Summary
В этом протоколе описана модель антиген-специфического переноса Т-клеток кишечной микробиоты. CD4+ Т-клетки выделены из трансгенных мышей CBir1 TCR. Они специфичны для иммунодоминантного антигена микробиоты кишечника CBir1 флагеллина, который переносится в реципиента Rag1-/- мышей, что приводит к воспалению кишечника.
Abstract
С ростом заболеваемости воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), которые являются хроническими заболеваниями, поражающими желудочно-кишечный тракт, налагают значительную медицинскую и финансовую нагрузку на отдельных лиц и общество. Поэтому крайне важно исследовать механизмы, лежащие в основе патогенеза и развития ВЗК. Здесь описана модель переноса антиген-специфического Т-клеточного трансферного колита микробиоты кишечника. Флагеллин CBir1 был признан иммунодоминантным бактериальным антигеном кишечника у экспериментального колита и пациентов с болезнью Крона. Трансгенные CD4+ Т-клетки CBir1 TCR, специфичные для флагеллина CBir1, могут вызывать хронический колит после принятия у иммунодефицитных мышей Rag1-/- mice. Тяжесть заболевания оценивается по гистопатологии. Также определяются фенотипы CD4+ Т-клеток в проприях толстой кишки. Эта модель очень напоминает разработку ВЗК, которая обеспечивает идеальную мышиную модель для исследования механизмов, приводящих к патогенезу ВЗК, и тестирования потенциальных лекарств для лечения ВЗК.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), в основном включающие болезнь Крона (БК) и язвенный колит (УК), характеризуются хроническим, рецидивирующе-ремиттирующим воспалением желудочно-кишечного тракта, затрагивающим миллионы людей во всем мире1. Несколько факторов были вовлечены в развитие и патогенез ВЗК, включая генетическую восприимчивость, микробиоту кишечника, иммунные реакции, диету и образ жизни2. Однако точный механизм ВЗК до сих пор до конца не изучен.
Одним из конкретных интересов является взаимодействие между кишечной микробиотой и иммунными реакциями хозяина в регулировании воспаления кишечника3. Микробиота кишечника обеспечивает ряд иммуностимулирующих молекул и антигенов, которые могут активировать иммунные реакции4. В то время как баланс между эффекторными Т-клетками и регуляторными Т-клетками (Tregs) имеет решающее значение для поддержания кишечного гомеостаза, чрезмерный ответ CD4 + Т-клеток слизистой оболочки кишечника на антигены микробиоты кишечника способствует воспалению кишечника5,6,7. Как иммунодоминантный антиген микробиоты кишечника, флагеллин CBir1 был связан с патогенезом CD8,9 человека. Кроме того, перенос трансгенных (Tg) Т-клеток CBir1 TCR вызывает воспаление кишечника у мышей с иммунодефицитом6, очень напоминая человеческий ВЗК, что указывает на то, что эта модель переноса Т-клеток помогает исследовать механизмы ВЗК человека.
В этой работе описан подробный протокол индуцирования колита у мышей Rag1-/- путем переноса CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клеток и оценки тяжести заболевания. Кроме того, показаны ожидаемые результаты, обсуждаются критические этапы процедуры и устранения неполадок, которые помогут исследователям исследовать механизмы патогенеза воспаления кишечника и протестировать потенциальные препараты для лечения ВЗК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с Комитетом медицинского отделения Техасского университета по использованию и уходу за животными. Мыши CBir1 TCR Tg были предоставлены доктором Чарльзом Элсоном из Университета Алабамы в Бирмингеме. Мыши CBir1 TCR Tg могут быть самками или самцами, но должны быть в 8-12 недель. Мыши Rag1-/- на фоне C57BL/6 были получены из лаборатории Джексона10. Мыши Rag1-/- должны соответствовать полу и возрасту, и могут использоваться как самцы, так и самки, но должны быть в 8-12 недель. Весь протокол обобщен на рисунке 1.
1. Подготовка мышей-реципиентов
- Приготовьте Rag1-/- мышей на фоне C57BL/6, выведенных в том же конкретном животном учреждении, свободном от патогенов. Рассчитайте количество мышей в группе с помощью анализа мощности11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши Rag1-/- не имеют зрелых Т-клеток и В-клеток10. - Пометьте мышей ударом на слух.
- Взвешивайте мышей в тот же день переноса Т-клеток.
2. Приготовление реагентов и растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые реагенты токсичны или опасны, и их обращение требует мер предосторожности и безопасности.
- Подготовьте промывочный буфер: добавьте 5 мл 100x пенициллина-стрептомицина в 500 мл среды RPMI 1640. Тщательно перемешайте и храните при температуре 4 °C.
- Приготовьте буфер лизиса Tris-NH4Cl.
- Приготовить раствор Часть А. Растворить 2,06 г основы Tris в 100 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) и отрегулировать значение рН до 7,2 с HCl.
- Приготовить раствор Часть В. Растворить 7,47 г NH4Cl в 800 мл ddH2O.
- Тщательно перемешайте А и В. Измерьте pH и отрегулируйте его до 7,2, если нет.
- Отрегулируйте общий объем до 1000 мл. Автоклав, а затем храните его при 4 °C.
- Подготовьте буфер изоляции.
- Добавьте 2,5 г BSA и 500 мкл ЭДТА (0,5 М, рН 8,0) в 500 мл 1x PBS. Тщательно перемешайте.
- Отфильтруйте раствор через одноразовый фильтр для бутылок с вакуумным приводом 0,22 мкм (см. Таблицу материалов). Храните при температуре 4 °C.
- Подготовьте буфер FACS. Добавьте 1 мл FBS и 50 мкл ЭДТА (0,5 М, рН 8,0) в 50 мл промывочного буфера (подготовленного на этапе 2.1). Тщательно перемешайте и храните при температуре 4 °C.
- Подготовьте полный носитель. Добавьте 5 мл FBS в 45 мл промывочного буфера. Тщательно перемешайте и храните при температуре 4 °C.
- Подготовьте буфер EDTA-PBS.
- Рассчитайте необходимый объем буфера EDTA-PBS. Объем (мл) = номер мыши x 20.
- Добавьте соответствующий объем FBS, EDTA и HEPES в PBS (2% FBS, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES в PBS) (см. Таблицу материалов).
- Тщательно перемешайте и предварительно нагрейте на водяной бане при температуре 37 °C.
- Подготовьте буфер пищеварения.
- Рассчитайте необходимый объем буфера пищеварения. Объем (мл) = номер мыши x 10.
- Добавьте соответствующий объем FBS, коллагеназы IV и ДНКазы I в моющий буфер (2% FBS, 0,5 мг/мл коллагеназы IV и 10 Ед/мл ДНКазы I в буфере промывки) (см. Таблицу материалов).
- Тщательно перемешайте и предварительно нагрейте на водяной бане при температуре 37 °C.
- Приготовьте раствор Перколла.
- Приготовьте 100% Percoll. Добавьте 5 мл 10x PBS в 45 мл оригинального Percoll (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте 2% FBS в буфере для стирки. Добавьте 1 мл FBS в 49 мл промывочного буфера.
- Колкуляция в объеме 40 % раствора Перколла и 75 % раствора Перколла. Объем 40% раствора Перколла (мл) = число мыши x 4; Объем 75% раствора Перколла (мл) = число мыши x 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты/растворы, приготовленные на этапах 2.1-2.5, будут использоваться на этапах 3-4, а реагенты/растворы, приготовленные на этапах 2.6-2.8, будут использоваться на этапе 9. Все реагенты/растворы, используемые на этапе 9, должны быть свежеприготовленными. Для всех этапов рекомендуется сделать 5% дополнительного буфера.
3. Выделение селезеночных CBir1 TCR Tg CD4+ Т-клеток
- Эвтаназия CBir1 TCR Tg мышей / мышей путем вывиха шейки матки с эвтаназией CO2 (30%-70% скорость вытеснения газа и воздуха). Смочите мышей 70% этанолом.
- Выполните ~ 1 см левый разрез живота, оттяните кожу от брюшной мышечной ткани, сделайте разрез ~ 3 см в брюшной мышечной ткани и удалите селезенку стерильными ножницами и щипцами. Поместите селезенку в культуральную посуду, содержащую 5 мл предварительно холодного промывочного буфера (приготовленного на этапе 2.1).
- Измельчите селезенку шероховатой поверхностью двух стерильных стеклянных слайдов. Перенесите клеточную суспензию в 50-литровую центрифужную трубку, пройдя через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм (см. Таблицу материалов). Промойте стеклянные горки и посуду для культивирования 5 мл предварительно холодного промывочного буфера и переложите буфер стирки в трубку.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки с 5 мл предварительно нагретого буфера лизиса Tris-NH4Cl (приготовленного на стадии 2.2) на селезенку. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Добавьте в пробирку 10 мл предварительно холодного промывочного буфера.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки с 10 мл предварительно холодного изоляционного буфера (подготовленного на этапе 2.3).
- Подсчитайте ячейки. Тщательно смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипан-синего. Загрузите 10 мкл смеси на слайд, вставьте слайд в автоматический счетчик ячеек (см. Таблицу материалов) и получите жизнеспособную ячейку No12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 1 x 108 клеток может быть получено от одной мыши-донора на этом этапе. - Центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию со стадии 3,6 при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте все супернатанты.
- Тщательно вращайте антимышечные магнитные частицы CD4 (см. Таблицу материалов), непосредственно добавляйте 50 мкл частиц на 107 клеток и тщательно смешивайте с гранулами клеток. Инкубировать в течение 30 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно использовать любой другой коммерческий комплект для обогащения CD4+ Т-клеток. - Переложите клеточно-частицевую суспензию в стерильную коллекторную трубку. Добавьте в пробирку 3,5 мл предварительно холодного изоляционного буфера.
- Поместите трубку на магнит разделения ячеек (см. Таблицу материалов) на 8 мин при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант с помощью переносной пипетки объемом 3 мл.
- Извлеките трубку из магнита разделения ячеек (см. Таблицу материалов), повторно суспендируйте ячейки с 3,5 мл предварительно холодного изоляционного буфера и поместите трубку в магнит на 4 минуты при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант с помощью переносной пипетки объемом 3 мл.
- Повторите шаг 3.11.
- Повторно суспендируют клетки 1 мл предварительно холодного буфера FACS (подготовленного на этапе 2.4).
4. Очистка CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клеток
- Подсчитайте ячейки после шага 3.6.
- Если концентрация в клетке составляет >107 /мл, добавьте объем буфера FACS, чтобы убедиться, что концентрация в клетке составляет ≤ 107 / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: ~1 × 107 клеток могут быть получены от одной мыши-донора на этом этапе. - Окрашивают поверхностные маркеры 10 мкл антимышечного CD4-APC, 10 мкл антимышечного CD25-Percp/Cy5.5 и 10 мкл антимышечного CD62L-PE13,14 (см. Таблицу материалов). Осторожно перемешать и инкубировать в течение 30 мин при 4 °C в темноте.
- Промыть ячейки 2 мл предварительно холодного буфера FACS. Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Аспирируйте все супернатанты, используя 3 мл трансферной пипетки.
- Повторите шаг 4.4.
- Повторное суспендирование клеток до концентрации 40 х 106/мл в предварительно холодном буфере FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить засорение сортировщика, пропустите ячейки через ситечко 70 мкм. - Добавьте 0,1 мкг/мл DAPI.
ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI используется для исключения мертвых клеток. - Подготовьте 15 мл центрифужных трубок, содержащих 4 мл готовой среды (подготовленной на стадии 2.5) для сбора отсортированных клеток.
- Загрузите ячейки на сортировщик. Сортировка одиночных жизнеспособных CD4+ Т-клеток (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ячеек) в режиме чистоты (размер сопла: 70 мкм; Давление: 70 фунтов на квадратный дюйм; Скорость события: 8000-12000 событий/с; Эффективность: выше 90%) (Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Naϊve CD4+ Т-клетки экспрессируют высокую экспрессию CD62L и не имеют маркера активации CD2513,14. - Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Аспирируйте все супернатанты, используя 3 мл transfer pipette.
- Повторное суспендирование клеток в 500 мкл 1x PBS.
- Подсчет ячеек после шага 3.6
ПРИМЕЧАНИЕ: ~5 × 106 клеток могут быть получены от одной мыши-донора на этом этапе.
5. Передача клеток мышам-реципиентам
- Повторное суспендирование CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клеток до концентрации 5 x 106/мл путем добавления 1x PBS.
- Согрейте мышей Rag-/- под тепловой лампой (см. Таблицу материалов) в течение 4 минут и удерживайте мышей с помощью мышиного ограничителя.
- Внутривенно переносят 200 мкл клеточной суспензии в хвостовую вену мышей Rag-/- с помощью инсулинового шприца 1 мл (27 г) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеток одной мыши-донора достаточно для передачи примерно пяти мышам-реципиентам.
6. Мониторинг клинических признаков во время прогрессирования колита
- Взвешивайте мышей каждую неделю и увеличивайте наблюдение до двух раз в неделю, как только мыши начинают терять >5% от первоначального веса.
- Наблюдайте за реакцией /движением мышей при мягкой стимуляции.
- Наблюдать другие клинические отклонения. т.е. осанка и консистенция стула.
7. Коллекция толстой кишки и гистопатологическая оценка
- Принесите в жертву мышей-реципиентов вывих шейки матки с CO2 в момент потери веса >20% от первоначального веса или через 6 недель после переноса клеток. Смочите мышей 70% этанолом.
- Выполните ~ 1 см вентральный разрез средней линии кожи, оттяните кожу от брюшной мышечной ткани, сделайте разрез ~ 3 см в брюшной мышечной ткани, определите слепую кишку и удалите всю толстую кишку стерильными ножницами и щипцами. Смочите толстую кишку предварительно холодным PBS в блюде для культуры.
- Обрежьте толстую кишку вдоль и промойте ее предварительно холодным PBS. Отрежьте 1/3 толстой кишки продольно.
- Поместите полоску толстой кишки в бумажное полотенце просветной стороной лицом вверх. Выполняйте швейцарскую прокатку с помощью зубочистки15.
- Поместите двоеточие Swiss в кассету и поместите кассету в 10% буферизованный формалин на 24 ч16 с последующим обезвоживанием с помощью автоматизированного процессора (см. Таблицу материалов) и встраиванием парафина.
- Вырежьте 5 мкм участков ткани на микротоме, установленном на слайдах, и выполните окрашивание гематоксилина и эозина (H&E)17 (см. Таблицу материалов).
- Определите гистопатологические баллы, объединив баллы по каждому из шести параметров максимум для 12. Воспаление Lamina propria (нормальное, 0; легкое, 1; умеренное, 2; тяжелое, 3); потеря бокаловидных клеток (нормальная, 0; легкая, 1; умеренная, 2; тяжелая, 3); аномальный крипта (нормальная, 0; гиперпластическая, 1; дезорганизация, 2; потеря крипты, 3); криптовые абсцессы (отсутствуют, 0; присутствуют, 1); эрозия и изъязвление слизистой оболочки (нормальные, 0; легкие, 1; умеренные, 2; тяжелые, 3); и подслизистое изменение (нет, 0; подслизистое, 1; трансмуральное, 2)18.
8. Выделение и окрашивание клеток кишечной пластинки проприи
- После шага 7.3 разрежьте еще 2/3 толстой кишки на кусочки по 0,5-1 см и промыть ее предварительно холодным PBS.
- Переведите сегменты толстой кишки в предварительно нагретый буфер ЭДТА-ПБС объемом 20 мл в центрифужной трубке объемом 50 мл. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием 250 об/мин в течение 30 мин.
- Вращайте трубку, отбрасывайте супернатанты, пропуская ее через стерильное сито (диаметр: 0,01 дюйма), и повторно суспендируйте сегменты толстой кишки в 20 мл предварительно холодного PBS в трубке объемом 50 мл.
- Повторите шаг 8.3 дважды.
- Поместите сегменты толстой кишки в трубку С (см. Таблицу материалов), содержащую 10 мл предварительно нагретого буфера пищеварения.
- Поместите трубку на диссоциаторную машину (см. Таблицу материалов) и высиживайте по программе «37C_m_LPDK_1» в течение 25 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: "37C_m_LPDK_1" - это стандартная предустановленная программа в машине Dissociator, используемая для перемешивания образцов и поддержания их при температуре 37 °C. - Проверьте, переваривается ли ткань полностью, что означает, что ни один кусочек ткани не находится в буфере пищеварения. Если нет, повторите программу «37C_m_LPDK_1».
- Соберите супернатант, пройдя через металлическое сито и ситечко 100 мкл. Смойте 10 мл предварительно холодного PBS.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Аспирируйте всех супернатантов.
- Повторно суспендируют клетки в 4 мл 40% раствора Перколла и тщательно перемешивают (готовят на стадии 2.8).
- Переведите повторно суспендированные ячейки в 2 мл 75% раствора Перколла в центрифужной трубке объемом 15 мл.
- Центрифугирование клеточной суспензии при 850 х g в течение 20 мин при 20 °C (ускорение рампы: 0; Тормозная рампа: 0).
- Осторожно удалите жир на верхнем слое с помощью пипетки 3 мл Transfer и перенесите слой клеток в 20 мл промывочного буфера в трубке объемом 50 мл.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте все супернатанты и повторно суспендированные клетки в 1 мл готовой среды.
- Подсчитайте ячейки после шага 3.6.
- Засевают клетки в 24-луночную пластину, активируют их 50 нг/мл формоль-12-миристата 13-ацетата и 750 нг/мл иономицина в течение 2 ч с последующей инкубацией с 5 мкг/мл Брефельдина А в течение 3 ч (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые реагенты токсичны, и их обращение требует мер предосторожности и безопасности. - Переложите ячейки в трубку FACS, добавьте 2 мл буфера FACS и центрифугируйте ячейки при 350 x g в течение 8 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Инкубируют клетки с 12,5 мкг/мл антимышечного CD16/3219 в (см. Таблицу материалов) буфере FACS для блокирования Fc-рецепторов в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пятно для живых/мертвых и поверхностных маркеров.
- Промыть ячейки 2 мл FACS Buffer и центрифугировать их при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Окрашивайте клетки живым красителем и поверхностными маркерами (т.е. антимышевыми CD3 и антимышевыми антителами CD4)20 (см. Таблицу материалов) в буфере FACS при оптимальной концентрации в течение 30 мин при 4 °C в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые реагенты токсичны, и их обращение требует мер предосторожности и безопасности.
- Выполняют клеточное и ядерное окрашивание.
- Добавьте 2 мл буфера FACS и центрифугируйте клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Пермеабилизируют и фиксируют клетки путем повторного использования клеток 200 мкл рабочего раствора Transcription Factor Fix (см. Таблицу материалов) в течение 40 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 мл пермского буфера и центрифугировать клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант.
- Инкубируют клетки клеточными и ядерными маркерами (т.е. антимышевыми IFNγ, антимышевыми IL-17A и антимышечными антителами Foxp3)20 в пермском буфере (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин-1 ч при комнатной температуре.
- Добавить 2 мл пермского буфера и центрифугировать клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант.
- Добавьте 1 мл facS Buffer и центрифугируйте клеточную суспензию при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование клеток с буфером FACS 200 мкл и запуск образцов на проточном цитометре (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Приблизительно 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клеток на селезенку были выделены от взрослой мыши CBir1 TCR Tg. Перенос CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клеток, индуцированный хроническим колитом у реципиентов Rag1-/- мышей. После переноса клеток клинические признаки контролировались для оценки прогрессирования воспаления кишечника, включая потерю веса, консистенцию стула и сгорбленную осанку. Как и ожидалось, мыши начали терять вес примерно через три недели после переноса клеток, а вес достиг около 80-85% от первоначального веса через шесть недель после переноса клеток (рисунок 3). Кроме того, мыши показали диарею примерно через 3-4 недели после переноса клеток и продемонстрировали сгорбленную позу, когда у них развился тяжелый колит. Была показана грубая морфология толстой кишки, а тяжесть колита оценивалась по гистопатологической оценке при жертвоприношении мышей. Мыши, получавшие CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ Т-клетки, показали короткую длину толстой кишки через 6 недель после переноса клеток (рисунок 4A). Мыши-реципиенты продемонстрировали большую инфильтрацию клеток в кишечной пластинке через 4 недели после переноса клеток (рисунок 4C), потерю бокаловидных клеток и гиперплазию эпителиальных клеток кишечника через 5 недель после переноса клеток (рисунок 4D), а также эрозию слизистой оболочки и воспалительную инфильтрацию клеток в подслизистой оболочке толстой кишки через 6 недель после переноса клеток (рисунок 4F). В то же время не было воспаления у rag1-/- мышей, получавших только PBS (рисунок 4B). Кроме того, в тонком кишечнике нет воспаления, но есть воспаление слепой кишки. Кроме того, фенотипы CD4+ Т-клеток в проприях толстой кишки были определены методом проточной цитометрии. Показана стратегия гатинга (рисунок 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + Т-клетки развились в IFNγ + Th1 клетки, IL-17A + Th17 клетки, IFNγ + IL-17 + CD4 + Т-клетки (рисунок 5F) и клетки Foxp3 + Treg в кишечной lamina propria реципиентов Rag1-/- (рисунок 5G).
Рисунок 1: Процедура индукции колита и оценка тяжести заболевания. Селезеночные CD4+ Т-клетки были выделены из трансгенных мышей CBir1 TCR с использованием магнитных шариков, а затем Т-клетки naϊve были очищены путем сортировки. CBir1 TCR трансгенные Т-клетки naϊve затем внутривенно переносились мышам-реципиенту Rag1-/- мышам. Когда мышей приносили в жертву примерно через шесть недель после переноса клеток, тяжесть колита оценивалась по гистопатологическим показателям. Фенотипы CD4+ Т-клеток в colonic lamina propria определяли методом проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия сортировки трансгенных Т-клеток CBir1 TCR. Жизнеспособные одиночные трансгенные Т-клетки CBir1 TCR были очищены путем исключения мусора (A), неединочных клеток (B-C), мертвых клеток (D) и активированных клеток (E-F). Субпопуляция была показана в (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изменения веса Rag1-/- мышей после переноса Т-клеток. 1 x 106 CBir1 TCR трансгенных Т-клеток naϊve были перенесены в Rag1-/- мышей, а мыши Rag1-/-, получавшие PBS, использовались в качестве контроля. Вес мышей регистрировался каждую неделю. Данные были представлены в среднем ± УР; Студенческий t-тест; с<0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Грубая морфология и окрашивание толстой кишки гематоксилином и эозином у мышей Rag1-/- мышей, получавших трансгенные Т-клетки CBir1 TCR. (A) Мышей-реципиентов приносили в жертву через шесть недель после переноса клеток, и была показана грубая морфология толстой кишки. (Б-Е) Мыши-реципиенты были принесены в жертву в разные моменты времени, а мыши Rag1-/- получали PBS в качестве контроля. Толстые кишки были обработаны для окрашивания гематоксилином и эозином. Показаны репрезентативные изображения окрашивания толстой кишки гематоксилином и эозином. Шкала bar = 200 мкм. (F) Были определены гистопатологические баллы. Данные были представлены в среднем ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Фенотипы CD4+ Т-клеток в толстой кишке lamina propria мышей Rag-/- мышей, получающих трансгенные Т-клетки CBir1 TCR naϊve. Когда мышей-реципиентов приносили в жертву через 6 недель после переноса клеток, клетки толстой кишки были выделены для окрашивания фенотипов CD4 + Т-клеток. (А-Е) Стратегия анализа фенотипов Т-клеток. (Ф-Г) (F) IL-17A + CD4 + Т-клетки, IFNγ + CD4 + Т-клетки, IL-17 + IFNγ + CD4 + Т-клетки и (G) Foxp3 + Tregs были определены с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя каждый шаг необходим для воспроизводимости этой модели колита, есть несколько критических шагов. Мыши-реципиент Rag-/- мыши должны получать адекватные жизнеспособные CD4+ Т-клетки naϊve, чтобы вызвать воспаление кишечника. Мы использовали селезенку для выделения наивных CD4+ Т-клеток вместо MLN. Потому что выход наивных CD4+ Т-клеток в МЛН значительно ниже, чем в селезенке. CD62L высоко экспрессируется в наивных Т-клетках, а CD44 и CD25 являются маркерами активации Т-клеток13,14. В этом исследовании мы впервые использовали магнитные шарики против CD4 для выделения CD4 + Т-клеток из селезенки. Затем мы использовали комбинацию анти-CD4, анти-CD62L и анти-CD25 антител для выделения наивных CD4+ Т-клеток13,14. Исследователи могут использовать другие маркеры для сортировки наивных CD4 + Т-клеток. CD45RBHI также является маркером наивных Т-клеток. CD45RBHI CD25-CD4+ Т-клетки обычно используются в качестве наивных Т-клеток трансгенных Т-клеток дикого типа non-TCR23. Поэтому методы сортировки клеток и внутривенного введения Т-клеток мышам-реципиентам имеют важное значение. Настройка протокола gating в качестве шаблона полезна для ускорения экспериментов с меньшим количеством ошибок. Чтобы избежать гибели клеток, клетки всегда следует держать на льду. Кроме того, окрашивание клеток с помощью DAPI настоятельно рекомендуется для исключения мертвых клеток, потому что DAPI не может проходить через неповрежденные клеточные мембраны, что делает его отличным зондом мертвых клеток24. Согревание мышей для стимуляции расширения хвостовых вен обеспечивает лучшую видимость вен для внутривенной инъекции. Все процедуры рекомендуется выполнять обученным исследователям.
Многие факторы могут повлиять на результат моделей колита, на которые необходимо обратить внимание. Во-первых, мыши-получатели Rag1-/- должны соответствовать возрасту и полу. В модели переноса Т-клеток CD45RBHI Т-клетки от мужских и женских доноров могут быть переданы мужчинам-реципиентам Rag-/-, в то время как при использовании женщин-реципиентов могут использоваться только доноры-женщины23. Однако мы не видим существенной разницы между мужчинами и женщинами-реципиентами. Мыши-реципиенты могут быть либо самками, либо самцами, а Т-клетки от доноров-мужчин также могут вызывать колит у женщин-реципиентов. Поскольку изменение веса является ценным показателем прогрессирования колита, рекомендуется использовать мышей-реципиентов между 8-12 неделями, чтобы представить стабильную весовую линию. Эти мыши-реципиенты должны быть выведены и содержаться в одной комнате животного учреждения, потому что микробиота имеет решающее значение для регулирования развития колита25. Время развития колита варьируется при передаче различного количества CBir1 TCR Tg наивных CD4 Т-клеток. Как и ожидалось, меньшее количество клеток требует более длительного времени для индукции колита, а большее количество клеток требует более короткого времени для индукции колита. Рекомендуется использовать 1 x 106 клеток на мышь-реципиента, поскольку мыши-реципиенты демонстрируют клинические признаки колита ~ 2-3 недели после переноса клеток и развивают относительно тяжелый колит ~ 6 недель после переноса клеток. Кроме того, по сравнению с внутрибрюшинной инъекцией, внутривенное введение клеток в хвостовую вену вызывает более последовательный колит. Для выделения клеток проприи толстой кишки ткани толстой кишки не должны пересыхать; в противном случае это снизит выход и жизнеспособность клеток. Одна из особых проблем заключается в том, что продолжительность колита будет изменена, если мышам-реципиентам будут переданы генетически модифицированные Т-клетки CBir1 TCR Tg или обработаны лекарствами26. Кроме того, Т-клетки CBir1 TCR Tg также вызывают воспаление кишечника у других мышей с иммунодефицитом, таких как мыши TCRβ / δ / - у которых отсутствуют Т-клетки27.
Поскольку накопленные данные указывают на решающую роль кишечных бактериальных антиген-специфических реактивных Т-клеток в патогенезе ВЗК, использование Т-клеток, специфичных для определенного бактериального антигена кишечника, даст представление о том, как кишечный бактериальный антиген индуцирует реакции Т-клеток на индуцирование колита. Антиген микробиоты кишечника CBir1 в изобилии присутствует в желудочно-кишечном тракте, что связано с патогенезом ВЗК8,9. Эта модель колита напоминает несколько критических характеристик ВЗК, включая диарею, потерю веса, гистопатологическое обнаружение и аномальные иммунные реакции кишечника. Поэтому эта модель колита полезна для изучения механизмов ВЗК человека и предоставляет инструмент для оценки лечения ВЗК. Интересно, что недавняя работа Chiaranunt et al. показала, что специфичность Т-клеток к одному только антигену микробиоты CBir 1 может быть недостаточной для индуцирования активации Т-клеток и колита. Об этом свидетельствуют Т-клетки дикого типа CBir1 TCR Tg, индуцированные колитом у реципиентов Rag-/-, тогда как Т-клетки Rag-/- CBir1 не индуцировали колит в своем животном учреждении, предполагая, что Кишечные Т-клетки, реагирующие на специфический бактериальный антиген кишечника, могут потребовать других взаимосвязанных комменсальных бактерий, например, Helicobacter spp, чтобы функционировать в качестве адъюванта28 . Интересным аспектом этой модели является то, что различные подмножества Т-клеток, а именно Th1, Th17 и клетки Treg, присутствуют в lamina propria мышей-реципиентов colitic, что дает уникальную возможность для исследования роли не только эффекторных Т-клеток, но и Tregs в патогенезе колита29.
Однако, поскольку эта модель колита опосредована Т-клетками, специфичными для кишечной микробиоты, одним из ограничений для этой модели колита является то, что продолжительность индукции колита может варьироваться в разных учреждениях животных в зависимости от микробиоты кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного автора нет противоречивых финансовых, профессиональных или личных интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения DK125011, AI150210 и DK124132, премией STARs Системы Техасского университета (Y.C.) и Фондом стипендий Джеймса В. Маклафлина от Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне (штат Вашингтон). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
