Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Restspecifikt utbyte av prolin med prolinanaloger i fluorescerande proteiner: Hur "molekylär kirurgi" i ryggraden påverkar vikning och stabilitet

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63320
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

För att övervinna begränsningarna av klassisk platsriktad mutagenes införlivades prolinanaloger med specifika modifieringar i flera fluorescerande proteiner. Vi visar hur ersättningen av väte med fluor eller singeln med dubbelbindningar i prolinrester ("molekylär kirurgi") påverkar grundläggande proteinegenskaper, inklusive deras vikning och interaktion med ljus.

Abstract

Ersättning av prolin (Pro) rester i proteiner med den traditionella platsstyrda mutagenesen med någon av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna är ofta skadlig för proteinveckning och i synnerhet kromoformognad i gröna fluorescerande proteiner och besläktade varianter. Ett rimligt alternativ är att manipulera översättningen av proteinet så att alla Pro-rester ersätts restsubstans specifikt med analoger, en metod som kallas selektiv tryckinkorporering (SPI). De inbyggda kemiska modifieringarna kan användas som en slags "molekylär kirurgi" för att fint dissekera mätbara förändringar eller till och med rationellt manipulera olika proteinegenskaper. Här visar studien nyttan av SPI-metoden för att studera prolinernas roll i organisationen av den typiska β-fatstrukturen av spektrala varianter av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) med 10-15 proliner i sin sekvens: förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP), NowGFP och KillerOrange. Pro-rester finns i anslutande sektioner mellan enskilda β-strängar och utgör de stängande locken på fatställningen, vilket är ansvarigt för isolering av kromoforen från vatten, dvs fluorescensegenskaper. Selektiva tryckinkorporeringsexperiment med (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) utfördes med användning av en prolin-auxotrofisk E. coli-stam som uttrycksvärd. Vi fann att fluorescerande proteiner med S-Flp och Dhp är aktiva (dvs fluorescerande), medan de andra två analogerna (Dfp och R-Flp) producerade dysfunktionella, felveckade proteiner. Inspektion av UV-Vis-absorptions- och fluorescensemissionsprofiler visade få karakteristiska förändringar i proteinerna som innehåller Pro-analoger. Undersökning av de vikande kinetiska profilerna i EGFP-varianter visade en accelererad omfällningsprocess i närvaro av S-Flp, medan processen liknade vildtyp i proteinet innehållande Dhp. Denna studie visar SPI-metodens förmåga att producera subtila modifieringar av proteinrester på atomnivå ("molekylär kirurgi"), som kan antas för studier av andra proteiner av intresse. Det illustrerar resultaten av prolinersättningar med nära kemiska analoger på viknings- och spektroskopiska egenskaper i klassen β fluorescerande proteiner.

Introduction

Klassisk platsstyrd mutagenes möjliggör permutation av någon befintlig genkodad proteinsekvens genom kodonmanipulation på DNA-nivå. För att studera proteinveckning och stabilitet är det ofta önskvärt att ersätta liknande aminosyror med liknande motsvarigheter. Traditionell proteinmutagenes är dock definitivt begränsad till strukturellt liknande ersättningar bland kanoniska aminosyror som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som finns i standardgenetisk kodrepertoar. Å andra sidan finns det inga sådana möjligheter för andra kanoniska aminosyror som Trp, Met, His eller Pro, som ofta spelar väsentliga strukturella och funktionella roller i proteiner1. Ett idealiskt tillvägagångssätt för att studera dessa interaktioner i samband med den mycket specifika interna arkitekturen hos proteiner och deras vikningsprocess är att generera icke-störande isosteriska modifieringar. Faktum är att när isosteriska aminosyraanaloger av dessa kanoniska aminosyror, även kända som icke-kanoniska aminosyror (ncAA), sätts in i proteiner, möjliggör de subtila förändringar även vid nivån av enskilda atomer eller atomgrupper som H / F,CH2 / S / Se / Te känd som "atommutationer"2. Sådan "molekylär kirurgi" producerar förändrade proteiner vars egenskaper enbart härrör från utbytet av enskilda atomer eller grupper av atomer, vilka i gynnsamma fall kan analyseras och de detekterade förändringarna kan rationaliseras. På detta sätt utvidgas omfattningen av proteinsyntes för att studera proteinveckning och struktur långt bortom klassisk DNA-mutagenes. Observera att proteiner som genereras av platsriktad mutagenes vanligtvis kallas "mutanter", medan proteiner med substituerade kanoniska aminosyror kallas "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongener"5.

Det gröna fluorescerande proteinet (GFP), som först identifierades i den marina organismen Aequorea victoria, uppvisar ljusgrön fluorescens när den utsätts för ultraviolett till blått ljus 6,7. Idag används GFP ofta som ett mycket känsligt märkningsverktyg för rutinmässig visualisering av genuttryck och proteinlokalisering i celler via fluorescerande mikroskopi. GFP har också visat sig vara användbart i olika biofysiska 8,9,10 och biomedicinska 11,12 studier, samt i proteinteknik 13,14,15. Noggrann analys av GFP-strukturen möjliggjorde skapandet av många varianter som kännetecknas av varierad stabilitet och fluorescensmaxima 16,17. De flesta GFP-varianter som används i cell- och molekylärbiologi är monomera proteiner både i lösning och ikristallen 18. Deras huvudsakliga strukturella organisation är typisk för alla medlemmar i GFP-familjen, oberoende av deras fylogenetiska ursprung, och består av 11 β-strängar som bildar en så kallad β-fat, medan en knäckt α-helix löper genom mitten av tunnan och bär kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiska mognaden av kromoforen (figur 1B) kräver exakt positionering av sidokedjorna som omger den på proteinets centrala plats; många av dessa sidokedjor är mycket bevarade i andra GFP-varianter19. I de flesta fluorescerande proteiner från maneter som Aequorea victoria består den grönemitterande kromoforen av två aromatiska ringar, inklusive en fenolring av Tyr66 och den femledade heterocykliska strukturen av imidazolinon (figur 1B). Kromoforen, när den är korrekt inbäddad i proteinmatrisen, är ansvarig för den karakteristiska fluorescensen hos hela proteinet. Den är belägen i mitten av strukturen, medan fatstrukturen isolerar den från det vattenhaltiga mediet20. Exponering av kromoforen för bulkvattnet skulle resultera i fluorescenssläckning, dvs förlust av fluorescens21.

Korrekt vikning av den fatliknande strukturen är avgörande för att skydda kromoforen mot fluorescenssläckning22. Proline (Pro) rester spelar en särskild roll i den strukturella organisationen av GFP23. Eftersom de inte kan stödja en β utgör de anslutningsslingor som är ansvariga för att upprätthålla proteinstrukturen som helhet. Inte överraskande finns 10-15 prolinrester i både Aequorea- och Anthoathecata-härledda GFP: er; några av dem är mycket bevarade i andra typer av fluorescerande β-fatproteiner. Proliner förväntas kritiskt påverka vikningsegenskaperna på grund av deras speciella geometriska egenskaper. Till exempel, i Aequorea-härledda GFP, av de tio prolinresterna (figur 2A), bildar nio trans- och endast en bildar en cis-peptidbindning (Pro89). Pro58 är väsentlig, dvs inte utbytbar med resten av de 19 kanoniska aminosyrorna. Denna rest kan vara ansvarig för korrekt positionering av Trp57-återstoden, som har rapporterats vara avgörande för kromoformognad och den totala GFP-vikningen24. Fragmentet PVPWP med tre prolinrester (Pro54, Pro56, Pro58) och Trp57 är den väsentliga delen av det "nedre locket" i GFP-strukturen från figur 1A. PVPWP-strukturmotivet finns i flera proteiner såsom cytokromer och eukaryota spänningsaktiverade kaliumkanaler25. Prolin-till-alanin substitutioner vid positionerna 75 och 89 är också skadliga för proteinuttryck och vikning och avskaffar kromoformognad. Pro75 och Pro89 är en del av det "övre locket" som begraver kromoforen (figur 1A) och bevaras över 11-strängade β-fat fluorescerande proteiner23. Dessa två "lock" håller kromoforen utesluten från det vattenhaltiga lösningsmedlet, även när den stabila tertiära strukturen delvis har brutits26. En sådan specifik molekylär arkitektur skyddar fluoroforen från kollisionssläckning (dynamisk) fluorescenssläckning, t.ex. av vatten, syre eller andra diffusibla ligander.

För att utföra molekylär konstruktion av GFP-strukturen bör man införa aminosyrasubstitutioner i proteinets primära struktur. Många mutationer har utförts på GFP, vilket ger varianter med förhöjd stabilitet, snabb och pålitlig vikning och variabla fluorescensegenskaper17. I de flesta fall anses emellertid mutation av prolinrester vara ett riskabelt tillvägagångssätt på grund av det faktum att ingen av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna korrekt kan återställa prolinrestens konformationsprofil27. Således har ett alternativt tillvägagångssätt utvecklats, där prolinrester ersätts med andra prolinbaserade strukturer, kallade prolinanaloger28. På grund av sin unika cykliska kemiska struktur uppvisar prolin två karakteristiska konformationsövergångar (figur 1C): 1) prolinringen puckering, en snabb process som medför organisering av ryggraden, som främst påverkar φ torsionsvinkel, och 2) peptidbindningen cis / transisomerisering, en långsam process som påverkar ryggradsvikningen via ω-torsionsvinklarna. På grund av sin långsamma natur är den senare övergången vanligtvis ansvarig för de hastighetsbegränsande stegen i vikningsprocessen för hela proteinet. Det har tidigare visats att peptidbindning cis / transisomerisering runt vissa prolinrester har långsamma steg i vikningen av GFP-varianter. Till exempel har bildandet av cis-peptidbindningen vid Pro89 det långsamma steget i vikningsprocessen eftersom det är beroende av bindningsövergången från trans till cis29. En snabbare omfällning kan uppnås efter att Pro89 har ersatts med en all-trans-peptidslinga, dvs genom att avskaffa en cis-till-trans-isomeriseringshändelse30. Förutom cis/trans-isomeriseringen kan puckerövergångarna också generera djupgående förändringar i proteinveckning på grund av ryggradsorganisationen och förpackningen inom proteininteriören27,31.

Kemiska modifieringar resulterar i förändring av de inneboende konformationsövergångarna hos prolinresterna, vilket påverkar proteinets förmåga att vikas. Vissa prolinanaloger är särskilt attraktiva kandidater för prolinsubstitution i proteiner eftersom de möjliggör manipulation och studier av vikningsegenskaperna. Till exempel är (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) fyra analoger (figur 1D) som skiljer sig minimalt från prolin när det gäller både molekylvolym och polaritet32. Samtidigt uppvisar varje analog en distinkt ringpubbning: S-Flp stabiliserar C 4-endo pucker, R-Flp stabiliserar C4-exo pucker, Dfp uppvisar ingen uppenbar puckerpreferens, medan Dhp avskaffar puckering (figur 1D)33. Genom att använda dessa analoger i proteinstrukturen kan man manipulera med den konformationella övergången av prolinresterna och därigenom påverka egenskaperna hos de resulterande GFP-varianterna.

I detta arbete bestämde vi oss för att införliva den angivna uppsättningen prolinanaloger (figur 1D) i strukturen hos GFP-varianter med hjälp av den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI, figur 3) 34. Ersättning av aminosyrarester med deras närmaste isostrukturella analoger är ett tillämpat biotekniskt koncept i proteindesign35,36. Således illustrerar effekterna av prolinanaloger i ett modellprotein deras potential att fungera som verktyg inom proteinteknik37. Produktionen av proteiner innehållande önskade analoger utfördes i modifierade E. coli-stammar som inte kan producera prolin (prolin-auxotrofi). Således kan de tvingas acceptera ersättning av substrat i processen med proteinbiosyntes38. Denna globala substitution av prolin möjliggörs av den naturliga substratflexibiliteten hos endogena aminoacyl-tRNA-syntetaser39, de viktigaste enzymerna som katalyserar förestringen av tRNA med lämpliga aminosyror40. I allmänhet, som beskrivs i figur 3, utförs cellulär tillväxt i ett definierat medium tills den mellersta logaritmiska tillväxtfasen uppnås. I nästa steg utarmas aminosyran som ska ersättas intracellulärt från uttryckssystemet under jäsning och utbyts därefter av den önskade analogen eller ncAA. Målproteinuttryck induceras sedan för restspecifik icke-kanonisk aminosyrainkorporering. Substitutionen av den besläktade aminosyran med dess analog sker på ett proteombrett sätt. Även om denna biverkning kan ha en negativ inverkan på tillväxten av värdstammen, påverkas kvaliteten på målproteinproduktionen för det mesta inte, eftersom de cellulära resurserna i rekombinant uttryck huvudsakligen riktas mot produktionen av målproteinet41,42. Därför är ett hårt reglerat, inducerbart uttryckssystem och starka promotorer avgörande för hög inkorporeringseffektivitet43. Vårt tillvägagångssätt är baserat på multipel restspecifik inkorporering av ncAA som svar på sinneskodoner (sinneskodonreasplacering), varigenom antalet positioner för Pro-analog insättning inom målgenen kan manipuleras via platsriktad mutagenes44. Ett liknande tillvägagångssätt tillämpades i vår tidigare rapport om framställning av rekombinanta peptider med antimikrobiella egenskaper45. I detta arbete har vi tillämpat SPI-metoden, som gör att alla prolinrester kan ersättas med relaterade analoger, för att generera proteiner som förväntas ha distinkta fysikalisk-kemiska egenskaper som inte finns i proteiner syntetiserade med den kanoniska aminosyrarepertoaren. Genom att karakterisera viknings- och fluorescensprofilen för resulterande varianter strävar vi efter att visa upp effekterna av atomsubstitutioner i varianter av GFP.

Protocol

1. Införande av uttrycksplasmider i kompetenta pro-auxotrofa E. coli-celler

  1. Blanda 1 ng av varje provplasmid, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP och pQE-80L H6-KillerOrange, med 50 μL kemiskt kompetenta eller elektrokompetenta celler i den pro-auxotrofa E. coli K12-härledda stammen JM83 (Addgene #50348 eller ATCC #35607) för omvandling genom värmechockmetoden eller elektroporering enligt tillgängliga protokoll46, 47.
    UTTRYCKSvektorn pQE-80L EGFP-H6 kodar för ett C-terminalt 6xHis-taggat förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP), uttrycksvektorerna pQE-80L H 6-NowGFP och pQE-80L H6-KillerOrange kodar för en N-terminalt 6xHis-taggad NowGFP48 respektive en N-terminalt 6xHis-taggad KillerOrange49, var och en i en pQE-80L-plasmidryggrad. Alla målgener kontrolleras av en bakteriell T5-promotor som regleras av lac-operatören. Ampicillinresistens användes som en urvalsmarkör och kolE1 som replikationens ursprung. Se materialförteckningen för ytterligare information om pQE-80L-plasmiden. Alternativ Pro-auxotrofisk E. coli som härrör från stammarna K-12 och B kan också användas för uttryck och bör ge liknande resultat. Den beräknade molekylmassan förH6-märkta ensindigt protonerade ([M+H]+) vildtypsproteiner (efter kromoformognad) är 27 745,33 Da (EGFP-H6), 27 931,50 Da (H6-NowGFP) och 27 606,09 Da (H6-KillerOrange). Målproteinernas primära strukturer anges i tabell 1 (His-tag understruken). Glutamin (Q) inom His-tag-sekvensen av NowGFP identifierades genom DNA-sekvensering efter subkloning av NowGFP cDNA mottaget från Pletnev et al.51 i pQE-80L-plasmiden. Det hindrar inte proteinrening eller egenskaperna hos det fluorescerande proteinet.
  2. Återställ cellerna i 950 μL SOC-medium vid 37 ° C i 1 timme.
  3. Sprid 50 μL av de återvunna cellerna på Luria Agar (LA) mediumplattor (se Kompletterande material) innehållande glukos (10 g / L) och ampicillin (100 μg / ml).
  4. Inkubera LA-mediumplattorna vid 37 ° C över natten eller 30 ° C i 24 timmar.

2. Framställning av rekombinanta fluorescerande proteiner av vild typ (med kanonisk prolin) och förfarande för selektiv tryckinkorporering (SPI) för att producera fluorescerande proteiner med prolinanaloger (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Över natten odling av Pro-auxotrofisk E. coli K12-härledd stam JM83 som hyser pQE-80L EGFP-H6, pQE-80L H 6-NowGFP och pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. Använd en steril pipettspets eller ympningsslinga för att välja en enda koloni från en LA-medelplatta och resuspendera cellerna i 5 ml lysogeny Broth (LB) -medium (se Kompletterande material; innehållande 10 g / L glukos, 100 μg / ml ampicillin) i ett sterilt 14 ml polystyrenodlingsrör.
      OBS: Nytransformerade kolonier rekommenderas för ympning. Celler på LA-medelplattor (från steg 2.2) som förvaras vid 4 °C ska användas inom några dagar.
    2. Odla cellkulturen över natten vid 37 ° C i en orbital shaker vid 200-250 rpm.
  2. Produktion av rekombinant EGFP- H6, H6-NowGFP och H6-KillerOrange med infödd prolin och motsvarande proteinvarianter med prolinanaloger
    1. Inokulera 200 ml färskt NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 och 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukos, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml tiamin, 10 μg/ml biotin, 0,01 μg/ml spårämnen (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~ 7,2) med alla kanoniska l-aminosyror (50 mg / L); se Kompletterande material) kompletterat med 100 μg/ml ampicillin med 2 ml övernattningskultur i en 2-L Erlenmeyerkolv.
      OBS: Beroende på typ av protein kan alternativa odlingsmedier som MOPS medium52, glukos-mineralsalter medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 eller GMML56 testas för att optimera proteinutbytet.
    2. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en orbital shaker vid 220 rpm i ~ 3 h 30 min.
    3. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) i en spektrofotometer var 30: e minut tills ett OD600-värde på ~ 0,7 uppnås.
      OBS: För OD600-bestämning i en spektrofotometer bör kyvetten ha en banlängd på 1 cm. Motsvarande odlingsmedium används för referensmätningen ("noll"). Inkubationstiden tills ett OD600-värde på ~ 0,7 uppnås kan bero på odlingsvolymen. 3 h 30 min är ett ungefärligt värde. I en variant av protokollets delsteg 2.2.1-2.2.3., kulturen från delsteg 2.1.2. används för att inokulera färskt NMMΔPro-medium (se Kompletterande material) kompletterat med en begränsad koncentration av prolin (t.ex. 5 mg/l i stället för 50 mg/l), och cellerna odlas över natten vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm. Nästa dag utförs OD600-bestämningen var 30: e minut tills skillnaderna mellan mätningarna är mindre än 0,05. Det maximala OD600-värdet bör vara cirka 1 (± 0,3). Den initiala, begränsade prolinkoncentrationen kan justeras beroende på uttrycksstam och odlingsmedium (se Diskussion).
    4. Snurra ner cellsuspensionen i 10 min vid 3 000 x g och 4 °C.
    5. Dekantera försiktigt supernatanten i avfall.
    6. Tvättsteg: Återsuspendera cellerna i 50 ml iskallt NMMΔAA (utan aminosyra, se Kompletterande material) eller NMMΔPro (utan prolin, se Kompletterande material) medium genom noggrann pipettering.
      OBS: För detta tvättsteg kan någon av de två angivna buffertarna användas, eftersom det bara är viktigt att bli av med kvarvarande prolin i inkubationsmediet.
    7. Separera cellerna från mediet genom sedimentering vid 4 °C i en centrifug vid 3 000 x g i 10 min.
    8. Dekantera försiktigt supernatanten i avfall.
    9. Pipett försiktigt upp och ner för att återsuspendera cellpelleten i 200 ml NMMΔPro-medium kompletterat med 100 μg/ml ampicillin till en 2-L Erlenmeyerkolv.
      OBS: Den resulterande cellsuspensionen kan separeras i flera prover med samma volym för att erhålla identiska startkulturer för att jämföra proteinuttryck i närvaro av Pro- eller prolinanaloger (t.ex. separation i 4 x 50 ml i 100 ml Erlenmeyer-kolvar).
    10. Inkubera i 30 min vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm för fullständig utarmning av Pro.
      OBS: Detta steg är avgörande för att helt tömma Pro från celler.
    11. Tillsätt en lämplig volym av antingen L-prolin eller R-Flp, S-Flp, Dfp och Dhp från 50 mM stamlösning för att justera 1 mM slutlig koncentration i cellsuspensionen.
      OBS: Som en allmän regel bör färska 50 mM lagerlösningar av Pro- eller prolinderivat alltid beredas före användning. Endast om hydrolys av den särskilda kanoniska eller icke-kanoniska aminosyran i en vattenlösning inte är ett problem, får frysta bestånd också användas.
    12. Tillsätt 0,5 mM IPTG från en 1 M stamlösning för att inducera målproteinuttryck.
    13. Uttryck målproteinet över natten (12 timmar) vid 37 °C i en orbital shaker vid 220 rpm.
    14. Mät OD600 nästa dag.
      OBS: OD600-bestämning görs för att kvantifiera mängden celler efter proteinuttryck. Ett lägre OD600-värde jämfört med det värde som uppmättes före tvättsteg 2.2.3 indikerar cytotoxiciteten hos den tillförda aminosyran. I detta fall bör proceduren upprepas med koncentrationen av den tillförda aminosyran minimerad (ner till 0,1 mM).
    15. Centrifugera och samla bakteriecellerna vid 5 000 x g och 4 °C i 10 minuter och dekantera supernatanten till avfall.
    16. Tvättsteg: Resuspendera cellerna genom noggrann pipettering i 50 ml bindningsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) innehållande 10% glycerol och överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt polystyrenrör.
    17. Centrifugera och samla bakteriecellerna vid 5 000 x g och 4 °C i 10 minuter och dekantera supernatanten till avfall.
    18. Förvara cellpelleten i ett 50 ml koniskt polystyrenrör vid -20 °C eller -80 °C tills vidare användning (proteinrening, se nedan).

3. Reningsförfarande för proteinprover genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC)

  1. Bakteriell celllys
    OBS: Utför alla steg av celllys på is eller vid 4 ° C för att förhindra nedbrytning av målproteinet.
    1. Tina bakteriecellpelleten på is eller vid 4 °C i ett 50 ml koniskt polystyrenrör i 10-20 min.
    2. Tillsätt 10 ml iskall bindningsbuffert (se Kompletterande material) och pipettera försiktigt upp och ner för att återanvända cellpelleten.
    3. Tillsätt 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNas I, 100 μL 1 mg/ml RNas A, 30 μL 1 MMgCl2. Invertera försiktigt cellsuspensionen fem gånger och håll det slutna röret på is eller vid 4 ° C i 60 minuter.
      OBS: Lysozym inducerar kemisk celllys genom att störa bakteriecellväggen.
    4. Sonicate provet för cellstörning med hjälp av en ultraljud homogenisator (t.ex. 3 gånger i 3 min i ett 50 ml polystyrenrör på en is-vattenblandning, puls 2 s / paus 4 s, 45% amplitud).
      OBS: Alternativt kan andra cellstörningsmetoder användas, t.ex. högtryckshomogenisering i 20 cykler vid 14 000 psi. Späd vid behov med en bindande buffert (se Kompletterande material) för att nå den minsta instrumentvolymen. Dessutom kan proteinextraktionsreagens användas för cellstörningar. Se Materialförteckningen för exempel.
    5. Centrifug i 60 min vid 18 000 x g, 4 °C.
    6. Anteckna vätskevolymen för delsteg 3.1.9. och häll supernatanten i ett nytt 50 ml polystyrenrör.
    7. Rensa supernatanten med ett membranfilter med 0,45 μm pordiameter.
    8. Ta ett prov av "lysat" för SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedan); detta motsvarar "löslig proteinfraktion", supernatanten från delsteg 3.1.6.
    9. Lägg till en lika stor volymddH2Oenligt understeg 3.1.6. att återsuspendera cellskräpet för att bibehålla samma utspädning av proverna för efterföljande SDS-PAGE-analys.
    10. Ta ett prov av "pellets" för SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedan); detta motsvarar "olöslig proteinfraktion", cellskräpetsuspensionen från delsteg 3.1.9.
  2. Immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC) rening
    OBS: Rening av målfluorescerande protein kan utföras vid 4 °C eller vid rumstemperatur (RT). För det senare alternativet, vänta tills lysatet, kolonnen och alla buffertar balanserar vid RT för att förhindra luftbubbelbildning på grund av förångning av luft som fångas i kall lösning vid placering i en varm kolonn.
    1. Rena provet med en 1 ml färdigförpackad eller självförpackad IMAC FPLC-kolonn (snabb protein [eller prestanda] vätskekromatografi) enligt tillverkarens instruktioner; ställ in maximalt kolonntryck till 0,3 MPa och flödeshastighet till 1 ml/min; Använda bindningsbuffert (se Kompletterande material) för kolonnjämning, tvättbuffert (se Kompletterande material) för tvättsteget och elueringsbuffert (se Kompletterande material) för målproteineluering.
      OBS: Alternativt kan ett automatiserat FPLC-system appliceras för att eluera målproteinet med elueringsbuffert som kör en linjär imidazolkoncentrationsgradient (20-200 mM).
    2. Samla och slå samman eluatfraktionerna med fluorescerande proteiner (välj efter synlig grön eller orange färg).
    3. Överför de sammanförda fraktionerna till ett dialysmembran (molekylviktsavgränsning (MWCO) på 5 000-10 000) enligt tillverkarens instruktioner och dialysera minst tre gånger mot dialysbuffert eller MS-buffert (se Kompletterande material). Utför till exempel dialys av ett 1 ml prov tre gånger mot 100 ml buffert i minst 2 timmar varje omgång. För ett detaljerat protokoll, se Budisa et al.34.
    4. Förbered en 1:100-faldig utspädning av den dialyserade elueringsfraktionen i PBS-bufferten (se Kompletterande material).
    5. Registrera absorbansspektrumet för de utspädda proverna i en UV-Vis-spektrofotometer.
    6. Beräkna proteinkoncentrationen baserat på Lambert-Beer-lagen enligt följande, med hjälp av litteraturvärden för de molära utrotningskoefficienterna ε vid specifik våglängd (för EGFP vid 488 nm ε488 = 55 000 cm-1 · M-1, NowGFP vid 493 nm ε493 = 53 600 cm-1· M-1, KillerOrange vid 514 nm ε514 = 22 600 cm-1· M-1):
      Equation 1 (Lambert-Beer lag)
      c-protein = proteinkoncentration [mg/ml]
      A = absorbans vid specifik våglängd
      ε = molär utrotningskoefficient vid specifik våglängd [M-1·cm-1]
      d = kyvettbanans längd, här 1 cm
      MW = molekylvikt för protein [g/mol]
      Använd dialysbuffert (se Kompletterande material) för referensmätningen ("noll").
    7. Ta ett prov av "eluat" för SDS-PAGE (se avsnitt 4 nedan), ladda 1-10 μg protein (beräknat enligt föregående steg) per provbrunn för Coomassie Brilliant Blue-färgade geler.
      OBS: Justera SDS-provmängderna beroende på den applicerade färgningsmetoden och färgämnets känslighet om föreningar som skiljer sig från Coomassie Brilliant Blue används för färgning av proteinband.
    8. Frys in och förvara proteinprovet i dialysbuffert (se Kompletterande material) vid -80 °C.
      OBS: Under detta lagringstillstånd bör proteinprover vara stabila i minst 6 månader. Alternativa laboratorie UV-Vis och fluorescensspektrofotometrar kan användas för registrering av absorptions- och fluorescensemissionsspektra av målproteiner. Följande excitationsvåglängder kan tillämpas för fluorescensemissionsmätningar: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) och 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE provberedning

  1. Bestäm absorbans A vid 280 nm (A280nm) för prover "eluate", "lysate" och "pellet" från avsnitt 3. Justera sondvolymen för att uppnå A280nm = 2 genom att lägga till en lämplig mängd elueringsbuffert (den slutliga sondvolymen bör vara minst 80 μL).
  2. Blanda provet i förhållandet 4:1 (v/v) med 5x SDS-laddningsfärgbuffert (se Kompletterande material) genom pipettering, t.ex. 80 μL av provet med 20 μL 5x SDS-laddningsbuffert.
  3. Koka SDS-proverna vid 95 ° C i 5 minuter i ett vattenbad eller värmeblock för att denaturera proteinerna.
  4. Låt proverna svalna till RT och snurra ner sonderna vid 13 000 x g i 1 min i en mikrocentrifug innan de laddas på gelén.
  5. Använd 5-10 μL för Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. För närmare uppgifter om SDS-PAGE-förfarandet, se57.
    OBS: Justera SDS-provmängderna beroende på den applicerade färgningsmetoden och färgämnets känslighet. Resultatet av SDS-PAGE bör kontrolleras noggrant för att säkerställa att proverna innehåller mer än 95% av det totala proteinet i ett band som motsvarar den förväntade molekylvikten för det önskade proteinet. För detta, ta ett fotografi av den Coomassie-färgade gelén och jämför intensiteten hos proteinbandet med önskad molekylvikt med intensiteten hos alla andra band i körfältet (om någon) genom densitometri. För densitometrisk utvärdering av bandintensiteter kan programvaran ImageJ användas58. För att experimentellt bevisa införlivandet av de önskade ncAA i proteinet av intresse, bör intakt proteinmassanalys genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kopplad till elektrosprayjoniseringstid för flygmasspektrometri (LC-ESI-TOF-MS) utföras enligt beskrivningen59 (se protokoll avsnitt 5 och materialtabell däri för exemplarisk utrustning).

5. Fluorescensutsläpp av proteinvarianter

  1. Kontrollera resultatet från SDS-PAGE-experimentet före proceduren för att se till att provets renhet är >95 % (se ANMÄRKNINGen efter steg 4.5.)
  2. Justera proverna för varje renad proteinvariant till en koncentration av 0,3 μM, med det beräknade absorbansvärdet vid lämplig våglängd som referens (delsteg 3.2.5). Se till att den ungefärliga slutliga provvolymen är 200 μL.
  3. Låt de utspädda proverna ekvillibrera i 1 timme vid RT.
  4. Överför proverna till en 1 cm kvartskyvett och mät ett fluorescensemissionsspektrum för proverna med hjälp av en fluorescensspektrometer (se materialtabell) med tillämpning av följande excitationsvåglängder: 488 nm (för EGFP), 493 nm (för NowGFP), 510 nm (för KillerOrange).

6. Denaturering och omfällning av EGFP-varianter

  1. Kontrollera resultatet från SDS-PAGE-experimentet före proceduren för att se till att provets renhet är >95 % (se ANMÄRKNINGen efter steg 4.5.)
  2. Förbered för varje renad proteinvariant två prover med 2 μL slutlig volym i en koncentration av 300 μM (se bestämning av proteinkoncentration i delsteg 3.2.4-3.2.6).
  3. Tillsätt 18 μL 1,11x PBS-buffert (se Kompletterande material) innehållande 8,89 M urea och 5,56 mM DTT till 2 μL av varje renad proteinvariant (för att erhålla 1x PBS innehållande 8 M urea och 5 mM DTT) för att inducera denaturering.
    OBS: För steg 6.4–6.6 ska du bearbeta varje prov separat.
  4. Inkubera proverna i 5 minuter vid 95 °C.
  5. Späd 20 μL-proverna 100-faldigt genom att tillsätta 1980 μL 1x PBS (se Kompletterande material) innehållande 5 mM DTT för att inducera renaturering, vilket ger 0,3 μM slutlig proteinkoncentration och omedelbart överföra 200 μL av proverna till en 1 cm kvartskyvett.
    OBS: Det är mycket viktigt att arbeta snabbt här eftersom renaturering börjar omedelbart.
  6. Sätt in kvartskyvetten i en lämplig fluorescensspektrometer (se Materialtabell) och övervaka proteinveckningen i proverna genom att förvärva ett fluorescensspektrum var 3: e sekund under 30 minuter. För varje proteinvariant, använd 295 nm fluorescensexcitation för det första provet och 488 nm fluorescensexcitation för den andra.
  7. Överför omfällningsproverna till 1,5 ml mikrocentrifugrör, stäng locket och förvara proverna vid RT i mörkret i 24 timmar för att möjliggöra fullständig omfällning av EGFP-varianter.
  8. Mäta fluorescensutsläpp av refoldade proteinprover enligt steg 6.6 med samma excitationsvåglängd som tidigare för att fånga det tidsmässiga effektmåttet för fluorescensåtervinning.

Representative Results

I början av studien valde vi tre olika fluorescerande proteinvarianter som delar den överordnade GFP-arkitekturen. Det första proteinet som valdes var EGFP, som är en konstruerad variant som härrör från den ursprungliga GFP från maneten Aequorea victoria som innehåller Phe64Leu / Ser65Thr-mutationer. Det andra utvalda proteinet var NowGFP51,60. Det är också en variant av A. victoria GFP härledd genom mutagenes i flera steg via föregående fluorescerande proteiner. NowGFP innehåller 18 mutationer jämfört med sin omedelbara föregångare fluorescerande protein "Cerulean"61. I sin tur är "Cerulean" -proteinet ett derivat av det förbättrade cyanfluorescensproteinet (ECFP)62,63, ett protein som tidigare valts ut genom riktad laboratorieutveckling och innehåller en tryptofanbaserad kromofor. Både EGFP och NowGFP används ofta i cellbiologi och biofysiska studier, och de innehåller tio konserverade prolinrester i sina strukturer. Dessutom har NowGFP en elfte prolinrest vid position 230, som uppstod på grund av den omfattande mutationshistorien för denna proteinvariant. Det tredje proteinet som valdes var killerorange fluorescerande protein64,65. Det är ett derivat av kromoproteinet anm2CP från hydrozosläktet Anthoathecata. Proteinsekvensen innehåller 15 prolinrester, och kromoforen är baserad på en tryptofan snarare än en tyrosinrest. Högupplösta röntgenstrukturer har rapporterats för alla tre utvalda proteiner (figur 2)51,65,66.

I det första steget införlivades prolinanaloger (figur 1D) i alla prolinpositioner för tre modellproteiner (EGFP, NowGFP och KillerOrange) genom selektiv tryckinkorporering (SPI, ett schema för proceduren ges i figur 3). Instrumentalt användes den prolin-auxotrofa E. coli K12-stammen JM8367 för uttryck av proteinerna i närvaro av prolin och analoger (figur 1D), vilket gav vildtyp respektive modifierade proteiner. Pellets från celler som uttrycker det inhemska proteinet och varianter som bär S-Flp och Dhp hade den typiska ljusa färgen på grund av den intakta kromoforen, medan varianter som innehöll R-Flp och Dfp förblev färglösa, vilket indikerar felveckning och avsättning av utfällt protein i inklusionskroppar (Figur 4A). SDS-PAGE-analys av de uttryckta proverna verifierade förekomsten av olösliga R-Flp-innehållande proteiner (figur 4B-D), vilket förhindrade ytterligare undersökningar. Även om detta ligger utanför tillämpningsområdet för denna studie bör det noteras att problem med proteinlöslighet och felveckning i viss utsträckning kan lindras genom in vitro-omfällningsförfaranden 68. Däremot hittades inhemska proteiner samt S-Flp- och Dhp-bärande varianter huvudsakligen i de lösliga fraktionerna (figur 4B-D). Den vilda typen, liksom S-Flp- och Dhp-innehållande varianter, kan isoleras ytterligare och karakteriseras i fluorescensstudier. Lösliga proteiner renades genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC), vilket gav 20-30 mg / L odlingsvolym för EGFP, 60-80 mg för NowGFP och KillerOrange, vars utbyte för vildtyp och modifierade proteiner var mycket lika. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS)-kopplad analys bekräftade den förväntade identiteten och renheten hos de isolat som erhållits på detta sätt (figur 5). I massspektra producerade varje prolinersättning med S-Flp ett +18 Da-skift per varje prolinrest i sekvensen, medan för prolin-till-Dhp-ersättningen var skiftet −2 Da per rest.

I nästa steg registrerades ljusabsorptions- och emissionsspektra för att analysera de potentiella effekterna av icke-kanoniska prolinanaloger som införlivas på de spektroskopiska egenskaperna hos de överordnade fluorescerande proteinerna (Figur 6). UV-Vis-absorptionsspektra visade ett typiskt band runt 280 nm som är karakteristiskt för aromatiska rester, tyrosin och tryptofan, medan kromoforabsorbentansen hittades vid 488 nm för EGFP och 493 nm för NowGFP (figur 6A,B). I KillerOrange bestod kromoforabsorabsansregionen av två band (figur 6C), som motsvarar två möjliga konfigurations- och laddningstillstånd för den komplexa kromoforen. Bandet runt 510 nm är känt som det tillstånd från vilket fluorescens sker med högt kvantutbyte49,65. I prolinersättningsvarianterna observerades följande: Inkorporering av Dhp förändrade inte absorbansspektra för EGFP och NowGFP, medan S-Flp gav en förbättrad UV-absorption. Det senare kan förklaras av inducerade skillnader i mikromiljöerna för tryptofanrester, särskilt Trp57 inklämd mellan tre S-Flp i PVPWP-motivet (figur 6A,B)69. En mer trivial förklaring till en högre UV-absorption kan dock härröra från en ökad fraktion av felaktigt vikta proteiner. Eftersom koncentrationen av proteinet bedömdes genom kvantifiering av absorbansegenskaper kan närvaron av ett protein med en felaktigt mogen kromofor öka absorbansen, medan denna fraktion inte räknas i den totala koncentrationen (figur 6A,B). För att stödja denna hypotes observerade vi att den S-Flp-innehållande EGFP uppvisade ett markant reducerat förhållande mellan kromofor kontra kombinerad tryptofan- och tyrosinabsorbering (ε (CRO) / ε (Tyr + Trp) = 0,96) jämfört med ett högre värde (1,57) i moderproteinet (tabell 2) 70. Närvaron av en icke-fluorescerande fraktion i den S-Flp-innehållande EGFP kommer att vara en viktig bidragande faktor vid vidare analys av proteinegenskaperna. I KillerOrange-varianten innehållande S-Flp observerades en förbättrad absorbans tillsammans med en rödförskjutning i kromoforbandet. Detta faktum indikerade att kromoforbildningen gynnade en konfiguration med ett stort fluorescenskvantutbyte (figur 6C).

Därefter analyserade vi fluorescensspektra för proteinerna som registrerades vid excitation vid motsvarande maximala absorbansvåglängder. Resultaten visar att spektra förblev i stort sett identiska för de undersökta fluorescerande proteinvarianterna med prolin och ersättningar, S-Flp och Dhp. Detta resultat innebär att analogerna inte förändrade den kemiska miljön i kromoforen i något fall (figur 6G-I). Trots detta faktum sågs markanta skillnader i fluorescensspektra av KillerOrange som registrerades vid excitation vid 295 nm, alltså vid tryptofan excitation. Detta experiment spårar fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) eller direkt excitonisk koppling som sker mellan tryptofansidkedjorna och den mogna kromoforen eftersom båda är belägna på ett kort avstånd av högst 25 Å. För EGFP- och NowGFP-varianter, när emissionsspektra mättes med 295 nm excitation, observerades en stark kromoforemission tillsammans med knappast någon tryptofanemission (figur 6D,E). Varianterna som innehöll S-Flp uppvisade dock ett något större tryptofanspecifikt utsläpp. Denna observation kan kopplas till ett oräkneligt bidrag från det utfällda apoproteinet som innehåller tryptofaner men inte den mogna kromoforen. Väsentligt ökad tryptofanspecifik emission sågs i KillerOrange, vilket indikerar brist på fluorescenssläckning via den förväntade mekanismen för excitationsenergiöverföring eller excitonisk koppling. Proteinvarianterna innehållande prolin och S-Flp uppvisade jämförbar tryptofanemission tillsammans med den gynnade rödförskjutna fluorescensfunktionen hos ett högt kvantutbyte. Däremot visade varianten som innehöll Dhp en drastisk minskning av kromoforfluorescensintensiteten, förmodligen på grund av mindre strukturella effekter (Figur 6F).

Därefter jämförde vi proteinernas vikningsegenskaper genom att utföra ett utvecklings- / renatureringsexperiment. Fluorescensemissionsspektra registrerades i det vikta tillståndet (protokollavsnitt 5), efter kemisk denaturering och därefter i processen med omfällning övervakad under en period av 24 timmar (protokoll avsnitt 6). Spektra registrerades vid excitation vid både relevanta våglängder, 295 nm, och vid maxima av kromoforernas absorbansspektra, medan den resulterande fluorescensen presenteras som normaliserad till det maximala värdet för varje protein (figur 7). I slutet av protokollet observerade vi att EGFP-varianter kunde återvecklas, medan NowGFP- och KillerOrange-varianterna - en gång denaturerade - förblev utfällda (data visas inte). Således varierade omvikningskapaciteten hos de ursprungliga fluorescensproteinerna väsentligt. Observera att KillerOrange har utvecklats som en fotosensibiliserare med utgångspunkt från hydrozokromoproteinvarianten KillerRed65,71, och dess omfällning ligger vanligtvis efter trots den robusta β-fatstrukturen. I våra experiment fann vi att EGFP-kromoforfluorescensen av vild typ återhämtade sig endast delvis, även om den tryptofanspecifika fluorescensen var större efter renaturering (Figur 7A, D). Väsentligen liknande beteende observerades i varianten innehållande Dhp (figur 7C,F). I S-Flp-innehållande EGFP observerades ett liknande resultat när excitationen utfördes vid den tryptofanspecifika våglängden 295 nm (figur 7B). Slående nog återhämtade sig fluorescensen till en mycket högre utsträckning när kromoforen var upphetsad vid 488 nm (figur 7E). Det verkar som om S-Flp inducerar ett mycket bättre utbyte av omfällning jämfört med de andra två varianterna. Denna fördelaktiga effekt sågs emellertid inte vid användning av 295 nm excitation på grund av okända molekylära interaktioner.

Därefter övervakades omfällningshastigheten genom att registrera fluorescens av både tryptofan och kromoforen separat, medan processens slutpunkt bestämdes vid 24 timmar efter starten av renaturering. Endast EGFP-varianter visade en relativt snabb omfällningskinetik som kunde utvärderas på ett tillförlitligt sätt, medan ingen av de denaturerade NowGFP- och KillerOrange-varianterna kunde återhämta sig till ett värde som möjliggjorde ytterligare kvantitativa mätningar. Vid EGFP var återvinningen av tryptofanutsläpp dubbelt så snabb (slutförd på 750 s) jämfört med återvinningen av kromoforutsläpp (slutförd på 1 500 s), vilket indikerar komplexiteten hos de underliggande processerna (figur 8). Vid båda excitationsvåglängderna höjdes omveckningshastigheten genom närvaron av S-Flp, i överensstämmelse med litteraturdata25. Samtidigt visade den Dhp-innehållande varianten en omfällbar profil som liknar vildtyp.

Figure 1
Figur 1: Grönt fluorescerande protein (GFP) strukturell byggnadsställning, kromoforbyggnad, prolinkonformationsövergångar och syntetiska analoger som används i denna studie. (A) Strukturen hos GFP består av β-strängar som bildar en nästan perfekt fat (dvs. en "burk" med måtten 4,2 nm x 2,4 nm) som är täckt i båda ändarna av α spiralformade lock. 27 kDa GFP-proteinet visar en tertiär struktur bestående av elva β-strängar, två korta α-helices och kromoforen i mitten. Konformationstillstånden hos intilliggande proliner är kopplade till kromoforbildning. (B) Autokatalytisk mognad (kondensation) av kromoforen sker vid resthalterna Ser65, Tyr66 och Gly67 och fortsätter i flera steg: För det första torsionsjusteringar i polypeptidryggraden för att föra karboxylkolet från Thr65 i närheten av amidkvävet i Gly67. Därefter uppstår bildandet av ett heterocykliskt imidazolin-5-ett-ringsystem vid nukleofil attack på denna kolatom genom amidkvävet av glycin och efterföljande uttorkning. Slutligen får systemet synlig fluorescens när oxidation av tyrosin alfa-beta-kolbindningen med molekylärt syre leder till förlängningen av det konjugerade systemet i imidazolinringsystemet, i slutet inklusive tyrosinfenylringen och dess para-syresubstituent. Den resulterande para-hydroxibenzylidenimidazolinonkromoforen i mitten av β-fat separeras fullständigt från bulklösningsmedlet. (C) Skelettstrukturformlerna och geometrierna för 1) prolinringen (puckers) och 2) den föregående amidbindningen representerar de huvudsakliga konformationsövergångarna för prolinresten. (D) De prolineanaloger som används i detta arbete med de angivna prolinringpuckarna. Figuren genererades med ChemDraw och Discovery Studio Visualizer. GFP-strukturen är från PDB-strukturpost 2Q6P. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerande proteiner som används i denna studie. Panelerna visar bandrepresentationen av de typiska β-fatstrukturerna av tre olika varianter av fluorescerande proteiner: EGFP, NowGFP och KillerOrange, med bandfärg som representerar färgen på fluorescensutsläpp för varje variant. Prolinrester (enbokstavskod) markeras som pinnar och lämpliga positioner kommenteras. Kromoforer visas med initial aminosyrakomposition i fetstil. Alla strukturrepresentationer producerades med PyMol baserat på följande PDB-strukturposter: 2Q6P för EGFP, 4RYS för NowGFP, 4ZFS för KillerOrange. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Flödesschemapresentation av SPI-metoden för restspecifik inkorporering av icke-kanoniska prolinanaloger. En prolin-auxotrofisk Escherichia coli (E. coli) värdstam som bär genen av intresse på en uttrycksplasmid odlas i ett definierat minimalt medium med alla 20 kanoniska aminosyror tills en OD600 på ~ 0,7 uppnås vid vilken cellkulturen är i mitten av logaritmisk tillväxtfas. Celler skördas och överförs till färskt minimalt medium innehållande 19 kanoniska aminosyror och en prolinanalog. Efter tillsats av en inducerare utförs proteinuttryck över natten. Slutligen isoleras målproteinet genom celllys och renas före ytterligare analys. I en variant av protokollet odlas cellerna i ett definierat minimalt medium med 19 kanoniska aminosyror och prolin tillsätts i en begränsad mängd (t.ex. en femtedel av koncentrationen av de andra aminosyrorna). Genom denna åtgärd avgaser cellerna prolin i mediet innan de kan lämna den logaritmiska tillväxtfasen, och därefter tillsätts analogen och proteinet av intresseproduktion induceras. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Uttrycksanalys av EGFP-, NowGFP- och KillerOrange-varianter. (A) Cellpellets från 1 ml uttryckskultur, normaliserad till OD600 = 2. SDS-PAGE-analys av (B) EGFP, (C) NowGFP och (D) KillerOrange-varianter. Lösliga (S) och olösliga fraktioner (I) av varje fluorescerande proteinderivat laddades på 15% akrylamidgel, liksom eluerade fraktioner (E) från IMAC av lösliga proteiner. PageRuler Unstained Protein Ladder användes som markör (M) i de banor som betecknas med (M). De förväntade regionerna för det specifika proteinet är inramade. Inkorporerade aminosyror vid prolinpositioner är Pro, R-Flp, S-Flp och Dhp (i (A) cellpellets från fluorescerande proteinvarianter som innehåller Dfp istället för Dhp visas). Geler färgades av 1% (w /v) Coomassie Brillant Blue. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Masspektrometrisk analys av fluorescerande proteinvarianter. (A) Representativa dekonvoluterade ESI-MS-spektra av H6-märkt EGFP (svart), S-Flp-EGFP (orange) och Dhp-EGFP (cyan) med placeringen av de huvudsakliga masstopparna angivna som siffror (i Da). De beräknade molekylmassorna [M+H]+ för deH6-märkta proteinerna är: För EGFP 27 745,33 Da (observerad 27 746,15 Da); för S-Flp-EGFP 27 925,33 Da (observerad 27 925,73 Da); för Dhp-EGFP 27 725,33 Da (observerad 27 726,01 Da). (B) Representativa dekonvoluterade ESI-MS-spektra av H6-märkt NowGFP (svart), S-Flp-NowGFP (orange) och Dhp-NowGFP (cyan) med placeringen av de huvudsakliga masstopparna angivna som siffror (i Da). De beräknade massorna avH6-märkta proteiner är: För NowGFP 27,931.50 Da (observerad 27,946.46 Da; skillnaden på ~ 16 Da beror troligen på oxidation av en metionin i proteinet); för S-Flp-NowGFP 28 129,50 Da (observerad 28 130,08 Da); för Dhp-NowGFP 27 909,50 Da (observerad 27 910,22 Da). (C) Representativa dekonvoluterade ESI-MS-spektra av H6-märkta KillerOrange (svart), S-Flp-KillerOrange (orange) och Dhp-KillerOrange (cyan) med placeringen av de huvudsakliga masstopparna angivna som siffror (i Da). De beräknade massorna avH6-märkta proteiner är: För KillerOrange 27 606,09 Da (observerad 27 605,91 Da); för S-Flp-KillerOrange 27 876,09 Da (observerad 27 876,08 Da); för Dhp-KillerOrange 27 576,09 Da (observerad 27 575,93 Da). Avvikelser mellan de observerade och beräknade molekylmassorna på cirka 1 Da ligger inom felområdet för ESI-MS-utrustningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Ljusabsorptions- och fluorescensemissionsspektra för fluorescerande proteinvarianter. Normaliserade UV-Vis-absorptionsspektra visas för varianterna (A) av EGFP, (B) av NowGFP och (C) av KillerOrange. Spektra normaliserades till maximal kromoforabsorberans (cirka 500 nm). Normaliserade fluorescensemissionsspektra visas av varianterna (D,G) av EGFP, (E,H) av NowGFP och (F,I) av KillerOrange. Spektra i (D,E,F) mättes vid excitation med ultraviolett ljus (295 nm), för spektra i (G,H,I) användes 488 nm, 493 nm respektive 510 nm ljus för excitation, och spektra normaliserades till respektive maxima av kromoforemission (cirka 500 nm). I varje panel motsvarar svarta kurvor spektra för den fluorescerande proteinvarianten med infödd prolin, orange kurvor indikerar spektra av S-Flp-substituerade proteiner och blå kurvor motsvarar Dhp-substituerade proteiner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Fluorescensemissionsspektra av EGFP-varianter i omfällningsexperiment. Normaliserade fluorescensemissionsspektra av 0,3 μM lösningar av fluorescerande proteinvarianter i ursprungligt tillstånd och efter denaturering och omfällning: Spektra i (A,B,C) mättes vid excitation med ultraviolett ljus (295 nm) (A) för EGFP, (B) för S-Flp-EGFP och (C) för Dhp-EGFP. Spektra i (D,E,F) mättes vid excitation med grönt ljus (488 nm) (D) för EFGP, (E) för S-Flp-EGFP och (F) för Dhp-EGFP. Emissionsspektra för de inhemska (svarta kurvorna) och omvikta proverna (grönt motsvarar EGFP, orange till S-Flp-EGFP respektive blått till Dhp-EGFP) för varje proteinvariant normaliseras till maximal fluorescens för lämpligt ursprungstillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Övervakning av proteinveckning och kromoformognad av EGFP-varianter med fluorescens. (A) Fluorescensutsläpp i området Trp-fluorescens (emissionen var inställd på 330 nm) som registrerats vid excitation med ultraviolett ljus (295 nm). (B) Utveckling av fluorescensamplituden i området för kromoforutsläpp vid excitation med grönt ljus (488 nm). De tidsberoende fluorescensspåren normaliserades till enhet (100%) enligt fluorescensamplituden som uppnåddes i slutet av övervakningsintervallet. I varje panel motsvarar svarta kurvor spektra för den fluorescerande proteinvarianten med infödd prolin, orange kurvor indikerar spektra av S-Flp-substituerade proteiner och blå kurvor motsvarar Dhp-substituerade proteiner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Konstruera Aminosyrasekvenser (6xHans tagg understruken):
EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-nuGFP MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabell 1: Primära strukturer hos målproteinerna. His-taggar är understrukna i varje sekvens.

λ [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO) 31 657 (± 1 341) 22 950 (± 290) 27 800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp) 20 116 (± 172) 23 800 (± 715) 17 300 (± 554)
Värdena för utrotningskoefficient ε (i M-1·cm-1) beräknas utifrån registrerade UV-Vis-absorptionsspektra av lämpliga EGFP-varianter med användning av kända proteinkoncentrationer. Vald våglängd vid 280 nm motsvarar den maximala absorbansen av aromatiska rester, tyrosin och tryptofan, och 488 nm representerar kromoforabsorabsordansvåglängden.

Tabell 2: Utrotningskoefficienter (ε) för EGFP-varianter vid valda våglängder. Värdena för utrotningskoefficienten ε (i M-1·cm-1) beräknas utifrån registrerade UV-Vis-absorptionsspektra av lämpliga EGFP-varianter med användning av kända proteinkoncentrationer. Den valda våglängden på 280 nm motsvarar den maximala absorbansen av aromatiska rester, tyrosin och tryptofan, medan 488 nm representerar den maximala kromoforabsorberingsvåglängden.

Kompletterande material: Förberedelse av lagerlösningar och buffertar Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

I naturen uppträder manipuleringar med proteinstrukturer och funktioner vanligtvis på grund av mutationer, fenomenet som leder till ett utbyte av en aminosyraidentitet vid vissa positioner i proteinsekvensen. Denna naturliga mekanism tillämpas allmänt som en bioteknisk metod för proteinteknik i form av mutagenes, och den bygger på repertoaren av de 20 kanoniska aminosyrorna som är involverade i processen. Utbytet av prolinrester är dock problematiskt. På grund av sin speciella ryggradsgruppsarkitektur är den knappast utbytbar med de återstående 19 resterna för ersättning72. Till exempel är prolin typiskt känd som en sekundär strukturbrytare i polypeptidsekvenser på grund av dess dåliga kompatibilitet med de vanligaste sekundära strukturerna, dvs α-helix och β-sträng. Denna prolinfunktion går lätt förlorad när återstoden muteras till en annan aminosyra från den gemensamma repertoaren. Ersättningen av prolin med dess kemiska analoger erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt, vilket gör det möjligt att behålla de grundläggande ryggradsegenskaperna hos moderprolinresten samtidigt som man ålägger bias på dess specifika konformationsövergångar eller producerar moduleringar av molekylvolymen och polariteten. Det är till exempel möjligt att leverera bakteriekulturer med analoga strukturer såsom hydroxi-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer med varierande ringstorlekar och mer, vilket underlättar produktionen av ett protein som innehåller specifika prolinrestförändringar.

Den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI) som beskrivs i denna studie möjliggör en global, dvs. restspecifik ersättning av alla proliner i målproteinet med relaterade kemiska analoger. Metodens betydelse återspeglas av det faktum att SPI gör det möjligt att skapa sekvensförändringar som är otillgängliga för vanliga mutagenstekniker. Till exempel tillåter det produktion av ett målprotein som innehåller ganska små strukturella förändringar som vanligtvis inte får överstiga en eller två atomersättningar / deletioner / tillägg, vilket demonstreras i denna studie. Sådana proteinmodifieringar kallas "atommutationer"73,74. I ett fluorescerande protein såsom GFP kan resultatet av detta molekylära intrång ses i vikningshastigheten, lokala polariteter, proteinförpackning, stabilitet hos de involverade strukturella egenskaperna. Förändringarna i absorbans- och fluorescensegenskaperna produceras indirekt på grund av påverkan på proteinveckning och restmikromiljöer. Precisionen hos de molekylära förändringar som utförs av SPI är vanligtvis mycket högre, jämfört med mutationer av proliner till andra kanoniska rester, den senare är typiskt skadlig för proteinveckningen, produktionen och isoleringen.

Som en produktionsmetod använder SPI-metoden substrattoleransen för aminoacyl-tRNA-syntetasfickan mot kemiska analoger av den inhemska aminosyran. Syntetasen är ansvarig för korrekt identifiering av aminosyrastrukturen, medan införlivandet i proteiner sker nedströms i översättningsprocessen. Instrumentellt utförs proteinproduktionen, isoleringen och reningen i SPI på ett sätt som är typiskt för alla andra rekombinanta proteinuttryckstekniker; emellertid med vissa tillägg till protokollet enligt följande: Proline, som är bunden för ersättning, tillhandahålls i början av jäsningsprocessen, så att cellerna kan växa och utveckla sitt intakta cellulära maskineri. Cellkulturen får emellertid inte nå den maximala optiska densiteten, för att hålla cellerna i den logaritmiska fasen optimal för proteinuttryck. Det finns två stora variationer av SPI-metoden vid denna tidpunkt. I den första justeras koncentrationen av prolin i det initiala tillväxtmediet (ett kemiskt definierat medium) så att utarmning av prolin sker utan något yttre intrång. Cellerna avgaser prolin i mediet innan de kan lämna den logaritmiska tillväxtfasen, och därefter tillsätts analogen och proteinet av intresseproduktion induceras. I den andra versionen av metoden odlas cellerna i mediet innehållande prolin fram till mitten av deras logaritmiska fas. Vid denna tidpunkt bör cellerna tas ut och fysiskt överföras till ett annat medium, som inte längre innehåller prolin, endast analogen, med efterföljande induktion av proteinet av intresse. I båda versionerna tillhandahålls analogen och proteininduktionsreagenset till de förvuxna cellerna. Isoleringen och reningen av vildtypsproteinet utförs på samma sätt som för varianterna. I princip kan varje tillgänglig pro-auxotrofisk stam användas som uttrycksvärd. Ändå rekommenderas uttryckstester för att identifiera den lämpligaste värden. Tester av olika kemiskt definierade medier kan också användas för att optimera proteinutbytet.

Det finns vissa krav på kemiska analoger som måste beaktas för SPI, såsom löslighet och koncentration. Den metaboliska tillgängligheten och upptaget av aminosyror är beroende av antalet upplösta molekyler i mediet. För att öka lösligheten hos en viss förening kan svagt sura eller alkaliska förhållanden väljas. Eftersom de konstgjorda molekylerna kan orsaka tillväxthämmande effekter på grund av deras celltoxicitet, bör koncentrationen sänkas till ett minimum för att undvika cellstress75.

En mindre svaghet i SPI är minskningen av inkorporeringseffektiviteten med ett större antal positioner som behöver bytas ut. I princip kan en minskning av aminosyrafrekvensen inom målbiomolekylen genom platsriktad mutagenes lösa detta problem. De strukturella och funktionella egenskaperna hos ett önskat protein kan emellertid påverkas av att ändra den primära strukturen.

Som nämnts tidigare tillåter SPI restspecifik ersättning av den kanoniska aminosyran. Detta innebär att icke-kanoniska aminosyror sätts in i varje position av den kanoniska aminosyran i målproteinet, inklusive konserverade rester som är oumbärliga för proteinfunktion eller vikning. Alternativa metoder för platsspecifik inkorporering är den enda möjligheten att lösa detta problem3. Under de senaste decennierna har den ortogonala parmetoden utvecklats som kan producera proteiner som innehåller modifierade rester på fördefinierade platser. Den vanligaste modifieringen av denna metod är känd som stoppkodonundertryckning. Denna metod är baserad på ett konstruerat ortogonalt översättningssystem dedikerat för platsspecifik inkorporering av syntetiska aminosyror76. Mer än 200 aminosyror med olika sidokedjemodifieringar har hittills införlivats i proteiner med hjälp av detta tillvägagångssätt77. Dessa översättningssystem är emellertid fortfarande inte lämpliga för införande av prolinanaloger i målproteiner. Vidare anses metodens prestanda vara låg vid mindre aminosyramodifieringar eftersom viss bakgrundspromiskuitet hos aminoacyl-tRNA-syntetaset typiskt kvarstår i de konstruerade översättningssystemen.

Med hjälp av SPI producerade vi ett antal β-fat fluorescerande proteinvarianter och studerade resultaten av utbytet av prolin med dess onaturliga analoger. Vid prolinersättning med R-Flp och Dfp producerades ett dysfunktionellt protein av uttrycksvärden. Effekten produceras sannolikt av felveckning av protein. Den senare kan härröra från C4-exo-konformationen som främjas av R-Flp, som är ogynnsam av moderproteinstrukturerna27. Med Dfp kommer felveckningen sannolikt att produceras genom den minskade hastigheten hos trans-till-cis-peptidbindningsisomeriseringen vid prolinresten27. Det senare är känt för att vara bland de begränsande stegen i den kinetiska profilen för proteinveckningen som påverkar β-fatbildning och efterföljande kromoformognad. För både aminosyror, R-Flp och Dfp resulterade proteinproduktionen i ett aggregerat och olösligt protein. Följaktligen kunde kromoforbildning inte inträffa, och fluorescensen förlorades helt. Med S-Flp och Dhp observerades dock korrekt proteinmognad, vilket resulterade i fluorescerande proteinprover för varje analog / proteinkombination. Trots vissa moduleringar i proteinets absorbans- och fluorescensegenskaper förblev dessa i stor utsträckning liknande dem hos vildtypsproteinerna. Effekten av aminosyrasubstitutionen avslöjades i de refolding kinetikstudierna. Den senare visade en snabbare omfällning vid ersättning med S-Flp. Modellstudier har visat att denna rest kan generera en viss förbättring av trans-till-cis-amidrotationshastigheten och leda till bildandet av C 4-endo-konformationen. Båda dessa faktorer kommer sannolikt att bidra till de fördelaktiga kinetiska effekterna av denna rest i EGFP. Däremot producerade Dhp kinetiska vikningsprofiler som maximalt liknar moderproteinet. Mångfalden av de resultat som produceras av enbart atommutationer i de undersökta fluorescerande proteinerna illustrerar potentialen hos SPI-produktionsmetoden för att förändra målproteinegenskaperna. Proteinförändringarna inducerade av prolinersättning med analogerna har ytterligare konsekvenser vid konstruktion av enzymer 78,79,80 och jonkanaler 81,82, liksom i allmänhet konstruktion av proteinstabilitet.

Den grundläggande begränsningen av SPI-metoden är dess "allt-eller-ingen" -läge vid utbyte av prolin finns med relaterade analoger. Det skulle vara till stor fördel att kunna välja exakt, vilka prolinrester som ska ersättas med analogerna och vilka som ska förbli oförändrade. För närvarande finns det emellertid ingen teknik som kan utföra en så sofistikerad produktion med hjälp av en mikrobiell produktionsvärd. Kemisk syntes av proteiner 83,84, liksom cellfri produktion85,86, är de två alternativa metoderna som kan producera positionsspecifika prolinmodifieringar. Ändå gör deras operativa komplexitet och låga produktionsutbyten dem sämre jämfört med produktionen i levande celler. Från och med nu är SPI fortfarande det mest operativt enkla och robusta tillvägagångssättet för produktion av komplexa proteiner som bär atommutationer. Genom att införa onaturliga aminosyrasubstitut möjliggör metoden modifiering av proteinegenskaper på ett målinriktat sätt, vilket exemplifieras här av förändringar i vikning och ljusabsorption / utsläpp av fluorescerande proteiner som genereras av prolinersättningar.

Disclosures

Författarna avslöjar alla intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) till T.F. och N.B. och av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF-programmet "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) till F.-J.S. och T.M.T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Tags

Bioengineering utgåva 180 icke-kanoniska aminosyror prolinanaloger selektiv tryckinkorporering proteinveckning vikningskinetik proteinstabilitet
Restspecifikt utbyte av prolin med prolinanaloger i fluorescerande proteiner: Hur "molekylär kirurgi" i ryggraden påverkar vikning och stabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thi To, T. M., Kubyshkin, V.,… More

Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F. J., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter