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Bioengineering

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63320
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

고전적 부위-지시된 돌연변이유발의 한계를 극복하기 위해, 특이적 변형을 갖는 프롤린 유사체를 몇몇 형광 단백질에 혼입시켰다. 우리는 수소를 불소로 대체하거나 프롤린 잔기의 이중 결합에 의한 단일 ( "분자 수술")이 접힘 및 빛과의 상호 작용을 포함한 근본적인 단백질 특성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

Abstract

나머지 19개의 정준 아미노산 중 어느 하나에 의한 전통적인 부위 지향 돌연변이유발에 의한 단백질 내의 프롤린(Pro) 잔기의 대체는 종종 단백질 폴딩 및 특히 녹색 형광 단백질 및 관련 변이체에서의 발색단 성숙에 해롭다. 합리적인 대안은 모든 Pro 잔기가 유사체에 의해 특이적으로 잔기 로 대체되도록 단백질의 번역을 조작하는 것인데, 이는 선택적 압력 혼입 (SPI)으로 알려진 방법이다. 내장 된 화학적 변형은 측정 가능한 변화를 미세하게 해부하거나 다른 단백질 특성을 합리적으로 조작하는 일종의 "분자 수술"로 사용될 수 있습니다. 여기에서이 연구는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 스펙트럼 변이체의 전형적인 β 배럴 구조의 조직에서 프롤린의 역할을 연구하는 SPI 방법의 유용성을 보여줍니다 : 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP), NowGFP 및 KillerOrange. 프로 잔기는 개별 β-가닥 사이의 연결 섹션에 존재하며 배럴 스캐폴드의 폐쇄 뚜껑을 구성하며, 따라서 물로부터의 발색단의 절연, 즉 형광 특성을 담당한다. 선택적 압력 혼입 실험은 (4R)-플루오로프롤린 (R-Flp), (4S)-플루오로프롤린 (S-Flp), 4,4-디플루오로프롤린 (Dfp), 및 3,4-데하이드로프롤린 (Dhp)을 발현 숙주로서 프롤린-영양영양 대장균 균주를 사용하여 수행하였다. 우리는 S-Flp 및 Dhip를 가진 형광 단백질이 활성 (즉, 형광)인 반면, 다른 두 유사체 (Dfp 및 R-Flp)는 기능 장애, 잘못 접힌 단백질을 생성한다는 것을 발견했습니다. UV-Vis 흡수 및 형광 방출 프로파일의 검사는 Pro 유사체를 함유하는 단백질에서 거의 특징적인 변화를 보이지 않았다. EGFP 변이체에서 폴딩 동역학 프로파일의 조사는 S-Flp의 존재하에 가속화된 리폴딩 과정을 보인 반면, 그 과정은 Dhp를 함유하는 단백질에서 야생형과 유사하였다. 이 연구는 관심있는 다른 단백질의 연구에 채택 될 수있는 원자 수준에서 단백질 잔기의 미묘한 변형을 생성하는 SPI 방법 ( "분자 수술")의 능력을 보여줍니다. 이는 β-배럴 형광 단백질의 부류에서 폴딩 및 분광학적 특성에 대한 근접한 화학적 유사체를 사용한 프롤린 대체의 결과를 예시한다.

Introduction

고전적 부위-지시된 돌연변이유발은 DNA 수준에서 코돈 조작에 의해 임의의 기존 유전자-코딩된 단백질 서열의 순열을 허용한다. 단백질 폴딩 및 안정성을 연구하기 위해, 유사한 아미노산을 유사한 대응물로 대체하는 것이 종종 바람직하다. 그러나 전통적인 단백질 돌연변이 유발은 Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe와 같은 표준 유전자 코드 레퍼토리에 존재하는 정식 아미노산 간의 구조적으로 유사한 대체로 확실히 제한됩니다. 한편, Trp, Met, His, 또는 Pro와 같은 다른 정준 아미노산에 대해서는 그러한 가능성이 없으며, 이는 종종 단백질1에서 필수적인 구조적 및 기능적 역할을 한다. 단백질의 고도로 특정한 내부 구조 및 이들의 폴딩 과정의 맥락에서 이러한 상호작용을 연구하는 이상적인 접근법은 비파괴적 등염색 변형을 생성하는 것이다. 실제로, 비정준 아미노산(ncAAs)이라고도 알려진 이러한 정준 아미노산의 등멸균 아미노산 유사체가 단백질에 삽입될 때, 이들은 "원자 돌연변이"2로 알려진 H/F, CH2/S/Se/Te와 같은 단일 원자 또는 원자 그룹의 수준에서도 미묘한 변화를 허용한다. 이러한 "분자 수술"은 단일 원자 또는 원자 그룹의 교환만으로 인한 성질을 가진 변경된 단백질을 생산하며, 유리한 경우에는 분석 할 수 있으며 검출 된 변화를 합리화 할 수 있습니다. 이런 식으로, 단백질 폴딩 및 구조를 연구하기 위한 단백질 합성의 범위는 고전적인 DNA 돌연변이유발을 훨씬 넘어서 확장된다. 부위 지향 돌연변이 유발에 의해 생성된 단백질은 일반적으로 "돌연변이"로 지칭되는 반면, 치환된 정준 아미노산을 갖는 단백질은 "변이체" 3, "동종 단백질"4 또는 "단백질 동족체"5로 지칭된다.

해양 생물 Aequorea victoria에서 처음 확인 된 녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선에서 청색광까지 노출 될 때 밝은 녹색 형광을 나타냅니다 6,7. 오늘날 GFP는 형광 현미경을 통해 세포에서 유전자 발현 및 단백질 국소화의 일상적인 시각화를위한 매우 민감한 표지 도구로 일반적으로 사용됩니다. GFP는 또한 다양한 생물 물리학 8,9,10 및 생물 의학 11,12 연구뿐만 아니라 단백질 공학 13,14,15에서 유용하다는 것이 입증되었습니다. GFP 구조의 엄격한 분석은 다양한 안정성 및 형광 최대16,17을 특징으로 하는 수많은 변이체의 생성을 가능하게 하였다. 세포 및 분자 생물학에 사용되는 GFP 변이체의 대부분은 용액 및 결정18 내의 단량체 단백질이다. 그들의 주요 구조 조직은 계통 발생 기원과 관계없이 GFP 패밀리의 모든 구성원에게 전형적이며 소위 β 배럴을 형성하는 11 개의 β 가닥으로 구성되며 꼬인 α나선은 배럴의 중심을 통과하여 발색단을 지니고 있습니다 (그림 1A). 발색단의 자가 촉매 성숙 (그림 1B)은 단백질의 중앙 위치에서 그것을 둘러싼 측쇄의 정확한 위치를 필요로합니다. 이들 측쇄 중 다수는 다른 GFP 변이체(19)에서 고도로 보존된다. Aequorea victoria와 같은 해파리의 대부분의 형광 단백질에서 녹색 방출 발색단은 Tyr66의 페놀 고리와 이미다졸리논의 다섯 원 헤테로 고리 구조를 포함한 두 개의 방향족 고리로 구성됩니다 (그림 1B). 발색단은 단백질 매트릭스에 적절하게 매립 될 때 전체 단백질의 특징적인 형광을 담당합니다. 이는 구조물의 중앙에 위치하는 반면, 배럴 구조는 그것을 수성 매질(20)로부터 절연시킨다. 벌크 물에 발색단의 노출은 형광 담금질, 즉 형광21의 손실을 초래할 것이다.

배럴형 구조의 적절한 폴딩은 형광 담금질(22)으로부터 발색단을 보호하는 데 필수적이다. 프롤린(Pro) 잔기는 GFP23의 구조 조직에서 특별한 역할을 한다. β 가닥을 지원할 수 없기 때문에, 그들은 전체적으로 단백질 구조를 유지하는 책임이있는 연결 루프를 구성합니다. 놀랍지 않게도, 10-15개의 프롤린 잔기는 Aequorea- 및 Anthoathecata-유래 GFP 둘 다에서 발견된다; 그들 중 일부는 다른 유형의 형광 β 배럴 단백질에서 고도로 보존됩니다. 프롤린은 독특한 기하학적 특성으로 인해 접이식 특성에 중대한 영향을 줄 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 아에쿠레아 유래 GFPs에서, 열 개의 프롤린 잔기 (도 2A) 중에서, 아홉 개의 형태는 트랜스-펩티드 결합 (Pro89)을 형성하고, 오직 하나만이 시스-펩티드 결합을 형성 한다 (Pro89). Pro58은 필수적이며, 즉, 나머지 19개의 표준 아미노산과 교환할 수 없습니다. 이 잔기는 Trp57 잔기의 정확한 포지셔닝을 담당할 수 있으며, 이는 발색단 성숙 및 전체 GFP 폴딩24에 결정적이라고 보고되었다. 세 개의 프롤린 잔기 (Pro54, Pro56, Pro58) 및 Trp57을 갖는 PVPWP 단편은 도 1A로부터의 GFP 구조에서 "하부 뚜껑"의 필수적인 부분이다. PVPWP 구조 모티프는 시토크롬 및 진핵 전압-활성화된 칼륨 채널(25)과 같은 몇몇 단백질에서 발견된다. 위치 75 및 89에서의 프롤린-알라닌 치환은 또한 단백질 발현 및 폴딩 및 발색단 성숙을 폐지하는데 해롭다. Pro75 및 Pro89는 발색단을 매장하는 "상부 뚜껑"의 일부이며(도 1A), 11가닥 β-배럴 형광 단백질(23)에 걸쳐 보존된다. 이들 두 개의 "뚜껑"은 안정한 삼차 구조가 부분적으로 파손된 경우에도 수성 용매로부터 발색단을 배제하도록 유지한다(26). 이러한 특정 분자 구조는 예를 들어, 물, 산소, 또는 다른 확산성 리간드에 의해, 충돌(dynamic) 형광 소광으로부터 형광단을 보호한다.

GFP 구조의 분자 공학을 수행하기 위해서는 단백질의 일차 구조에 아미노산 치환을 도입해야합니다. GFP에서 수많은 돌연변이가 수행되어 높은 안정성, 빠르고 신뢰할 수 있는 폴딩 및 가변 형광 특성을 갖는 변이체를 제공하였다17. 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우, 프롤린 잔기의 돌연변이는 나머지 19개의 정준 아미노산 중 어느 것도 프롤린 잔기27의 형태적 프로파일을 적절하게 복원할 수 없다는 사실 때문에 위험한 접근법으로 간주된다. 따라서, 프롤린 잔기가 프롤린 유사체28로 불리는 다른 프롤린-기반 구조로 대체되는 대안적인 접근법이 개발되었다. 독특한 순환 화학 구조로 인해 프롤린은 두 가지 특징적인 형태 전이를 나타냅니다 (그림 1C) 프롤린 링 퍼커링, 주로 φ 비틀림 각도에 영향을 미치는 백본의 조직을 수반하는 빠른 공정 및 2) 펩티드 결합 시스 / 트랜스 이성체화, ω 비틀림 각도를 통해 백본 폴딩에 영향을 미치는 느린 프로세스. 느린 특성으로 인해, 후자의 전이는 일반적으로 전체 단백질의 폴딩 과정에서 속도 제한 단계를 담당합니다. 일부 프롤린 잔기 주위의 펩티드 결합 시스/트랜스 이성체화는 GFP 변이체의 폴딩에서 느린 단계를 특징으로 한다는 것이 이전에 입증되었다. 예를 들어, Pro89에서 시스-펩티드 결합의 형성은 트랜스에서 시스29로의 결합 전이에 의존하기 때문에 폴딩 과정에서 느린 단계를 특징으로 한다. Pro89를 모든 트랜스 펩티드 루프로 대체한 후, 즉 시스-트랜스 이성체화 이벤트(30)를 폐지함으로써 더 빠른 재폴딩이 달성될 수 있다. 시스/트랜스 이성체화 이외에도, 퍼커 전이는 또한 백본 조직 및 단백질 내부27,31 내의 패킹으로 인해 단백질 폴딩에 심오한 변화를 일으킬 수 있다.

화학적 변형은 프롤린 잔기의 본질적인 형태적 전이의 변화를 초래하여, 단백질의 접는 능력에 영향을 미친다. 특정 프롤린 유사체는 폴딩 특성의 조작 및 연구를 허용하기 때문에 단백질에서 프롤린 치환에 특히 매력적인 후보이다. 예를 들어, (4R)-플루오로프롤린 (R-Flp), (4S)-플루오로프롤린 (S-Flp), 4,4-디플루오로프롤린 (Dfp), 및 3,4-데히드로프롤린 (Dhp)은 분자 부피 및 극성32 모두에서 프롤린과 최소한으로 상이한 4개의 유사체 (도 1D)이다. 동시에, 각 아날로그는 뚜렷한 고리 퍼커링을 나타낸다: S-Flp는 C4-엔도퍼커를 안정화시키고, R-Flp는C4-엑소퍼커를 안정화시키고, Dfp는 명백한 퍼커 선호도를 나타내지 않으며, Dhp는 퍼커링을 폐지한다(도 1D)33). 단백질 구조에서 이들 유사체를 사용함으로써, 프롤린 잔기의 형태적 전이와 함께 조작할 수 있고, 이것으로 생성된 GFP 변이체의 특성에 영향을 미친다.

이 작업에서, 우리는 선택적 압력 혼입 방법 (SPI, 그림 3)34를 사용하여 GFP 변이체의 구조에 지정된 프롤린 유사체 세트 (그림 1D)를 통합하기 시작했습니다. 아미노산 잔기를 가장 가까운 등구조 유사체로 대체하는 것은 단백질 설계35,36에 적용된 생명공학적 개념이다. 따라서, 모델 단백질에서 프롤린 유사체의 효과는 단백질 공학37에서 도구로서 기능할 수 있는 그들의 잠재력을 예시한다. 목적하는 유사체를 함유하는 단백질의 생산은 프롤린(proline-auxotrophy)을 생산할 수 없는 변형된 대장균 균주에서 수행되었다. 따라서, 그들은 단백질 생합성(38)의 과정에서 기질의 대체를 수용하도록 강요될 수 있다. 프롤린의 이러한 글로벌 치환은 내인성 아미노아실-tRNA 신테타제39의 천연 기질 유연성에 의해 활성화되며, 이는 tRNA와 적절한 아미노산(40)의 에스테르화를 촉매하는 핵심 효소이다. 일반적으로, 도 3에 요약된 바와 같이, 세포 성장은 중간 대수 성장 단계에 도달할 때까지 정의된 배지에서 수행된다. 다음 단계에서, 대체될 아미노산은 발효 동안 발현 시스템으로부터 세포내 고갈되고, 이어서 원하는 유사체 또는 ncAA에 의해 교환된다. 표적 단백질 발현은 이어서 잔기 특이적 비-정준 아미노산 혼입을 유도한다. 동족 아미노산을 그의 유사체로 치환하는 것은 프로테옴 넓은 방식으로 일어난다. 이러한 부작용이 숙주 균주의 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있지만, 표적 단백질 생산의 질은 대부분 영향을 받지 않는데, 이는 재조합 발현에서, 세포 자원이 주로 표적 단백질41,42의 생산에 지시되기 때문이다. 따라서, 엄격하게 조절된, 유도성 발현 시스템 및 강력한 프로모터는 높은 혼입 효율(43)에 결정적이다. 우리의 접근법은 센스 코돈 (센스 코돈 재할당)에 응답하여 ncAAs의 다중 잔기 특이적 혼입에 기초하며, 이에 의해 표적 유전자 내에서, 프로 아날로그 삽입을 위한 위치의 수는 부위-지향 돌연변이유발44를 통해 조작될 수 있다. 항균 특성을 갖는 재조합 펩티드의 제조에 관한 우리의 이전 보고서(45)에도 유사한 접근법이 적용되었다. 이 작업에서는 모든 프롤린 잔기를 관련 유사체로 대체 할 수있는 SPI 방법을 적용하여 정준 아미노산 레퍼토리로 합성 된 단백질에 존재하지 않는 뚜렷한 물리 화학적 특성을 가질 것으로 예상되는 단백질을 생성합니다. 결과 변이체의 폴딩 및 형광 프로파일을 특성화함으로써, 우리는 GFP의 변이체에서 원자 치환의 효과를 보여주는 것을 목표로합니다.

Protocol

1. 발현 플라스미드를 유능한 Pro-auxotrophic E. coli 세포로의 도입

  1. 각 시료 플라스미드 1 ng, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H 6-NowGFP 및 pQE-80L H 6-KillerOrange를 50 μL의 화학적으로 유능하거나 전기적격 세포인 프로영양영양 대장균 K12-유래 균주 JM83(Addgene #50348, 또는 ATCC #35607)과 혼합하여 열충격법 또는 전기천공이 가능한 프로토콜에 따라 형질전환시키는46, 47년.
    참고: 발현 벡터 pQE-80L EGFP-H 6은 C-말단 6xHis-태깅된 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 코딩하고, 발현 벡터 pQE-80L H 6-NowGFP 및 pQE-80L H 6-KillerOrange는 pQE-80L 플라스미드 백본에서 각각 N-말단 6xHis-태깅된 NowGFP48 또는 N-말단 6xHis-태깅된 KillerOrange49를 각각 인코딩한다. 모든 표적 유전자는 lac 오퍼레이터에 의해 조절되는 박테리아 T5 프로모터의 제어 하에 있다. 암피실린 내성은 복제 기점으로서 선택 마커로서 그리고 colE1을 사용하였다. pQE-80L 플라스미드에 대한 추가 정보는 재료 표를 참조한다. 균주 K-12 및 B로부터 기원한 대안적인 프로영양영양 대장균은 발현에도 사용될 수 있으며 유사한 결과를 산출해야 한다. H6-태깅된 단일 양성자화된([M+H]+) 야생형 단백질(발색단 성숙 후)의 계산된 분자 질량은 27,745.33 Da (EGFP-H6), 27,931.50 Da (H6-NowGFP), 및 27,606.09 Da (H6-KillerOrange)이다. 표적 단백질의 일차 구조는 표 1에 제시되어 있다 (His-tag 밑줄이 그어짐). NowGFP의 His-tag 서열 내의 글루타민 (Q)은 Pletnev et al.51로부터 받은 NowGFP cDNA를 pQE-80L 플라스미드 내로 서브클로닝한 후 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 단백질 정제 또는 형광 단백질의 특성을 방해하지 않습니다.
  2. 세포를 950 μL의 SOC 배지에서 37°C에서 1시간 동안 회수하였다.
  3. 회수된 세포 50μL를 글루코스(10g/L)와 암피실린(100μg/mL)이 포함된 루리아 아가(LA) 배지 플레이트( 보충 자료 참조)에 퍼뜨립니다.
  4. LA 배지 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 또는 30°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.

2. 재조합 야생형 형광 단백질(정식 프롤린을 보유함)의 생산 및 프롤린 유사체(S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)를 이용한 형광 단백질을 생산하기 위한 선택적 압력 혼입(SPI) 절차

  1. pQE-80L EGFP-H6, pQE-80L H6, pQE-80LH6-NowGFP 및 pQE-80LH6-킬러오렌지를 보유하는 프로영양영양 대장균 K12 유래 균주 JM83의 하룻밤 배양
    1. 멸균 피펫 팁 또는 접종 루프를 사용하여 LA 배지 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 세포를 멸균된 14mL 폴리스티렌 배양 튜브에 5mL의 라이소제니 브로스(LB) 배지( 보충 자료 참조, 100 μg/mL 암피실린 포함)에 재현탁시킵니다.
      참고 : 갓 변형 된 식민지는 예방 접종을 위해 권장됩니다. 4°C에서 저장된 LA 배지 플레이트 (단계 2.2부터) 상의 세포는 며칠 이내에 사용되어야 한다.
    2. 세포 배양물을 200-250 rpm의 오비탈 진탕기에서 37°C에서 밤새 성장시켰다.
  2. 재조합 EGFP-H의 제조6, H6- NowGFP와 H6-KillerOrange와 네이티브 프롤린과 프롤린 유사체를 가진 상응하는 단백질 변이체
    1. 신선한 NMM 배지 200 mL (7.5 mM (NH4)2SO4, 50 mMK2HPO4및 22 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl,1 mM MgSO4, 20mM D-글루코스, 1 μg/mL FeCl2, 1 μg/mLCaCl2, 10 μg/mL 티아민, 10 μg/mL 비오틴, 0.01 μg/mL 미량 원소 (CuSO4, ZnCl2,MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7.2) 모든 정준 l-아미노산 (50 mg/L); 보충 자료 참조) 100 μg/mL 암피실린과 2-L 삼각플라스크에서 하룻밤 배양물을 2 mL로 보충하였다.
      참고: 단백질의 종류에 따라 MOPS 배지52, 글루코스-미네랄 염 배지 53, 데이비스 최소 배지 54, M9 최소 배지55 또는 GMML56과 같은 대체 배양 배지를 테스트하여 단백질 수율을 최적화할 수 있습니다.
    2. 세포를 220 rpm의 오비탈 진탕기에서 37°C에서 ∼3 h 30분 동안 인큐베이션한다.
    3. ~0.7의 OD600 값에 도달할 때까지 분광광도계에서30분마다 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도를 측정한다.
      참고: 분광 광도계에서 OD600 측정을 위해서는 큐벳의 경로 길이가 1cm여야 합니다. 상응하는 배양 배지는 기준("제로") 측정에 사용된다. ~0.7의OD600 값에 도달할 때까지의 배양 시간은 배양 부피에 따라 달라질 수 있다. 3 시간 30 분은 대략적인 값입니다. 프로토콜 서브 단계 2.2.1-2.2.3.의 변형에서, 서브 단계 2.1.2로부터의 배양. 제한된 농도의 프롤린(예를 들어, 50mg/L 대신 5mg/L)으로 보충된 신선한 NMMΔPro 배지( 보충 자료 참조)를 접종하는데 사용되며, 세포는 220rpm의 오비탈 진탕기에서 37°C에서 밤새 성장한다. 다음날,OD600 결정은 측정값 간의 차이가 0.05 미만이 될 때까지 30분마다 수행된다. 최대OD600 값은 약 1(± 0.3)이어야 합니다. 초기의, 제한된 프롤린 농도는 발현 균주 및 배양 배지에 따라 조정될 수 있다(논의 참조).
    4. 세포 현탁액을 3,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 스핀다운시킨다.
    5. 상층액을 부드럽게 폐기물로 떨어 뜨립니다.
    6. 세척 단계: 세포를 50 mL의 빙냉 NMMΔAA (아미노산이 없는 보충 재료 참조) 또는 NMMΔPro (프롤린 없이, 보충 재료 참조) 배지에 조심스럽게 재현탁시킨다.
      참고: 이 세척 단계에서는 인큐베이션 배지에서 잔류 프롤린을 제거하는 것만이 중요하기 때문에 두 개의 명시된 버퍼 중 하나를 사용할 수 있습니다.
    7. 세포를 3,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기에서 4°C에서 침전시킴으로써 배지로부터 분리하였다.
    8. 상층액을 부드럽게 폐기물로 떨어 뜨립니다.
    9. 세포 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫하여 100 μg/mL 암피실린이 보충된 NMMΔPro 배지 200 mL에 2-L 삼각 플라스크에 재현탁시킨다.
      참고: 생성된 세포 현탁액은 Pro 또는 프롤린 유사체의 존재 하에 단백질 발현을 비교하기 위한 동일한 시작 배양을 얻기 위해 동일한 부피의 여러 샘플로 분리될 수 있다(예를 들어, 100 mL 삼각 플라스크에서 4 x 50 mL로 분리).
    10. Pro의 완전한 고갈을 위해 220 rpm의 오비탈 진탕기에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
      참고: 이 단계는 셀에서 Pro를 완전히 고갈시키는 데 중요합니다.
    11. 50 mM 원액으로부터 L-프롤린 또는 R-Flp, S-Flp, Dfp 및 Dhp의 적절한 부피를 첨가하여 세포 현탁액 중의 1 mM 최종 농도를 조정한다.
      참고: 일반적으로 Pro 또는 프롤린 유도체의 신선한 50mM 스톡 솔루션은 항상 사용 전에 준비해야 합니다. 수용액 중의 특정 정준 또는 비정준 아미노산의 가수분해가 중요하지 않은 경우에만, 냉동 스톡이 또한 사용될 수 있다.
    12. 1 M 원액으로부터 0.5 mM IPTG를 첨가하여 표적 단백질 발현을 유도하였다.
    13. 표적 단백질을 220 rpm의 오비탈 진탕기에서 37°C에서 하룻밤(12 h) 발현시킨다.
    14. 다음날 OD600 을 측정하십시오.
      참고:OD600 결정은 단백질 발현 후 세포의 양을 정량화하기 위해 수행됩니다. 세척 단계 2.2.3 전에 측정된 값과 비교하여 더 낮은OD600 값은 공급된 아미노산의 세포독성을 나타낸다. 이 경우, 제공된 아미노산의 농도가 최소화 된 (0.1 mM까지) 절차를 반복해야합니다.
    15. 원심분리하여 박테리아 세포를 5,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 수집하고, 상층액을 폐기물로 데칸트한다.
    16. 세척 단계: 10% 글리세롤을 함유하는 50 mL의 결합 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT)에 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시키고, 세포 현탁액을 50 mL 원뿔형 폴리스티렌 튜브 내로 옮긴다.
    17. 원심분리하여 박테리아 세포를 5,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 수집하고, 상층액을 폐기물로 데칸트한다.
    18. 세포 펠릿을 추가로 사용할 때까지 -20°C 또는 -80°C의 50 mL 원뿔형 폴리스티렌 튜브에 보관한다(단백질 정제, 하기 참조).

3. 고정화된 금속이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의한 단백질 시료의 정제 절차

  1. 세균성 세포 용해
    참고: 표적 단백질의 분해를 방지하기 위해 얼음 또는 4°C에서 세포 용해의 모든 단계를 수행하십시오.
    1. 박테리아 세포 펠릿을 얼음 상에서 또는 50 mL 원뿔형 폴리스티렌 튜브에서 4°C에서 10-20분 동안 해동시킨다.
    2. 빙냉 결합 완충액 10mL( 보충 자료 참조)를 넣고 위아래로 부드럽게 피펫을 만들어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
    3. 50 mg/mL 라이소자임 100 μL, 1 mg/mL DNase I 100 μL, 1 mg/mL RNase A 100 μL, 1 MMgCl2 30 μL를 첨가한다. 세포 현탁액을 다섯 번 조심스럽게 반전시키고, 닫힌 튜브를 얼음 위에 또는 4°C에서 60분 동안 유지한다.
      참고: Lysozyme은 박테리아 세포벽을 파괴하여 화학 세포 용해를 유도합니다.
    4. 초음파 균질기를 사용하여 세포 파쇄를 위해 샘플을 초음파 처리한다 (예를 들어, 얼음 - 물 혼합물 상의 50 mL 폴리스티렌 튜브에서 3 분 동안 3 회, 펄스 2 s / 일시 정지 4 초, 45 % 진폭).
      참고: 대안적으로, 다른 세포 파쇄 방법, 예를 들어, 14,000 psi에서 20 사이클에서의 고압 균질화가 사용될 수 있다. 필요한 경우 결합 버퍼 ( 보충 자료 참조)를 사용하여 희석하여 최소 기기 부피에 도달하십시오. 또한, 단백질 추출 시약은 세포 파괴에 사용될 수 있다. 예를 보려면 재료 표를 참조하십시오.
    5. 18,000 x g, 4°C에서 60분 동안 원심분리한다.
    6. 3.1.9 하위 단계에 대한 액체 부피를 적어 둡니다. 상층액을 신선한 50 mL 폴리스티렌 튜브에 붓는다.
    7. 공극 직경이 0.45 μm인 멤브레인 필터를 사용하여 상청액을 맑게 한다.
    8. SDS-PAGE에 대한 "용해물"샘플을 채취하십시오 (아래 섹션 4 참조). 이는 하위단계 3.1.6으로부터의 상청액인 "가용성 단백질 분획"에 상응한다.
    9. 하위 단계 3.1.6에서 결정된 대로 동일한 부피의ddH2O를 추가합니다. 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 샘플의 동일한 희석을 유지하기 위해 세포 파편을 재현탁시킨다.
    10. SDS-PAGE에 대한 "펠릿"샘플을 채취하십시오 (아래 섹션 4 참조). 이는 3.1.9 하위단계로부터의 세포 파편 현탁액인 "불용성 단백질 분획"에 상응한다.
  2. 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 정제
    참고: 표적 형광 단백질의 정제는 4°C 또는 실온(RT)에서 수행될 수 있다. 후자의 옵션의 경우, 용해물, 컬럼 및 모든 버퍼가 RT에서 평형을 이루어 따뜻한 컬럼에 배치 할 때 차가운 용액에 갇힌 공기의 기화로 인한 기포 형성을 방지 할 때까지 기다리십시오.
    1. 제조자의 지시에 따라 1 mL 미리 포장되거나 자체 패킹된 IMAC FPLC (고속 단백질 [또는 성능] 액체 크로마토그래피) 컬럼을 사용하여 샘플을 정제하는 단계; 최대 컬럼 압력을 0.3 MPa로 설정하고 유량을 1 mL / 분으로 설정하십시오. 컬럼 평형화를 위한 결합 완충액(보충 자료 참조), 세척 단계를 위한 세척 완충액(보충 자료 참조), 표적 단백질 용출을 위한 용출 완충액(보충 자료 참조)을 사용하십시오.
      참고: 대안적으로, 자동화된 FPLC 시스템은 선형 이미다졸 농도 구배(20-200 mM)를 실행하는 용출 완충액으로 표적 단백질을 용출시키기 위해 적용될 수 있다.
    2. 용출액 분획을 수집하고 형광 단백질로 풀링하십시오 (보이는 녹색 또는 주황색으로 선택하십시오).
    3. 풀링된 분획을 제조자의 지시에 따라 투석막(분자량 컷오프(MWCO) 5,000-10,000)으로 옮기고 투석 완충액 또는 MS 완충액에 대해 적어도 세 번 투석 한다(보충 재료 참조). 예를 들어, 매 라운드마다 적어도 2시간 동안 완충액 100mL에 대해 1mL 샘플을 세 번 투석을 수행한다. 자세한 프로토콜은 Budisa et al.34를 참조하십시오.
    4. 투석된 용출 분획을 PBS 완충액으로 1:100배 희석하여 제조하였다( 보충 자료 참조).
    5. 희석된 샘플의 흡광도 스펙트럼을 UV-Vis 분광광도계에 기록한다.
    6. 램버트-비어 법칙에 근거하여 단백질 농도를 계산하여 특정 파장에서 ε 몰 흡광 계수의 문헌 값을 사용하여 다음과 같이 계산한다 (488 nm에서의 EGFP의 경우 ε488 = 55,000 cm-1· M-1, 493nm에서의 NowGFP ε493 = 53,600 cm-1· M-1, 킬러오렌지 514nm에서 ε514 = 22,600 cm-1· M-1):
      Equation 1 (램버트 맥주 법)
      c 단백질 =단백질 농도 [mg/mL]
      A = 특정 파장에서의 흡광도
      ε = 특정 파장에서의 몰 흡광 계수 [M-1·cm-1]
      d = 큐벳 경로 길이, 여기 1cm
      MW = 단백질의 분자량 [g/mol]
      기준("제로") 측정을 위해 투석 완충액( 보충 자료 참조)을 사용하십시오.
    7. SDS-PAGE에 대한 "용출물"의 샘플을 취하고(아래 섹션 4 참조), 쿠마시 브릴리언트 블루-염색된 겔에 대해 샘플 웰당 1-10 μg의 단백질(이전 단계에 따라 계산됨)을 로딩한다.
      참고: 단백질 밴드 염색에 쿠마시 브릴리언트 블루와 다른 화합물이 사용되는 경우 적용된 염색 방법 및 염료의 민감도에 따라 SDS 샘플 양을 조정하십시오.
    8. 단백질 샘플을 동결시키고 -80°C에서 투석 완충액( 보충 재료 참조)에 저장한다.
      참고: 이 보관 조건 하에서, 단백질 샘플은 적어도 6개월 동안 안정해야 합니다. 대안적인 실험실 UV-Vis 및 형광 분광 광도계는 표적 단백질의 흡수 및 형광 방출 스펙트럼의 기록에 사용될 수 있다. 형광 방출 측정에 다음과 같은 여기 파장을 적용할 수 있습니다: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) 및 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE 샘플 준비

  1. 섹션 3의 샘플 "용출물", "용해물" 및 "펠릿"에 대해 280nm(A280nm)에서 흡광도 A를 결정합니다. 적절한 양의 용출 완충액을 추가하여 프로브 부피를 조정하여 A280nm = 2를 달성하십시오 (최종 프로브 부피는 80 μL 이상이어야합니다).
  2. 파이프팅(예: 80μL의 샘플과 20μL의 5x SDS 로딩 버퍼)을 피펫팅하여 4:1(v/ v)의 비율로 샘플을 5x SDS 로딩 버퍼 20μL와 혼합합니다.
  3. SDS 샘플을 95°C에서 5분 동안 수조 또는 열 블록에서 끓여서 단백질을 변성시킨다.
  4. 샘플을 RT로 냉각시키고 겔에 로딩하기 전에 마이크로원심분리기에서 1분 동안 13,000 x g 에서 프로브를 스핀다운시키십시오.
  5. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 SDS-PAGE에 5-10 μL를 사용하십시오. SDS-PAGE 절차에 대한 자세한 내용은57을 참조하십시오.
    참고: 적용된 염색 방법 및 염료의 민감도에 따라 SDS 샘플 양을 조정하십시오. SDS-PAGE의 결과는 샘플이 목적 단백질의 예상 분자량에 상응하는 밴드에서 전체 단백질의 95% 이상을 함유하는지 확인하기 위해 주의 깊게 점검되어야 한다. 이를 위해, Coomassie-stained gel의 사진을 찍고, 밀도 측정에 의해 원하는 분자량의 단백질 밴드의 강도와 레인 내의 다른 모든 밴드의 강도(있는 경우)를 비교한다. 밴드 강도의 치밀성 평가를 위해, 소프트웨어 ImageJ가 사용될 수 있다(58). 목적하는 단백질 내로의 원하는 ncAAs의 혼입을 실험적으로 증명하기 위해, 전기분무 이온화 시간-비행 질량 분광분석법 (LC-ESI-TOF-MS)에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 무손상 단백질 질량 분석은59에 기재된 바와 같이 수행되어야 한다 (예시적인 장비에 대해서는 프로토콜 섹션 5 및 그 안 의 물질의 표 참조).

5. 단백질 변이체의 형광 방출

  1. 절차를 시작하기 전에 SDS-PAGE 실험의 결과를 확인하여 샘플 순도가 >95%인지 확인하십시오(4.5단계 이후의 참고 사항 참조).
  2. 정제된 각 단백질 변이체의 샘플을 0.3 μM의 농도로 조정하고, 적절한 파장에서 계산된 흡광도 값을 기준으로 취한다(서브단계 3.2.5.). 대략적인 최종 샘플 부피가 200μL인지 확인하십시오.
  3. 희석된 샘플을 RT에서 1 h 동안 평형화시키십시오.
  4. 샘플을 1-cm 석영 큐벳으로 옮기고 형광 분광계( 표 참조)를 사용하여 샘플의 형광 방출 스펙트럼을 측정하고, 다음과 같은 여기 파장을 적용하였다: 488 nm (EGFP의 경우), 493 nm (NowGFP의 경우), 510 nm (KillerOrange의 경우).

6. EGFP 변이체의 변성 및 재접힘

  1. 절차를 시작하기 전에 SDS-PAGE 실험의 결과를 확인하여 샘플 순도가 >95%인지 확인하십시오(4.5단계 이후의 참고 사항 참조).
  2. 300 μM의 농도에서 최종 부피 2 μL의 각 정제된 단백질 변이체 2개의 샘플을 준비한다(3.2.4-3.2.6 하위단계의 단백질 농도 결정 참조).
  3. 8.89 M 우레아 및 5.56 mM DTT를 함유하는 1.11x PBS 완충액 ( 보충 자료 참조) 중 18 μL를 2 μL의 정제된 단백질 변이체 (8 M 우레아 및 5 mM DTT를 함유하는 1x PBS를 수득함)에 첨가하여 변성을 유도하였다.
    참고: 6.4-6.6 단계의 경우 각 샘플을 개별적으로 처리하십시오.
  4. 샘플을 95°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  5. 20 μL 샘플을 5 mM DTT를 함유하는 1x PBS ( 보충 자료 참조) 중 1980 μL를 첨가하여 100배 희석하여 재생을 유도하고, 0.3 μM 최종 단백질 농도를 산출하고, 즉시 200 μL의 샘플을 1-cm 석영 큐벳으로 옮겼다.
    참고: 재생이 즉시 시작되기 때문에 여기에서 빠르게 작업하는 것이 매우 중요합니다.
  6. 석영 큐벳을 적절한 형광 분광계에 삽입하고( 표 자료 참조) 30분에 걸쳐 3초마다 형광 스펙트럼을 획득하여 샘플에서 단백질 리폴딩을 모니터링합니다. 각 단백질 변이체에 대해 첫 번째 샘플에는 295nm 형광 여기를, 두 번째 샘플에는 488nm 형광 여기를 사용합니다.
  7. 재접힘 샘플을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 뚜껑을 닫고, 샘플을 24시간 동안 어둠 속에서 RT에 보관하여 EGFP 변이체의 완전한 재접힘을 허용한다.
  8. 단계 6.6에 따라 재접힌 단백질 샘플의 형광 방출을 측정하기 전에 동일한 여기 파장을 사용하여 형광 회수의 시간적 종점을 포획한다.

Representative Results

연구 초기에, 우리는 모 GFP 아키텍처를 공유하는 세 가지 다른 형광 단백질 변이체를 선택했다. 선택된 첫 번째 단백질은 EGFP였으며, 이는 Phe64Leu/Ser65Thr 돌연변이를 포함하는 해파리 Aequorea victoria에서 원래의 GFP에서 유래한 조작된 변이체이다. 두 번째로 선택된 단백질은 NowGFP 51,60이었다. 또한 선행 형광 단백질을 통해 여러 단계에서 돌연변이 유발에 의해 유도된 A. victoria GFP의 변이체이기도 하다. NowGFP는 직계 전임자 형광 단백질 "Cerulean"61에 비해 18 개의 돌연변이를 포함합니다. 차례로, "Cerulean" 단백질은 강화된 시안 형광 단백질(ECFP)62,63의 유도체로서, 실험실 진화에 의해 이전에 선택된 단백질이며 트립토판 기반 발색단을 함유한다. EGFP와 NowGFP 모두 세포 생물학 및 생물 물리학 연구에 널리 사용되며 구조에 열 개의 보존 된 프롤린 잔기를 함유하고 있습니다. 또한, NowGFP는 위치 230에 열한 번째 프롤린 잔기를 가지며, 이는 이 단백질 변이체의 광범위한 돌연변이 이력으로 인해 나타났다. 세 번째로 선택된 단백질은 KillerOrange 형광 단백질64,65였다. 그것은 하이드로조안 속 안토아테카타로부터의 염색체 단백질 anm2CP의 유도체이다. 단백질 서열은 15개의 프롤린 잔기를 함유하고, 발색단은 티로신 잔기가 아닌 트립토판에 기초한다. 고분해능 X선 구조는 선택된 세 단백질 모두에 대해 보고되었다(도 2)51,65,66.

첫 번째 단계에서, 프롤린 유사체 (도 1D)는 선택적 압력 혼입에 의해 3 개의 모델 단백질 (EGFP, NowGFP 및 KillerOrange)의 모든 프롤린 위치에 통합되었다 (SPI, 절차의 계획은 도 3에 제시된다). 도구적으로, 프롤린-영양축성 대장균 K12 균주 JM8367을 프롤린 및 유사체의 존재 하에 단백질의 발현에 사용하였고(도 1D), 야생형 및 변형된 단백질을 각각 수득하였다. S-Flp 및 Dhip를 지닌 천연 단백질 및 변이체를 발현하는 세포의 펠릿은 온전한 발색단으로 인해 전형적인 밝은 색을 띠는 반면, R-Flp 및 Dfp를 포함하는 변이체는 무색으로 유지되어 봉입체에서 펼쳐진 단백질의 미스폴딩 및 침착을 나타냅니다 (그림 4A). 발현된 샘플의 SDS-PAGE 분석은 불용성 R-Flp-함유 단백질의 존재를 확인하였고(도 4B-D), 이는 추가 조사를 배제하였다. 비록 이것이 본 연구의 범위를 벗어나지만, 단백질 용해도 및 미스폴딩 문제는 시험관내 리폴딩 절차(68)에 의해 어느 정도 완화될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 대조적으로, 천연 단백질 뿐만 아니라 S-Flp- 및 Dhp-함유 변이체는 주로 가용성 분획에서 발견되었다 (도 4B-D). 야생형, S-Flp- 및 Dhp-함유 변이체뿐만 아니라, 형광 연구에서 추가로 단리되고 특성화될 수 있었다. 가용성 단백질은 고정화 된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)로 정제하여 EGFP의 경우 20-30 mg / L, NowGFP 및 KillerOrange의 경우 60-80 mg의 배양 부피를 산출했으며, 야생형 및 변형 단백질의 수율은 매우 유사했습니다. 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS)-결합 분석은 이러한 방식으로 수득된 단리물의 예상된 동일성 및 순도를 확인하였다(도 5). 질량 스펙트럼에서, S-Flp를 사용한 각각의 프롤린 치환은 서열의 각 프롤린 잔기 당 +18 Da 시프트를 생성한 반면, 프롤린-Dhp 치환의 경우, 시프트는 잔기 당 -2 Da였다.

다음 단계에서, 모 형광 단백질의 분광학적 특성에 대한 비정준 프롤린 유사체 혼입의 잠재적 효과를 분석하기 위해 광 흡수 및 방출 스펙트럼을 기록하였다(도 6). UV-Vis 흡수 스펙트럼은 방향족 잔기, 티로신 및 트립토판에 대해 약 280 nm 특성의 전형적인 밴드를 보인 반면, 발색단 흡광도는 EGFP의 경우 488 nm, NowGFP의 경우 493 nm에서 발견되었다 (도 6A, B). KillerOrange에서 발색단 흡광도 영역은 두 개의 밴드(그림 6C)로 구성되었으며, 이는 복합 발색단의 두 가지 가능한 구성 및 전하 상태에 해당합니다. 510nm 주변의 밴드는 높은 양자 수율49,65로 형광이 발생하는 상태로 알려져 있습니다. 프롤린 대체 변이체에서, 다음이 관찰되었다: DHP의 혼입은 EGFP 및 NowGFP의 흡광도 스펙트럼을 변화시키지 않았고, S-Flp는 향상된 UV 흡수를 생성하였다. 후자는 트립토판 잔기 미세환경, 특히 PVPWP 모티프에서 세 개의 S-Flp 사이에 끼워진 Trp57에서의 유도된 차이에 의해 설명될 수 있다(도 6A, B)69. 그러나 더 높은 UV 흡수에 대한보다 사소한 설명은 부적절하게 접힌 단백질의 증가 된 분획에서 비롯될 수 있습니다. 단백질의 농도는 흡광도 특징의 정량화에 의해 평가되었기 때문에, 부적절하게 성숙한 발색단을 가진 단백질의 존재는 흡광도를 증가시킬 수 있지만, 이 분획은 전체 농도에서 계산되지 않는다(도 6A,B). 이 가설을 뒷받침하면서, 우리는 S-Flp 함유 EGFP가 모 단백질에서 더 높은 값 (1.57)과 비교하여 결합 트립토판 및 티로신 흡광도 (ε (CRO) / ε (Tyr + Trp) = 0.96)70 대 발색단의 현저하게 감소 된 비율을 나타냈다는 것을 관찰했다. EGFP를 함유하는 S-Flp에서 비형광 분획의 존재는 단백질 특성의 추가 분석에 중요한 기여 인자가 될 것이다. S-Flp를 함유하는 KillerOrange 변이체에서, 발색단 밴드의 적색 이동과 함께 향상된 흡광도가 관찰되었다. 이러한 사실은 발색단 형성이 큰 형광 양자 수율을 갖는 구성을 선호한다는 것을 나타내었다 (도 6C).

이어서, 상응하는 최대 흡광도 파장에서 여기 시 기록된 단백질의 형광 스펙트럼을 분석하였다. 결과는 스펙트럼이 프롤린 및 대체물을 담지한 조사된 형광 단백질 변이체, S-Flp 및 Dhp에 대해 본질적으로 동일하게 유지됨을 보여준다. 이 결과는 유사체가 어떤 경우에도 발색단의 화학적 환경을 변화시키지 않았 음을 의미합니다 (그림 6G-I). 이러한 사실에도 불구하고, 295nm에서의 여기 시 기록된 KillerOrange의 형광 스펙트럼에서 현저한 차이가 나타났으며, 따라서 트립토판 여기 시에는 나타났다. 이 실험은 트립토판 측쇄와 성숙한 발색단 사이에서 발생하는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 직접 흥분성 결합을 추적합니다 둘 다 25 Å 이하의 짧은 거리에 위치합니다. EGFP 및 NowGFP 변이체의 경우, 방출 스펙트럼이 295nm 여기를 사용하여 측정되었을 때, 거의 모든 트립토판 방출과 함께 강한 발색단 방출이 관찰되었다 (도 6D, E). 그러나, S-Flp를 함유하는 변이체는 약간 더 큰 트립토판 특이적 방출을 나타내었다. 이 관찰은 트립토판을 포함하지만 성숙한 발색단이 아닌 펼쳐진 아포 단백질의 계산되지 않은 기여와 연결될 수 있습니다. 실질적으로 증가된 트립토판-특이적 방출은 KillerOrange에서 나타났으며, 이는 여기 에너지 전달 또는 흥분성 결합의 예상된 메카니즘을 통한 형광 담금질의 부족을 나타낸다. 프롤린 및 S-Flp를 함유하는 단백질 변이체는 높은 양자 수율의 선호되는 적색 시프트 형광 특징과 함께 비교 가능한 트립토판 방출을 나타내었다. 대조적으로, DHP를 함유한 변이체는 발색단 형광 강도의 급격한 감소를 나타냈으며, 아마도 사소한 구조적 효과 때문이었을 것이다(도 6F).

다음으로, 언폴딩/재생 실험을 수행하여 단백질의 폴딩 특성을 비교했습니다. 형광 방출 스펙트럼은 폴딩 상태(프로토콜 섹션 5)에 기록되었고, 화학적 변성 후, 후속적으로, 24h의 기간에 걸쳐 모니터링된 재폴딩 과정(프로토콜 섹션 6)에 기록되었다. 스펙트럼은 두 관련 파장, 295 nm 및 발색단의 흡광도 스펙트럼의 최대치에서 여기 시 기록되었으며, 결과 형광은 각 단백질에 대해 최대값으로 정규화된 것으로 제시된다(그림 7). 프로토콜의 끝에서, 우리는 EGFP 변이체가 다시 접힐 수 있다는 것을 관찰했고, NowGFP 및 KillerOrange 변이체 - 일단 변성 된 - 은 펼쳐진 채로 남아있다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 원래의 형광 단백질의 재접힘 능력은 실질적으로 다양했다. 참고로, KillerOrange는 하이드로조아 염색체 단백질 변이체 KillerRed65,71에서 시작하여 광감작제로 개발되었으며, 그 리폴딩은 견고한 β 배럴 구조에도 불구하고 일반적으로 뒤쳐져 있습니다. 우리의 실험에서, 우리는 야생형 EGFP 발색단 형광이 부분적으로 만 회복되었지만 트립토판 특이적 형광은 재생 후 더 컸다는 것을 발견했습니다 (그림 7A, D). 본질적으로 유사한 거동이 DHP를 함유하는 변이체에서 관찰되었다 (도 7C, F). S-Flp 함유 EGFP에서, 295 nm의 트립토판 특이적 파장에서 여기가 수행되었을 때 유사한 결과가 관찰되었다(도 7B). 놀랍게도, 형광은 발색단이 488 nm에서 여기되었을 때 훨씬 더 높은 연장으로 회복되었다 (도 7E). S-Flp는 다른 두 변종에 비해 훨씬 더 나은 리폴딩 수율을 유도하는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 유익한 효과는 알려지지 않은 분자 상호작용으로 인해 295 nm 여기를 사용할 때 보이지 않았다.

이어서, 재접힘 속도는 트립토판 및 발색단 둘 다의 형광을 개별적으로 기록함으로써 모니터링되었고, 한편 공정의 종점은 재생 개시 후 24 h에서 결정되었다. 오직 EGFP 변이체만이 신뢰성 있게 평가될 수 있는 비교적 빠른 리폴딩 동역학을 보인 반면, 변성된 NowGFP 및 KillerOrange 변이체 중 어느 것도 추가적인 정량적 측정을 가능하게 하는 값으로 회복될 수 없었다. EGFP에서, 트립토판 방출 회수는 발색단 방출의 회복 (1,500 s에서 완료)에 비해 두 배 빠른 (750 s에서 완료)였으며, 이는 근본적인 과정의 복잡성을 나타낸다 (도 8). 두 여기 파장 모두에서, 리폴딩 속도는 문헌 데이터(25)와 일치하여 S-Flp의 존재에 의해 상승되었다. 동시에, Dhp 함유 변이체는 야생형과 유사한 리폴딩 프로파일을 나타내었다.

Figure 1
도 1: 녹색 형광 단백질(GFP) 구조 스캐폴드, 발색단 구축, 프롤린 형태 전이 및 본 연구에 사용된 합성 유사체. (A ) GFP의 구조는 β나선 뚜껑에 의해 양쪽 끝에 캡핑되는 거의 완벽한 배럴 (즉, 치수 4.2nm x 2.4nm의 "캔")을 형성하는 α 가닥으로 구성됩니다. 27 kDa GFP 단백질은 열한 개의 β-가닥, 두 개의 짧은 α-나선, 및 중간에 발색단으로 구성된 삼차 구조를 나타낸다. 인접한 프롤린의 형태 상태는 발색단 형성과 관련이 있습니다. (b ) 발색단의 자가촉매 성숙(축합)은 잔기 Ser65, Tyr66 및 Gly67에서 발생하고, 여러 단계로 진행된다: 첫째, Thr65의 카르복실 탄소를 Gly67의 아미드 질소에 근접하게 하기 위해 폴리펩티드 골격에서의 비틀림 조정. 이어서, 헤테로시클릭 이미다졸린-5-온 고리계의 형성은 글리신의 아미드 질소에 의한 이러한 탄소 원자에 대한 친핵성 공격 및 후속적인 탈수시에 발생한다. 마지막으로, 시스템은 분자 산소에 의한 티로신 알파-베타 탄소 결합의 산화가 티로신 페닐 고리 및 그의 파라-산소 치환기를 포함하는 말단에서 이미다졸린 고리 시스템의 공액 시스템의 연장을 유도할 때 가시적인 형광을 얻는다. 생성된 파라하이드록시벤질리덴 이미다졸리논 발색단은 β통의 중심에 벌크 용매로부터 완전히 분리된다. (c ) 골격 구조 공식 및 기하학은 1) 프롤린 고리(puckers) 및 2) 선행 아미드 결합의 프롤린 잔기의 주요 형태적 전이를 나타낸다. (D) 지정된 프롤린 고리 퍼커와 함께 이 작업에 사용된 프롤린 유사체. 이 그림은 ChemDraw 및 Discovery Studio Visualizer를 사용하여 생성되었습니다. GFP 구조는 PDB 구조 엔트리 2Q6P로부터 유래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 이 연구에 사용된 형광 단백질. 패널은 EGFP, NowGFP 및 KillerOrange의 세 가지 다른 형광 단백질 변형의 전형적인 β 배럴 구조의 리본 표현을 보여 주며 리본 색상은 각 변이체의 형광 방출 색상을 나타냅니다. 프롤린 잔기 (한 글자 코드)는 스틱으로 강조 표시되고 적절한 위치에 주석이 추가됩니다. 발색단은 초기 아미노산 조성을 굵은 글씨로 표시한다. 모든 구조 표현은 다음의 PDB 구조 엔트리에 기초하여 PyMol로 제작되었다: EGFP에 대한 2Q6P, NowGFP를 위한 4RYS, 킬러오렌지를 위한 4ZFS. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 비표준 프롤린 유사체의 잔기 특이적 혼입을 위한 SPI 방법의 흐름도 제시. 발현 플라스미드 상에 관심 유전자를 운반하는 프롤린-영양영양 대장균(E. coli) 숙주 균주는 ~0.7의 OD600이 도달될 때까지 모든20개의 표준 아미노산을 갖는 정의된 최소 배지에서 성장시키고, 여기서 세포 배양물은 중간 대수 성장 단계에 있다. 세포는 수확되어 19개의 정준 아미노산 및 프롤린 유사체를 함유하는 신선한 최소 배지로 옮겨진다. 유도제를 첨가한 후, 단백질 발현은 하룻밤 동안 수행된다. 마지막으로, 표적 단백질은 세포 용해에 의해 단리되고 추가 분석 전에 정제된다. 프로토콜의 변형에서, 세포는 19개의 정준 아미노산을 갖는 정의된 최소 배지에서 성장하고, 프롤린은 제한된 양(예를 들어, 다른 아미노산의 농도의 일-다섯째)으로 첨가된다. 이러한 측정에 의해, 세포는 대수 성장 단계를 종료할 수 있기 전에 배지에서 프롤린을 배출한 다음, 후속적으로, 유사체가 첨가되고, 관심있는 단백질 생산이 유도된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: EGFP, NowGFP 및 KillerOrange 변이체의 발현 분석. (a) 세포 펠릿을 발현 배양액 1 mL로부터,OD600= 2로 정규화한다. (B ) EGFP, ( C ) NowGFP 및 (D) KillerOrange 변이체의 SDS-PAGE 분석. 각 형광 단백질 유도체의 가용성 (S) 및 불용성 분획 (I)을 가용성 단백질의 IMAC로부터 용출된 분획 (E)뿐만 아니라 15% 아크릴아미드 겔에 로딩하였다. PageRuler 염색되지 않은 단백질 사다리는 (M)으로 표기된 레인에서 마커 (M)로서 사용되었다. 특정 단백질의 예상 영역은 프레임화된다. 프롤린 위치에서의 혼입된 아미노산은 Pro, R-Flp, S-Flp, 및 Ddp이다 ( (A) Dhp 대신 Dfp를 혼입하는 형광 단백질 변이체로부터의 세포 펠릿이 도시되어 있다). 겔을 1% (w/v) 쿠마시 브릴란트 블루로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 형광 단백질 변이체의 질량 분광분석 (a)H6 태깅된 EGFP(검정), S-Flp-EGFP(오렌지), 및 Dhp-EGFP(시안)의 대표적인 디컨볼루션된 ESI-MS 스펙트럼은 주요 질량 피크의 위치를 갖는 숫자(Da에서)로서 제공된다. H6-태깅된 단백질의 계산된 분자 질량 [M+H]+는: EGFP의 경우 27,745.33 Da (관찰된 27,746,15 Da); S-Flp-EGFP의 경우 27,925.33 Da (관찰된 27,925.73 Da); Dhp-EGFP의 경우 27,725.33 Da (관찰된 27,726.01 Da). (B)H6 태깅된 NowGFP(검정), S-Flp-NowGFP(오렌지색) 및 Dhp-NowGFP(시안)의 대표적인 디컨볼루션된 ESI-MS 스펙트럼은 숫자(Da에서)로서 제공된 주요 질량 피크의 위치를 갖는다. H6-태깅된 단백질의 계산된 질량은 다음과 같다: NowGFP 27,931.50 Da (관찰된 27,946.46 Da; ~16 Da의 차이는 아마도 단백질 내의 메티오닌의 산화에 기인한다); S-Flp-NowGFP의 경우 28,129.50 Da (관찰된 28,130.08 Da); Dhp-NowGFP의 경우 27,909.50 Da (관찰 27,910.22 Da). (C)H6 태그가 붙은 킬러오렌지(블랙), S-Flp-킬러오렌지(오렌지) 및 Dhp-킬러오렌지(시안)의 대표적인 디컨볼루션된 ESI-MS 스펙트럼은 숫자(Da)로 제공된 주요 질량 피크의 위치를 갖는다. H6-태깅된 단백질의 계산된 질량은 다음과 같다: 킬러오렌지의 경우 27,606.09 Da (관찰된 27,605.91 Da); S-Flp-킬러오렌지 27,876.09 Da (관찰 27,876.08 Da); Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (관찰 된 27,575.93 Da)의 경우. 약 1 Da의 관찰된 분자 질량과 계산된 분자 질량 사이의 편차는 ESI-MS 장비의 오차 범위 내에 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 형광 단백질 변이체의 광 흡수 및 형광 방출 스펙트럼. 정규화된 UV-Vis 흡수 스펙트럼은 EGFP의 변이체 (A), NowGFP의 (B) 및 KillerOrange의 (C)에 대해 도시된다. 스펙트럼을 발색단 흡광도의 최대치(약 500 nm)로 정규화하였다. 정규화된 형광 방출 스펙트럼은 EGFP의 변이체 (D,G), NowGFP의 (E,H) 및 KillerOrange의 (F,I)로 도시되어 있다. (D,E,F)에서의 스펙트럼은 자외선(295 nm)으로 여기시 측정되었고, (G,H,I) 488 nm, 493 nm 및 510 nm 광에서의 스펙트럼에 대해서는 여기용으로 각각 사용되었고, 스펙트럼은 발색단 방출의 각각의 최대치(약 500 nm)로 정규화되었다. 각 패널에서 검정 곡선은 천연 프롤린을 사용한 형광 단백질 변이체의 스펙트럼에 해당하고, 주황색 곡선은 S-Flp 치환 단백질의 스펙트럼을 나타내며, 파란색 곡선은 Dhp 치환 단백질에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 리폴딩 실험에서의 EGFP 변이체의 형광 방출 스펙트럼. 천연 상태에서 및 변성 및 재접힘 후에 형광 단백질 변이체의 0.3 μM 용액의 정규화된 형광 방출 스펙트럼: 스펙트럼 인 (A,B,C)은 자외선으로 여기시 (295 nm) (A) EGFP에 대해, (B) S-Flp-EGFP에 대해, 및 (C) Dhp-EGFP에 대해 측정하였다. (D,E,F)에서의 스펙트럼은 EFGP에 대해 녹색 광 (488 nm) (D), (E) S-Flp-EGFP에 대해, 및 (F) Dhp-EGFP에 대해 여기시 측정되었다. 각 단백질 변이체의 천연 (검정 곡선) 및 재접힌 샘플 (녹색은 EGFP에 상응하고, 주황색은 S-Flp-EGFP에 상응하고, 청색은 Dhp-EGFP에 각각 상응함)의 방출 스펙트럼은 적절한 천연 상태의 최대 형광으로 정규화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: 형광을 이용한 EGFP 변이체의 단백질 폴딩 및 발색단 성숙 모니터링. (a ) Trp 형광 영역에서의 형광 방출(방출은 330 nm로 설정됨)은 자외선(295 nm)으로 여기시 기록된다. (B ) 녹색 빛 (488 nm)으로 여기 시 발색단 방출 영역에서 형광 진폭의 발달. 시간-의존적 형광 트레이스를 모니터링 간격의 끝에서 도달된 형광 진폭에 따라 단일성(100%)으로 정규화하였다. 각 패널에서, 검정 곡선은 천연 프롤린을 갖는 형광 단백질 변이체의 스펙트럼에 상응하고, 주황색 곡선은 S-Flp 치환 단백질의 스펙트럼을 나타내고, 청색 곡선은 Dhp 치환 단백질에 상응한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

건설하다 아미노산 서열 (6xHis 태그에 밑줄이 그어짐):
EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFP MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-킬러오렌지 MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

표 1: 표적 단백질의 1차 구조. 그의 태그는 각 시퀀스에서 밑줄이 그어져 있습니다.

λ [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (DHP-EGFP)
488(크로≡) 31,657(± 1,341명) 22,950명(± 290명) 27,800 (± 542)
280 (≡ 티르+Trp) 20,116 (± 172) 23,800명(715±) 17,300 (± 554)
ε 흡광 계수에 대한 값(M-1·cm-1에서)은 공지된 단백질 농도를 사용하여 적절한 EGFP 변이체의 기록된 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로부터 계산된다. 280 nm에서 선택된 파장은 방향족 잔기, 티로신 및 트립토판의 최대 흡광도에 해당하고, 488 nm는 발색단 흡광도 파장을 나타낸다.

표 2: 선택된 파장에서 EGFP 변이체의 소멸 계수 (ε). ε 흡광 계수(M-1·cm-1에서)에 대한 값은 공지된 단백질 농도를 사용하여 적절한 EGFP 변이체의 기록된 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로부터 계산된다. 280nm의 선택된 파장은 방향족 잔기, 티로신 및 트립토판의 최대 흡광도에 해당하는 반면, 488nm는 최대 발색단 흡광도 파장을 나타냅니다.

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Discussion

자연에서, 단백질 구조 및 기능을 이용한 조작은 전형적으로 돌연변이, 단백질 서열의 특정 위치에서 아미노산 동일성의 교환으로 이어지는 현상으로 인해 발생한다. 이 천연 메카니즘은 돌연변이 유발의 형태로 단백질 공학을위한 생명 공학 방법으로 널리 적용되며, 과정에 관련된 20 개의 표준 아미노산의 레퍼토리에 의존합니다. 그러나 프롤린 잔기의 교환은 문제가 있습니다. 그것의 특별한 백본 그룹 구조로 인해, 그것은 대체72를 위해 나머지 19 개의 잔류 물과 거의 교환 할 수 없다. 예를 들어, 프롤린은 전형적으로 가장 일반적인 이차 구조, 즉 α나선 및 β-가닥과의 불량한 상용성 때문에 폴리펩티드 서열에서 이차 구조 차단기로 알려져 있다. 이러한 프롤린 특징은 잔기가 공통 레퍼토리로부터 다른 아미노산으로 돌연변이될 때 쉽게 소실된다. 프롤린을 화학적 유사체로 대체하는 것은 부모 프롤린 잔기의 기본 골격 특징을 유지하면서 특정 형태 전이에 편향을 가하거나 분자 부피 및 극성의 변조를 생성 할 수있는 대안적인 접근법을 제공합니다. 예를 들어, 박테리아 배양물에 히드록시-, 플루오로-, 알킬-, 데하이드로프롤린, 가변 고리 크기를 갖는 구조 등과 같은 유사체 구조를 공급할 수 있고, 따라서 특정 프롤린 잔기 변경을 함유하는 단백질의 생산을 용이하게 할 수 있다.

본 연구에 기술된 선택적 압력 혼입 (SPI) 방법은 글로벌, 즉 표적 단백질 내의 모든 프롤린을 관련 화학적 유사체로 잔기 특이적 대체를 허용한다. 이 방법의 중요성은 SPI가 일반적인 돌연변이 유발 기술에 접근 할 수없는 서열 변화를 생성 할 수 있다는 사실에 의해 반영됩니다. 예를 들어, 본 연구에서 입증된 바와 같이, 전형적으로 하나 또는 두 개의 원자 대체/결실/추가를 초과하지 않을 수 있는 다소 작은 구조적 변화를 함유하는 표적 단백질의 생산을 허용한다. 이러한 단백질 변형은 "원자 돌연변이"73,74라고 불린다. GFP와 같은 형광 단백질에서, 이러한 분자 침입의 결과는 폴딩 속도, 국소 극성, 단백질 패킹, 관련된 구조적 특징의 안정성에서 알 수 있다. 흡광도 및 형광 특성의 변화는 단백질 폴딩 및 잔류 미세 환경에 미치는 영향으로 인해 간접적으로 생성됩니다. SPI에 의해 수행되는 분자 변화의 정밀도는 일반적으로 다른 정준 잔기에 대한 프롤린의 돌연변이와 비교하여 훨씬 높으며, 후자는 일반적으로 단백질 폴딩, 생산 및 단리에 해롭다.

생산 방법으로서, SPI 접근법은 천연 아미노산의 화학적 유사체에 대한 아미노아실-tRNA 신테타제 포켓의 기질 내성을 이용한다. 신테타제는 아미노산 구조의 정확한 식별을 담당하며, 단백질로의 혼입은 번역 과정에서 하류에서 발생합니다. 도구적으로, SPI에서의 단백질 생산, 단리 및 정제는 임의의 다른 재조합 단백질 발현 기술에 전형적인 방식으로 수행되고; 그러나 다음과 같이 프로토콜에 몇 가지 추가 사항이 있습니다 : 대체를 위해 묶여있는 프롤린은 발효 과정의 시작 부분에 제공되어 세포가 성장하고 손상되지 않은 세포 기계를 개발할 수 있도록합니다. 그러나, 세포 배양물은 최대 광학 밀도에 도달하는 것이 허용되지 않으며, 세포 단백질을 발현에 최적으로 대수 단계로 유지한다. 이 시점에서 SPI 방법에는 두 가지 주요 변형이 있습니다. 첫 번째로, 프롤린의 농도는 초기 성장 배지 (화학적으로 정의 된 배지)에서 조정되어 프롤린의 고갈이 외부 침입없이 발생합니다. 세포는 대수 성장 단계를 종료하기 전에 배지에서 프롤린을 배출한 다음, 이어서 아날로그가 첨가되고, 관심있는 단백질 생산이 유도된다. 상기 방법의 두 번째 버전에서, 세포는 그들의 대수 단계의 중간까지 프롤린을 함유하는 배지에서 성장한다. 이 시점에서, 세포는 꺼내어 더 이상 프롤린을 함유하지 않는 다른 배지로 물리적으로 옮겨져야하며, 관심있는 단백질의 후속 유도와 함께 유사체 만 함유해야합니다. 두 버전 모두에서, 유사체 및 단백질 유도 시약은 미리 성장된 세포에 제공된다. 야생형 단백질의 단리 및 정제는 변이체에 대한 것과 동일한 방식으로 수행된다. 원칙적으로, 모든 이용가능한 프로영양영양 균주가 발현 숙주로서 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 가장 적합한 호스트를 식별하기위한 표현식 테스트가 권장됩니다. 또한, 화학적으로 정의된 상이한 배지의 시험은 단백질 수율을 최적화하는데 사용될 수 있다.

용해도 및 농도와 같이 SPI에 대해 고려해야 할 화학 유사체에 관한 특정 요구 사항이 있습니다. 아미노산의 대사 가용성 및 흡수는 배지 내의 용해된 분자의 수에 의존한다. 특정 화합물의 용해도를 증가시키기 위해, 약산성 또는 알칼리성 조건이 선택될 수 있다. 인공 분자는 세포 독성으로 인해 성장 억제 효과를 일으킬 수 있기 때문에, 세포 스트레스(75)를 피하기 위해 농도를 최소한으로 낮추어야 한다.

SPI의 사소한 약점은 교환해야 할 포지션 수가 많을수록 통합 효율성이 떨어진다는 것입니다. 원칙적으로, 부위 지향적 돌연변이유발에 의한 표적 생체분자 내 아미노산 주파수의 감소는 이러한 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 원하는 단백질의 구조적 및 기능적 특성은 일차 구조를 변경함으로써 영향을 받을 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, SPI는 정준 아미노산의 잔기-특이적 치환을 허용한다. 이는 비-정준 아미노산이 단백질 기능 또는 폴딩에 필수적으로 필수적인 보존된 잔기를 포함하여 표적 단백질 내의 정준 아미노산의 모든 위치에 삽입된다는 것을 의미한다. 사이트 별 통합을위한 대안적인 방법은이 문제를 극복 할 수있는 유일한 가능성입니다3. 지난 수십 년 동안, 미리 정의된 부위에서 변형된 잔기를 함유하는 단백질을 생산할 수 있는 직교 쌍 방법이 개발되었다. 이 방법의 가장 일반적인 변형은 정지 코돈 억제로 알려져 있다. 이 방법은 합성 아미노산(76)의 부위-특이적 혼입을 위해 전용된 조작된 직교 번역 시스템에 기초한다. 상이한 측쇄 변형을 갖는 200개 이상의 아미노산이 이 접근법77을 사용하여 현재까지 단백질에 혼입되었다. 그러나, 이들 번역 시스템은 여전히 표적 단백질 내로의 프롤린 유사체의 삽입에 적합하지 않다. 더욱이, 아미노아실-tRNA 신테타제의 일부 배경 난잡함이 전형적으로 조작된 번역 시스템에 남아 있기 때문에 이 방법의 성능은 경미한 아미노산 변형의 경우에 낮은 것으로 간주된다.

SPI를 사용하여 우리는 많은 β 배럴 형광 단백질 변이체를 생산하고 프롤린과 비천연 유사체의 교환 결과를 연구했습니다. 프롤린을 R-Flp 및 Dfp로 대체하는 경우, 발현 숙주에 의해 기능장애 단백질이 생성되었다. 이 효과는 단백질 미스폴딩에 의해 생성 될 가능성이 큽니다. 후자는 R-Flp에 의해 촉진된C4-엑소오스 입체형태로부터 기원할 수 있으며, 이는 모 단백질 구조(27)에 의해 바람직하지 않다. Dfp의 경우, 미스폴딩은 프롤린 잔기27에서의 트랜스-시스 펩티드 결합 이성체화의 감소된 속도에 의해 생성될 가능성이 있다. 후자는 β-배럴 형성 및 후속 발색단 성숙에 영향을 미치는 단백질 폴딩의 동역학적 프로파일에서 제한 단계 중 하나로 알려져 있다. 실제로, 두 아미노산, R-Flp 및 Dfp 모두에 대해, 단백질 생산은 응집되고 불용성인 단백질을 초래했다. 결과적으로, 발색단 형성은 일어날 수 없었고, 형광은 완전히 소실되었다. 그러나 S-Flp 및 Dhp에서는 적절한 단백질 성숙이 관찰되어 각 유사체 / 단백질 조합에 대한 형광 단백질 샘플이 생성되었습니다. 단백질의 흡광도 및 형광 특징에서 약간의 조절에도 불구하고, 이들은 대체로 야생형 단백질의 그것과 유사하게 남아있었다. 아미노산 치환의 효과는 리폴딩 동역학 연구에서 밝혀졌다. 후자는 S-Flp로 대체하는 경우에 더 빠른 리폴딩을 나타냈다. 모델 연구는 이 잔기가 트랜스-시스티아미드 회전 속도에서 약간의 개선을 발생시키고C4-엔도입체형성의 형성을 유도할 수 있음을 보여주었다. 이 두 인자 모두 EGFP에서 이 잔기의 유익한 동역학적 효과에 기여할 가능성이 높다. 대조적으로, DHP는 모 단백질과 최대로 유사한 운동 폴딩 프로파일을 생성하였다. 조사된 형광 단백질에서 단순한 원자 돌연변이에 의해 생성된 결과의 다양성은 표적 단백질 특성을 변화시키는 SPI 생산 방법의 잠재력을 보여준다. 프롤린을 유사체로 대체함으로써 유도되는 단백질 변경은 효소78,79,80 및 이온 채널 81,82의 엔지니어링뿐만 아니라 단백질 안정성의 일반적인 엔지니어링에도 추가적인 영향을 미칩니다.

SPI 방법의 기본 한계는 프롤린을 교환하는 데있어 "모두 또는 없음"모드가 관련 아날로그와 상주한다는 것입니다. 어떤 프롤린 잔기를 유사체로 대체해야 하는지, 어떤 프롤린 잔기가 변형되지 않은 상태로 유지되어야 하는지를 정확하게 선택할 수 있다는 것이 큰 이점일 것이다. 그러나, 현재, 미생물 생산 숙주를 이용하여 이러한 정교한 생산을 수행할 수 있는 기술은 없다. 단백질 83,84의 화학적 합성과 무세포 생산85,86은 위치 특이적 프롤린 변형을 생산할 수 있는 두 가지 대안적인 방법이다. 그럼에도 불구하고, 그들의 운영 복잡성과 낮은 생산 수율은 살아있는 세포에서의 생산에 비해 열등하게 만듭니다. 현재 SPI는 원자 돌연변이를 지닌 복잡한 단백질을 생산하기 위한 가장 조작적으로 간단하고 강력한 접근 방식으로 남아 있습니다. 비천연 아미노산 대체물을 도입함으로써, 이 방법은 프롤린 치환에 의해 생성된 형광 단백질의 폴딩 및 광 흡수/방출의 변경에 의해 여기에서 예시된 바와 같이 표적화된 방식으로 단백질 특징을 변형시킬 수 있다.

Disclosures

저자는 모든 이해 상충을 공개합니다.

Acknowledgments

이 연구는 독일 연구 재단 (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis")이 T.F. 및 N.B.에 지원하고 연방 교육 과학부 (BMBF 프로그램 "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio)가 F.-J.S.에 지원했습니다. 및 T.M.T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR

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References

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형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향
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Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F. J., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).

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