Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Snabb inkapsling av rekonstituerad cytoskelett inuti jätte unilamellarblåsor

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel introducerar en enkel metod för snabb produktion av gigantiska unilamellarblåsor med inkapslade cytoskelettproteiner. Metoden visar sig vara användbar för bottom-up rekonstitution av cytoskelettstrukturer i inneslutning och cytoskelett-membraninteraktioner.

Abstract

Gigantiska unilamellarblåsor (GUV) används ofta som modeller av biologiska membran och är därför ett utmärkt verktyg för att studera membranrelaterade cellulära processer in vitro. Under de senaste åren har inkapsling inom GUVs visat sig vara ett användbart tillvägagångssätt för rekonstitueringsexperiment inom cellbiologi och relaterade områden. Det efterliknar bättre inneslutningsförhållanden inuti levande celler, i motsats till konventionell biokemisk rekonstituering. Metoder för inkapsling inuti GUVs är ofta inte lätta att implementera, och framgångsgraden kan skilja sig avsevärt från labb till labb. En teknik som har visat sig vara framgångsrik för att kapsla in mer komplexa proteinsystem kallas continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Här presenteras en cDICE-baserad metod för att snabbt kapsla in cytoskelettproteiner i GUV med hög inkapslingseffektivitet. I denna metod genereras först lipid-monolagerdroppar genom att emulgera en proteinlösning av intresse i en lipid / oljeblandning. Efter att ha tillsatts i en roterande 3D-tryckt kammare passerar dessa lipid-monolagerade droppar sedan genom ett andra lipidmonolager vid ett vatten / oljegränssnitt inuti kammaren för att bilda GUVs som innehåller proteinsystemet. Denna metod förenklar det övergripande förfarandet för inkapsling inom GUV och påskyndar processen, och gör det därmed möjligt för oss att begränsa och observera den dynamiska utvecklingen av nätverksmontering inuti lipid-dubbelskiktsblåsor. Denna plattform är praktisk för att studera mekaniken för cytoskelett-membraninteraktioner i inneslutning.

Introduction

Lipid-dubbelskiktsfack används som modellsyntetiska celler för att studera slutna organiska reaktioner och membranbaserade processer eller som bärarmoduler i läkemedelsleveransapplikationer 1,2. Bottom-up biologi med renade komponenter kräver minimala experimentella system för att utforska egenskaper och interaktioner mellan biomolekyler, såsom proteiner och lipider 3,4. Men med fältets framsteg finns det ett ökat behov av mer komplexa experimentella system som bättre imiterar förhållandena i biologiska celler. Inkapsling i GUVs är ett praktiskt tillvägagångssätt som kan erbjuda några av dessa cellliknande egenskaper genom att tillhandahålla ett deformerbart och selektivt permeabelt lipid-dubbelskikt och ett begränsat reaktionsutrymme. I synnerhet kan in vitro-rekonstituering av cytoskelettsystem, som modeller av syntetiska celler, dra nytta av inkapsling i membranfack5. Många cytoskelettproteiner binder och interagerar med cellmembranet. Eftersom de flesta cytoskelettaggregat bildar strukturer som sträcker sig över hela cellen, bestäms deras form naturligt av cellstorlek6.

Olika metoder används för att generera GUV, såsom svullnad 7,8, liten vesikelfusion 9,10, emulsionsöverföring11,12, pulserad sprutning13 och andra mikrofluidiska tillvägagångssätt14,15. Även om dessa metoder fortfarande används, har var och en sina begränsningar. Således är ett robust och enkelt tillvägagångssätt med ett högt utbyte av GUV-inkapsling mycket önskvärt. Även om tekniker som spontan svullnad och elektroswelling används allmänt för bildandet av GUV, är dessa metoder främst kompatibla med specifika lipidkompositioner16, låg saltkoncentrationsbuffertar17, mindre inkapslingsmolekylstorlek18 och kräver en hög volym av inkapslingsmedlet. Att smälta samman flera små vesiklar till en GUV är i sig energiskt ogynnsamt, vilket kräver specificitet i laddade lipidkompositioner9 och / eller externa fusionsinducerande medel, såsom peptider19 eller andra kemikalier. Emulsionsöverföring och mikrofluidiska metoder kan å andra sidan kräva droppstabilisering genom avlägsnande av ytaktivt medel och lösningsmedel efter tvåskiktsbildning, respektive18,20. Komplexiteten i experimentell installation och anordning i mikrofluidiska tekniker som pulserad jetting innebär en ytterligare utmaning21. cDICE är en emulsionsbaserad metod härledd från liknande principer för emulsionsöverföring22,23. En vattenlösning (yttre lösning) och en lipid-oljeblandning stratifieras av centrifugalkrafter i en roterande cylindrisk kammare (cDICE-kammare) som bildar ett lipidmättat gränssnitt. Shuttling lipid monolayered vattenhaltiga droppar i den roterande cDICE-kammaren resulterar i zipping av ett dubbelskikt när droppar korsar det lipidmättade gränssnittet i den yttre vattenhaltiga lösningen22,24. cDICE-metoden är en robust teknik för GUV-inkapsling. Med den presenterade modifierade metoden uppnås inte bara det höga vesikelutbytet som är typiskt för cDICE med en signifikant kortare inkapslingstid (några sekunder) utan GUV-genereringstid som möjliggör observation av tidsberoende processer (t.ex. aktin cytoskelettnätverksbildning) reduceras avsevärt. Protokollet tar ca 15-20 min från start till GUV insamling och avbildning. Här beskrivs GUV-generering med hjälp av den modifierade cDICE-metoden för inkapsling av aktin och aktinbindande proteiner (ABPs). Den presenterade tekniken är emellertid tillämplig för att kapsla in ett brett spektrum av biologiska reaktioner och membraninteraktioner, från sammansättning av biopolymerer till cellfritt proteinuttryck till membranfusionsbaserad lastöverföring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av olja-lipid-blandning

OBS: Steget måste utföras i en dragskåp enligt alla säkerhetsriktlinjer för hantering av kloroform.

  1. Ta 0,5 ml kloroform i en 15 ml glasflaska. Tillsätt 88 μl 25 mg/ml dioleoylfosfokolin (DOPC), 9,3 μl 50 mg/ml kolesterol och 5 μl 1 mg/ml dioleoylfosfoetanolamin-lissamin rhodamin B (rhodamin PE) (se materialtabell) i injektionsflaskan med 15 ml glas.
    OBS: De slutliga molfraktionerna av DOPC och kolesterol i silikonolja / mineralolja är 69,9% respektive 30%. Det fastställdes att 20-30 mol% kolesterol är en optimerad koncentration för membranfluiditet och stabilitet hos GUVs som genereras med användning av den presenterade tekniken25,26. Fysiologiskt ligger dessa värden väl inom kolesterolkoncentrationsintervallet som finns i däggdjurscellplasmamembran6. Lipidlager förvärvas som lösningar i kloroform och lagras vid -20 °C. Lipidbuljongflaskor ska acklimatiseras till rumstemperatur innan de öppnas.
  2. Pipettera 7,2 ml silikonolja och 1,8 ml mineralolja i en andra 15 ml injektionsflaska (se materialtabell). I allmänhet måste detta göras i en handskfack med låg luftfuktighet, främst om mineraloljan återanvänds.
  3. Blanda oljorna genom att virvla med maximal rotationshastighet (3200 rpm) i 10 s, tillsätt blandningen till injektionsflaskan som innehåller lipid-i-kloroformblandningen och placera den omedelbart på virvelblandaren. Virvel i 10-15 s vid maximal rotationshastighet (3200 rpm). Den resulterande lipid-i-olja-blandningen bör vara något grumlig, eftersom lipiderna inte är helt upplösta i oljan utan snarare dispergerade som små aggregat24.
  4. Sätt lipid-i-olja dispersion i ett bad sonicator (se tabell av material) med ultraljudseffekt på 80 W och driftsfrekvens på 40 kHz vid rumstemperatur i 30 min. Använd blandningen omedelbart eller förvara vid 4 °C i högst 24 timmar.

2. Vesikelgenerering

  1. Montera den 3D-tryckta axeln (tilläggsfil 1) tillverkad av svart harts (se materialtabell) på bänkskivans omrörningsplatta och ställ in rotationshastigheten till 1200 rpm.
  2. Montera den 3D-printade cDICE-kammaren (tilläggsfil 2) tillverkad av klart harts (se materialtabell) på axeln (figur 1A,B).
  3. Förbered lösningar med aktin och aktinbindande proteiner (ABP) separat i en total volym av 20 μl.
    1. Bered 1-10 μM aktin i klotformig aktinbuffert (G-buffert), inklusive 10% ATTO 488 aktin (se materialtabell).
      OBS: 1x G-buffert består av 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 och 0,2 mM CaCl2.
    2. Tillsätt filamentös aktinpolymerisationsbuffert (F-buffert) för att påbörja aktinpolymerisation på is. Förvara lösningarna på is för att bromsa aktinpolymerisationen innan en tvärbindare tillsätts.
      OBS: 1x F-bufferten innehåller 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 och 3 mM ATP i 10 mM Tris, pH 7,5.
    3. Vänta i 15 minuter för att möjliggöra initiering av aktinpolymerisation på is innan du lägger till tvärbindare av intresse vid önskat molförhållande. Håll lösningen på is tills inkapsling.
    4. Förbered aktinbindande proteiner (ABP) separat i ett mikrorör (figur 1C).
      OBS: Detta steg utförs när en kombination av ABPs (t.ex. myosin, α-aktinin, fascin, Arp2/3-komplex) kapslar in med aktin 25,26,27. I sådana fall dras den önskade mängden av varje ABP från dess lager och tillsätts i mikroröret som är avsett för ABP: er. Eftersom den totala lösningen ska vara 20 μl måste stam alikvoter av ABPs beredas så att den önskade mängden av den totala ABP-blandningen inte överstiger 5-6 μL. Den enda ABP som används i de representativa resultaten här är fascin, vars beredning nämns nedan.
      1. Alikvot 1,57 μl fascin från 1,75 mg/ml fascinstock (se materialtabell) och tillsätt direkt till aktinlösningen i steg 2.7. Detta motsvarar 2,5 μM fascin i lösningen.
  4. Tillsätt 7,5% av densitetsgradientmediet (se materialtabell) i aktinlösningen för att skapa en densitetsgradient mellan den yttre och den inre vattenfasen för att underlätta GUV-sedimentering.
  5. Fördela 700 μL av den yttre lösningen av 200 mM glukos i kammaren (figur 1D, vänster).
    OBS: Osmolariteten hos den inre lösningen bestämmer koncentrationen av glukos. För dessa experiment är osmolariteten hos den inre lösningen ~ 200 mOsm, så en 200 mM glukoslösning används som den yttre lösningen.
  6. Tillsätt en tillräcklig mängd lipid-oljeblandning (>3 ml baserat på kammarens storlek) i kammaren tills 60% -80% av kammaren är fylld (figur 1D, höger). Ett gränssnitt kommer att bildas mellan lipid-oljeblandningen och den yttre lösningen.
  7. Överför ABPs (framställda i steg 2.3.4) till aktinlösningen. Använd en vanlig 100-1000 μL pipett och överför omedelbart 700 μL lipid-oljeblandningen till aktin-ABP-blandningen (figur 1E, vänster). Pipettera upp och ner 8 gånger för att generera lipid-monolagerdroppar i cellstorlek med diameter i intervallet 7-100 μm (figur 1E, mitten).
    OBS: Steg 2.7 måste slutföras på några sekunder för att undvika aktinnätverksmontering före inkapsling. Således, innan du utför steget, se till att pipettspetsarna redan är införda i pipetterna och redo att överföra blandningarna.
  8. Använd samma 100-1000 μL pipett, fördela omedelbart hela emulsionen i den roterande kammaren. Droppar kommer att förvärva en andra bipacksedel av lipider genom att korsa lipidmonoskiktet vid gränssnittet mellan olja och yttre lösning och därigenom bilda GUV (figur 1E, höger).
  9. Ta bort kammaren från omrörningsplattan och kassera det mesta av lipidoljeblandningen genom att luta kammaren i avfallsbehållaren så att en stor del av lipidoljeblandningen dräneras från den stora öppningen i mitten av kammaren.
    OBS: På detta sätt dras lipid-oljeblandningen av kammaren och undviker blandning av lipid-oljeblandning med den yttre lösningen i nästa steg.
  10. Håll kammaren med locket vänt mot användaren. Öppna kammarlocket och luta kammaren något mot användaren. Gränssnittet mellan den yttre lösningen som innehåller GUVs och lipid-oljeblandningen är synlig från kammaröppningen (där locket är beläget).
  11. Samla upp tillräckligt med yttre lösning som innehåller GUV med hjälp av en pipett och dosera 50-300 μL av den yttre lösningen i en 96-brunnsplatta för att erhålla en lämplig densitet av GUVs.
    OBS: Efter detta protokoll släpps totalt cirka 2 x 105 GUVs i den yttre lösningen inuti kammaren. GUV-spridningen kvantifierades inte; diametern på cirka 90% av GUVs ligger emellertid i intervallet 12-30 μm. GUVs med vilken diameter som helst i intervallet 7-50 μm finns i befolkningen. Beroende på det inkapslade densitetsgradientmediet, GUV-storleken och lösningsdjupet i brunnsplattan tar det 2-15 minuter för GUV att sätta sig ner på ytan. Utbytet av GUVs med rekonstituerade aktinbuntar är cirka 90%.

3. Bildbehandling och 3D-bildrekonstruktion

  1. Ställ in 96-brunnsplattan på scenen i ett inverterat mikroskop utrustat med en snurrande skiva (eller laserskanning) konfokalenhet, en EMCCD eller en sCMOS-kamera och en oljedoppning 60x objektivlins (se materialtabell).
  2. Fokusera på alla intressanta regioner (ROI) och ta en z-stack-bildsekvens från ROI med ett z-stegsintervall på 0,5 μm.
    OBS: Eftersom GUV kan förskjutas något på ytan över tid, rekommenderas det att ta en uppsättning bilder med flera våglängder vid varje z-plan om flera fluoroforer avbildas, dvs. ta en grupp av 561 nm och 488 nm bilder vid varje z-lane åt gången för att fånga ATTO 488 aktin- och Rhod PE-bilder.
  3. Spara varje z-stack-bildsekvens i .tiff format.
  4. Öppna en bildsekvens av intresse i ett bildbehandlingsprogram (ImageJ/Fiji). Identifiera bilden med högsta intensitet. Håll "ctrl + shift + c" för att öppna fönstret Ljusstyrka och kontrast och klicka på Återställ.
  5. Från ImageJ / Fiji-menyn, gå till Analysera > Ställ in skala och ange det kända fysiska avståndet och dess enhet för varje bildpixel.
  6. Från ImageJ / Fiji-menyn går du till Image > Stacks > 3D-projekt för att rekonstruera en 3D-bild från z-stacken. Ställ in "Projektionsmetod" som ljusstyrkepunkt, "Segmentavstånd (μm)" som 0,5 och markera Interpolera. Standardalternativen kan användas för resten av inställningarna.
    OBS: z-intervall i vissa mikroskop kanske inte kalibreras, och den faktiska rörelsen i z-riktning kan skilja sig något från det angivna z-intervallet (dvs. 0,5 μm). I sådana fall kan ett 3D-kalibreringsprov såsom fluorescerande mikrosfärer med en känd diameter användas för att erhålla det faktiska z-intervallet. Detta värde kommer således att användas som "Segmentavstånd (μm)" för 3D-projektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera den framgångsrika genereringen av cytoskelett-GUV med hjälp av det nuvarande protokollet rekonstituerades fascin-aktinbuntstrukturer i GUV. Fascin är en kort tvärbindare av aktinfilament som bildar styva parallelljusterade aktinbuntar och renas från E. coli som glutation-S-transferas (GST) fusionsprotein26. 5 μM aktin rekonstituerades först, inklusive 0,53 μM ATTO488-aktin i aktinpolymerisationsbufferten och 7,5% av densitetsgradientmediet. Vid tillsats av fascin i en koncentration av 2,5 μM och inkapsling av fascin-aktinblandningen bildades aktinbuntstrukturer i GUV. Z-stack konfokala bildsekvenser av de inkapslade aktinbuntstrukturerna i rhodamin PE-märkta GUVs fångades 1 h efter inkapsling (figur 2A). Med hjälp av detta protokoll demonstrerades tidigare inneboende konkurrens och sortering av de inkapslade aktin-tvärbindarna, α-aktinin och fascin, som tillsammans bildar olika aktinbuntmönster på ett GUV-storleksberoende sätt,26.

Liksom den modifierade inverterade emulsionsmetoden som presenteras här, genererar den traditionella cDICE-processen cytoskelett-GUV med högt utbyte men kräver en sprutpump och slanginställning för kontrollerad injektion av proteinlösning i den roterande kammaren vid låga flödeshastigheter i storleksordningen nanoliter per sekund22,28. I detta tillvägagångssätt genereras emulsionen direkt i den roterande cDICE-kammaren; en tunn kapillär sätts in i oljefasen. Proteinlösningen injiceras genom en sprutpump. Droppar bildas och klipps av vid kapillärspetsen innan de färdas mot den vattenhaltiga yttre fasen, där de förvandlas till GUV, liknande den metod som beskrivs ovan. Figur 2B visar vesiklar som kapslar in en reaktionsblandning med hjälp av denna metod. Reaktionsblandningen innehåller 6 μM aktin som buntas av 0,9 μM fascin. Här jämförs inte de två metoderna och deras resultat men noterar att de båda genererar ett högt utbyte av GUVs.

Figure 1
Bild 1: Experimentell inställning för att generera GUVs. (A) Toppvy och sidosektionsvy av cDICE-kammaren. (B) Foton av installationen för spinnkammaren. (C-E) Schematiska illustrationer av stegvisa procedurer för generering av GUV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Inkapsling av aktinbuntstrukturer. (A) Bilderna visar representativa fluorescenskonfokala skivor av GUVs (vänster) och maximala utsprång av en konfokal z-stack av aktin- och lipidkanaler (höger). Fascin, 2,5 μM; aktin, 5 μM (inklusive 10% ATTO 488 aktin). Skalstreck = 10 μm. (B) Inkapsling av aktinbuntstrukturer med användning av konventionell cDICE. Bilden visar en representativ maximal projicering av konfokala fluorescensbilder av inkapslade aktinbuntar bildade i närvaro av fascin. Fascin, 0,9 μM; Actin, 6 μM. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfil 1: 3D-tryckt axeldesign. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Design för den 3D-tryckta cDICE-kammaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Olika metoder för att generera GUV har undersökts för skapandet av syntetiska celler Men komplexiteten i procedurerna, förlängd tid för att uppnå inkapsling, begränsning av lipidtyper och molekylär sammansättning av inkapslingsmedlet, behovet av icke-fysiologiska kemikalier för att underlätta inkapsling, lågt GUV-utbyte och inkonsekvenser i inkapslingseffektivitet har fortsatt att utmana forskare inom detta område. Med tanke på det breda utbudet av potentiella studier som kan inledas inom syntetisk biologi underifrån, kan en sömlös GUV-inkapslingsmetod med hög genomströmning som är kompatibel med olika lipidkompositioner och kan inkapsla alla molekyler oavsett storlek stimulera nya möjligheter att studera komplexa biomimikerande syntetiska system. cDICE-metoden har eliminerat de flesta utmaningar och begränsningar som är inneboende i tidigare GUV-genereringsmetoder.

Tillvägagångssättet och styrprinciperna för att generera GUVs med cDICE-metoden föregår plattformen och har implementerats i tidigare tekniker som den inverterade emulsionsöverföringen12. Den inverterade emulsionsöverföringsmetoden har emellertid begränsningar såsom lågt vesikelutbyte och heterogenitet hos vesiklar. För cDICE-metoden som presenteras här dispergeras lipider i olja i form av aggregat på tiotals nanometer (storleken på lipidaggregatet är beroende av den totala koncentrationen av lipider)24. Dispersion av lipider finns i två blandbara oljor, där en (mineralolja) kan lösa upp lipider och en andra olja (kiselolja) som inte är blandbar med lipider. Detta skapar lipidaggregatkoacervater genom lösningsmedelsförskjutande29. Denna speciella dispersionsmetod underlättar omedelbar monolagermättnad av vattenhaltiga droppar och snabbare förnyelse av lipider vid det olje-vattenhaltiga gränssnittet när vattenhaltiga droppar kontinuerligt passerar det lipidmättade olje-vattenhaltiga gränssnittet. Detta förbättrar också dubbelskikts zipping för att bilda GUV och ökar GUV-genomströmningen. Centrifugalkrafterna som genereras av den roterande kammaren är optimala för att stänga polydisperserade droppar över det lipidmättade gränssnittet. Den ursprungliga versionen av cDICE-metoden använder ett mikrokapillärt munstycke för att injicera den inre lösningen i olje-lipidblandningen. I detta tillvägagångssätt genererar skjuvkrafter som skapas av den roterande olje-lipidblandningen vattenhaltiga droppar och omvandlas så småningom till GUV enligt beskrivningen. Men med avsikt att minska den tid det tar att förbereda injektionsplattformen, särskilt kritisk för snabba reaktioner, såsom aktinnätverksenhet och potentiell igensättning av mikrokapillären, genereras nu vattenhaltiga droppar med lipidmonolager genom att tillsätta olje-lipidblandningen direkt till den inre lösningen och pipettera upp och ner. Detta tillvägagångssätt eliminerar tidsfördröjningen i GUV-inkapsling för ett snabbt reaktionsexperiment.

Bland de utmaningar som orsakas av tidigare GUV-genereringsmetoder är begränsningen av lipidtyper (laddning av lipid och lipidfas) beroende på tekniken för GUV-generering. Flera lipidtyper, inklusive DOPC, dioleoyl-glycero-hosfoserin (DOPS), dioleoyl-glycero-succinat (DGS), dimyristoyl-glycero-fosfokolin (DMPC) och kombinationer av olika lipider och kolesterol i varierande koncentrationer testades. För alla förhållanden visas cDICE-metoden bilda GUV med hög inkapslingseffektivitet vid ett konsekvent högt GUV-utbyte. Dessutom har cDICE-metoden också visat sig effektivt inkapsla olika cellulära komponenter, inklusive cytoskelettproteiner, cellfria uttrycksreaktioner, trängselmedel, färgämnen och andra cellulära molekyler av olika storlekar utan förlust av inkapslingseffektivitet eller minskad genomströmning. Dessutom, liksom normala inverterade emulsionsöverföringsmetoder30, kan den modifierade cDICE potentiellt möjliggöra generering av asymmetriska GUVs för framtida arbete. Olika lipidkompositioner kan användas för den inre bipacksedeln och den yttre bipacksedeln eftersom monolagerdroppar bildas separat (inuti ett mikrorör genom pipettering upp och ner) innan dubbelskiktet zippas inuti cDICE-kammaren. Sedimentering av lipider observeras när lipid-oljeblandningen hålls länge; emellertid kan man helt enkelt virvla lipid-oljeblandningen före inkapsling för att återdispergera lipidaggregat. Det är viktigt att notera att inkapslingskvaliteten kan äventyras när lipid-oljeblandningarna hålls längre, vilket indikeras av mer signifikanta än vanliga lipidaggregat i lipid-oljeblandningen. Även om de inte testas kan dessa aggregat potentiellt leda till ofullkomlighet i dubbelskikts zipping, och aggregaten kan också sluta inkapslas med inre lösning som äventyrar den önskade kemiska miljön.

Begränsningen av det presenterade modifierade tillvägagångssättet för att bilda vattenhaltiga droppar är att generera enhetlighet i droppens storlek. Även om detta kan förbättras genom att använda mikrokapillär injektion av inre lösning vid olika flödeshastigheter för att reglera GUV-storlekar, är det mindre önskvärt att övervaka snabba reaktioner som aktinmontering i inkapslade GUV. Genom att göra droppar genom att pipettera upp och ner som resulterar i olika GUV-storlekar kan man analysera populationer av liknande storlek vesiklar. Oro för eventuell oljeretention i tvålager hindrar antagandet av de flesta GUV-genereringstekniker, inklusive emulsionsbaserade GUV-genereringstekniker som cDICE21. Mängden olja som finns kvar i membranet kan dock minskas med hjälp av organiska medel såsom 1-oktanol, som kan avlägsnas efter att vesiklarna31,32 har genererats. Framtida modifieringar av metoden, eventuellt genom att ändra lösningsmedelskompositionen, måste undersökas.

Det finns många områden inom syntetisk biologi nedifrån och upp som ännu inte har undersökts och kanske kräver cellliknande inneslutningar av GUV. Sådana experimentella ansträngningar kräver GUV-genereringsplattformar som cDICE för att generera GUV robust samtidigt som de effektivt kapslar in olika molekyler av intresse. Många cellulära processer sker snabbare än den tid det tar att kapsla in molekyler med hjälp av tidigare GUV-genereringstekniker. Som beskrivs här kapslas aktinlösningar in tillräckligt snabbt för att observera vesikeldeformation till följd av aktinnätverksenhet. Sådana syntetiska celler med rekonstituerat aktincytoskelett har avslöjat egenskaper hos aktinnätverksorganisation i närvaro av olika tvärbindare 5,25,33 och membranombyggnad 25,27,28. De kommer att inspirera till framtida arbete med att skapa mer sofistikerade syntetiska celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

APL erkänner stöd från ett Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers och från National Science Foundation (1939310 and 1817909) och National Institutes of Health (R01 EB030031).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Tags

Bioteknik utgåva 177 Emulsionsöverföring cDICE GUVs bottom-up rekonstituering aktin fascin
Snabb inkapsling av rekonstituerad cytoskelett inuti jätte unilamellarblåsor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N.,… More

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter