استنادا إلى آلية تجميع مركب البروتين INAD ، في هذا البروتوكول ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة Drosophila TRP الذاتية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد النقل الضوئي لذبابة الفاكهة أحد أسرع مسارات الإشارات المقترنة ببروتين G المعروفة. لضمان خصوصية وكفاءة هذا الشلال ، ترتبط قناة كاتيون الكالسيوم (Ca2+) القابلة للنفاذ ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) ، بإحكام ببروتين السقالة ، وتعطيل D بدون جهد لاحق (INAD) ، وتشكل مركبا كبيرا من بروتين الإشارات مع كيناز البروتين C (ePKC) الخاص بالعين والفوسفوليباز Cβ / بدون مستقبلات المحتملة A (PLCβ / NORPA). ومع ذلك ، فإن الخصائص البيوكيميائية لقناة ذبابة الفاكهة TRP لا تزال غير واضحة. استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. أولا ، كان جزء الهيستيدين النقي (له) الموسوم NORPA 863-1095 مرتبطا بحبات Ni ويستخدم كطعم لسحب مركب بروتين INAD الداخلي المنشأ من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة. بعد ذلك ، تمت إضافة جزء من الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسوم باسم TRP 1261-1275 إلى حبات Ni للتنافس مع قناة TRP. وأخيرا ، تم فصل قناة TRP في supernatant عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذه الطريقة تجعل من الممكن دراسة آلية بوابة قناة ذبابة الفاكهة TRP من كل من الزوايا الكيميائية الحيوية والهيكلية. يمكن أيضا قياس خصائص الفيزيولوجيا الكهربية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP النقية في المستقبل.
المقدمة
النقل الضوئي هو عملية يتم فيها تحويل الفوتونات الممتصة إلى رموز كهربائية للخلايا العصبية. وهو ينقل حصريا الأوبسينات وسلسلة الإشارات التالية المرتبطة ببروتين G في كل من الفقاريات واللافقاريات. في ذبابة الفاكهة ، باستخدام مجالات PDZ الخمسة ، ينظم تعطيل بروتين السقالة - بدون إمكانات لاحقة D (INAD) مجمع إشارات فوق جزيئي ، والذي يتكون من قناة محتملة للمستقبلات العابرة (TRP) ، و phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) ، وكيناز البروتين C (ePKC) (ePKC) 1. يضمن تكوين مجمع الإشارات فوق الجزيئية هذا التوطين الصحيح تحت الخلوي والكفاءة العالية وخصوصية آلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. في هذا المعقد ، تعمل قنوات TRP الحساس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تنقية شظايا TRP الموسومة بضريبة السلع والخدمات وشظايا NORPA الموسومة به
- تنقية جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات
- حول بلازميد pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 إلى خلايا الإشريكية القولونية (E. coli ) BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl2 21. قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط لوريا بيرتاني (LB) وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتضخيم 10 مل من ثقافة البذر في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية.
- بعد أن تصل الكثافة البصرية (OD600) للخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية وإضافة 0.1 mM isoprop....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه المقالة ، يتم توضيح طريقة تنقية البروتين لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ (الشكل 1).
أولا ، يتم تطبيق التعبير عن البروتين المؤتلف وتنقيته للحصول على الطعم والبروتينات المنافسة. بعد ذلك ، يتم التعبير عن جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في خلايا E. coli BL21 (DE3) في وسط LB ويتم تنقيته باستخدام حبات الجلوتاثيون وعمود استبعاد الحجم (الشكل 2). تم التحقق من العينات باستخدام تحليل SDS-PAGE مع تلطيخ Coomas.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
INAD ، الذي يحتوي على خمسة نطاقات PDZ ، هو المنظم الأساسي لآلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن INAD PDZ3 يرتبط بذيل قناة TRP C-terminal مع خصوصية رائعة (KD = 0.3 μM)18. يتفاعل الترادف INAD PDZ45 مع جزء NORPA 863-1095 مع تقارب ربط عال للغاية (KD = 30 nM). وتوفر هذه النتائج أساسا كيميائيا حيويا متينا لتصميم استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة، التي تمكن من استخدام جزء NORPA CC-PBM كطعم منسدل، في حين يعمل ذيل TRP C-terminal (الجزء 1261-.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870746) ، ومنح شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20200109140414636) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم 2021A1515010796) إلى W. L. نشكر LetPub (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية >سلالات بكتيرية < / قوية > | |||
| < م > BL21 (DE3) الخلايا المختصة < / م > | نوفاجين | 69450 | الإفراط في التعبير عن البروتين |
| < قوي > نماذج التجربة < / قوي > | |||
| D.melanogaster: W 1118 < / sup> سلالة | مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة | BDSC: 3605 | <>ذبابة الفاكهة < / م > إعداد |
| الرأس <قوي > مادة < / قوي > | |||
| 20/30/40 شبكة غرابيل الفولاذ المقاوم للصدأ شركة | Jiufeng شبكة معدنية | شركة GB / T6003.1 | ذبابة الفاكهة < / م > تحضير الرأس |
| 30٪ أكريلاميد-N ، N & Prime ؛ -Methylenebisacrylamide (29: 1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE تحضير جل |
| الأمونيوم بيرسولفات | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE تحضير جل |
| مثبط البروتياز كوكتيل | Roche | 05892953001 | مثبط البروتياز |
| Coomassie الأزرق اللامع R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE تلطيخ |
| جل DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | إعداد |
| العازلة لعمود استبعاد الحجمملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | سانجون للتكنولوجيا الحيوية | A500838-0500 | إعداد العازلة لعمود استبعاد الحجم |
| الجلايسين | سانجون للتكنولوجيا الحيوية | A610235-0005 | SDS-PAGE إعداد العازلة |
| الجلوتاثيون سيفاروز 4 حبات التدفق السريع | Cytiva | 17513202 | كروماتوغرافيا التقارب |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer التحضير لعمود النيكل |
| الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) | سانجون بيوتك | A600168-0025 | تحريض البروتين المفرط |
| التعبير LB مرق مسحوق | سانجون للتكنولوجيا الحيوية | A507002-0250 | E.coli.< / em> ثقافة الخلية |
| L-Glutathione المخفضة (GSH) | إعداد عازلة Sigma-aldrich | G4251-100G | لحبات الجلوتاثيون |
| Ni-Sepharose excel الخرز | Cytiva | 17371202 | تقارب اللونيات |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | منظف لتنقية البروتين |
| N ، N ، N '، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE تحضير جل |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | مخزن مؤقت للتجانس ل E.coli.< / em> خلية |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | مثبط البروتياز |
| البروتين المصبغة | مسبقا Thermo Scientific | 26619/26616 | سلم البروتين الملون |
| عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG |
| عمود استبعاد الحجم (درجة تحليلية) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 زيادة 10/300 GL عمود |
| كلوريد الصوديوم | Sangon Biotech | A501218-0001 | تحضير عازلة تنقية البروتين |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE هلام / إعداد العازلة |
| تريس | Sigma-aldrich | T1503-10KG | عازلة تنقية البروتين |
| تدور الترشيح الفائق عمود | Millipore | UFC901096 / 801096 | تركيز البروتين |
| <قوي > المعدات < / قوي > | |||
| الميزان التحليلي | دنفر | APX-60 | Metage من ذبابة الفاكهة < / em> رأس |
| طرد مركزي مبرد عالي السرعة على سطح المكتب لأنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 مل و 50 مل | البروتين | Eppendorf | 5810R |
| أجهزة الطرد المركزي المبردة عالية السرعة على سطح المكتب 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | Eppendorf | 5417R | الطرد المركزي ذبابة الفاكهة< / em> محللة الرأس بعد التجانس |
| عمود تدفق الجاذبية الفارغة (القطر الداخلي = 1.0 سم) | Bio-Rad | 738-0015 | تنقية البروتين TRP |
| عمود تدفق الجاذبية الفارغ (القطر الداخلي = 2.5 سم) | Bio-Rad | 738-0017 | تنقية البروتين الطعم والمنافس من E.coli.< / em> |
| نظام التوثيق | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR | System SDS-PAGE التصوير |
| جهاز طرد مركزي مبرد عالي | السرعة Beckman coulter | Avanti J-26 XP | الطرد المركزي من E.coli.< / em> الخلايا / الخلية المحلل |
| الخالط عالي الضغط | UNION-BIOTECH | UH-05 | تجانس خلايا E.coli.< / em> |
| خزان النيتروجين السائل | Taylor-Wharton | CX-100 | ذبابة الفاكهة < / em> تحضير الرأس |
| نظام تنقية البروتين | Cytiva | AKTA | لتنقية البروتين |
| ثلاجة (-80 درجة ؛ ج) | Thermo | 900GP | em>ذبابة الفاكهة < / em> إعداد الرأس |
| مقياس الطيف الضوئي | MAPADA | UV-1200 | OD600 لخلايا E.coli.< / em> |
| مقياس الطيف | الضوئي الحراري العلمي | NanoDrop 2000c | تحديد تركيز البروتين |
| جهاز الطرد المركزي الفائق | بيكمان كولتر | أوبتيما XPN-100 أجهزة الطرد | المركزي الفائقالطرد المركزي الفائق |
المراجع
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by proto....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
