Summary
En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.
Abstract
Con el aumento de la incidencia, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que son enfermedades crónicas que afectan el tracto gastrointestinal, imponen una carga financiera y de salud considerable a los individuos y la sociedad. Por lo tanto, es fundamental investigar los mecanismos subyacentes a la patogénesis y el desarrollo de la EII. Aquí, se describe un modelo de colitis por transferencia de células T específica del antígeno de la microbiota intestinal. La flagelina CBir1 ha sido reconocida como el antígeno bacteriano intestinal inmunodominante en la colitis experimental y en pacientes con enfermedad de Crohn. Las células T CD4+ transgénicas CBir1 TCRA T, específicas de la flagelina CBir1, pueden inducir colitis crónica después de la transferencia adoptiva a ratones Rag1-/- inmunodeficientes. La gravedad de la enfermedad se evalúa mediante histopatología. También se determinan los fenotipos de linfocitos T CD4+ en la lámina propia colónica. Este modelo se asemeja mucho al desarrollo de la EII, que proporciona un modelo murino ideal para investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de la EII y probar los medicamentos potenciales para tratar la EII.
Introduction
Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que incluyen principalmente la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), se caracterizan por una inflamación crónica del tracto gastrointestinal recurrente-remitente, que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Varios factores se han implicado en el desarrollo y la patogénesis de la EII, incluyendo la susceptibilidad genética, la microbiota intestinal, las respuestas inmunes, la dieta y el estilo de vida2. Sin embargo, el mecanismo exacto de la EII aún no se entiende completamente.
Uno de los intereses particulares es la interacción entre la microbiota intestinal y las respuestas inmunes del huésped en la regulación de la inflamación intestinal3. La microbiota intestinal proporciona una serie de moléculas y antígenos inmunoestimulantes, que pueden activar las respuestas inmunitarias4. Si bien el equilibrio entre las células T efectoras y las células T reguladoras (Tregs) es fundamental para mantener la homeostasis intestinal, la respuesta excesiva de las células T CD4+ de la mucosa intestinal a los antígenos de la microbiota intestinal contribuye a la inflamación intestinal5,6,7. Como antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal, la flagelina CBir1 se ha relacionado con la patogénesis del CD8 humano,9. Además, la transferencia de células T transgénicas (Tg) CBir1 TCR induce inflamación intestinal en ratones inmunodeficientes6, muy parecida a la EII humana, lo que indica que este modelo de transferencia de células T ayuda a investigar los mecanismos de la EII humana.
Este trabajo describe el protocolo detallado de inducción de colitis en ratones Rag1-/- mediante transferencia adoptiva de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ y la evaluación de la gravedad de la enfermedad. Además, se muestran los resultados anticipados y se discuten los pasos críticos del procedimiento y la solución de problemas, lo que ayudará a los investigadores a investigar los mecanismos de patogénesis de la inflamación intestinal y probar los posibles medicamentos para tratar la EII.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité sobre el Uso y Cuidado de los Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas. Los ratones CBir1 TCR Tg fueron proporcionados por el Dr. Charles Elson de la Universidad de Alabama en Birmingham. Los ratones CBir1 TCR Tg pueden ser hembra o macho, pero deben ser a las 8-12 semanas. Los ratones Rag1-/- en el fondo C57BL/6 se obtuvieron del Laboratorio Jackson10. Los ratones Rag1-/- deben ser de género y edad, y se puede usar macho o hembra, pero deben ser a las 8-12 semanas. Todo el protocolo se resume en la Figura 1.
1. Preparación de los ratones receptores
- Prepare ratones Rag1-/- en el fondo C57BL/6, criados en la misma instalación animal específica libre de patógenos. Calcular el número de ratones por grupo mediante análisis de potencia11.
NOTA: Los ratones Rag1-/- no tienen células T maduras y células B10. - Marque los ratones con un golpe de oreja.
- Pesar los ratones el mismo día de la transferencia de células T.
2. Preparación de los reactivos y soluciones
NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, o de riesgo biológico y su manejo requiere precauciones y medidas de seguridad.
- Prepare el tampón de lavado: agregue 5 ml de penicilina-estreptomicina 100x en 500 ml de medio RPMI 1640. Mézclalo bien y guárdalo a 4 °C.
- Prepare tris-NH4Cl Lysis Buffer.
- Preparar la solución Parte A. Disolver 2,06 g de base Tris en 100 ml de agua de doble destilación (ddH2O) y ajustar el valor de pH a 7,2 con HCl.
- Preparar la solución Parte B. Disolver 7,47 g de NH4Cl en 800 mL de ddH2O.
- Mezcle A y B a fondo. Mide el pH y ajústalo a 7.2 si no.
- Ajuste el volumen total a 1000 ml. Autoclave y luego guárdelo a 4 °C.
- Prepare el búfer de aislamiento.
- Añadir 2,5 g de BSA y 500 μL de EDTA (0,5 M, pH 8,0) en 500 mL de 1x PBS. Mézclalo bien.
- Filtre la solución a través de un filtro de tapa de botella desechable accionado al vacío de 0,22 μm (consulte la Tabla de materiales). Guárdelo a 4 °C.
- Prepare el búfer FACS. Añadir 1 mL de FBS y 50 μL de EDTA (0,5 M, pH 8,0) en 50 mL de Tampón de lavado (preparado en el paso 2.1). Mezclar bien y almacenar a 4 °C.
- Prepare el medio completo. Agregue 5 ml de FBS en 45 ml de tampón de lavado. Mezclar bien y almacenar a 4 °C.
- Prepare el búfer EDTA-PBS.
- Calcule el volumen del búfer EDTA-PBS necesario. Volumen (mL) = número de ratón x 20.
- Agregue el volumen apropiado de FBS, EDTA y HEPES en el PBS (2% de FBS, 0.5 mM de EDTA, 10 mM de HEPES en PBS) (ver Tabla de Materiales).
- Mézclelo bien y precaliente en un baño de agua a 37 °C.
- Prepare el tampón de digestión.
- Calcule el volumen del tampón de digestión necesario. Volumen (mL) = número de ratón x 10.
- Agregue el volumen apropiado de FBS, colagenasa IV y DNasa I en el tampón de lavado (2% de FBS, 0.5 mg / ml de colagenasa IV y 10 U / ml de DNasa I en el tampón de lavado) (consulte la Tabla de materiales).
- Mézclelo bien y precaliente en un baño de agua a 37 °C.
- Prepare la solución Percoll.
- Prepara 100% Percoll. Agregue 5 ml de PBS 10x en 45 ml de Percoll original (ver Tabla de materiales).
- Prepare el 2% de FBS en el tampón de lavado. Agregue 1 ml de FBS en 49 ml de tampón de lavado.
- Caulcule el volumen de 40 % de Solución de Percoll y 75 % de Solución de Percoll. Volumen de solución de Percoll al 40% (ml) = número de ratón x 4; Volumen de solución de Percoll al 75% (ml) = número de ratón x 2.
NOTA: Los reactivos/soluciones preparados en los pasos 2.1-2.5 se utilizarán en los pasos 3-4, y los preparados en los pasos 2.6-2.8 se utilizarán en el paso 9. Todos los reactivos/soluciones utilizados en el paso 9 deben estar recién preparados. Se recomienda hacer un 5 % de Buffer adicional para todos los pasos.
3. Aislamiento de células T esplénicas CBir1 TCR Tg CD4+
- Eutanasia CBir1 TCR Tg ratón/ratones por una luxación cervical con eutanasia de CO2 (30%-70% de tasa de desplazamiento gas-aire). Humedezca los ratones con etanol al 70%.
- Realice una incisión en el abdomen izquierdo de ~ 1 cm, retire la piel del tejido muscular abdominal, haga una incisión de ~ 3 cm en el tejido muscular abdominal y retire el bazo con tijeras y fórceps estériles. Coloque el bazo en un plato de cultivo que contenga 5 ml de tampón de lavado prefrío (preparado en el paso 2.1).
- Moler el bazo con la superficie rugosa de dos portaobjetos de vidrio estériles. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 ml pasando a través de un colador de células de 100 μm (consulte la Tabla de materiales). Enjuague los portaobjetos de vidrio y el plato de cultivo con 5 ml de tampón de lavado prefrío y transfiera el tampón de lavado al tubo.
- Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 5 ml de tampón de lisis Tris-NH4Cl precalentado (preparado en el paso 2.2) por bazo. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Agregue 10 ml de tampón de lavado pre-frío al tubo.
- Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas con 10 ml de tampón de aislamiento prefrío (preparado en el paso 2.3).
- Cuente las celdas. Mezclar 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripano a fondo. Cargue 10 μL de la mezcla en una diapositiva, inserte la diapositiva en el contador de celdas automatizado (consulte la Tabla de materiales) y obtenga el número de celda viable12.
NOTA: Se puede obtener aproximadamente 1 x 108 células de un ratón donante en este paso. - Centrifugar la suspensión celular restante del paso 3.6 a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Descarta todos los sobrenadantes.
- Vórtice las partículas magnéticas CD4 anti-ratón a fondo (ver Tabla de materiales), agregue directamente 50 μL de las partículas por cada 107 células y mezcle con gránulos celulares a fondo. Incubar durante 30 min a 4 °C.
NOTA: Cualquier otro kit comercial de enriquecimiento de células T CD4 + se puede utilizar aquí. - Transfiera la suspensión de partículas celulares a un tubo de recolección estéril. Agregue 3.5 ml de tampón de aislamiento prefrío en el tubo.
- Coloque el tubo en el imán de separación celular (consulte la Tabla de materiales) durante 8 minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de transferencia de 3 ml.
- Retire el tubo del imán de separación celular (consulte la Tabla de materiales), vuelva a suspender las celdas con un tampón de aislamiento prefrío de 3,5 ml y coloque el tubo en el imán durante 4 minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de transferencia de 3 ml.
- Repita el paso 3.11.
- Resuspendir las celdas con 1 ml de tampón FACS prefrío (preparado en el paso 2.4).
4. Purificación de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+
- Cuente las celdas siguiendo el paso 3.6.
- Si la concentración celular es de >107/ml, agregue un volumen de tampón FACS para asegurarse de que la concentración celular sea ≤ 107/ml.
NOTA: Se pueden obtener ~ 1 × 107 células de un ratón donante en este paso. - Teñir los marcadores de superficie con 10 μL de CD4-APC anti-ratón, 10 μL de CD25-Percp/Cy5.5 anti-ratón y 10 μL de CD62L-PE13 anti-ratón,14 (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente e incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
- Lave las células con 2 ml de tampón FACS prefrío. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar todo el supernatantsusing una pipeta de transferencia de 3 mL.
- Repita el paso 4.4.
- Resuspend las células a la concentración de 40 x 106/mL en tampón FACS pre-frío.
NOTA: Para evitar que el clasificador se obstruya, pase las células a través de un colador de 70 μm. - Añadir 0,1 μg/ml de DAPI.
NOTA: DAPI se utiliza para excluir las células muertas. - Preparar tubos centrífugos de 15 ml que contengan 4 ml de medio completo (preparado en la etapa 2.5) para recoger las células clasificadas.
- Cargue las celdas en el clasificador. Clasificar células T CD4+ naϊve individuales viables (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ células) en modo de pureza (tamaño de la boquilla: 70 μm; Presión: 70 PSI; Tasa de eventos: 8000-12000 eventos/s; Eficiencia: superior al 90%) (Figura 2).
NOTA: Las células T Naϊve CD4+ expresan alta expresión de CD62L y carecen del marcador de activación CD2513,14. - Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspira todos los sobrenadantes usando una pipeta de transferencia de 3 mL.
- Resuspend las células en 500 μL de 1x PBS.
- Contar celdas siguiendo el paso 3.6
NOTA: Se pueden obtener ~ 5 × 106 células de un ratón donante en este paso.
5. Transferencia celular a los ratones receptores
- Resuspend las células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ a la concentración de 5 x 106/mL añadiendo 1x PBS.
- Caliente los ratones Rag-/- bajo una lámpara de calor (ver Tabla de Materiales) durante 4 minutos, y sujete a los ratones usando un retenedor de ratón.
- Transfiera por vía intravenosa 200 μL de la suspensión celular a la vena de la cola de ratones Rag-/- utilizando una jeringa de insulina de 1 ml (27 G) (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Las células de un ratón donante son suficientes para transferirse a alrededor de cinco ratones receptores.
6. Monitoreo de los signos clínicos durante la progresión de la colitis
- Pesa a los ratones cada semana y aumenta la observación a dos veces por semana una vez que los ratones comienzan a perder >5% de los pesos originales.
- Observe la respuesta / movimiento de los ratones cuando se estimula suavemente.
- Observar otras anomalías clínicas. es decir, la postura y la consistencia de las heces.
7. Colección de colon y puntuación histopatológica
- Sacrificar a los ratones receptores por una luxación cervical con CO2 en un punto temporal de la pérdida de peso >20% del peso original o 6 semanas después de la transferencia celular. Humedezca los ratones con etanol al 70%.
- Realice una incisión cutánea ventral de ~ 1 cm, aleje la piel del tejido muscular abdominal, haga una incisión de ~ 3 cm en el tejido muscular abdominal, identifique el ciego y retire todo el colon con tijeras y fórceps estériles. Humedezca el colon con PBS prefrío en un plato de cultivo.
- Incise el colon a lo largo y enjuáguelo con PBS pre-frío. Corte 1/3 del colon longitudinalmente.
- Coloque la tira de colon en una toalla de papel con el lado luminal hacia arriba. Realice el laminado suizo con un palillo de dientes15.
- Coloque el colon suizo en un cassette y coloque el cassette en formalina tamponada al 10% durante 24 h16, seguido de deshidratación utilizando un procesador automatizado (ver Tabla de materiales) e incrustación de parafina.
- Cortar secciones de tejido de 5 μm en un microtomo, montadas en portaobjetos, y realizar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E)17 (ver Tabla de Materiales).
- Determinar las puntuaciones histopatológicas combinando las puntuaciones para cada uno de los seis parámetros para un máximo de 12. Inflamación de la lámina propia (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); pérdida de células caliciformes (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); cripta anormal (normal, 0; hiperplásica, 1; desorganización, 2; pérdida de cripta, 3); abscesos de cripta (ausente, 0; presente, 1); erosión mucosa y ulceración (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); y cambio submucoso (ninguno, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Aislamiento y tinción de células de lámina propia intestinal
- Después del paso 7.3, corte otros 2/3 del colon en trozos de 0.5-1 cm y lávelo con PBS prefrío.
- Transfiera los segmentos de colon a un tampón EDTA-PBS precalentado de 20 ml en un tubo centrífugo de 50 ml. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 30 min.
- Vórtice el tubo, deseche los sobrenadantes pasándolo a través de un tamiz estéril (diámetro: 0.01 pulgadas) y resuspenda los segmentos de colon en 20 ml de PBS prefrío en el tubo de 50 ml.
- Repita el paso 8.3 dos veces.
- Coloque los segmentos de colon en un tubo C (ver Tabla de Materiales) que contenga 10 ml de tampón de digestión precalentado.
- Coloque el tubo en una máquina disociadora (ver Tabla de Materiales) e incube bajo el programa de "37C_m_LPDK_1" durante 25 min.
NOTA: "37C_m_LPDK_1" es un programa preestablecido estándar en la máquina disociadora utilizada para agitar las muestras y mantenerlas a 37 ° C. - Compruebe si el tejido se digiere por completo, lo que significa que no hay ningún trozo de tejido en el tampón de digestión. Si no es así, repita el programa de "37C_m_LPDK_1".
- Recoge el sobrenadante pasando por un tamiz metálico y un colador de 100 μL. Enjuague con 10 ml de PBS prefrío.
- Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar a todos los sobrenadantes.
- Resuspend las células en 4 ml de solución de Percoll al 40% y mezclar bien (preparado en el paso 2.8).
- Transfiera las células resuspendidas a 2 ml de solución de Percoll al 75% en un tubo centrífugo de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 850 x g durante 20 min a 20 °C (Rampa de aceleración: 0; Rampa de freno: 0).
- Retire cuidadosamente la grasa en la capa superior con una pipeta de transferencia de 3 ml y transfiera la capa celular a 20 ml de tampón de lavado en un tubo de 50 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche todos los sobrenadantes y células resuspend en 1 mL de Medio Completado.
- Cuente las celdas siguiendo el paso 3.6.
- Sembrar las células en una placa de 24 pocillos, activarlas con 50 ng/mL de Phorbol-12-miristato 13-acetato y 750 ng/mL de ionomicina durante 2 h, seguido de incubación con 5 μg/mL de Brefeldina A durante 3 h (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, y su manejo necesita precauciones y medidas de seguridad. - Transfiera las células a un tubo FACS, agregue 2 ml de tampón FACS y centrífuga las células a 350 x g durante 8 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Incubar las células con 12,5 μg/mL de CD16/3219 anti-ratón en tampón FACS (ver Tabla de Materiales) para bloquear los receptores Fc durante 5 min a temperatura ambiente.
- Mancha para marcador vivo/muerto y de superficie.
- Lavar las células con 2 mL de TAMPÓN FACS y centrifugarlas a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Teñir las células con colorantes vivos y marcadores de superficie (es decir, anticuerpos CD3 anti-ratón y anti-ratón CD4)20 (ver Tabla de Materiales) en FACS Buffer a la concentración optimizada durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, y su manejo necesita precauciones y medidas de seguridad.
- Realizar la tinción celular y nuclear.
- Añadir 2 mL de TAMPÓN FACS y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Permeabilizar y fijar las células resuspiendo las células con 200 μL de solución de trabajo Transcription Factor Fix (ver Tabla de Materiales) durante 40 min a temperatura ambiente.
- Añadir 2 ml de tampón permanente y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Incubar las células con marcadores celulares y nucleares (es decir, anticuerpos anti-ratón IFNγ, anti-ratón IL-17A y anti-ratón Foxp3)20 en tampón Perm (ver Tabla de Materiales) durante 30 min-1 h a temperatura ambiente.
- Añadir 2 ml de tampón permanente y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de tampón FACS y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspend las células con 200 μL de TAMPÓN FACS y ejecute las muestras en un citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales).
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Representative Results
Se aislaron aproximadamente 5 x 106 células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ por bazo de un ratón adulto CBir1 TCR Tg. La transferencia de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ indujo colitis crónica en ratones Rag1-/- receptores. Después de la transferencia celular, se monitorearon los signos clínicos para evaluar la progresión de la inflamación intestinal, incluida la pérdida de peso, la consistencia de las heces y la postura encorvada. Como se esperaba, los ratones comenzaron a perder peso alrededor de las tres semanas posteriores a la transferencia celular, y el peso alcanzó alrededor del 80% -85% del peso original seis semanas después de la transferencia celular (Figura 3). Además, los ratones mostraron diarrea alrededor de 3-4 semanas después de la transferencia celular y demostraron una postura encorvada cuando desarrollaron colitis grave. Se mostró morfología gruesa del colon, y la gravedad de la colitis se evaluó mediante la puntuación histopatológica cuando se sacrificaron ratones. Los ratones que recibieron células T CD4+ CBir1 TCR Tg naϊve mostraron una longitud corta del colon 6 semanas después de la transferencia celular (Figura 4A). Los ratones receptores demostraron más infiltración celular en la lámina propia intestinal 4 semanas después de la transferencia celular (Figura 4C), pérdida de células caliciformes e hiperplasia de células epiteliales intestinales 5 semanas después de la transferencia celular (Figura 4D), y erosión mucosa e infiltración celular inflamatoria en la submucosa del colon 6 semanas después de la transferencia celular (Figura 4F). Al mismo tiempo, no hubo inflamación en ratones Rag1-/- que recibieron PBS solo (Figura 4B). Además, no hay inflamación en el intestino delgado, pero el ciego tiene inflamación. Además, los fenotipos de linfocitos T CD4+ en la lámina propia colónica se determinaron mediante citometría de flujo. Se muestra la estrategia de cierre (Figura 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve Células T CD4+ se convirtieron en células IFNγ+ Th1, células IL-17A+ Th17, células T IFNγ+ IL-17+ CD4+ (Figura 5F) y células Foxp3+ Treg en láminas intestinales propias de receptores Rag1-/- (Figura 5G).
Figura 1: El procedimiento de colitis de inducción y la evaluación de la gravedad de la enfermedad. Las células T CD4 + esplénicas se aislaron de ratones transgénicos CBir1 TCR utilizando perlas magnéticas, y luego las células T naϊve se purificaron mediante clasificación. Las células T transgénicas naϊve CBir1 TGR se transfirieron por vía intravenosa a los ratones Rag1-/- receptores. Cuando los ratones fueron sacrificados alrededor de seis semanas después de la transferencia celular, la gravedad de la colitis se evaluó mediante puntuaciones histopatológicas. Los fenotipos de linfocitos T CD4+ en la lámina propia colónica se determinaron mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La estrategia de gating para clasificar las células T transgénicas naϊve CBir1 TCR. Las células T transgénicas naϊve CBir1 TCR individuales viables se purificaron excluyendo los desechos (A), las células no individuales (B-C), las células muertas (D) y las células activadas (E-F). La subpoblación se mostró en (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los cambios de peso de los ratones Rag1-/- después de la transferencia de células T. 1 x 106 CBir1 TCR células T transgénicas naϊve se transfirieron a ratones Rag1-/-, y los ratones Rag1-/- que recibieron PBS se utilizaron como controles. Los pesos de los ratones se registraron cada semana. Los datos se presentaron en media ± DE; Prueba t del estudiante; p<0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La morfología macroscópica y la tinción de hematoxilina y eosina del colon de ratones Rag1-/- que recibieron células T transgénicas naϊve CBir1 TCR. (A) Los ratones receptores fueron sacrificados seis semanas después de la transferencia celular, y se mostró la morfología gruesa del colon. (B-E) Los ratones receptores fueron sacrificados en diferentes puntos de tiempo, y los ratones Rag1-/- recibieron PBS como controles. Los colones fueron procesados para la tinción de hematoxilina y eosina. Se muestran imágenes representativas de la hematoxilina y la tinción de eosina del colon. Barra de escala = 200 μm. (F) Se determinaron las puntuaciones histopatológicas. Los datos se presentaron en la media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Los fenotipos de células T CD4+ en la lámina propia colónica de ratones Rag-/- que reciben células T transgénicas naϊve CBir1 TCR. Cuando los ratones receptores fueron sacrificados 6 semanas después de la transferencia celular, las células de la lámina propia colónica se aislaron para teñir fenotipos de células T CD4 + . (A-E) La estrategia de gating para el análisis de fenotipos de células T. (F-G) (F) Las células T IL-17A+ CD4+ , las células T IFNγ+ CD4+ , las células T IL-17+ IFNγ+ CD4+ y (G) Foxp3+ Tregs se determinaron mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque cada paso es esencial para la reproducibilidad de este modelo de colitis, hay varios pasos críticos. Los ratones Rag-/- receptores deben recibir células T CD4+ naϊve viables adecuadas para inducir la inflamación intestinal. Utilizamos bazos para el aislamiento de células T CD4+ ingenuas en lugar de MLNs. Porque el rendimiento de las células T CD4+ ingenuas en las MLN es mucho menor que en los bazos. CD62L está altamente expresado en linfocitos T naïve, y CD44 y CD25 son los marcadores de activación de linfocitos T13,14. En este estudio, primero utilizamos perlas magnéticas anti-CD4 para aislar las células T CD4 + del bazo. Luego utilizamos la combinación de anticuerpos anti-CD4, anti-CD62L y anti-CD25 para el aislamiento de linfocitos T CD4+ naïve13,14. Los investigadores podrían usar otros marcadores para clasificar las células T CD4 + naïve. CD45RBhi también es marcador de células T naïve. Cd45RBhi Cd25- CD4+ Las células T se utilizan comúnmente como células T ingenuas de células T transgénicas no TCR de tipo salvaje23. Por lo tanto, las técnicas de clasificación de células e inyección intravenosa de las células T en los ratones receptores son esenciales. Configurar el protocolo de cierre como plantilla es útil para acelerar los experimentos con menos errores. Para evitar la muerte celular, las células siempre deben mantenerse en hielo. Además, la tinción de células con DAPI es muy recomendable para excluir células muertas porque DAPI no puede transitar a través de membranas celulares intactas, lo que la convierte en una excelente sonda de células muertas24. El calentamiento de los ratones para estimular la dilatación de las venas de la cola proporciona una mejor visibilidad de las venas para la inyección intravenosa. Se recomienda que todos los procedimientos sean realizados por investigadores capacitados.
Muchos factores pueden afectar el resultado de los modelos de colitis, a los que hay que prestar atención. Primero, los ratones Rag1-/- receptores deben coincidir con la edad y el género. En el modelo de transferencia de células T CD45RBhi, las células T de donantes masculinos y femeninos pueden transferirse a receptores masculinos de Rag-/-, mientras que solo se pueden utilizar donantes femeninas cuando se utilizan receptoras femeninas23. Sin embargo, no vemos una diferencia significativa entre los receptores masculinos y femeninos. Los ratones receptores podrían ser hembras o machos, y las células T de donantes machos también pueden inducir colitis en las receptoras hembras. Dado que el cambio de peso es un indicador valioso de la progresión de la colitis, se recomienda utilizar los ratones receptores entre 8-12 semanas para presentar una línea de peso estable. Estos ratones receptores deben ser criados y mantenidos en la misma habitación de la instalación animal porque la microbiota es crítica para regular el desarrollo de la colitis25. El tiempo para desarrollar colitis varía cuando se transfieren diferentes números de células T CBir1 TCR Tg ingenuas CD4. Como era de esperar, menos células requieren un tiempo más largo para la inducción de la colitis, y un mayor número de células requieren un tiempo más corto para la inducción de la colitis. Se recomienda el uso de 1 x 106 células por ratón receptor ya que los ratones receptores demuestran signos clínicos de colitis ~ 2-3 semanas después de la transferencia celular y desarrollan colitis relativamente grave ~ 6 semanas después de la transferencia celular. Además, en comparación con la inyección intraperitoneal, la inyección intravenosa de células en la vena de la cola induce una colitis más consistente. Para el aislamiento de las células de la lámina propia colónica, los tejidos del colon no deben secarse; de lo contrario, reduciría el rendimiento y la viabilidad de las células. Una de las preocupaciones particulares es que la duración de la colitis cambiaría si los ratones receptores son transferidos con células T TG T TC TC TC T genéticamente modificadas o tratados con fármacos26. Además, las células TC TC TC1 también inducen inflamación intestinal en otros ratones inmunodeficientes, como los ratones TCRβ/δ-/-, que carecen de células T27.
Como la evidencia acumulada indica un papel crucial de las células T reactivas específicas del antígeno bacteriano intestinal en la patogénesis de la EII, el uso de células T específicas para un antígeno bacteriano intestinal definido proporcionará información sobre cómo el antígeno bacteriano intestinal induce respuestas de células T para inducir colitis. El antígeno de la microbiota intestinal CBir1 flagelina es abundante en el tracto gastrointestinal, lo que está relacionado con la patogénesis de la EII8,9. Este modelo de colitis se asemeja a varias características críticas de la EII, incluyendo diarrea, pérdida de peso, hallazgo histopatológico y respuestas inmunes intestinales anormales. Por lo tanto, este modelo de colitis es útil para estudiar los mecanismos de la EII humana y proporciona una herramienta para evaluar los tratamientos para la EII. Curiosamente, el trabajo reciente de Chiaranunt et al. indicó que la especificidad de las células T para el antígeno CBir 1 de la microbiota por sí solo podría no ser suficiente para inducir la activación de las células T y la colitis. Esto se evidencia en la colitis inducida por las células T TG T de tipo salvaje CBir1 en receptores de Rag-/-, mientras que las células T Rag-/- CBir1 no indujeron colitis en sus instalaciones animales, lo que sugiere que las células T intestinales que responden a antígeno bacteriano intestinal específico pueden requerir otras bacterias comensales interrelacionadas, por ejemplo, Helicobacter spp, para funcionar como adyuvante28 . Un aspecto emocionante de este modelo es que diferentes subconjuntos de células T, a saber, células Th1, Th17 y Treg, están presentes en la lámina propia de ratones receptores de colión basilicales, lo que brinda una oportunidad única para investigar el papel no solo de las células T efectoras sino también de Tregs en la patogénesis de la colitis29.
Sin embargo, como este modelo de colitis está mediado por células T específicas de la microbiota intestinal, una limitación para este modelo de colitis es que la duración de la inducción de la colitis puede variar en diferentes instalaciones animales dependiendo de la microbiota intestinal.
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Disclosures
Ningún autor tiene intereses financieros, profesionales o personales en conflicto.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones DK125011, AI150210 y DK124132 de los Institutos Nacionales de Salud, el premio STARs del Sistema de la Universidad de Texas (Y.C.) y el Fondo de Becas James W. McLaughlin de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (W.Y.). La Figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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