Summary
本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、初期の膵臓発生を研究し、糖尿病の遺伝的寄与因子を調査するための優れたツールです。しかし、hPSC由来のインスリン分泌細胞は、細胞治療や疾患モデリングのために生成することができますが、効率と機能特性は限られています。ベータ細胞および他の内分泌細胞の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、2つの転写因子PDX1およびNKX6.1を共発現すると、in vitro および in vivoの両方で機能的なインスリン分泌ベータ細胞への前駆細胞を指定する。hPSC由来の膵臓前駆細胞は現在、臨床試験の一環として1型糖尿病患者の細胞療法に使用されています。しかし、現在の手順では、NKX6.1および膵臓前駆細胞の割合が高くないため、機能しない内分泌細胞の共生成と、グルコース応答性のインスリン分泌細胞がほとんど発生しません。したがって、この研究は、2D単層でPDX1とNKX6.1の共発現を最大化するhPSC由来の膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルを開発しました。細胞密度、新鮮なマトリックスの利用可能性、hPSC由来の内胚葉細胞の解離などの要因が調節され、生成された膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1レベルが上昇し、代替肝系統への関与が最小限に抑えられます。今回の研究は、 in vitro 分化中に細胞の物理的環境を操作すると、系統の仕様と遺伝子発現に影響を与える可能性があることを強調している。したがって、現在最適化されたプロトコルは、細胞治療および疾患モデリングのためのPDX1およびNKX6.1共発現前駆細胞のスケーラブルな生成を容易にする。
Introduction
糖尿病は、世界中の何百万人もの人々に影響を与える複雑な代謝障害です。インスリンの補給は、糖尿病の唯一の治療選択肢と考えられています。より進行した症例は、死体膵臓全体または膵島のいずれかの移植によって達成されるベータ細胞補充療法で治療されます1,2。免疫抑制剤の継続的な必要性に加えて、組織の入手可能性と質の制限、移植手順の侵襲性など、移植療法を取り巻くいくつかの問題。これには、ベータ細胞補充療法のための新規かつ代替的な選択肢を発見する必要性が必要です2,3。ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、最近、ヒト膵臓の生物学を理解するための有望なツールとして、また移植治療のための非網羅的で潜在的によりパーソナライズされた供給源として浮上しています4,5,6,7。ヒト胚性幹細胞(hESC)やヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)などのhPSCは、自己複製能力が高く、あらゆる組織型の人体を生じさせます。hESCは胚の内部細胞塊に由来し、hiPS細胞は任意の体細胞から再プログラムされます4,8。
指向性分化プロトコルは、hPSCから膵臓ベータ細胞を生成するように最適化されており、hPSCを膵臓発生段階までinvitroで順次指示します。これらのプロトコルは、hPSC由来の膵島オルガノイドを生成します。それらはその中の膵臓ベータ細胞の割合を増加させることで大幅に改善されましたが、プロトコルの効率は非常に変動します。NKX6.1+/インスリン+またはC-ペプチド+細胞の~40%以上に増加しない5、9、10、11、12、13。しかしながら、生成されたベータ細胞は、それらの転写および代謝プロファイルならびにグルコースに対するそれらの応答の点で、成体ヒトベータ細胞と完全に同一ではない4,5,14。hPSC由来のベータ細胞は、成体ヒト膵島と比較して、PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2、およびKCNK3などの主要なベータ細胞マーカーの遺伝子発現を欠いています5。さらに、hPSC由来のベータ細胞は、グルコースに応答してカルシウムシグナル伝達を低下させています。それらは、グルコースレベルの上昇に応答して適切な量のインスリンを分泌しない共生成多ホルモン細胞で汚染されています5。一方、膵島の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、ベータ細胞と比較してin vitroでより効率的に生成でき、in vivoに移植すると、機能的なインスリン分泌ベータ細胞に成熟する可能性があります15,16。臨床試験は現在、T1D被験者における移植時の安全性と有効性を実証することに焦点を当てています。
特に、同じ膵臓前駆細胞内での転写因子PDX1(膵臓および十二指腸ホメオボックス1)およびNKX6.1(NKX6ホメオボックス1)の発現は、ベータ細胞系譜5へのコミットメントにとって非常に重要です。NKX6.1を発現しない膵臓前駆細胞は、多ホルモン性内分泌細胞または非機能性ベータ細胞を生じさせる17,18。したがって、膵臓前駆細胞期におけるPDX1とNKX6.1の高い共発現は、最終的に多数の機能的ベータ細胞を生成するために不可欠である。研究によると、胚様体または3D培養は、分化細胞が凝集している膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1を増強し、PDX1 + / NKX6.1 +集団の40%〜80%の間で変動することが示されています12,19。しかし、浮遊培養と比較して、2D分化培養は、複数の細胞株への適用において、より費用効果が高く、実現可能で、便利です5。我々は最近、単層分化培養により、PDX1+/NKX6.1+を共発現するhPSC由来の膵臓前駆細胞を最大90%以上生成することを示しました20,21,22。報告された方法は、生成された膵臓前駆細胞に高い複製能力を与え、肝系統21などの代替運命仕様を防止しました。したがって、本明細書において、このプロトコルは、PDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓ベータ細胞前駆体へのhPSCの分化のための非常に効率的な方法を実証する。この方法は、hPSC由来の内胚葉を解離して細胞密度を操作する技術を利用し、その後、FGFとレチノイドのシグナル伝達を拡張し、ヘッジホッグを阻害してPDX1とNKX6.1の共発現を促進します(図1)。この方法は、移植治療および疾患モデリングのためのhPSC由来膵臓ベータ細胞前駆体のスケーラブルな生成を促進することができる。
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Protocol
この研究は、適切な機関研究倫理委員会によって承認され、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改正または同等の倫理基準に定められた倫理基準に従って実施されています。このプロトコルは、HMCの治験審査委員会(IRB)(番号16260/16)およびカタール生物医学研究所(QBRI)(番号2016-003)によって承認されました。この作業は、H1、H9、HUES8などのhESC用に最適化されています。血液サンプルは、ハマドメディカルコーポレーション(HMC)病院の健康な個人から完全なインフォームドコンセントで取得されました。このiPS細胞は、対照の末梢血単核球(PBMC)から生成される、健常個体23。
1. 培地の調製
- ヒト多能性幹細胞(hPSC)培地の調製
- ヒト胚性幹細胞を維持および増殖させるための市販の培地から、100単位/mLのペニシリンと100 ug/mLのストレプトマイシンを添加してhPSC培養培地を調製します( 材料の表を参照)。培地全体を分注し、-20°Cで長期間、または4°Cで保管してすぐに使用します。
- ステージ1の分化培地を準備します(決定的な内胚葉(DE)用)。
- 0.5%の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(FFA-BSA)、1.5 g / Lの重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、10 mMのグルコース、2 mMのグルタマックス、100単位/ mLのペニシリン、および100 μg / mLのストレプトマイシンを補給することにより、MCDB 131培地から基礎培地を調製します( 材料の表を参照)。調製した培地を0.2 μmフィルターでろ過し、4°Cで保存します。
- 基礎培地を37°Cで加温し、2 μMのCHIR99021、100 ng/mLのアクチビンA、10 μMのロック阻害剤(Y-27632)、および0.25 mMのビタミンCを補給することにより、基礎培地(ステップ1.2.1で調製)からCHIR99021を含むステージ1培地を準備します( 材料の表を参照)。補充したメディアをよく混ぜ、アルミホイルで覆い、光から保護します。
注:このメディアは、差別化の初日にのみ使用されます。 - 基礎培地からCHIR99021を含まないステージ1培地を37°Cで温め、100 ng/mLのアクチビンAと0.25 mMのビタミンCを補給して調製し、よく混合します。
注:オプションで5 ng/mLの塩基性FGFまたはFGF2をこの培地に追加できます。このメディアは、ステージ1の残りの日に使用されます。
- ステージ2分化培地を調製する(プリミティブガットチューブ用;PGT)。
- 基礎培地からロック阻害剤を含むステージ2分化培地を調製し、FGF10 50 ng/mL、ノギン50 ng/mL、CHIR99021 0.25 μM、Y-27632(ロック阻害剤)10 μM、ビタミンC0.25 mMを添加します。
注:この培地は、内胚葉細胞の解離の日に使用されます。 - Rock阻害剤を除くステップ1.3.1で調製した培地についても同様の手順に従って、Rock阻害剤を含まないステージ2分化培地を調製する。
注:このメディアは、ステージ2の2日目に使用されます。
- 基礎培地からロック阻害剤を含むステージ2分化培地を調製し、FGF10 50 ng/mL、ノギン50 ng/mL、CHIR99021 0.25 μM、Y-27632(ロック阻害剤)10 μM、ビタミンC0.25 mMを添加します。
- ステージ3の分化培地を準備します(後部フォレガット用)。
- 4.5 g / Lのグルコースを含むDMEM培地を準備し、1%のペニシリン-ストレプトマイシンと2 mMのグルタマックスを補給し、ステージ3および4の基礎培地として使用します。
- DMEM培地(ステップ1.4.1で調製)を温め、2 μMのレチノイン酸、0.25 μMのSANT-1、50 ng / mLのFGF10、50 ng / mLのNOGGIN、0.25 mMのビタミンC、およびビタミンAを含まない1%B27サプリメントを補給します( 材料の表を参照)。
注:このメディアは、P2-D(プロトコル2、最適化、解離)のステージ3の4日間、P1-ND(プロトコル1、最適化されていない、解離していない)のステージ3の2日間使用されます。
- ステージ4の分化培地(膵臓前駆細胞用)を準備します。
- 4.5 g / Lのグルコースを含むDMEMと100 ng / mLのEGF、10 mMのニコチンアミド、50 ng / mLのノギン、0.25 mMのビタミンC、およびビタミンAを含まない1%のB27サプリメントを追加します( 材料の表を参照)。このメディアは、ステージ 4 のすべての日に使用します。
注:すべての試薬を適切な温度に維持し、すべてのサイトカインと敏感な試薬を分注する必要があります。分注した試薬を解凍し、分化培地交換時に基礎培地に添加する。異なる分化培地の組成を 表1に示す。
- 4.5 g / Lのグルコースを含むDMEMと100 ng / mLのEGF、10 mMのニコチンアミド、50 ng / mLのノギン、0.25 mMのビタミンC、およびビタミンAを含まない1%のB27サプリメントを追加します( 材料の表を参照)。このメディアは、ステージ 4 のすべての日に使用します。
2.基底膜マトリックスコーティングディッシュの調製
- 市販の地下マトリックス( 材料表を参照)を解凍し、氷上でアリコートします。アリコートを-20°Cで凍結します。
- 組織培養皿をコーティングする前に、凍結したアリコートを氷上で解凍します。適切な量のメンブレンマトリックス溶液をチルドKO-DMEM/F-12培地(KnockOut DMEM/F-12)( 材料表を参照)に加えて、目的の希釈濃度を達成し、よく混合します。希釈したマトリックス溶液を4°Cで保存すると、すぐに使用できます。
- 組織培養処理プレート( 材料の表を参照)の表面を希釈膜マトリックス溶液で覆い、プレートを37°Cに少なくとも60分間置いてから、細胞をプレーティングします。KO-DMEM/F-12の膜マトリックス溶液の1:50希釈液は、膵臓分化実験用の細胞のプレーティングに、1:80の希釈液を使用して未分化hPSCの増殖に使用します。
3. 未分化hPS細胞の培養
- コロニーが70%〜80%のコンフルエントに達したときにhPSCを通過させる。
- 継代するには、hPSCを温かいPBSで一度洗浄し、組織培養フード内のポータブル真空吸引器を使用して吸引し、PBSに0.5 mMのEDTA溶液を加えてコロニー表面を覆います。37°C、5%CO2 で1分間、またはコロニーの境界がプレート表面から剥離するまでインキュベートします。
- EDTA溶液を除去し、P1000マイクロピペットを用いてhPSC培養液で剥離コロニーを回収します。採取した細胞を128 x gで室温で4分間遠心分離します。上清を廃棄し、10 μMのY-27632(Rock阻害剤)を含むhPSC培養培地で細胞を補充します23,24。
注:hPSCを1:80メンブレンマトリックスコーティングされたディッシュに少なくとも1:3の比率で通過させます。ただし、分化実験では、hPSCを1:50コーティングされた皿にプレートします。
4. hPSCにおける内胚葉(DE)確定分化誘導(ステージ1)
- hPSCコロニーが70%〜80%のコンフルエンシーに達したら、温かいPBSで2回洗浄し、組織培養フード内のポータブル真空吸引器を使用して吸引して、ステージ1の分化を開始します。
- CHIR99021を含むステージ1分化培地(ステップ1.2.2から)をコロニーに加え、6ウェルプレートあたり2 mL、37°Cで24時間インキュベートします。
- 翌日、使用済み培地をCHIR99021を含まないステージ1分化培地と交換します(ステップ1.2.3)。
- 24時間ごとに、組織培養フード内のポータブル真空吸引器を使用して使用済み培地を吸引し、CHIR99021を含まない新しいステージ1分化培地と交換します。
注:ステージ1は最大4日間延長できます。ステージ1の長さは、使用するhPSCラインに依存するため、それに応じて最適化する必要があります。
5. hPSC由来DEの免疫蛍光解析(ステージ1)
- 免疫蛍光の場合は、ウェルから組織培養フード内のポータブル真空吸引器を使用して使用済み培地を吸引し、温かいPBSで2回洗浄します。プレートを回転させて、細胞の破片を取り除きます。
- ウェルの表面を4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で覆い、DE細胞を固定します。例えば、24ウェルプレートのウェルあたり250 uLのPFAを追加します。プレートを20 x g の2Dシェーカーに20分間置きます。
- 固定後、DE細胞を0.5%のトゥイーン(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄し( 材料の表を参照)、プレートを20 x g のシェーカーに10分間置きます。この手順をもう一度繰り返します。
- 0.5%のTriton X-100(PBST)を含むリン酸緩衝生理食塩水をたっぷりと添加することにより、固定細胞を透過処理します。例えば、24ウェルプレートのウェルあたり1 mLのPBSTを加え、プレートを20 x g のシェーカーに20分間戻します。
- ブロッキングバッファーとしてPBST中のBSAの5%〜6%を新たに調製し、透過処理細胞に加えます。プレートをシェーカーのブロッキング溶液中で少なくとも1時間インキュベートします。
- SOX17とFOXA2に対する一次抗体をPBST溶液中の2%〜3%BSAで一緒に希釈します( 材料の表を参照)。結合した抗体をブロック細胞に加え、プレートをシェーカーに置き、4°Cで低速で一晩、穏やかに振とうします。
注:SOX17およびFOXA2は、確立されたDEマーカー25,26です。 - 翌日、ポータブル真空フィルターを使用して一次抗体を吸引し、TBSTでウェルを3回洗浄し、それぞれ振とう機で10分間洗浄します。
- 一次抗体を産生させた種に対するAlexa fluor 488および568結合二次抗体( 材料の表を参照)の1:500希釈を準備します。
- 二次抗体の組み合わせを染色ウェルに加え、光から保護するためにプレートをアルミホイルで覆います。プレートをシェーカーに室温で1時間置きます。
- ポータブル真空フィルターを使用して二次抗体溶液を吸引し、染色したウェルをシェーカー上でTBSTで10分間洗浄し、プレートをホイルで覆います。洗浄ステップを合計3回繰り返します。
- 核を染色するために、PBSで1 μg/mLのヘキスト33342希釈液を調製します。Hoechst溶液をウェルに加え、プレートをシェーカーに2〜3分間置きます。
- ポータブル真空フィルターを使用してヘキスト溶液を吸引し、PBSでウェルを2回すすぎます。
- 最後に、染色した細胞にPBSを加え、暗所で倒立蛍光顕微鏡( 材料表を参照)を使用してイメージングします。イメージングを行わないときは、プレートをホイルで覆って、蛍光色素の漂白を最小限に抑えます。
注:あるいは、フローサイトメトリーを使用して、ステップ9.2で説明されているようにDE効率を評価することもできます。
6. hPSCからの原始腸管(PGT)の生成(ステージ2)
注:ステップ5.13の免疫蛍光分析が80%以上のSOX17-FOXA2共発現であると判断された場合、実験はステージ2に進みます。効率が<80%の場合は、ステージ1の期間を4日に延長します。
- ステージ2の1日目に、最適化されたP2-DプロトコルのためにTrypLEまたはアキュターゼ( 材料の表を参照)を使用してhPSC由来の内胚葉細胞を解離します。接着細胞を温かいPBSで洗浄し、6ウェルプレートのウェルあたり温かい1 mLのTrypLEまたはAccutase溶液を37°C、5%CO2 で3〜5分間、または細胞が互いに剥離し始めるまで加えます。
- ウェル内の剥離したシートまたは単層の細胞を解離し、ウシ胎児血清(FBS)またはKnockOut血清(KOSR)のいずれかを少なくとも0.5%含むサイトカインを含まない基礎ステージ1/2培地を使用して、15 mLポリプロピレンチューブにまとめて収集します( 材料の表を参照)。
- 細胞を800 x g で4°Cで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。1 mLの滅菌PBSを加え、ペレットを単一細胞に再懸濁します。
- チャンバースライドに推奨量のセルをロードすることにより、自動カウンター( 材料表を参照)を使用してセルをカウントします。再懸濁した細胞を800 x g で4°Cで5分間スピンさせ、上清を廃棄します。
- ペレットを、Rock阻害剤を含む適切な容量のステージ2分化培地に2.5〜3.5 x 105 細胞/ cm2の密度で再懸濁します。
注:このカウントは、増殖速度に応じて、ほとんどの細胞株で1:2の分裂比に下がる可能性があります。総容量は、6ウェルプレートの1ウェルに細胞を再懸濁した培地2mLになります。 - 再懸濁した細胞を1:50メンブレンマトリックスコーティングプレート(ステップ2で調製)にプレートし、インキュベーター内で37°C、5%CO2 でインキュベートします。
- 24時間後、培地をRock阻害剤を含まないステージ2分化培地(ステップ1.3.2で調製)と交換します。
7. hPSCによる後前腸の作製(ステージ3)
- 組織培養フード内のポータブル真空吸引器を使用して使用済みのステージ2培地を吸引し、温かいPBSで細胞を洗浄します。
- ステップ1.4のステージ3分化培地を細胞に加え、37°C、5%CO2でインキュベートします。
- 24時間後、使用済み培地を新たに調製したステージ3分化培地と交換します。これをP2-Dプロトコル(最適化)の場合は合計4日間、解離していないP1-NDの場合はわずか2日間繰り返します。
8. hPSCからの膵臓前駆細胞の作製(ステージ4)
- ステージ3の処理を4日間行った後、細胞を温かいPBSで洗浄し、プレートを静かに回転させ、ポータブル真空吸引器を使用して吸引します。次に、ステップ1.5のステージ4の分化培地を細胞に追加します。
- 24時間後、使用済みの培地を新しく準備したステージ4の培地と交換します。これを合計4日間繰り返します。
9. hPSCからの膵臓前駆細胞の分化効率の評価
- PDX1およびNKX6.1の発現についてhPSC由来膵臓前駆細胞(ステージ4)の免疫蛍光解析を行う。
注:PDX1およびNKX6.1は、確立された膵臓前駆マーカーです17,18。- ステップ5に従って、固定、透過処理、ブロッキング、および抗体インキュベーションおよび洗浄を行う。
- PBST中の2%〜3%BSAで希釈したPDX1抗体とNKX6.1抗体の組み合わせ( 材料の表を参照)でhPSC由来の膵臓前駆細胞を染色します。
- 適切なAlexa fluor 488および568結合二次抗体の1:500希釈液を使用します(材料の表を参照)。
- PDX1およびNKX6.1の発現に関するhPSC由来膵臓前駆細胞のフローサイトメトリー解析を実行します。
注:生成されたhPSC由来の膵臓前駆細胞における膵臓マーカーのフローサイトメトリー分析は、PDX1およびNKX6.1共発現細胞を定量する方法を提供します。- ステージ4の終わりに、温かいPBSで細胞を2回洗浄し、ウェルの表面を覆うのに十分なTrypLEまたはアキュターゼ、例えば、6ウェルプレートのウェルあたり1mLのTrypLEまたはアキュターゼを追加します。プレートをインキュベーターに5〜7分間、または細胞が表面から剥離するまで入れます。
- P1000マイクロピペットを使用してウェル内の細胞の接着シートを解離してから、15 mLポリプロピレンチューブに回収します。
- hPSC由来の膵臓前駆細胞の細胞を800 x g で4°Cで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。細胞を単一細胞に解離させることにより、PBSで細胞を洗浄します。自動カウンター( 材料表を参照)を使用して細胞をカウントし、mLあたりの細胞数の濃度をメモします。
- 800 x g で4°Cで5分間スピンし、上清を廃棄します。200 μLのチルドPBSをペレットに加え、解離させます。
- 2 mLの冷やした80%エタノールを滴下し、チューブを低速から中速(室温で400 x g )の渦上に置きます。キャップをしっかりと閉め、チューブをシェーカーに少し傾けて4°Cで一晩置きます。
- 細胞を800 x g で4°Cで5分間スピンダウンし、PBSで洗浄して固定細胞の塊を解離させます。
- 固定セルをPBST中の5%-6%BSA溶液で、室温またはシェーカーで一晩4°Cで少なくとも1時間ブロックします。
- 以下の手順に従って、膵臓前駆細胞マーカーの染色を行います。
- 一次抗体の宿主種のIgGサブクラスに依存する適切なアイソタイプコントロール、染色されていない抗体コントロール、二次抗体コントロールを含む、条件ごとに2,00,000個の細胞を96ウェルVボトムプレートまたは1.5 mL遠心チューブに分配します。
- プレートを800 x gで4°Cで5分間スピンダウンし、素早い動きでプレートを裏返し、ペレットを失うことなく上清を廃棄します。3%BSA溶液で一次抗体希釈液を調製します(材料表を参照)。
注:一次抗体の濃度は1:50から1:200の間ですることができます。 - 染色した細胞を室温で少なくとも2時間、または低速で穏やかに振とうしながら振とう機で4°Cで一晩インキュベートします。
- 染色した細胞をTBSTで3回洗浄し、ウェル内で細胞を上下にピペッティングします。ステップ9.2.8.2のように上清をスピンして廃棄します。
- PBSで調製した二次抗体(Alexa fluor 488および647標識抗体)を1:500希釈します( 材料の表を参照)。室温で30分間インキュベートします。
- 染色した細胞をTBSTで少なくとも2回、ピペッティングして上下に洗浄します。プレートを回転させ、ステップ9.2.8.2のように上清を廃棄します。
- 染色した細胞を少なくとも100 μLのPBSに集め、光で保護されたFACSチューブに移します( 材料の表を参照)。サンプルをフローサイトメトリーマシンで実行します。
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Representative Results
結果は、最適化されたプロトコルP2-D(図1A)がPDX1とNKX6.1の共発現をアップレギュレートすることによって膵臓前駆細胞分化効率を高めることを示しています(図2A、B、および図3A)。特に、結果は、以前に発表された研究から変更された非解離プロトコル(P1-ND)と比較して、ステージ3のより長い期間とともに、内胚葉細胞の解離と新鮮な膜マトリックス上での再メッキがhPSC由来の膵臓前駆細胞(最適化されたプロトコル、P2-D)(図2および図3A)におけるNKX6.1発現を増強したことを示しました27。.また、本拡張プロトコルは、「P1-D」(プロトコル1、S3=2日、解離)および「P2-ND」(プロトコル2、S3=4日、非解離)と比較してPDX1+/NKX6.1+前駆細胞の割合が最も高く、詳細な結果は以前に公開されています21。P2-Dを用いて作製された膵臓前駆細胞も、解離していないP1-NDと比較してSOX9+細胞数が増加しています(図3B)。最適化された方法では、増殖マーカーKi67を共発現する増殖性NKX6.1+細胞の割合も高くなりました(図3C)。
ここで提示する代表的な結果は、対照の健常個体の末梢血単核球(PBMC)から作製したiPS細胞からのものである。しかし、H1-hESC、H9-hESC、HUES8-hESC、および他のいくつかのコントロールiPSc株などの複数のhPSC株に現在の拡張プロトコルを再現可能に適用し、~90%のPDX1およびNKX6.1共発現膵臓前駆細胞20,21,28を得ました。
hPS細胞におけるDE誘導に続いて、軽度の細胞死が予想されます。ただし、高い細胞死率が観察された場合は、実験を中止し、新しい細胞バッチで再開しました。DE誘導の効率は、膵臓前駆細胞誘導の理想的な出発源となる培養中のDE細胞の割合を高くするために、70%〜80%より高くする必要があります(図1C)。
解離後の内胚葉細胞の再めっきの密度は、その特定の細胞の増殖速度に基づいて操作することができる。例えば、成長の遅い細胞は、推奨よりも高い密度で再播種され得る。これにより、ステージ4で無関係な膵臓集団を取得する可能性が最小限に抑えられます。PDX1とNKX6.1の高い共発現は、ステージ1後の解離と半密度での再メッキ後に得られます(図1A、図2A、B、および図3A)。 PDX1の高発現が観察されてもNKX6.1の発現が中程度である場合、ステージ4を2日間延長して、PDX1発現細胞におけるNKX6.1発現を増強することができます。
図1:膵臓前駆細胞分化中のサイトカインと成長因子の添加のタイムライン 。 (A)hPSCからのPDX1およびNKX6.1の生成に最適化されたプロトコル(P1-D)の概略図。hPSC由来の決定的な内胚葉(DE)は解離され、半密度で再メッキされ、その後、膵臓前駆細胞の運命に順次向けられます。(B)0日目に分化を開始する前の明視野でのhPSCの画像。(C)hPSC由来内胚葉(ステージ1)細胞における内胚葉マーカーSOX17およびFOXA2の発現に関する免疫染色解析。SOX17、緑。フォクサ2、赤。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PDX1とNKX6.1を共発現するhPSC由来の膵臓前駆細胞の作製。 強化されたプロトコル(P2-D)(A)および最適化されていない以前に公開されたプロトコル(P1-ND)(B)を使用した、hPSC由来の膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1発現の比較のための免疫染色分析。強化されたプロトコルは、PDX1とNKX6.1の最高の共発現を達成しました。PDX1、緑。NKX6.1、赤。拡大画像は、各プロトコルの2番目のパネルに提供されます。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:拡張プロトコルを使用して生成された膵臓前駆細胞の膵臓マーカーの定量化。 hPSC由来の膵臓前駆細胞におけるフローサイトメトリー解析は、解離していないP1-NDと比較してP2-Dを用いて得られた。(A)PDX1およびNKX6.1発現のヒストグラムおよびダブルポジティブ染色グラフ。(B)SOX9発現のヒストグラムおよび(C)NKX6.1と増殖マーカーKi67との共発現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 舞台 | メディア | サイトカイン | 日 | ||||||
| 1 | MCDB 131培地 + 0.5% 脂肪酸フリーウシ血清アルブミン (FFA-BSA)、1.5 g/L 重炭酸ナトリウム (NaHCO3)、10 mM グルコース | 1日目:2 μM CHIR99021、100 ng/mLアクチビンA、10 μMロック阻害剤(Y-27632)、0.25 mMビタミンC 2 日目以降:100 ng/mLアクチビンA、0.25 mMビタミンC | 3 または 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131培地 + 0.5% 脂肪酸フリーウシ血清アルブミン (FFA-BSA)、1.5 g/L 重炭酸ナトリウム (NaHCO3)、10 mM グルコース | 1日目(解離):50 ng/mL FGF10、50 ng/mL ノギン、0.25 μM CHIR99021、10 μM Y-27632(岩石阻害剤)、0.25 mM ビタミンC 2日目:50 ng/mL FGF10、50 ng/mL ノギン、0.25 μM CHIR99021、0.25 mM ビタミンC | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4.5 g/L グルコース | 2 μM レチノイン酸、0.25 μM サント-1、50 ng/mL FGF10、50 ng/mL ノギン、0.25 mM ビタミン C、ビタミン A を含まない 1% B27 サプリメント | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4.5 g/L グルコース | 100 ng/mL EGF、10 mM ニコチンアミド、50 ng/mL ノギン、0.25 mM ビタミン C、ビタミン A を含まない 1% B27 サプリメント。 | 4 | ||||||
表1:研究で使用された異なる分化培地の組成。
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Discussion
この研究では、PDX1とNKX6.1の高い共発現を持つhPSCから膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルについて説明します。新鮮なマトリックス上での半密度でのhPSC由来内胚葉の解離および再メッキは、hPSC由来膵臓前駆細胞においてより高いPDX1およびNKX6.1をもたらした。
各ステージの成長因子カクテルはP1-ND27と非常に類似していますが、FGFとレチノイドシグナル伝達、BMPとヘッジホッグの阻害を含むより拡張されたステージ3の治療はNKX6.1の発現を増加させることが示されています。胚発生中の膵臓におけるPDX1発現は、FGFおよびレチノイドシグナル伝達ならびにBMPおよびヘッジホッグ阻害によって正に調節されるが27、29、30、本結果は、このシグナル伝達カクテルの伸長がNKX6.1もアップレギュレーションすることを実証した。それにもかかわらず、延長されたステージ3治療の効果は、PDX1およびNKX6.1発現の増加をもたらした内胚葉細胞の解離および再メッキによって支援された。さらに、この方法(P2-D)は、増殖マーカーKi67を共発現する増殖性NKX6.1+細胞の割合に加えて、hPSC由来の膵臓前駆細胞のSOX9発現細胞も増加させました。
分化の効率に影響を与える別の重要な要因は、解離した細胞への新しい膜マトリックスの利用可能性でした。細胞外マトリックス成分は、幹細胞運命仕様31,32を調節することが以前に実証されている。全体として、膵臓の発達に対する細胞外マトリックス成分の好ましい効果が記録されており33,34,35、特に膜マトリックスについては、ラミニンとともに、膵臓系譜細胞に対して内分泌促進効果を有することが示された36。したがって、新鮮な膜マトリックス上の内胚葉細胞を再播種すると、hPSC由来の膵臓前駆細胞におけるNKX6.1発現が増強された可能性があります。
分化細胞の細胞密度も遺伝子発現を制御します。複数の研究により、膵臓の発達を調節する上での細胞間接触の重要性が実証されています37,38,39。細胞凝集または胚様体形成は、2D培養よりも高い膵臓内分泌遺伝子発現を誘導することが示されている19。しかし、結果は、より高い膵臓発現、特にNKX6.1が、最適化されたプロトコル21を使用して内胚葉密度の半分で2D単層で細胞を培養することによって得られることを示しています。興味深いことに、この方法は、肝遺伝子AFP(アルファフェトプロテイン)とALB(アルブミン)の発現低下によって気づかれるように、肝細胞の運命(hPSC由来DEの代替運命)も阻害し21、物理的要因がhPSCの系統指定に関与していることが示されました。
全体として、結果は、分化細胞の物理的環境を調節することが膵臓遺伝子発現を増強できることを実証する21。具体的には、hPSC由来の内胚葉の解離と、より長いFGFとレチノイドシグナル伝達、およびヘッジホッグとBMPの阻害を伴う新鮮な膜マトリックスへの再メッキは、hPSC由来の膵臓前駆細胞におけるPDX1とNKX6.1の共発現を高めることができます。ただし、最適化されたプロトコルは、以前に公開されたプロトコルよりも少なくとも 2 日間長くなっています。また、ステージ4の長さは、使用されている細胞株に基づいて、推奨される最小値、すなわち4日間を超えて延長され得る。最適化されたプロトコルでは、複数の組換えヒト成長因子が採用されており、同じ作用を発揮するより安価な低分子化合物で置き換えることができます。それにもかかわらず、この最適化されたプロトコルは、細胞療法および疾患モデリングのためのhPSCからの膵臓前駆細胞のスケーラブルな生成を促進することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、カタール国立研究基金(QNRF)からの助成金によって資金提供されました(助成金番号。NPRP10-1221-160041)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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