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इम्युनोडेफिशिएंट चूहों के लिए CBir1 TCR ट्रांसजेनिक CD4+ T कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण द्वारा आंतों की सूजन का प्रेरण

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63293
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch

Summary

इस प्रोटोकॉल में, एक आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन-विशिष्ट टी सेल दत्तक हस्तांतरण कोलाइटिस मॉडल का वर्णन किया गया है। CD4+ T कोशिकाओं को CBir1 TCR ट्रांसजेनिक चूहों से अलग किया जाता है। ये एक immunodominant आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन CBir1 flagellin, जो प्राप्तकर्ता Rag1-/ - चूहों में स्थानांतरित कर दिया जाता है, आंतों की सूजन के लिए अग्रणी के लिए विशिष्ट हैं।

Abstract

घटनाओं में वृद्धि के साथ, सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), जो जठरांत्र संबंधी मार्ग को प्रभावित करने वाली पुरानी बीमारियां हैं, व्यक्तियों और समाज पर काफी स्वास्थ्य और वित्तीय बोझ डालती हैं। इसलिए, आईबीडी के रोगजनन और विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच करना महत्वपूर्ण है। यहां, एक आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन-विशिष्ट टी सेल ट्रांसफर कोलाइटिस मॉडल का वर्णन किया गया है। CBir1 flagellin प्रयोगात्मक बृहदांत्रशोथ और Crohn रोग के साथ रोगियों में immunodominant आंत जीवाणु एंटीजन के रूप में मान्यता प्राप्त है। CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve CD4 + T कोशिकाएं, CBir1 flagellin के लिए विशिष्ट, प्रतिरक्षा-कमी वाले Rag1-/- चूहों में दत्तक हस्तांतरण के बाद क्रोनिक कोलाइटिस को प्रेरित कर सकती हैं। रोग की गंभीरता का आकलन हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा किया जाता है। कोलोनिक लामिना प्रोपरिया में सीडी 4 + टी सेल फेनोटाइप भी निर्धारित किए जाते हैं। यह मॉडल आईबीडी के विकास से मिलता-जुलता है, जो आईबीडी के रोगजनन को चलाने वाले तंत्र की जांच करने और आईबीडी के इलाज के लिए संभावित दवाओं का परीक्षण करने के लिए एक आदर्श मुरीन मॉडल प्रदान करता है।

Introduction

सूजन आंत्र रोगों (आईबीडी), मुख्य रूप से क्रोहन रोग (सीडी) और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) सहित, जठरांत्र संबंधी मार्ग की पुरानी, पुनरावर्ती-उत्सर्जक सूजन की विशेषता है, जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करता है। आईबीडी के विकास और रोगजनन में कई कारकों को फंसाया गया है, जिसमें आनुवंशिक संवेदनशीलता, आंत माइक्रोबायोटा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं, आहार और जीवन शैली शामिल हैं2। हालांकि, आईबीडी का सटीक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आया है।

विशेष हितों में से एक आंत माइक्रोबायोटा और आंतों की सूजन को विनियमित करने में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बीच बातचीत है3। आंत माइक्रोबायोटा immunostimulatory अणुओं और एंटीजन की एक श्रृंखला प्रदान करता है, जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय कर सकते हैं4. जबकि आंतों के होमोस्टैसिस को बनाए रखने में प्रभावक टी कोशिकाओं और नियामक टी कोशिकाओं (Tregs) के बीच संतुलन महत्वपूर्ण है, आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन के लिए अत्यधिक आंतों के म्यूकोसल सीडी 4 + टी सेल प्रतिक्रिया आंतों की सूजन में योगदान देती है5,6,7। एक immunodominant आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन के रूप में, CBir1 flagellin मानव CD8,9 के रोगजनन से संबंधित किया गया है। इसके अलावा, CBir1 TCR ट्रांसजेनिक (Tg) T कोशिकाओं का स्थानांतरण प्रतिरक्षा-कमी वाले चूहों में आंतों की सूजन को प्रेरित करता है6, जो मानव आईबीडी के समान है, यह दर्शाता है कि यह टी सेल ट्रांसफर मॉडल मानव आईबीडी के तंत्र की जांच करने में मदद करता है।

यह काम Rag1 में कोलाइटिस को प्रेरित करने के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है - / - CBir1 TCR Tg nag naπve CD4 + T कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण और रोग की गंभीरता का आकलन करके चूहों। इसके अलावा, प्रत्याशित परिणाम दिखाए जाते हैं, और प्रक्रिया और समस्या निवारण के महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा की जाती है, जो शोधकर्ताओं को आंतों की सूजन के रोगजनन के तंत्र की जांच करने और आईबीडी के इलाज के लिए संभावित दवाओं का परीक्षण करने में मदद करेगा।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को टेक्सास विश्वविद्यालय की मेडिकल ब्रांच की जानवरों के उपयोग और देखभाल पर समिति के अनुसार किया गया था। CBir1 TCR Tg चूहों को बर्मिंघम में अलबामा विश्वविद्यालय के डॉ चार्ल्स एल्सन द्वारा प्रदान किया गया था। CBir1 TCR Tg चूहे मादा या पुरुष हो सकते हैं लेकिन 8-12 सप्ताह में होना चाहिए। C57BL/6 पृष्ठभूमि पर Rag1-/- चूहों को जैक्सन लेबोरेटरी 10 से प्राप्त किया गया था। रैग 1-/ - चूहों को लिंग और आयु-मिलान होना चाहिए, और या तो पुरुष या महिला का उपयोग किया जा सकता है लेकिन 8-12 सप्ताह में होना चाहिए। पूरे प्रोटोकॉल को चित्र 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

1. प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी

  1. C57BL/6 पृष्ठभूमि पर Rag1-/- चूहों को तैयार करें, जो एक ही विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त पशु सुविधा में पैदा हुआ है। शक्ति विश्लेषण 11 द्वारा प्रति समूह चूहों की संख्या की गणना करें।
    नोट: Rag1-/- चूहों में परिपक्व टी कोशिकाएं और बी cells10 नहीं हैं।
  2. कान पंच द्वारा चूहों को चिह्नित करें।
  3. टी सेल हस्तांतरण के एक ही दिन पर चूहों का वजन करें।

2. अभिकर्मकों और समाधानों की तैयारी

नोट: उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक विषाक्त, या बायोहैजार्ड हैं और उनके हैंडलिंग को सावधानी बरतने और सुरक्षा उपायों की आवश्यकता होती है।

  1. वाशिंग बफर तैयार करें: RPMI 1640 माध्यम के 500 mL में 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 mL जोड़ें। इसे अच्छी तरह से मिलाएं और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. Tris-NH4Cl Lysis बफ़र तैयार करें।
    1. समाधान भाग A तैयार करें डबल-आसुत पानी (ddH2O) के 100 mL में Tris आधार के 2.06 g को भंग करें और HCl के साथ 7.2 के लिए pH मान को समायोजित करें।
    2. समाधान तैयार करें भाग B. DdH2O के 800 mL में NH4Cl के 7.47 g को भंग करें।
    3. A और B को अच्छी तरह से मिलाएं। पीएच को मापें और यदि नहीं तो इसे 7.2 पर समायोजित करें।
    4. कुल वॉल्यूम को 1000 mL पर समायोजित करें। आटोक्लेव करें और फिर इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. अलगाव बफ़र तैयार करें।
    1. 1x PBS के 500 mL में 2.5 g BSA और EDTA के 500 μL (0.5 M, pH 8.0) जोड़ें। इसे अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. एक 0.22 μm वैक्यूम संचालित डिस्पोजेबल बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर ( सामग्री की तालिका देखें). इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. FACS बफ़र तैयार करें. वाशिंग बफर (चरण 2.1 में तैयार) के 50 मिलीलीटर में 1 एमएल एफबीएस और ईडीटीए (0.5 एम, पीएच 8.0) के 50 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. पूरा माध्यम तैयार करें। वाशिंग बफर के 45 मिलीलीटर में FBS के 5 mL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. EDTA-PBS बफ़र तैयार करें.
    1. आवश्यक EDTA-PBS बफ़र की मात्रा की गणना करें। आयतन (mL) = माउस संख्या x 20.
    2. PBS में FBS, EDTA, और HEPES की उपयुक्त मात्रा जोड़ें (FBS का 2%, EDTA का 0.5 mM, PBS में HEPES का 10 mM) ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. इसे अच्छी तरह से मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व-गर्म करें।
  7. पाचन बफर तैयार करें।
    1. आवश्यक पाचन बफर की मात्रा की गणना करें। आयतन (mL) = माउस संख्या x 10.
    2. वाशिंग बफर में FBS, Collagenase IV, और DNase I की उचित मात्रा जोड़ें (FBS का 2%, कोलेजनेस IV का 0.5 mg/mL, और वाशिंग बफर में DNase I का 10 U/mL) ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. इसे अच्छी तरह से मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व-गर्म करें।
  8. Percoll समाधान तैयार करें.
    1. 100% Percoll तैयार करें। मूल Percoll के 45 mL में 10x PBS के 5 mL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. वाशिंग बफर में 2% FBS तैयार करें। वाशिंग बफर के 49 mL में FBS के 1 mL जोड़ें।
    3. 40% Percoll Solution और 75% Percoll Solution की मात्रा को Caulculate करें। 40% Percoll Solution (mL) का आयतन = माउस संख्या x 4; 75% Percoll Solution (mL) का आयतन = माउस संख्या x 2.
      नोट:: चरण 2.1-2.5 में तैयार अभिकर्मकों/समाधानों का उपयोग चरण 3-4 में किया जाएगा, और चरण 2.6-2.8 में तैयार किए गए अभिकर्मकों का उपयोग चरण 9 में किया जाएगा। चरण 9 में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों / समाधानों को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए। 5% अतिरिक्त बफर बनाने के लिए सभी चरणों के लिए अनुशंसित है.

3. प्लीहा CBir1 TCR Tg CD4 + टी कोशिकाओं का अलगाव

  1. CO2 इच्छामृत्यु (30% -70% गैस-वायु विस्थापन दर) के साथ एक गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा CBir1 TCR Tg माउस / चूहों को Euthanize करें। 70% इथेनॉल के साथ चूहों गीला.
  2. एक ~ 1 सेमी बाएं पेट चीरा प्रदर्शन, पेट की मांसपेशियों के ऊतकों से त्वचा को दूर खींचें, पेट की मांसपेशियों के ऊतकों में ~ 3 सेमी चीरा बनाएं, और बाँझ कैंची और संदंश के साथ तिल्ली को हटा दें। प्लीहा को एक संस्कृति पकवान में रखें जिसमें 5 मिलीलीटर पूर्व-ठंडा वॉशिंग बफर (चरण 2.1 में तैयार) शामिल है।
  3. दो बाँझ कांच स्लाइड की खुरदरी सतह के साथ तिल्ली पीसें। एक 100 μm सेल छलनी के माध्यम से पारित करके एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण ( सामग्री की तालिका देखें)। पूर्व ठंड वाशिंग बफर के 5 मिलीलीटर के साथ ग्लास स्लाइड और संस्कृति पकवान कुल्ला और ट्यूब में वॉशिंग बफर हस्तांतरण।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें और पूर्व-गर्म Tris-NH4Cl Lysis बफ़र (चरण 2.2 में तैयार) प्रति तिल्ली के 5 mL के साथ कोशिकाओं resuspend। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब के लिए पूर्व ठंडा वाशिंग बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें और पूर्व-ठंडे अलगाव बफर (चरण 2.3 में तैयार) के 10 mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. कोशिकाओं की गणना करें। ट्रिपैन नीले रंग के 10 μL के साथ सेल निलंबन के 10 μL को अच्छी तरह से मिलाएं। एक स्लाइड पर मिश्रण के 10 μL लोड करें, स्वचालित सेल काउंटर में स्लाइड डालें ( सामग्री की तालिका देखें) और व्यवहार्य सेल नंबर 12 प्राप्त करें।
    नोट:: लगभग 1 x 108 कक्षइस चरण में एक दाता माउस से प्राप्त किया जा सकता है।
  7. चरण 3.6 से शेष सेल निलंबन को 350 x g पर 4 °C पर 8 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सभी supernatants को छोड़ दें।
  8. भंवर विरोधी माउस CD4 चुंबकीय कणों को अच्छी तरह से (सामग्री की तालिका देखें), सीधे 107 कोशिकाओं प्रति कणों के 50 μL जोड़ें और सेल छर्रों के साथ अच्छी तरह से मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: किसी भी अन्य वाणिज्यिक CD4 + T सेल संवर्धन किट यहाँ इस्तेमाल किया जा सकता है।
  9. एक बाँझ संग्रह ट्यूब में सेल कण निलंबन हस्तांतरण. ट्यूब में पूर्व ठंडा अलगाव बफर के 3.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए सेल पृथक्करण चुंबक ( सामग्री की तालिका देखें) पर ट्यूब रखें। ध्यान से एक 3 mL स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर supernatant बंद aspirate.
  11. सेल सेपरेशन चुंबक से ट्यूब निकालें ( सामग्री की तालिका देखें), 3.5 मिलीलीटर पूर्व-ठंडा अलगाव बफर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए चुंबक को ट्यूब रखें। ध्यान से एक 3 mL स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर supernatant बंद aspirate.
  12. चरण 3.11 को दोहराएँ।
  13. पूर्व-ठंडे FACS बफ़र के 1 mL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (चरण 2.4 में तैयार)।

4. CBir1 TCR Tg naπve CD4+ T कोशिकाओं का शुद्धिकरण

  1. चरण 3.6 के बाद कक्षों की गणना करें।
  2. यदि सेल एकाग्रता >107/mL है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए FACS बफ़र की मात्रा जोड़ें कि कक्ष एकाग्रता 107/mL ≤ है.
    नोट: ~ 1 × 107 कोशिकाओं को इस चरण में एक दाता माउस से प्राप्त किया जा सकता है।
  3. विरोधी माउस CD4-APC के 10 μL के साथ सतह मार्करों दाग, विरोधी माउस CD25-Percp / Cy5.5 के 10 μL, और विरोधी माउस CD62L-PE13,14 के 10 μL (सामग्री की तालिका देखें). धीरे से मिलाएं और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. पूर्व-ठंडे FACS बफर के 2 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। Aspirate एक 3 mL स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर सभी supernatants.
  5. चरण 4.4 को दोहराएँ।
  6. पूर्व-ठंडे FACS बफर में 40 x 106 / mL की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट:: सॉर्टर को clogging से रोकने के लिए, एक 70 μm छलनी के माध्यम से कक्षों को पास करें।
  7. DAPI के 0.1 μg/mL जोड़ें.
    नोट:: DAPI मृत कक्षों को छोड़कर के लिए उपयोग किया जाता है।
  8. सॉर्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 4 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम (चरण 2.5 में तैयार) वाले 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
  9. सॉर्टर पर कक्षों को लोड करें. शुद्धता मोड (नोजल आकार: 70 μm) में एकल व्यवहार्य naπve CD4 + T कोशिकाओं (DAPI- CD4+ CD25- CD62L + कोशिकाओं) को सॉर्ट करें; दबाव: 70 पीएसआई; इवेंट दर: 8000-12000 घटनाओं / दक्षता: 90% से अधिक (चित्रा 2)।
    नोट:: Naπve CD4+ T कक्षों CD62L की उच्च अभिव्यक्ति व्यक्त और सक्रियण मार्कर CD2513,14 की कमी है।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। एक 3 mL स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर सभी supernatants aspirate.
  11. 1x PBS के 500 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  12. चरण 3.6 के बाद कक्षों की गणना करें
    नोट: ~ 5 × 106 कोशिकाओं को इस चरण में एक दाता माउस से प्राप्त किया जा सकता है।

5. प्राप्तकर्ता चूहों में सेल स्थानांतरण

  1. 1x PBS जोड़कर CBir1 TCR Tg naπve CD4+ T कोशिकाओं को 5 x 106/mL सांद्रता में पुन: निलंबित करें।
  2. 4 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे रैग-/ - चूहों को गर्म करें ( सामग्री की तालिका देखें), और माउस अवरोधक का उपयोग करके चूहों को रोकें।
  3. अंतःशिरा रूप से 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज (27 जी) का उपयोग करके रैग-/- चूहों की पूंछ शिरा में सेल निलंबन के 200 μL को स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: एक दाता माउस से कोशिकाओं के आसपास पांच प्राप्तकर्ता चूहों को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त हैं।

6. कोलाइटिस प्रगति के दौरान नैदानिक संकेतों की निगरानी

  1. हर हफ्ते चूहों का वजन करें और सप्ताह में दो बार अवलोकन बढ़ाएं जब चूहों ने मूल वजन का >5% खोना शुरू कर दिया।
  2. धीरे से उत्तेजित होने पर चूहों की प्रतिक्रिया / चाल का निरीक्षण करें।
  3. अन्य नैदानिक असामान्यताओं का निरीक्षण करें। यानी, मुद्रा और मल स्थिरता।

7. बृहदान्त्र संग्रह और हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोरिंग

  1. वजन घटाने के एक समय बिंदु पर CO2 के साथ एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा प्राप्तकर्ता चूहों का बलिदान करें >मूल वजन का 20% या सेल हस्तांतरण के बाद 6 सप्ताह। 70% इथेनॉल के साथ चूहों गीला.
  2. एक ~ 1 सेमी वेंट्रल मिडलाइन त्वचा चीरा प्रदर्शन, पेट की मांसपेशियों के ऊतकों से त्वचा को दूर खींचें, पेट की मांसपेशियों के ऊतकों में एक ~ 3 सेमी चीरा बनाने, cecum की पहचान करें, और बाँझ कैंची और संदंश के साथ पूरे बृहदान्त्र को हटा दें। एक संस्कृति पकवान में पूर्व ठंडा PBS के साथ बृहदान्त्र गीला.
  3. बृहदान्त्र लंबाई incise और पूर्व ठंड PBS के साथ यह कुल्ला. बृहदान्त्र अनुदैर्ध्य रूप से 1/3 काटें।
  4. बृहदान्त्र पट्टी को एक कागज तौलिया में रखें जिसमें ल्यूमिनल साइड ऊपर की ओर हो। एक toothpick15 का उपयोग कर स्विस रोलिंग प्रदर्शन.
  5. बृहदान्त्र स्विस को एक कैसेट में रखें और कैसेट को 24 h16 के लिए 10% बफ़र्ड फॉर्मेलिन में रखें, इसके बाद एक स्वचालित प्रोसेसर ( सामग्री की तालिका देखें) और पैराफिन एम्बेडिंग का उपयोग करके निर्जलीकरण किया गया।
  6. एक माइक्रोटोम पर 5 μm ऊतक वर्गों को काटें, स्लाइड पर घुड़सवार, और Hematoxylin और eosin (H & E) stain17 ( सामग्री की तालिका देखें) का प्रदर्शन करें।
  7. अधिकतम 12 के लिए छह पैरामीटर में से प्रत्येक के लिए स्कोर के संयोजन से हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोर निर्धारित करें। लामिना प्रोपरिया सूजन (सामान्य, 0; हल्के, 1; मध्यम, 2; गंभीर, 3); गोब्लेट सेल हानि (सामान्य, 0; हल्के, 1; मध्यम, 2; गंभीर, 3); असामान्य क्रिप्ट (सामान्य, 0; हाइपरप्लास्टिक, 1; अव्यवस्था, 2; क्रिप्ट हानि, 3); क्रिप्ट फोड़े (अनुपस्थित, 0; वर्तमान, 1); म्यूकोसल क्षरण और अल्सरेशन (सामान्य, 0; हल्के, 1; मध्यम, 2; गंभीर, 3); और submucosal परिवर्तन (कोई नहीं, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.

8. अलगाव और आंतों लामिना propria कोशिकाओं के दाग

  1. चरण 7.3 के बाद, बृहदान्त्र के एक और 2/3 को 0.5-1 सेमी टुकड़ों में काट लें और इसे पूर्व-ठंडे पीबीएस के साथ धो लें।
  2. बृहदान्त्र खंडों को 20 मिलीलीटर पूर्व-गर्म ईडीटीए-पीबीएस बफर में 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 30 मिनट के लिए 250 आरपीएम मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूब भंवर, एक बाँझ छलनी (व्यास: 0.01 इंच) के माध्यम से पारित करके supernatants त्याग, और 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूर्व ठंडा PBS के 20 मिलीलीटर में बृहदान्त्र खंडों resuspend.
  4. चरण 8.3 को दो बार दोहराएं।
  5. बृहदान्त्र खंडों को एक सी ट्यूब में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें 10 मिलीलीटर पूर्व-गर्म पाचन बफर होता है।
  6. एक Dissociator मशीन पर ट्यूब रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और 25 मिनट के लिए "37C_m_LPDK_1" के कार्यक्रम के तहत इनक्यूबेट करें।
    नोट: "37C_m_LPDK_1" Dissociator मशीन में एक मानक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम है जिसका उपयोग नमूनों को हिलाने और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए किया जाता है।
  7. जांचें कि क्या ऊतक पूरी तरह से पच गया है, जिसका अर्थ है कि ऊतक का कोई टुकड़ा पाचन बफर में नहीं है। यदि नहीं, तो "37C_m_LPDK_1" के कार्यक्रम को दोहराएं।
  8. एक धातु छलनी और 100 μL छलनी के माध्यम से पारित करके supernatant ले लीजिए. पूर्व ठंडा PBS के 10 मिलीलीटर के साथ कुल्ला.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। एस्पिरेट सभी supernatants.
  10. 40% Percoll Solution के 4 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और इसे अच्छी तरह से मिलाएं (चरण 2.8 में तैयार)।
  11. एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 75% Percoll समाधान के 2 mL करने के लिए resuspended कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  12. 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 850 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें (त्वरण रैंप: 0; ब्रेक रैंप: 0)।
  13. ध्यान से एक 3 mL स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर शीर्ष परत पर वसा को हटाने और एक 50 mL ट्यूब में धोने बफर के 20 mL करने के लिए सेल परत हस्तांतरण।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। पूर्ण माध्यम के 1 mL में सभी supernatants और resuspend कोशिकाओं को छोड़ दें।
  15. चरण 3.6 के बाद कक्षों की गणना करें।
  16. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को बीज दें, उन्हें 50 एनजी / एमएल के साथ सक्रिय करें Phorbol-12-myristate 13-एसीटेट और 750 एनजी / एमएल आयोनोमाइसिन के 2 घंटे के लिए, इसके बाद 3 घंटे के लिए ब्रेफेल्डिन ए के 5 μg / mL के साथ इनक्यूबेशन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक विषाक्त हैं, और उनकी हैंडलिंग को सावधानी बरतने और सुरक्षा उपायों की आवश्यकता होती है।
  17. एक FACS ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, FACS बफर के 2 mL जोड़ें, और 4 °C पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें।
  18. 12.5 μg / mL एंटी-माउस CD16/3219 के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) FACS बफर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एफसी रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए।
  19. लाइव / मृत और सतह मार्कर के लिए दाग।
    1. FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें।
    2. लाइव डाई और सतह मार्करों के साथ कोशिकाओं को दाग (यानी, विरोधी माउस CD3 और विरोधी माउस CD4 एंटीबॉडी)20 ( सामग्री की तालिका देखें) FACS बफर में 30 मिनट के लिए अनुकूलित एकाग्रता पर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर.
      नोट: उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक विषाक्त हैं, और उनकी हैंडलिंग को सावधानी बरतने और सुरक्षा उपायों की आवश्यकता होती है।
  20. सेलुलर और परमाणु धुंधला प्रदर्शन.
    1. FACS बफर के 2 mL जोड़ें और 4 °C पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन centrifuge। supernatant को छोड़ दें।
    2. Permeabilize और प्रतिलेखन कारक फिक्स काम समाधान के 200 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को ठीक करें ( सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए.
    3. पर्म बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें।
    4. सेलुलर और परमाणु मार्करों के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (यानी, विरोधी माउस IFNπ, विरोधी माउस IL-17A, और विरोधी माउस Foxp3 एंटीबॉडी)20 पर्म बफर में 20 ( सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर 30 मिनट-1 घंटे के लिए।
    5. पर्म बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें।
    6. FACS बफर के 1 mL जोड़ें और 4 °C पर 8 मिनट के लिए 350 x g पर सेल निलंबन centrifuge। supernatant को छोड़ दें।
  21. FACS बफर के 200 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूनों को चलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

लगभग 5 x 106 CBir1 TCR Tg naπve CD4+ T कोशिकाओं प्रति तिल्ली एक वयस्क CBir1 TCR Tg माउस से अलग थे। CBir1 TCR Tg nag naπve CD4+ T कोशिकाओं का स्थानांतरण प्राप्तकर्ता Rag1-/- चूहों में क्रोनिक कोलाइटिस को प्रेरित करता है। सेल हस्तांतरण के बाद, आंतों की सूजन की प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए नैदानिक संकेतों की निगरानी की गई, जिसमें वजन घटाने, मल स्थिरता और कूबड़ मुद्रा शामिल थी। जैसा कि अपेक्षित था, चूहों ने सेल ट्रांसफर के बाद तीन सप्ताह के आसपास वजन कम करना शुरू कर दिया, और वजन सेल ट्रांसफर के बाद छह सप्ताह के मूल वजन के लगभग 80% -85% तक पहुंच गया (चित्रा 3)। इसके अतिरिक्त, चूहों ने सेल ट्रांसफर के बाद 3-4 सप्ताह के आसपास दस्त दिखाया और गंभीर कोलाइटिस विकसित होने पर कूबड़ मुद्रा का प्रदर्शन किया। बृहदान्त्र की सकल आकृति विज्ञान दिखाया गया था, और कोलाइटिस की गंभीरता का आकलन हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोर द्वारा किया गया था जब चूहों की बलि दी गई थी। CBir1 TCR Tg naπve CD4 + T कोशिकाओं को प्राप्त करने वाले चूहों ने सेल ट्रांसफर के बाद 6 सप्ताह की छोटी बृहदान्त्र लंबाई दिखाई (चित्रा 4 ए)। प्राप्तकर्ता चूहों ने आंतों के लामिना प्रोपरिया 4 सप्ताह के बाद सेल ट्रांसफर (चित्रा 4 सी), गोब्लेट सेल हानि और आंतों के उपकला सेल हाइपरप्लासिया 5 सप्ताह के बाद सेल ट्रांसफर (चित्रा 4 डी) में अधिक सेल घुसपैठ का प्रदर्शन किया, और म्यूकोसल क्षरण और भड़काऊ सेल घुसपैठ बृहदान्त्र के सबम्यूकोसा में 6 सप्ताह के बाद सेल ट्रांसफर (चित्रा 4 एफ)। उसी समय, अकेले पीबीएस प्राप्त करने वाले रैग 1-/- चूहों में कोई सूजन नहीं थी (चित्रा 4 बी)। इसके अलावा, छोटी आंत में कोई सूजन नहीं है, लेकिन सीकम में सूजन है। इसके अलावा, कोलोनिक लामिना प्रोपरिया में सीडी 4 + टी सेल फेनोटाइप्स को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। गेटिंग रणनीति को दिखाया गया है (चित्र5ए-ई)। CBir1 TCR Tg naπve CD4+ T कोशिकाओं को IFNπ+ Th1 कोशिकाओं, IL-17A + Th17 कोशिकाओं, IFNπ + IL-17 + CD4 + T कोशिकाओं (चित्रा 5F), और Foxp3 + Treg कोशिकाओं में विकसित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रेरण कोलाइटिस की प्रक्रिया और रोग की गंभीरता का आकलन। प्लीहा CD4 + T कोशिकाओं को चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके CBir1 TCR ट्रांसजेनिक चूहों से अलग किया गया था, और फिर छँटाई द्वारा naπve T कोशिकाओं को शुद्ध किया गया था। CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं को तब अंतःशिरा रूप से प्राप्तकर्ता Rag1-/- चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया था। जब चूहों को सेल ट्रांसफर के बाद छह सप्ताह के आसपास बलिदान किया गया था, तो कोलाइटिस की गंभीरता का आकलन हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोर द्वारा किया गया था। कोलोनिक लामिना प्रोपरिया में सीडी 4 + टी सेल फेनोटाइप्स को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं छँटाई के लिए गेटिंग रणनीति. व्यवहार्य एकल CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं को मलबे (ए), गैर-एकल कोशिकाओं (बी-सी), मृत कोशिकाओं (डी), और सक्रिय कोशिकाओं (ई-एफ) को छोड़कर शुद्ध किया गया था। उप-जनसंख्या (जी) में दिखाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Rag1-/- चूहों के वजन में परिवर्तन T सेल स्थानांतरण के बाद। 1 x 106 CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं को Rag1-/- चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और PBS प्राप्त करने वाले Rag1-/- चूहों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। माउस वजन हर हफ्ते दर्ज किया गया था। डेटा एसडी ± मतलब में प्रस्तुत किए गए थे; छात्र का टी-टेस्ट; पी<0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Groger morphology और Hematoxylin और eosin Rag1 से बृहदान्त्र के दाग- / - चूहों CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं. (A) प्राप्तकर्ता चूहों को सेल हस्तांतरण के बाद छह सप्ताह की बलि दी गई थी, और बृहदान्त्र की सकल आकृति विज्ञान दिखाया गया था। (B-E) प्राप्तकर्ता चूहों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया गया था, और रैग 1- / - चूहों को नियंत्रण के रूप में पीबीएस प्राप्त हुआ। बृहदान्त्र Hematoxylin और eosin धुंधला के लिए संसाधित किया गया था. बृहदान्त्र के हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन स्टेनिंग की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार = 200 μm.(F) हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोर निर्धारित किए गए थे। डेटा को एसडी ± माध्य में प्रस्तुत किया गया था। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: रैग के कोलोनिक लामिना प्रोपरिया में सीडी 4 + टी सेल फेनोटाइप्स - / - चूहों को CBir1 TCR ट्रांसजेनिक naπve T कोशिकाओं को प्राप्त करना। जब प्राप्तकर्ता चूहों को सेल ट्रांसफर के बाद 6 सप्ताह का बलिदान दिया गया था, तो कोलोनिक लामिना प्रोपरिया कोशिकाओं को सीडी 4 + टी सेल फेनोटाइप्स को धुंधला करने के लिए अलग किया गया था। (A-E) टी सेल फेनोटाइप के विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। (F-G) (एफ) IL-17A + CD4 + T कोशिकाओं, IFNπ + CD4 + T कोशिकाओं, IL-17 + IFNπ + CD4 + T कोशिकाओं, और (G) Foxp3 + Tregs प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यद्यपि इस कोलाइटिस मॉडल की पुनरुत्पादकता के लिए हर कदम आवश्यक है, लेकिन कई महत्वपूर्ण कदम हैं। प्राप्तकर्ता रैग-/- चूहों को आंतों की सूजन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त व्यवहार्य नेव सीडी 4 + टी कोशिकाएं प्राप्त करनी चाहिए। हम MLNs के बजाय भोले CD4 + टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए तिल्ली का इस्तेमाल किया. क्योंकि MLNs में भोले CD4 + T कोशिकाओं की उपज प्लीहा की तुलना में बहुत कम है। CD62L अत्यधिक भोली टी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और CD44 और CD25 T cells13,14 के सक्रियण मार्कर हैं। इस अध्ययन में, हमने पहली बार तिल्ली से सीडी 4 + टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंटी-सीडी 4 चुंबकीय मोतियों का उपयोग किया। फिर हमने भोले CD4+ T cells13,14 के अलगाव के लिए एंटी-CD4, एंटी-CD62L, और एंटी-CD25 एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग किया। शोधकर्ता भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए अन्य मार्करों का उपयोग कर सकते हैं। CD45RBhi भी भोले टी कोशिकाओं का मार्कर है. CD45RBhi CD25- CD4+ T कोशिकाओं का उपयोग आमतौर पर जंगली-प्रकार के गैर-TCR ट्रांसजेनिक T cells23 की भोली T कोशिकाओं के रूप में किया जाता है। इसलिए, प्राप्तकर्ता चूहों में कोशिकाओं को सॉर्ट करने और टी कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन की तकनीकें आवश्यक हैं। एक टेम्पलेट के रूप में गेटिंग प्रोटोकॉल की स्थापना कम त्रुटियों के साथ प्रयोगों को गति देने में सहायक है। कोशिका मृत्यु से बचने के लिए, कोशिकाओं को हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, डीएपीआई के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए क्योंकि डीएपीआई बरकरार सेल झिल्ली में पारगमन नहीं कर सकता है, जिससे यह एक उत्कृष्ट मृत सेल प्रोब 24 बन जाता है। पूंछ नसों के फैलाव को प्रोत्साहित करने के लिए चूहों को गर्म करना अंतःशिरा इंजेक्शन के लिए बेहतर शिरा दृश्यता प्रदान करता है। सभी प्रक्रियाओं को प्रशिक्षित शोधकर्ताओं द्वारा किए जाने की सिफारिश की जाती है।

कई कारक कोलाइटिस मॉडल के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, जिस पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, प्राप्तकर्ता Rag1-/- चूहों को उम्र और लिंग-मिलान किया जाना चाहिए। CD45RBHI T सेल ट्रांसफर मॉडल में, पुरुष और महिला दाताओं से टी कोशिकाओं को पुरुष रैग-/ प्राप्तकर्ताओं को स्थानांतरित किया जा सकता है, जबकि महिला प्राप्तकर्ताओं का उपयोग करते समय केवल महिला दाताओं का उपयोग किया जा सकता है23। हालांकि, हम पुरुष और महिला प्राप्तकर्ताओं के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखते हैं। प्राप्तकर्ता चूहे या तो मादा या पुरुष हो सकते हैं, और पुरुष दाताओं से टी कोशिकाएं भी महिला प्राप्तकर्ताओं में कोलाइटिस को प्रेरित कर सकती हैं। चूंकि वजन परिवर्तन कोलाइटिस प्रगति का एक मूल्यवान संकेतक है, इसलिए एक स्थिर वजन रेखा पेश करने के लिए 8-12 सप्ताह के बीच प्राप्तकर्ता चूहों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इन प्राप्तकर्ता चूहों को नस्ल और पशु सुविधा के एक ही कमरे में रखा जाना चाहिए क्योंकि माइक्रोबायोटा कोलाइटिस विकास को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है25। कोलाइटिस विकसित करने का समय तब भिन्न होता है जब CBir1 TCR Tg भोले CD4 T कोशिकाओं की विभिन्न संख्याओं को स्थानांतरित किया जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, कम कोशिकाओं को कोलाइटिस के प्रेरण के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है, और कोशिकाओं की एक उच्च संख्या को कोलाइटिस के प्रेरण के लिए कम समय की आवश्यकता होती है। प्रति प्राप्तकर्ता माउस 1 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि प्राप्तकर्ता चूहों ने कोलाइटिस के नैदानिक संकेतों का प्रदर्शन किया है ~ 2-3 सप्ताह के बाद सेल स्थानांतरण और अपेक्षाकृत गंभीर कोलाइटिस ~ 6 सप्ताह पोस्ट सेल हस्तांतरण विकसित करते हैं। इसके अलावा, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन की तुलना में, पूंछ की नस में कोशिकाओं का अंतःशिरा इंजेक्शन अधिक सुसंगत कोलाइटिस को प्रेरित करता है। कोलोनिक लामिना प्रोपरिया कोशिकाओं के अलगाव के लिए, बृहदान्त्र ऊतकों को सूखा नहीं होना चाहिए; अन्यथा, यह कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता को कम कर देगा। विशेष चिंताओं में से एक यह है कि कोलाइटिस की अवधि बदल जाएगी यदि प्राप्तकर्ता चूहों को आनुवंशिक-संशोधित CBir1 TCR Tg T कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित कर दिया जाता है या दवाओं के साथ इलाज किया जाता है26। इसके अलावा, CBir1 TCR Tg T कोशिकाएं अन्य प्रतिरक्षा-कमी वाले चूहों में आंतों की सूजन को भी प्रेरित करती हैं, जैसे कि TCRπ / δ - / - चूहों, जिनमें टी कोशिकाओं की कमी होती है27।

जैसा कि साक्ष्य जमा करना आईबीडी के रोगजनन में आंत बैक्टीरियल एंटीजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण भूमिका को इंगित करता है, एक परिभाषित आंत बैक्टीरियल एंटीजन के लिए विशिष्ट टी कोशिकाओं का उपयोग करके अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि आंत जीवाणु एंटीजन कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रेरित करता है। आंत माइक्रोबायोटा एंटीजन CBir1 फ्लैगेलिन जठरांत्र संबंधी मार्ग में प्रचुर मात्रा में है, जो IBD8,9 के रोगजनन से संबंधित है। यह कोलाइटिस मॉडल आईबीडी की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं जैसा दिखता है, जिसमें दस्त, वजन घटाने, हिस्टोपैथोलॉजिकल खोज और असामान्य आंतों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। इसलिए, यह कोलाइटिस मॉडल मानव आईबीडी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है और आईबीडी के लिए उपचार का मूल्यांकन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। दिलचस्प बात यह है कि, Chiaranunt et al. के हाल के काम ने संकेत दिया कि माइक्रोबायोटा CBir 1 एंटीजन के लिए टी सेल विशिष्टता अकेले टी सेल सक्रियण और कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है। यह जंगली प्रकार के CBir1 TCR Tg T कोशिकाओं द्वारा प्रमाणित है जो रैग-/- प्राप्तकर्ताओं में कोलाइटिस को प्रेरित करते हैं, जबकि रैग-/- CBir1 T कोशिकाओं ने अपने पशु सुविधा में कोलाइटिस को प्रेरित नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि विशिष्ट आंत बैक्टीरियल एंटीजन का जवाब देने वाली आंत टी कोशिकाओं को अन्य परस्पर संबंधित कॉमेन्सल बैक्टीरिया की आवश्यकता हो सकती है, उदाहरण के लिए, हेलिकोबैक्टर एसपीपी, एक सहायक के रूप में कार्य करने के लिए 28 . इस मॉडल का एक रोमांचक पहलू यह है कि विभिन्न टी सेल सबसेट, अर्थात् Th1, Th17, और Treg कोशिकाएं, कोलिटिक प्राप्तकर्ता चूहों के लामिना प्रोपरिया में मौजूद हैं, जो न केवल प्रभावकारी टी कोशिकाओं की भूमिकाओं की जांच करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, बल्कि कोलाइटिस 29 के रोगजनन में Tregs भी प्रदान करता है।

हालांकि, जैसा कि इस कोलाइटिस मॉडल को आंत माइक्रोबायोटा-विशिष्ट टी कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता की जाती है, इस कोलाइटिस मॉडल के लिए एक सीमा यह है कि कोलाइटिस के प्रेरण की अवधि आंत माइक्रोबायोटा के आधार पर विभिन्न पशु सुविधाओं में भिन्न हो सकती है।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास परस्पर विरोधी वित्तीय, पेशेवर या व्यक्तिगत हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा भाग में समर्थित किया गया था DK125011, AI150210, और DK124132, टेक्सास सिस्टम एसटीएआर पुरस्कार विश्वविद्यालय (Y.C.), और गैल्वेस्टन में टेक्सास मेडिकल ब्रांच विश्वविद्यालय (W.Y.) से जेम्स डब्ल्यू मैकलॉफलिन फैलोशिप फंड। चित्र1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter MilliporeSigma SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
100-µm strainer BD Biosciences 352360
3-mL Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32 Biolegend 101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 Biolegend 102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 Biolegend 100327
Anti-Mouse CD4 APC Biolegend 100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles BD Biosciences 551539
Anti-Mouse CD4-BV421 Biolegend 100544
Anti-Mouse CD62L-PE Biolegend 104408
Anti-Mouse Foxp3-PE ThermoFisher 12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC Biolegend 505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 Biolegend 506922
Automated Cell Counter Bio-rad TC20
Brefeldin A BD Biosciences 555029
BSA Fisher Bioreagents BP1600-1
C tube Miltenyi 130-093-237
Cell Separation Magnet BD Biosciences 552311
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Dissociator Machine Miltenyi 130-096-427
DNase I Sigma-Aldrich
EDTA Corning 46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0) Corning 46-034-CI
FBS R&D Systems S11550
Flow cytometer BD Biosciences LSD Fortessa
Heat Lamp CoverShield BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit Abcam ab245880
Insulin Syringes BD Biosciences 329412
Ionomycin ThermoFisher I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit ThermoFisher L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers ThermoFisher SHKE6000
NH4Cl Thermo Scientific A687-500
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
RPMI 1640 Medium Cytiva HyClone SH3002702
Sorter BD Biosciences Arial Fusion
Tissue Automatic Processor ThermoFisher STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette Fisher Healthcare 22048142
Tris Base Thermo Scientific BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) Biolegend 424401

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References

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चिकित्सा अंक 178
इम्युनोडेफिशिएंट चूहों के लिए CBir1 TCR ट्रांसजेनिक CD4<sup>+</sup> T कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण द्वारा आंतों की सूजन का प्रेरण
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Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction … More

Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (178), e63293, doi:10.3791/63293 (2021).

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