤقت للاستلقاء. يتم وصف الوصفة العازلة لتنقية البروتين الموسومة بضريبة السلع والخدمات في الجدول 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تنقية بروتين NORPA 863-1095 الموسوم به بواسطة حبات Ni وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. (A) ملف تعريف تنقية بروتين NORPA 863-1095 الموسوم به في عمود استبعاد الحجم. معدل التدفق = 3 مل / دقيقة. يتم جمع الكسور في 5 مل / أنبوب. يتم جمع الكسور في موضع السهم (الأنابيب 44-49) وتركيزها للتنقية التالية لقناة TRP الذاتية. (ب) هلام SDS-PAGE الملون باللون الأزرق Coomassie R250 يظهر بروتين NORPA 863-1095 الموسوم به في تنقية عمود Ni وتنقية العمود الاستبعاد اللاحق للحجم. يسلط السهم الضوء على موضع بروتين NORPA 863-1095 الموسوم به في جل SDS-PAGE. الاختصارات: P: بيليه من الإشريكية القولونية. BL21 (DE3) تحلل الخلايا بعد التجانس في المخزن المؤقت للربط والطرد المركزي عند 48,384 × g ؛ S: جزء فائق من الإشريكية القولونية. BL21 (DE3) تحلل الخلايا بعد التجانس والطرد المركزي عند 48,384 × g ؛ F: جزء التدفق بعد احتضان الكسر S السابق بحبات Ni لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ؛ W1 و W2: كسر الغسيل الأول والثاني بمقدار 10 أحجام عمود من المخزن المؤقت للغسيل ؛ B: بروتين غير مطفأ على حبات Ni-Beads المعاد تعليقها بعد التخليص ؛ E: كسور الاستخلاص من حبات Ni بواسطة المخزن المؤقت للاستخراج. يتم سرد الوصفة العازلة لتنقية البروتين الموسومة في الجدول 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية. يتم تحليل العينات التي تم جمعها من كل خطوة بواسطة SDS-PAGE وتلطيخها بصبغة R-250 الزرقاء Coomassie. (أ) 20817 g S: جزء فائق من تجانسات الرأس بعد 20,817 × g الطرد المركزي؛ NORPA F: جزء التدفق من خلال حبات Ni بعد ربط جزء NORPA 863-1095 الموسوم به ؛ Wash1 و Wash2: كسور الغسيل الأولى والثانية من حبات Ni-beads بواسطة المخزن المؤقت للتحلل بعد ربط NORPA 863-1095 الموسوم به ؛ 100,000 g S: يتم طرد السوبرناتانت السابق 20,817 g S بشكل أكبر عند 100,000 x g ويتم جمع supernatant ل SDS-PAGE; تحلل رأس درو F: جزء متدفق من حبات Ni بعد الحضانة مع عينة 100,000 g S ؛ Wash3 و Wash4: غسل أجزاء من حبات Ni-beads بواسطة المخزن المؤقت للتحلل بعد الحضانة مع عينة 100,000 g S. (ب) الجزءان E1 و E2 من TRP: الكسوران الأولى والثانية لقناة TRP المفصولة بواسطة جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات؛ Wash5: غسل أجزاء من حبات Ni-beads عن طريق ربط المخزن المؤقت بعد المنافسة بواسطة TRP 1261-1275 الموسوم ب GST ؛ NORPA E1 و E2: الجزء الأول والثاني من أجزاء NORPA 863-1095 الموسومة به مع مجمعات INAD / ePKC التي تم التقاطها ؛ الخرز: بروتين غير مطفأ يبقى في حبات الني-بيرز المعاد تعليقها بعد العلاج العازل للاستخراج. ويرد في الجدول 4 وصف للوصفة العازلة لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تنقية بروتين قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. (أ) لمحة عن تنقية بروتين قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ في عمود استبعاد الحجم. معدل التدفق = 0.5 مل / دقيقة. تم جمع الكسور عند 0.5 مل / أنبوب. تم جمع الكسور في موضع السهم (1E8-1F2) وتركيزها. (ب) هلام Coomassie الأزرق R-250 الملطخ SDS-PAGE الذي يظهر بروتين قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ بعد تنقية العمود الاستبعاد من الحجم. يتم تسليط الضوء على موقف بروتين قناة ذبابة الفاكهة TRP الداخلية المنقاة بواسطة السهم الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المواد اللازمة لتنقية الجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: المواد اللازمة لتنقية جزء NORPA 863-1095 الموسوم به. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: المواد اللازمة لإعداد رؤوس ذبابة الفاكهة يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: المواد اللازمة لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: المواد اللازمة لتنقية عمود استبعاد الحجم لقناة ذبابة الفاكهة TRP. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

INAD ، الذي يحتوي على خمسة نطاقات PDZ ، هو المنظم الأساسي لآلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن INAD PDZ3 يرتبط بذيل قناة TRP C-terminal مع خصوصية رائعة (KD = 0.3 μM)18. يتفاعل الترادف INAD PDZ45 مع جزء NORPA 863-1095 مع تقارب ربط عال للغاية (KD = 30 nM). وتوفر هذه النتائج أساسا كيميائيا حيويا متينا لتصميم استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة، التي تمكن من استخدام جزء NORPA CC-PBM كطعم منسدل، في حين يعمل ذيل TRP C-terminal (الجزء 1261-1275) ككاشف تنافسي. لذلك ، فإن النقطة الحرجة الأولى لهذه الطريقة هي فهم آلية تجميع مجمع INAD والحصول على ما يكفي من شظايا NORPA و TRP. في الوقت نفسه ، نظرا لأن قناة TRP هي بروتين الغشاء الذي يحتاج إلى استخراجه من الغشاء وتثبيته في المحلول ، فإن استخدام المنظفات هو النقطة الحرجة الثانية لهذه الطريقة. كمنظف شائع للدراسات الهيكلية والوظيفية لقنوات TRP24,25 ، يتم استخدام n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) في هذه الطريقة. إذا كانت نتائج التنقية غير مرضية ، فيجب فحص صفات بروتين الطعم والبروتين المنافس والمنظفات بعناية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تتبع كفاءة استخراج قنوات TRP عن طريق اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد TRP.

في دراسة سابقة5 ، تم استخدام حبات الستربتافيدين باهظة الثمن لتنقية قناة TRP من مستخلصات رأس الذبابة ، مما يحد من التنقية الروتينية في المختبر. لذلك ، تم تحسين الطريقة باستخدام جزء NORPA 863-1095 الموسوم به إلى جانب حبات Ni لتقليل التكلفة وزيادة العائد. وفي الوقت الحالي، تكفي غلة قناة TRP المنقاة في الطريقة المحسنة لإجراء تجربة تلطيخ سلبية بالمجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، حيث تشكل قنوات TRP المنقاة رباعيات (البيانات غير معروضة)، مما يشير إلى أن عملية التنقية لا تعطل تكوين رباعي قنوات TRP. لذلك ، سيكون هذا البروتوكول مناسبا لتجارب التبريد EM والفيزيولوجيا الكهربية المستقبلية.

ومع ذلك ، نظرا لأن المنافسين المستخدمين في التجارب (جزء NORPA 863-1095 ، جزء TRP 1261-1275) لديهم تقاربات ربط مماثلة مع البروتينات البرية ، فإن الحد من هذه الطريقة هو أنه يجب استخدام البروتينات والخرز التنافسية الضخمة لسحب البروتين المستهدف. لن يكون مناسبا للمختبرات التي لا تستطيع تنقية الطعم على نطاق واسع.

سيكون التطبيق المستقبلي المحتمل لهذه الطريقة هو دراسة المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP باستخدام تقنيات Cryo-EM. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقنوات TRP الداخلية النقية في غشاء الدهون الاصطناعي ثنائي الطبقة ممكن أيضا. علاوة على ذلك ، في هذا النظام النموذجي المعاد تشكيله ، سيكون من المثير للاهتمام توصيف الخصائص الكهروفسيولوجية لقنوات TRP الداخلية المنقاة عن طريق تعديل تكوين INAD المعقد وتكوين الدهون. أخيرا ، جنبا إلى جنب مع المعلومات الهيكلية والخصائص الكهروفسيولوجية ، يمكن فحص آليات البوابات والتنظيم لقناة TRP بعناية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870746) ، ومنح شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20200109140414636) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم 2021A1515010796) إلى W. L. نشكر LetPub (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 178 ، تنقية البروتين ، ذبابة الفاكهة ، قناة TRP ، INAD
تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات <em>ذبابة الفاكهة</em> العابرة الذاتية المنشأ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding,… More

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter