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Biochemistry

अंतर्जात ड्रोसोफिला क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों की शुद्धि

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63260
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के संयोजन तंत्र के आधार पर, इस प्रोटोकॉल में, अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक संशोधित आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीति विकसित की गई थी।

Abstract

ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन सबसे तेजी से ज्ञात जी प्रोटीन-युग्मित सिग्नलिंग मार्गों में से एक है। इस झरने की विशिष्टता और दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, कैल्शियम (सीए2 +) -पारगम्य उद्धरण चैनल, क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी), मचान प्रोटीन, निष्क्रियता-नो-आफ्टर-पोटेंशियल डी (आईएनएडी) को कसकर बांधता है, और आंख-विशिष्ट प्रोटीन किनेज सी (ईपीकेसी) और फॉस्फोलिपेज सी / हालांकि, ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के जैव रासायनिक गुण स्पष्ट नहीं हैं। आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के संयोजन तंत्र के आधार पर, अंतर्जात टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक संशोधित आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीति विकसित की गई थी। सबसे पहले, शुद्ध हिस्टिडीन (हिज) -टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को नी-मोती से बांधा गया था और ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट्स से अंतर्जात आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को खींचने के लिए चारा के रूप में इस्तेमाल किया गया था। फिर, टीआरपी चैनल के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए नी-बीड्स में अत्यधिक शुद्ध ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा जोड़ा गया था। अंत में, सतह पर तैरनेवाला में टीआरपी चैनल को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अत्यधिक टीआरपी 1261-1275 पेप्टाइड से अलग किया गया था। यह विधि जैव रासायनिक और संरचनात्मक दोनों कोणों से ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के गेटिंग तंत्र का अध्ययन करना संभव बनाती है। शुद्ध ड्रोसोफिला टीआरपी चैनलों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी गुणों को भविष्य में भी मापा जा सकता है।

Introduction

फोटोट्रांसडक्शन एक ऐसी प्रक्रिया है जहां अवशोषित फोटॉन न्यूरॉन्स के विद्युत कोड में परिवर्तित हो जाते हैं। यह विशेष रूप से कशेरुक और अकशेरुकी दोनों में ऑप्सिन और निम्नलिखित जी प्रोटीन-युग्मित सिग्नलिंग कैस्केड को रिले करता है। ड्रोसोफिला में, अपने पांच पीडीजेड डोमेन का उपयोग करके, मचान प्रोटीन निष्क्रियता-नो-आफ्टर-पोटेंशियल डी (आईएनएडी) एक सुपरमॉलिक्युलर सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स का आयोजन करता है, जिसमें एक क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (टीआरपी) चैनल, फॉस्फोलिपेज़ सीβ / इस सुपरमॉलिक्युलर सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स का गठन सही उपकोशिकीय स्थानीयकरण, उच्च दक्षता और ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन मशीनरी की विशिष्टता की गारंटी देता है। इस परिसर में, प्रकाश-संवेदनशील टीआरपी चैनल एनओआरपीए के डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के रूप में कार्य करते हैं और कैल्शियम प्रवाह और फोटोरिसेप्टर के विध्रुवण की मध्यस्थता करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल का उद्घाटन प्रोटॉन, स्थानीय लिपिड पर्यावरण के विघटन, या यांत्रिक बल 2,3,4 द्वारा मध्यस्थता की जाती है। ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल भी शांतोडुलिन5 के साथ बातचीत करता है और सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रिया 6,7,8 दोनों द्वारा कैल्शियम द्वारा संशोधित किया जाता है।

अब तक, ड्रोसोफिला टीआरपी और टीआरपी-जैसे (टीआरपीएल) चैनलों के गेटिंग तंत्र पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन एक्साइज्ड मेम्ब्रेन पैच, अलग-अलग जंगली प्रकार के ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर से पूरे सेल रिकॉर्डिंग और एस 2, एसएफ 9, या एचईके कोशिकाओं 2,9,10,11,12,13 में हेटेरो-व्यक्त चैनलों पर आधारित थे, लेकिन शुद्ध चैनलों पर नहीं। पूर्ण लंबाई वाले ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की संरचनात्मक जानकारी भी स्पष्ट नहीं है। पुनर्गठित झिल्ली वातावरण में शुद्ध प्रोटीन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करने और पूर्ण लंबाई वाले ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए, शुद्ध पूर्ण लंबाई टीआरपी चैनल प्राप्त करना आवश्यक पहला कदम है, स्तनधारी टीआरपी चैनल अध्ययन 14,15,16,17 में उपयोग की जाने वाली पद्धतियों के समान।

हाल ही में, आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 18,19,20 के संयोजन तंत्र के आधार पर, स्ट्रेप्टाविडिन मोती 5 द्वारा ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट्स से टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीतिपहली बार विकसित की गई थी। स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की कम क्षमता और महंगी लागत को ध्यान में रखते हुए, यहां एक बेहतर शुद्धिकरण प्रोटोकॉल पेश किया गया है जो उनके टैग किए गए चारा प्रोटीन और बहुत अधिक क्षमता वाले संबंधित कम लागत वाले नी-मोतियों का उपयोग करता है। प्रस्तावित विधि संरचनात्मक कोणों से टीआरपी चैनल के गेटिंग तंत्र का अध्ययन करने और शुद्ध प्रोटीन के साथ टीआरपी चैनल के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को मापने में मदद करेगी।

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Protocol

1. जीएसटी-टैग की गई टीआरपी और उनके टैग किए गए एनओआरपीए टुकड़ों का शुद्धिकरण

  1. जीएसटी टैग की गई टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा शुद्ध करें
    1. सीएसीएल 2 हीट-शॉक ट्रांसफॉर्मेशनविधि 21 का उपयोग करके पीजीईएक्स 4 टी -1 टीआरपी 1261-1275 प्लास्मिड 10 को एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) बीएल21 (डीई 3) कोशिकाओं में बदलें। लुरिया बर्तानी (एलबी) माध्यम के 10 मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी माध्यम के 1 एल में बोने की संस्कृति के 10 एमएल को बढ़ाएं।
    2. कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो 600) 0.5 तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को 16 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और लक्ष्य प्रोटीन के ओवरएक्सप्रेशन को प्रेरित करने के लिए 0.1 एमएम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी; अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और 18 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. ओवरएक्सप्रेशन के बाद, 20 मिनट के लिए 3,993 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं के गोली 1 एल और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर के 40 एमएल में पुन: निलंबित कर दिया गया।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा एक उच्च दबाव होमोजेनाइज़र में पुन: निलंबित कोशिकाओं लोड। धीरे-धीरे होमोजेनाइज़र दबाव को 800 बार तक बढ़ाएं। इनलेट टैप खोलें और पुन: निलंबित कोशिकाओं को बहुत संकीर्ण स्लिट्स के साथ वाल्व के माध्यम से परिपत्र रूप से गुजरने दें।
      नोट: कोशिकाओं को एक बड़े दबाव ड्रॉप और गुहिकायन के कारण उच्च कतरनी बलों द्वारा समरूप किया जाता है।
    5. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ के लिए ग्लूटाथियोन मोती के 5 मिलीलीटर लोड करें और कुल तीन बार पीबीएस बफर के 50 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धो लें।
    6. 48,384 x g पर उच्च दबाव होमोजेनाइज़र से सेल लाइसेट अपकेंद्रित्र। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में संतुलित ग्लूटाथियोन मोती के लिए सेंट्रीफ्यूज्ड सेल लाइसेट (40 एमएल) के सतह पर तैरनेवाला जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। हर 10 मिनट में ग्लूटाथियोन मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    7. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, मोती और प्रवाह-थ्रू अंश को अलग करने के लिए कॉलम आउटलेट टैप खोलें। प्रवाह-थ्रू अंश को त्यागें। पीबीएस बफर के 50 मिलीलीटर के साथ दो बार शेष ग्लूटाथियोन मोती कुल्ला।
    8. ग्लूटाथियोन मोती के लिए क्षालन बफर के 15 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए सेते हैं। हर 10 मिनट में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    9. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में और आकार-बहिष्करण कॉलम (तैयारी ग्रेड) में लोड करें, जिसे 50 एमएम ट्रिस (पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम डीटीटी) बफर का उपयोग करके संतुलित किया जाता है।
    10. आकार-बहिष्करण स्तंभ की क्षालन प्रवाह दर को 3 एमएल / ट्यूब की दर से एल्यूटेड प्रोटीन इकट्ठा करें।
    11. 280 एनएम पर यूवी अवशोषण संकेतों का विश्लेषण करके आकार-बहिष्करण कॉलम में लक्ष्य प्रोटीन के शिखर की पहचान करें और एसडीएस-पेज जेल विश्लेषण (वैद्युतकणसंचलन पैरामीटर: स्टैकिंग जेल के लिए 150 वी; हल करने वाले जेल के लिए 200 वी) द्वारा सत्यापित करें। कूमासी नीले आर 250 के साथ जेल दाग।
    12. डेस्क-टॉप रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किए गए 15 एमएल अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम का उपयोग करके आकार-बहिष्करण कॉलम से 1 एमएल तक शुद्ध जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े को केंद्रित करें।
    13. बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करके केंद्रित प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े के यूवी अवशोषण को मापें।
    14. प्रोटपरम कार्यक्रम (https://web.expasy.org/protparam/) में प्रोटीन अनुक्रमों को आयात करके 280 एनएम पर विलुप्त होने गुणांक प्राप्त करें। आमतौर पर, जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 की 1 एल संस्कृति प्रोटीन के 600 μM (6 x 10-7 मोल) के 1 एमएल पैदावार देती है। आवश्यक सामग्रियों के लिए तालिका 1 देखें।
  2. उनके टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े की शुद्धि
    1. सीएसीएल 2 हीट-शॉक ट्रांसफॉर्मेशन विधि21 का उपयोग करके पीईटीएम.3 सी एनओआरपीए 863-1095 प्लास्मिड20 को ई कोलाई बीएल21 (डीई 3) कोशिकाओं में बदलें। एलबी माध्यम के 10 मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी माध्यम के 1 एल में 10 एमएल बोने की संस्कृति को बढ़ाएं।
    2. कोशिकाओं केआयुध डिपो 600 0.5 तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को 16 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और लक्ष्य प्रोटीन के ओवरएक्सप्रेशन को प्रेरित करने के लिए 0.1 एमएम आईपीटीजी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और 18 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. ओवरएक्सप्रेशन के बाद, 20 मिनट के लिए 3,993 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं के गोली 1 एल और बाध्यकारी बफर के 40 मिलीलीटर में पुन: निलंबित कर दिया गया। अगला, चरण 1.1.4 में वर्णित 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उच्च दबाव होमोजेनाइज़र में पुन: निलंबित कोशिकाओं को लाइज़ करें।
    4. एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में नी-मोती के 5 मिलीलीटर लोड करें और बाध्यकारी बफर के 50 मिलीलीटर के साथ तीन बार धो लें।
    5. 48,384 x g पर उच्च दबाव होमोजेनाइज़र से सेल लाइसेट अपकेंद्रित्र। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में संतुलित नी-मोती के लिए सेंट्रीफ्यूज्ड सेल लाइसेट के सतह पर तैरनेवाला जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। नी-मोतियों को हर 10 मिनट में फिर से निलंबित करें।
    6. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, मोती और प्रवाह-थ्रू अंश को अलग करने के लिए कॉलम आउटलेट टैप खोलें। प्रवाह-थ्रू अंश को त्यागें और शेष नी-मोतियों को 50 मिलीलीटर वॉश बफर के साथ दो बार धो लें।
    7. नी मोती के लिए क्षालन बफर के 15 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए सेते हैं। नी-मोतियों को हर 10 मिनट में फिर से निलंबित करें।
    8. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एल्यूटेड हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को इकट्ठा करें और एक आकार-बहिष्करण कॉलम (तैयारी ग्रेड) में लोड करें, जिसे 50 एमएम ट्रिस (पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम डीटीटी) का उपयोग करके संतुलित किया जाता है।
    9. आकार-बहिष्करण स्तंभ की क्षालन प्रवाह दर को 3 एमएल / ट्यूब की दर से एल्यूटेड प्रोटीन इकट्ठा करें।
    10. 280 एनएम पर यूवी अवशोषण संकेतों का विश्लेषण करके आकार-बहिष्करण कॉलम में लक्ष्य प्रोटीन के शिखर की पहचान करें और एसडीएस-पेज जेल विश्लेषण (वैद्युतकणसंचलन पैरामीटर: स्टैकिंग जेल के लिए 150 वी; हल करने वाले जेल के लिए 200 वी) द्वारा सत्यापित करें। कूमासी नीले आर 250 का उपयोग करके जेल को दाग दें।
    11. डेस्क-टॉप रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किए गए 15 एमएल अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम का उपयोग करके आकार-बहिष्करण कॉलम से 1 एमएल तक शुद्ध हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को केंद्रित करें।
    12. बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करके केंद्रित प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर उनके टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े के यूवी अवशोषण को मापें।
    13. प्रोटपरम कार्यक्रम (https://web.expasy.org/protparam/) में प्रोटीन अनुक्रमों को आयात करके 280 एनएम पर विलुप्त होने गुणांक प्राप्त करें। आमतौर पर, हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े की 1 एल संस्कृति प्रोटीन के 600 μM (6 x 10-7 मोल) के 1 एमएल की पैदावार करती है। आवश्यक सामग्रियों के लिए तालिका 2 देखें।

2. ड्रोसोफिला सिर की तैयारी

  1. सीओ 2 संवेदनाहारी विधि22,23 का उपयोग कर50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूजेशनट्यूबों में वयस्क मक्खियों ले लीजिए; तुरंत 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  2. मक्खियों की पर्याप्त संख्या इकट्ठा करने के बाद, मक्खियों के पैरों, सिर, पंखों और निकायों को अलग करने के लिए जमे हुए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को हाथ से सख्ती से हिलाएं। मिश्रण को तीन क्रमिक रूप से स्टैक्ड प्री-कूल्ड स्टेनलेस-स्टील छलनी (क्रमशः 20/30/40 जाल आकार) में स्थानांतरित करें और छलनी को हिलाएं।
  3. अगला, चूंकि सिर 40-जाल छलनी से नहीं गुजर सकते हैं, इसलिए 40-जाल चलनी से फ्लाई हेड को स्वीप करने के लिए ब्रश का उपयोग करें, उन्हें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. मक्खियों और उनके सिर को लगातार इकट्ठा करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें जब तक कि वे प्रयोग (0.5 ग्राम) के लिए आवश्यक मात्रा तक नहीं पहुंच जाते। आमतौर पर, 0.5 ग्राम सिर इकट्ठा करने के लिए, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 35 मिलीलीटर मक्खियों की आवश्यकता होती है। आवश्यक सामग्रियों के लिए तालिका 3 देखें।

3. ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल शुद्धिकरण

  1. सिर के कुल 0.5 ग्राम वजन और एक पूर्व ठंडा मोर्टार मूसल का उपयोग कर तरल नाइट्रोजन में पूरी तरह से समरूप। डब्ल्यू लाइसिस बफर (5 एमएल) में होमोजेनाइज्ड सिर को भंग करें, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर में सेते हैं, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,817 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  2. स्पिन-डाउन सतह पर तैरनेवाला ("20817 ग्राम एस", चित्रा 4) लीजिए और आगे 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 100,000 एक्स जी पर इसे अपकेंद्रित्र। निम्नलिखित पुल-डाउन परख के लिए स्पिन-डाउन सतह पर तैरनेवाला ("100,000 ग्राम एस", चित्रा 4) का उपयोग करें।
  3. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में नी-मोती के 1 एमएल जोड़ें और कुल तीन बार के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ (डीडीएच2ओ) के 10 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर तीन बार लाइसिस बफर के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ मोतियों को संतुलित करें।
  4. नी-कॉलम में 600 μM शुद्ध उनके-टैग किए गए NORPA 863-1095 प्रोटीन (3 x 10-7 मोल) के 500 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। हर 10 मिनट में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  5. मोती और प्रवाह-थ्रू अंश को अलग करने के लिए कॉलम आउटलेट टैप खोलें। एसडीएस-पेज विश्लेषण (एनओआरपीए एफ, चित्रा 4) के लिए प्रवाह-थ्रू अंश लें। इस खंड में, चारा प्रोटीन नी-मोतियों पर स्थिर होते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर लाइसिस बफर (10 एमएल) के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ नी-मोती धो लें और एसडीएस-पेज विश्लेषण (वॉश 1, चित्रा 4 ए) के लिए धोने के अंश को रखें। उपरोक्त चरणों को दोहराएं और एसडीएस-पेज विश्लेषण (वॉश 2, चित्रा 4 ए) के लिए नमूना रखें। इस खंड में, नी-मोतियों पर अत्यधिक चारा प्रोटीन हटा दिए जाते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर नी-कॉलम में 100,000 एक्स जी सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट के सतह पर तैरनेवाला जोड़ें, जहां हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को स्थिर किया गया है।
  8. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नी मोती के साथ सतह पर तैरनेवाला सेते हैं। हर 10 मिनट में मोतियों को फिर से निलंबित करें। फिर, मोतियों और प्रवाह-थ्रू अंश को अलग करने के लिए कॉलम आउटलेट टैप खोलें।
  9. एसडीएस-पेज विश्लेषण (ड्रो हेड लाइसिस एफ, चित्रा 4 ए) के लिए सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए। इस खंड में, सिर होमोजेनेट्स में आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आईएनएडी / टीआरपी / ईपीकेसी) नी-मोतियों पर स्थिर एनओआरपीए 863-1095 टुकड़ों द्वारा कब्जा कर लिया जाता है।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर लाइसिस बफर (10 एमएल) के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ नी-मोती धो लें और एसडीएस-पेज विश्लेषण (वॉश 3, चित्रा 4 ए) के लिए गुरुत्वाकर्षण वर्षा से सतह पर तैरनेवाला रखें। उपरोक्त चरणों को दोहराएं और एसडीएस-पेज विश्लेषण (वॉश 4, चित्रा 4 ए) के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। इस खंड में, नी-मोती पर अनबाउंड प्रोटीन को हटा दिया जाता है।
  11. जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 प्रोटीन (3 x 10-7 मोल) के 600 μM के 500 μL नी-मोती में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। हर 10 मिनट में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  12. गुरुत्वाकर्षण स्तंभ (टीआरपी ई 1, चित्रा 4 बी) से एल्यूटेड अंश एकत्र करें, जिसमें अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल शामिल है। उपरोक्त चरणों को दोहराएं और क्षालन अंश (टीआरपी ई 2, चित्रा 4 बी) एकत्र करें। इस चरण में, प्रतियोगी के रूप में जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ों का उपयोग करके, टीआरपी चैनलों को नी-बीड्स पर कैप्चर किए गए आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आईएनएडी / टीआरपी / ईपीकेसी) से हटा दिया जाता है।
  13. बाध्यकारी बफर (10 एमएल) के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ नी-मोती धो लें; तालिका 1) 4 डिग्री सेल्सियस पर और एसडीएस-पेज विश्लेषण (वॉश 5, चित्रा 4 बी) के लिए धोने के अंश को इकट्ठा करें।
  14. नी मोती में क्षालन बफर (तालिका 1) के 500 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ (एनओआरपीए ई 1, चित्रा 4 बी) से क्षालन अंश लीजिए। उपरोक्त चरणों को दोहराएं, और क्षालन अंश (एनओआरपीए ई 2, चित्रा 4 बी) एकत्र करें।
  15. क्षालन बफर का उपयोग करके, आईएनएडी / ईपीकेसी प्रोटीन परिसरों के साथ उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को एल्यूट करें। अगला, बाध्यकारी बफर के 500 μL में नी-मोती को फिर से निलंबित करें।
  16. क्षालन की दक्षता का विश्लेषण करने और मूल्यांकन करने के लिए एसडीएस-पेज (कूमासी ब्लू आर 250 द्वारा दाग) चलाने के लिए पुन: निलंबित नी-मोती लें और मूल्यांकन करें कि क्या एल्यूट बफर काम करता है (मोती, चित्रा 4 बी)। आवश्यक सामग्रियों के लिए तालिका 4 देखें।

4. ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल का आकार-बहिष्करण कॉलम शुद्धिकरण

  1. प्रोटीन शोधन प्रणाली पर एक आकार-बहिष्करण कॉलम (विश्लेषणात्मक ग्रेड) स्थापित करें। कॉलम बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 150 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम डीटीटी, 0.75 एमएम डीडीएम) के साथ कॉलम को संतुलित करें, जिसे 0.45 μm फ़िल्टर द्वारा फ़िल्टर किया जाता है।
  2. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज, 4 एमएल अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम का उपयोग करके चरण 3.14 से टीआरपी ई 1 और ई 2 अंश को केंद्रित करें।
  3. स्तंभ बफर के साथ नमूना पाश कुल्ला और नमूना पाश में नमूना लोड। आकार-बहिष्करण कॉलम में नमूना इंजेक्ट करें और उचित प्रवाह दर (0.5 एमएल /
  4. 280 एनएम पर अवशोषण द्वारा लक्ष्य प्रोटीन के शिखर की पहचान करें और शुद्ध अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल (चित्रा 5) का पता लगाने के लिए एक एसडीएस-पेज जेल चलाएं। आवश्यक सामग्रियों के लिए तालिका 5 देखें।

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Representative Results

इस लेख में, अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल (चित्रा 1) को शुद्ध करने के लिए एक प्रोटीन शुद्धि विधि का प्रदर्शन किया गया है।

सबसे पहले, पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण चारा और प्रतियोगी प्रोटीन प्राप्त करने के लिए लागू किया जाता है। फिर, एक जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा एलबी माध्यम में ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और ग्लूटाथियोन मोती और एक आकार-बहिष्करण कॉलम (चित्रा 2) का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। नमूनों को कूमासी ब्लू आर 250 धुंधला के साथ एसडीएस-पेज विश्लेषण का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। एसडीएस-पेज नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में, प्रोटीन नमूने के 30 μL 4x लोडिंग डाई के 10 μL के साथ मिश्रित है और 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबला हुआ है। फिर, उबला हुआ नमूना के 15 μL व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कुएं में लोड किया जाता है। उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को एलबी माध्यम में ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) कोशिकाओं में भी व्यक्त किया गया है और नी-मोती और आकार-बहिष्करण कॉलम (चित्रा 3) द्वारा शुद्ध किया गया है। शुद्ध जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 और उनके टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के शुद्धिकरण के लिए केंद्रित हैं।

दूसरा, ड्रोसोफिला सिर को पूर्व-ठंडा मोर्टार-मूसल का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में एकत्र और समरूप किया जाता है, और फिर 10x वी / भंग सिर होमोजेनेट 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में ऊष्मायन किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,817 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। स्पिन-डाउन सतह पर तैरनेवाला (20817 ग्राम एस, चित्रा 4 ए) एकत्र किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 100,000 एक्स जी पर आगे सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। दूसरा स्पिन-डाउन सतह पर तैरनेवाला (100,000 ग्राम एस, चित्रा 4 ए) का उपयोग बाद के पुल-डाउन परख के लिए किया जाता है।

अंत में, पुल-डाउन और प्रतिस्पर्धा परख के सिद्धांतों के आधार पर, आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीति का उपयोग अंतर्जात टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। शुद्ध हिज-टैग किया गया एनओआरपीए 863-1095 टुकड़ा नी-मोतियों से बंधा हुआ है और ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट्स से अंतर्जात आईएनएडी प्रोटीन परिसरों को खींचने के लिए चारा के रूप में उपयोग किया जाता है। फिर, नी-मोतियों (टीआरपी ई 1, टीआरपी ई 2, चित्रा 4 बी) पर कब्जा किए गए आईएनएडी परिसरों से टीआरपी चैनल के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए अत्यधिक शुद्ध जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा जोड़ा जाता है। अंत में, एल्यूटेड टीआरपी चैनल को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 5) द्वारा अत्यधिक जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 पेप्टाइड से अलग किया जाता है। एसडीएस-पेज नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में, प्रोटीन नमूने के 30 μL 4x लोडिंग डाई के 10 μL के साथ मिश्रित है और 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबला हुआ है। फिर, नमूने के 15 μL व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कुएं में लोड किया जाता है। एक उपोत्पाद के रूप में, आईएनएडी-ईपीकेसी-एनओआरपीए 863-1095 परिसरों को टीआरपी 1261-1275 पेप्टाइड प्रतियोगिता (एनओआरपीए ई 1, नोरैप ई 2, चित्रा 4 बी) के बाद नी-मोतियों को एल्यूट करके भी प्राप्त किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, 0.5 ग्राम फ्लाई हेड्स से अंतिम शुद्ध ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की विशिष्ट उपज 3 μM टीआरपी प्रोटीन (1.5 x 10-10 मोल) का 50 μL है। यदि अधिक शुद्ध टीआरपी चैनलों की आवश्यकता होती है, तो फ्लाई हेड्स, नी-बीड्स, चारा प्रोटीन और प्रतिस्पर्धी की मात्रा को स्केल करें।

Figure 1
चित्र 1: अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के शुद्धिकरण के लिए योजनाबद्ध आरेख( ए) शुद्ध हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन नी-मोतियों पर स्थिर हैं। (बी) ड्रोसोफिला सिर होमोजेनाइज्ड होते हैं और 100,000 एक्स जी सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद स्पिन-डाउन सतह पर तैरनेवाला को एनओआरपीए-बाउंड नी-बीड्स में जोड़ा जाता है, जहां एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन अंतर्जात आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आईएनएडी / टीआरपी / ईपीकेसी) को पकड़ने के लिए चारा के रूप में कार्य करता है। (सी) जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा कैप्चर किए गए आईएनएडी प्रोटीन परिसरों से अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए जोड़ा गया है। (डी) अत्यधिक जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े को अलग करने के लिए एल्यूटेड टीआरपी प्रोटीन को आकार-बहिष्करण कॉलम द्वारा और शुद्ध किया जाता है। लाल तीर क्रमशः टीआरपी चैनल और जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े की क्षालन स्थिति को उजागर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ग्लूटाथियोन मोतियों और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा जीएसटी-टैग टीआरपी-सीटी 1261-1275 प्रोटीन का शुद्धिकरण। (ए) आकार-बहिष्करण कॉलम (तैयारी ग्रेड) में जीएसटी-टैग टीआरपी-सीटी 1261-1275 प्रोटीन की शुद्धि प्रोफ़ाइल। अंशों को 5 एमएल / ट्यूब पर एकत्र किया जाता है। तीर की स्थिति (ट्यूब 44-48) पर अंश एकत्र किए जाते हैं और अंतर्जात टीआरपी चैनल के निम्नलिखित शुद्धिकरण के लिए केंद्रित होते हैं। (बी) कूमासी ब्लू आर 250 सना हुआ एसडीएस-पेज जेल ग्लूटाथियोन-मोती आत्मीयता शुद्धिकरण और बाद में आकार-बहिष्करण कॉलम शुद्धिकरण में जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा दिखा रहा है। तीर एसडीएस-पेज जेल में जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े की स्थिति को उजागर करता है। संक्षिप्त नाम: पी: ई कोलाई से गोली। बीएल 21 (डीई 3) 48,384 एक्स जी पर पीबीएस बफर और सेंट्रीफ्यूजेशन में होमोजेनाइजेशन के बाद सेल लाइसेट; एस: ई कोलाई से सतह पर तैरनेवाला। बीएल 21 (डीई 3) 48,384 एक्स जी पर समरूपता और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सेल लाइसेट; एफ: 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ग्लूटाथियोन मोती के साथ ऊष्मायन पिछले एस अंश के बाद प्रवाह के माध्यम से अंश; डब्ल्यू 1 और डब्ल्यू 2: पीबीएस बफर के 10 कॉलम वॉल्यूम द्वारा पहला और दूसरा धोने का अंश; बी: पुन: निलंबित ग्लूटाथियोन मोतियों पर अन-एल्यूटेड प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस-पेज जेल द्वारा क्षालन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है; ई: क्षालन बफर द्वारा ग्लूटाथियोन मोतियों से क्षालन अंश। जीएसटी-टैग प्रोटीन शोधन के लिए बफर नुस्खा तालिका 1 में वर्णित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: नी-मोती और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन का शुद्धिकरण( ए) आकार-बहिष्करण कॉलम में उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन की शुद्धि प्रोफ़ाइल। प्रवाह दर = 3 एमएल / अंशों को 5 एमएल / ट्यूब पर एकत्र किया जाता है। तीर की स्थिति (ट्यूब 44-49) पर अंशों को अंतर्जात टीआरपी चैनल के निम्नलिखित शुद्धिकरण के लिए एकत्र और केंद्रित किया जाता है। (बी) कूमासी ब्लू आर 250 दाग एसडीएस-पेज जेल नी-कॉलम शुद्धिकरण और बाद में आकार-बहिष्करण कॉलम शुद्धिकरण में अपने टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन दिखा रहा है। तीर एसडीएस-पेज जेल में उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 प्रोटीन की स्थिति पर प्रकाश डालता है। संक्षिप्त नाम: पी: ई कोलाई से गोली। बीएल 21 (डीई 3) 48,384 एक्स जी पर बाध्यकारी बफर और सेंट्रीफ्यूजेशन में होमोजेनाइजेशन के बाद सेल लाइसेट; एस: ई कोलाई से सतह पर तैरनेवाला अंश। बीएल 21 (डीई 3) 48,384 एक्स जी पर समरूपता और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सेल लाइसेट; एफ: पिछले एस अंश के बाद प्रवाह-थ्रू अंश 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नी-मोती के साथ ऊष्मायन किया जाता है; डब्ल्यू 1 और डब्ल्यू 2: वॉश बफर के 10 कॉलम वॉल्यूम द्वारा पहला और दूसरा वॉशिंग अंश; बी: क्षालन के बाद पुन: निलंबित नी-मोती पर अन-एल्यूटेड प्रोटीन; ई: क्षालन बफर द्वारा नी-मोती से क्षालन अंश। उनके टैग किए गए प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए बफर नुस्खा तालिका 2 में सूचीबद्ध है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल का शुद्धिकरण। हर कदम से एकत्र किए गए नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया जाता है और कूमासी ब्लू आर -250 डाई के साथ दाग दिया जाता है। (ए) 20817 ग्राम एस: 20,817 एक्स जी सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सिर होमोजेनेट्स का सतह पर तैरनेवाला अंश; एनओआरपीए एफ: उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े बाध्यकारी के बाद नी-मोतियों का प्रवाह-थ्रू अंश; वॉश 1 और वॉश 2: उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 बाइंडिंग के बाद लाइसिस बफर द्वारा नी-मोतियों का पहला और दूसरा धोने का अंश; 100,000 ग्राम एस: पिछले 20,817 ग्राम एस सतह पर तैरनेवाला आगे 100,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है और सतह पर तैरनेवाला एसडीएस-पेज के लिए एकत्र किया जाता है; ड्रो हेड लाइसिस एफ: 100,000 ग्राम एस नमूने के साथ इनक्यूबेशन के बाद नी-मोतियों का प्रवाह-थ्रू अंश; वॉश 3 और वॉश 4: 100,000 ग्राम एस नमूने के साथ इनक्यूबेशन के बाद लाइसिस बफर द्वारा नी-मोतियों के अंशों को धोना। (बी) टीआरपी ई 1 और ई 2: जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 खंड द्वारा पहला और दूसरा एल्यूटेड टीआरपी चैनल अंश; वॉश 5: जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 द्वारा प्रतिस्पर्धा के बाद बाध्यकारी बफर द्वारा नी-मोतियों के अंशों को धोना; एनओआरपीए ई 1 और ई 2: कैप्चर किए गए आईएनएडी / ईपीकेसी परिसरों के साथ उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़ों का पहला और दूसरा क्षालन अंश; मोती: क्षालन बफर उपचार के बाद पुन: निलंबित नी-मोती में रहने वाले अन-एल्यूटेड प्रोटीन। अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल शुद्धिकरण के लिए बफर नुस्खा तालिका 4 में वर्णित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल प्रोटीन का शुद्धिकरण। (ए) आकार-बहिष्करण कॉलम में अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल प्रोटीन की शुद्धि प्रोफ़ाइल। प्रवाह दर = 0.5 एमएल / अंशों को 0.5 एमएल / ट्यूब पर एकत्र किया गया था। तीर की स्थिति (1E8-1F2) पर अंश एकत्र किए गए और केंद्रित किए गए। (बी) आकार-बहिष्करण कॉलम शुद्धिकरण के बाद अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल प्रोटीन दिखाते हुए कूमासी नीले आर -250 दाग वाले एसडीएस-पेज जेल। शुद्ध अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल प्रोटीन की स्थिति लाल तीर द्वारा हाइलाइट की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: जीएसटी-टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़े के शुद्धिकरण के लिए आवश्यक सामग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: उनके-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े की शुद्धि के लिए आवश्यक सामग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: ड्रोसोफिला हेड्स तैयार करने के लिए आवश्यक सामग्री । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के शुद्धिकरण के लिए आवश्यक सामग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 5: ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के आकार-बहिष्करण स्तंभ शुद्धिकरण के लिए आवश्यक सामग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आईएनएडी, जिसमें पांच पीडीजेड डोमेन शामिल हैं, ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन मशीनरी का मुख्य आयोजक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि आईएनएडी पीडीजेड 3 उत्तम विशिष्टता (केडी = 0.3 μM)18 के साथ टीआरपी चैनल सी-टर्मिनल पूंछ को बांधता है। आईएनएडी पीडीजेड 45 अग्रानुक्रम एक अत्यंत उच्च बाध्यकारी आत्मीयता (केडी = 30 एनएम) के साथ एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े के साथ बातचीत करता है। ये निष्कर्ष आत्मीयता शुद्धिकरण प्लस प्रतिस्पर्धा रणनीति को डिजाइन करने के लिए एक ठोस जैव रासायनिक आधार प्रदान करते हैं, जो एनओआरपीए सीसी-पीबीएम टुकड़े को पुलडाउन चारा के रूप में उपयोग करने में सक्षम बनाता है, जबकि टीआरपी सी-टर्मिनल पूंछ (टुकड़ा 1261-1275) प्रतिस्पर्धी अभिकर्मक के रूप में कार्य करता है। इसलिए, इस पद्धति के लिए पहला महत्वपूर्ण बिंदु आईएनएडी कॉम्प्लेक्स के संयोजन तंत्र को समझना और पर्याप्त एनओआरपीए और टीआरपी टुकड़े प्राप्त करना है। इसी समय, चूंकि टीआरपी चैनल झिल्ली प्रोटीन है जिसे झिल्ली से निकालने और समाधान में स्थिर करने की आवश्यकता होती है, इसलिए डिटर्जेंट का उपयोग इस विधि का दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु है। टीआरपीचैनलों के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय डिटर्जेंट के रूप में 24,25, एन-डोडेसिल-बी-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) का उपयोग इस विधि में किया जाता है। यदि शुद्धिकरण परिणाम असंतोषजनक हैं, तो चारा प्रोटीन, प्रतियोगी प्रोटीन और डिटर्जेंट के गुणों को सावधानीपूर्वक जांचने की आवश्यकता है। इसके अलावा, टीआरपी एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा टीआरपी चैनलों की निष्कर्षण दक्षता का पता लगाया जा सकता है।

पिछले अध्ययन5 में, फ्लाई हेड अर्क से टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए महंगे स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों का उपयोग किया गया था, जो प्रयोगशाला में नियमित शुद्धिकरण को सीमित करता है। इसलिए, लागत को कम करने और उपज बढ़ाने के लिए नी-मोतियों के साथ युग्मित हिज-टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े का उपयोग करके विधि में सुधार किया गया था। वर्तमान में, बेहतर विधि में शुद्ध टीआरपी चैनल की पैदावार एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) नकारात्मक धुंधला प्रयोग करने के लिए पर्याप्त है, जिसमें शुद्ध टीआरपी चैनल टेट्रामर बनाते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है), यह दर्शाता है कि शुद्धिकरण प्रक्रिया टीआरपी चैनलों के टेट्रामर गठन को बाधित नहीं करती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल भविष्य के क्रायो-ईएम और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए संभावित रूप से उपयुक्त होगा।

हालांकि, चूंकि प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्रतियोगियों (एनओआरपीए 863-1095 टुकड़ा, टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा) में जंगली प्रकार के प्रोटीन के साथ समान बाध्यकारी संबंध हैं, इस विधि की सीमा यह है कि लक्ष्य प्रोटीन को नीचे खींचने के लिए बड़े पैमाने पर प्रतिस्पर्धी प्रोटीन और मोतियों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह उन प्रयोगशालाओं के लिए सुविधाजनक नहीं होगा जो बड़े पैमाने पर चारा शुद्ध नहीं कर सकते हैं।

इस पद्धति का एक संभावित भविष्य का अनुप्रयोग क्रायो-ईएम तकनीकों का उपयोग करके ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की संरचनात्मक जानकारी का अध्ययन करना होगा। इसके अलावा, कृत्रिम बाइलेयर लिपिड झिल्ली में शुद्ध अंतर्जात टीआरपी चैनलों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को मापना भी संभव है। इसके अलावा, इस पुनर्गठित मॉडल प्रणाली में, आईएनएडी जटिल संरचना और लिपिड संरचना को संशोधित करके शुद्ध अंतर्जात टीआरपी चैनलों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को चिह्नित करना दिलचस्प होगा। अंत में, संरचनात्मक जानकारी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के साथ संयुक्त, भविष्य में टीआरपी चैनल के गेटिंग और विनियमन तंत्र की सावधानीपूर्वक जांच की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31870746), शेन्ज़ेन बेसिक रिसर्च ग्रांट्स (जेसीवाईजे 20200109140414636), और गुआंग्डोंग प्रांत, चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 2021 ए 1515010796) द्वारा डब्ल्यूएल को समर्थित किया गया था। हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान अपनी भाषाई सहायता के लिए लेटपब (www.letpub.com) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

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References

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जैव रसायन अंक 178 प्रोटीन शोधन ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल आईएनएडी
अंतर्जात <em>ड्रोसोफिला</em> क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों की शुद्धि
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Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding,… More

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

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