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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63350
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, University of Texas Medical Branch at Galveston, 2Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital of Central South University

Summary

L’interaction de la susceptibilité génétique, de l’immunité muqueuse et de l’environnement microécologique intestinal est impliquée dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Dans cette étude, nous avons appliqué la transplantation de microbiote fécal à des souris déficientes en IL-10 et étudié son impact sur l’inflammation colique et la fonction cardiaque.

Abstract

Avec le développement de la microécologie au cours des dernières années, la relation entre les bactéries intestinales et les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) a attiré une attention considérable. L’accumulation de preuves suggère que le microbiote dysbiotique joue un rôle actif dans le déclenchement ou l’aggravation du processus inflammatoire dans les MII et que la transplantation de microbiote fécal (FMT) est une stratégie thérapeutique attrayante puisque le transfert d’un microbiote sain à un patient atteint de MII pourrait rétablir la communication hôte-microbiote appropriée. Cependant, les mécanismes moléculaires ne sont pas clairs et l’efficacité de la FMT n’a pas été très bien établie. Par conséquent, d’autres études sur des modèles animaux de MII sont nécessaires. Dans cette méthode, nous avons appliqué la FMT de souris C57BL / 6J de type sauvage à des souris déficientes en IL-10, un modèle murin largement utilisé de colite. L’étude porte sur la collecte de granulés fécaux sur les souris donneuses, la fabrication de la solution / suspension fécale, l’administration de la solution fécale et la surveillance de la maladie. Nous avons constaté que la FMT atténuait significativement l’insuffisance cardiaque chez les souris knock-out IL-10, soulignant son potentiel thérapeutique pour la prise en charge des MII.

Introduction

Le micro-écosystème intestinal humain est extrêmement complexe, avec plus de 1000 espèces de bactéries dans l’intestin d’une personne en bonne santé1. La flore intestinale est impliquée dans le maintien des fonctions physiologiques normales de l’intestin et de la réponse immunitaire et a une relation inséparable avec le corps humain. L’accumulation de preuves suggère que le microbiome intestinal constitue le dernier organe humain, qui fait partie du corps humain, pas seulement un groupe de parasites2. Une relation symbiotique « saine » entre le microbiote intestinal, ses métabolites et le système immunitaire de l’hôte établi au début de la vie est essentielle au maintien de l’homéostasie intestinale. Dans certaines conditions anormales telles que l’inflammation chronique, les changements dans l’environnement interne et externe du corps perturbent gravement l’homéostasie intestinale, entraînant un déséquilibre persistant de la communauté microbienne de l’intestin, appelé dysbiose3. En fait, l’exposition à de multiples facteurs environnementaux, y compris l’alimentation, les médicaments et les agents pathogènes, peut entraîner des changements dans le microbiote.

La dysbiose est associée à la pathogenèse de diverses maladies intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), le syndrome du côlon irritable (SCI) et l’entérite pseudomembraneuse, ainsi qu’à une liste croissante de troubles extra-intestinaux, notamment les maladies cardiovasculaires, l’obésité et les allergies4. Le profilage du microbiote a révélé que les patients atteints de MII présentent une diminution spectaculaire de la diversité bactérienne, ainsi que des altérations marquées dans les populations de certaines souches bactériennes spécifiques 5,6. Ces études ont démontré moins de Lachnospiraceae et de Bacteroidetes, mais plus de Protéobactéries et d’Actinobactéries chez les patients atteints de MII. On croit que la pathogenèse des MII est liée à divers facteurs pathogènes, y compris une flore intestinale anormale, une réponse immunitaire dérégulée, des défis environnementaux et des variantes génétiques7. De nombreuses preuves suggèrent que les bactéries intestinales jouent un rôle dans les phases d’initiation et d’application de la MII8,9, ce qui indique que la correction de la dysbiose intestinale peut représenter une nouvelle approche pour le traitement et/ou le traitement d’entretien des MII.

Le prototype de la transplantation de microbiote fécal (TMF) a commencé dans la Chine ancienne10. En 1958, le Dr Eiseman et ses collègues ont traité avec succès quatre cas d’entérite pseudomembraneuse sévère avec des matières fécales provenant de donneurs sains par lavement, ouvrant un nouveau chapitre dans la médecine occidentale moderne utilisant des excréments humains pour traiter des maladies humaines11. L’infection à Clostridium difficile (ICD) s’est avérée être la principale cause d’entérite pseudomembraneuse12 et la FMT est très efficace dans le traitement de l’ICD. Au cours des huit dernières années, la TMF est devenue une thérapie standard pour le traitement de l’ICD13 récurrente, ce qui a incité d’autres études sur le rôle de la TMF dans d’autres troubles, tels que les MII. Au cours des vingt dernières années, de nombreux rapports de cas et études de cohorte ont documenté l’utilisation de la FMT chez les patients atteints de MII14. Une méta-analyse, incluant 12 essais, a montré que 62 % des patients atteints de la maladie de Crohn (MC) ont obtenu une rémission clinique après la TMF et que 69 % des patients atteints de la MC ont présenté une réponse clinique15. Malgré ces résultats encourageants, le rôle de la FMT dans la prise en charge des MII demeure incertain, et les mécanismes par lesquels la FMT améliore l’inflammation intestinale sont mal compris. Une enquête plus approfondie est nécessaire avant que FMT puisse rejoindre l’arsenal actuel des options de traitement pour les MII dans les cliniques.

Dans ce protocole, nous avons appliqué la FMT sur des souris IL-10-/-, qui développent spontanément une colite après le sevrage et ont servi d’étalon-or pour refléter la nature multifactorielle de la MII16,17,18. Les souris IL-10−/− ont été largement utilisées pour disséquer l’étiologie des MII parce qu’elles présentent des caractéristiques moléculaires et histologiques similaires à celles des patients atteints de MII et, comme les patients, la maladie peut être améliorée par un traitement anti-TNFα16. Les souris IL10−/− vieillissantes (âgées de >9 mois) ont une taille cardiaque accrue et une fonction cardiaque altérée par rapport aux souris de type sauvage appariées selon l’âge19, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les maladies cardiaques induites par la colite. Cependant, d’autres modèles murins de colite, tels que le modèle de sulfate de sodium de dextrane et le modèle de colite induite par les cellules T, peuvent également être utilisés. Nous avons administré une suspension fécale par gavage oral, qui s’est avérée être une voie efficace et meilleure que le lavement chez l’homme20.

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Protocol

Toutes les procédures effectuées sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston (Protocole # 1512071A).

1. Collecte de granulés fécaux frais

  1. Préparez des serviettes en papier stériles, des pinces à extrémité émoussée et des tubes coniques de 50 mL.
    1. Placer des serviettes en papier et des pinces dans des sacs d’autoclave séparés et les autoclaver à 180 °C à feu sec pendant 30 min. Utilisez également des tubes coniques stériles. Pesez les tubes coniques et notez leur poids sur les tubes.
  2. Allumez l’armoire de biosécurité dans la salle animalière.
  3. Prenez une cage à souris propre autoclavée sans litière et placez-la dans l’armoire de biosécurité. Retirez le couvercle et la grille à nourriture et placez-les à l’intérieur de l’armoire.
  4. Placez des serviettes en papier stériles au fond de la cage et replacez le support métallique sur le dessus de la cage.
  5. Identifiez les donneurs fécaux compatibles selon l’âge et placez la cage de la souris dans l’enceinte de biosécurité. Ouvrez la cage et attrapez doucement une souris donneuse (C57BL/6J) par la queue et placez-la sur le support métallique au-dessus de la cage propre.
  6. Placez le couvercle de la cage sur le dessus du support et attendez que le ou les animaux défèquent.
    REMARQUE: Mettez quelques compagnons de portée de souris sur le rack simultanément.
  7. Prélever les granulés fécaux et les mettre dans un tube conique stérile de 50 mL. Mettez les granulés en commun par sexe. Ne mélangez pas les granulés fécaux prélevés sur les mâles et les femelles.
  8. Pesez à nouveau le tube et calculez le poids des granulés fécaux.

2. Préparation de la suspension fécale

  1. Préparer une solution stérile (10% de glycérol dans une solution saline normale).
  2. Ajouter 10 mL de glycérol à 10 % / solution saline normale dans le tube conique pour chaque gramme de granulés fécaux.
    REMARQUE : Augmentez le volume de solution à 20 mL si nécessaire. Cette étude a également utilisé 1 mL de solution pour chaque pastille (5-10 mg).
  3. Homogénéiser le mélange à basse vitesse avec un homogénéisateur de paillasse ou un mélangeur à l’intérieur d’une hotte pour remettre les matières fécales en suspension (3 X 30 s).
  4. Filtrer la suspension fécale à travers 2 couches de gaze de coton stérile (10,2 cm x 10,2 cm). Conservez temporairement le filtrat au réfrigérateur jusqu’à 6 heures ou conditionnez-le dans des flacons cryogéniques stériles et conservez-le dans un congélateur à -80 °C.
  5. Nettoyez soigneusement l’homogénéisateur ou le mélangeur en suivant une procédure standard.

3. Administration de suspension fécale par gavage oral

  1. Décongeler la suspension fécale congelée sur la glace si vous utilisez des échantillons congelés. Mélanger la suspension fécale décongelée par vortex.
  2. Transférer la suspension fécale fraîche ou décongelée dans des seringues de 1 mL.
    REMARQUE: Chaque souris recevra un total de 200 μL de suspension fécale, et chaque souris IL-10-/- du groupe témoin recevra 200 μL de glycérol à 10% / solution saline normale17.
  3. Pesez les souris et choisissez la bonne taille d’aiguille de gavage et le volume de dosage maximal.
    REMARQUE: Pour les souris dont le poids corporel se situe entre 20 et 25 grammes, utilisez une aiguille de gavage incurvée de 20 g 3,81 cm avec une balle de 2,25 mm. Veuillez consulter gavageneedle.com pour plus d’informations.
  4. Testez l’aiguille de gavage en mesurant la longueur entre le bout du nez de la souris et le processus xiphoïde (bas du sternum). Remplissez la seringue avec 10% de glycérol / solution saline ou de suspension fécale et retirez les bulles d’air à l’intérieur de la seringue et de l’aiguille.
    REMARQUE: Si l’aiguille est plus longue que la longueur, mettez une marque sur la tige ou le tube de l’aiguille au niveau du nez. Ne passez pas l’aiguille ou la tubulure à travers l’animal au-delà de ce point pour éviter la perforation gastrique.
  5. Placez une cage de souris dans l’armoire de biosécurité, retirez le couvercle de la cage en plastique et laissez le support métallique en place.
  6. Attrapez une souris par la queue et mettez-la sur le support en métal. Tenez la souris par la queue d’une main et utilisez le pouce et le majeur d’une autre main pour retenir l’animal en saisissant la peau par-dessus les épaules. De cette façon, les pattes antérieures sont tendues sur le côté, ce qui empêchera les pieds avant de pousser l’aiguille. Étendez doucement la tête de l’animal vers l’arrière et maintenez la tête en place d’une main.
    REMARQUE: Pratiquez la manipulation de la souris jusqu’à ce que l’expérimentateur ait une confiance totale avant de procéder à l’expérience.
  7. Placez l’aiguille de gavage sur le dessus de la langue à l’intérieur de la bouche. Avancez doucement le long du palais supérieur jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’œsophage. Passez l’aiguille en douceur en un seul mouvement. Ne forcez pas l’aiguille si une résistance est ressentie. Retirez l’aiguille et réessayez.
  8. Une fois que l’aiguille est correctement placée et vérifiée, administrez lentement le matériel en poussant la seringue attachée à l’aiguille. Ne tournez pas l’aiguille et ne poussez pas l’aiguille vers l’avant, ce qui pourrait rompre l’œsophage. Après le dosage, retirez doucement l’aiguille.
  9. Remettez la souris dans sa cage d’origine. Surveillez l’animal pendant 5 à 10 minutes en recherchant des signes de respiration laborieuse ou de détresse. Surveillez à nouveau les souris entre 12 et 24 heures après le FMT.

4. Surveillance des maladies et euthanasie

  1. Surveiller longitudinalement les souris pour détecter l’apparition de MII par sang fécal occulte et/ou coloscopie21. Évaluer la fonction cardiaque par échocardiographie transthoracique22,23.
  2. Euthanasier les animaux par décapitation sous un plan d’anesthésie profond avec de l’isoflurane (1%-4%).
  3. Prélever le sang dans des tubes de microcentrifugation avec anticoagulant et centrifuger à 1000-2000 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C). Conservez le surnageant, désigné plasma dans un congélateur à -80°C.
  4. Lors de l’euthanasie, préparer le côlon de souris en utilisant la technique Swiss-roll24 pour l’analyse histopathologique (coloration H&E)25.
  5. Mesurer le peptide natriurétique de type B (BNP) dans le plasma à l’aide d’un kit de dosage immunoenzymatique (EIA)23.

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Representative Results

Nous avons effectué une FMT de donneur sain 3 fois (une fois par mois pendant 3 mois) sur des souris C57BL/6J de type sauvage (WT) et IL-10 âgées de 2 mois. Des souris C57BL/6J appariées selon l’âge (la différence d’âge devrait être de <2 mois) ont servi de donneurs fécaux et des granulés fécaux frais ont été utilisés à chaque fois. Les tests EIA ont révélé que le BNP était nettement élevé dans le plasma des souris déficitaires en IL-10 et que la TMF d’un donneur sain atténuait significativement l’augmentation des taux de BNP (Figure 1A, n = 5, p < 0,05). L’échocardiographie a détecté une diminution significative de la fraction d’éjection du ventricule gauche (FEVG) chez les souris IL-10-/- , par rapport aux souris WT; la diminution a été significativement abrogée par la TMF (figure 1B, n = 5, p < 0,05). Ces résultats suggèrent que la FMT d’un donneur sain atténuait l’insuffisance cardiaque induite par la colite.

Figure 1
Graphique 1. La régulation à la hausse de la BNP et la régulation négative de la FEVG ont été atténuées par la transplantation de microbiote fécal (FMT) chez des souris knock-out IL-10. (A) Concentration plasmatique de BNP (pg/mL) chez les souris de type sauvage (WT) et d’IL-10 knockout (KO) traitées avec un véhicule (Veh) ou FMT. (B) FEVG de souris WT et IL-10 KO traitées avec/sans FMT. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± ET (n = 5). * p < 0,05 vs souris WT traitées avec un véhicule (Veh). # p < 0,05 vs souris IL-10 KO traitées avec Veh. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En tant que traitement expérimental innovant, la FMT est devenue un sujet brûlant dans le traitement de divers troubles ces dernières années, car la dysbiose du microbiote commensale est impliquée dans la pathogenèse de multiples maladies humaines, notamment les MII, l’obésité, le diabète sucré, l’autisme, les maladies cardiaques et le cancer26. Bien que le mécanisme n’ait pas été déterminé, on pense que la FMT agit en construisant une nouvelle flore biologique et en empêchant la perte de bactéries résiduelles. La méthode présentée ici a adopté le gavage oral comme voie d’administration, qui s’est avéré efficace27. Nous avons choisi la voie orale parce que l’administration orale est la plus pratique et la plus économique et est préférée par la plupart des patients. En outre, la TMF par capsules orales s’est révélée être une approche efficace pour traiter les ICD récurrentes dans les essais cliniques28. Les autres voies d’administration gastro-intestinales supérieures courantes sont la sonde nasogastrique, la sonde nasojéjunale, la sonde de jéjunostomie et l’œsophagogastroduodénoscopie. Les voies d’administration gastro-intestinales inférieures courantes comprennent la coloscopie, la tubulure entérale transendoscopique du côlon (TET) et le lavement rectal. Cependant, le tracé optimal de la FMT reste incertain20. Actuellement, l’administration d’un GI supérieur est considérée comme la plus appropriée29, mais il n’existe pas de voie idéale qui convienne à tous les patients.

Les outils et les contenants utilisés dans la collecte des granulés fécaux doivent être stériles pour éviter toute contamination croisée. Les granulés fécaux prélevés chez les mâles et les femelles ne doivent pas être mélangés en raison des différences d’immunité entre les sexes. Dans les modèles animaux et chez l’homme, il existe des différences de microbiote entre les sexes30. Ces différences entre les sexes entraînent souvent des altérations dépendantes du sexe de l’inflammation gastro-intestinale locale, de l’immunité de l’hôte et de la susceptibilité à une série de troubles inflammatoires31. Les granulés fécaux peuvent être homogénéisés dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou 10-50% glycérol / solution saline normale, et 10% de glycérol a été largement adopté29. Dans cette étude, 10%, 20% et 50% de glycérol / solution saline ont été utilisés, et ils ont tous offert une bonne conservation bactérienne dans des conditions de congélation. L’homogénéisation doit être effectuée à basse vitesse et à l’intérieur d’une hotte afin de minimiser l’exposition aux aérosols respirables produits au cours de ce processus. La suspension fécale doit être filtrée à travers deux couches de gaze stérile ou un filtre en nylon de 20 μm pour éliminer les grosses particules qui pourraient bloquer les aiguilles de gavage. La suspension fécale filtrée pour une utilisation immédiate doit être placée au réfrigérateur, et le reste peut être aliquote et conservé dans un congélateur à -80 °C. La congélation est particulièrement nécessaire si les matières fécales proviennent de donneurs humains. Une méta-analyse a révélé que la TMF congelée est aussi efficace que la TMF fraîche chez les patients atteints d’ICDrécurrente 32,33,34. Cependant, Cui et coll. ont également observé qu’à 6 mois après la TMF, le taux de réponse était 26,7 % plus élevé chez les patients atteints de la maladie coeliaque dans le groupe des bactéries fécales fraîches que dans le groupe35 des bactéries fécales congelées, ce qui suggère que la TMF fraîche est un meilleur choix que la TMF congelée dans certains cas.

La dose et la fréquence optimales de perfusion de FMT restent inconnues à ce stade. Des études ont montré que la durée de la réponse clinique à un seul traitement par TMF est transitoire et insuffisante pour induire des changements fondamentaux dans la flore intestinale receveuse, et qu’un traitement séquentiel par TMF est nécessaire pour maintenir la rémission de la MC36,37. Nous avons pratiqué la FMT une fois par mois pendant 3 mois consécutifs, et nos données ont montré une bonne efficacité thérapeutique. Dans le cadre d’une étude en cours, nous effectuons une TMF mensuelle chez un groupe de souris déficientes en IL-10 pendant 12 mois et évaluerons le microbiote intestinal, l’inflammation intestinale et la fonction cardiaque à la fin de l’étude. Nous nous attendons à ce que la TMF séquentielle montre une meilleure efficacité thérapeutique que la TMF unique.

Bien que la TMF offre un énorme potentiel pour réparer le microbiote intestinal perturbé et que des données sur l’innocuité émergent38,39, il y a encore un manque de preuves médicales sur l’innocuité, le mode d’administration, la dose bactérienne, la fréquence d’administration et le pronostic à long terme de la FMT pour le traitement des maladies humaines. Le 12 mars 2020, la FDA a émis une alerte de sécurité indiquant que la FMT est associée à un risque potentiel d’infections graves ou potentiellement mortelles40. Les infections ont été causées par E. coli entéropathogène et E. coli producteur de toxines Shiga, et le produit FMT a été fourni par une banque de selles basée aux États-Unis. Ainsi, d’autres études mécanistes et des observations à long terme chez les animaux sont encore nécessaires pour vraiment comprendre l’utilisation de la FMT comme modalité de traitement chez les patients. La TMF chez les rongeurs restera un outil puissant dans la recherche sur le microbiome, ce qui pourrait éventuellement faire de la procédure de TMF un traitement facilement accessible avec une toxicité inférieure à celle des autres drogues synthétiques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu, en partie, par des subventions des National Institutes of Health (R01 HL152683 et R21 AI126097 à Q. Li) et par l’American Heart Association Grant-in-Aid 17GRNT33460395 (à Q. Li) (heart.org).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Syringe, 1 mL Fisher Scientific 14-829-10F
Blunt end forceps Knipex 926443
Brain natriuretic peptide EIA kit Sigma RAB0386
C57BL/6J mice Jackson Lab 000664
Centrifuge Eppendorf 5415R
Conical tubes ThermoFisher 339650
Curved feeding Needles Kent Scientific FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer Omni International GLH-115
Glycerol MilliporeSigma G5516
IL-10 knockout mice Jackson Lab 004366
Isoflurane Piramal Critical care NDC66794-017-10
USP normal saline Grainger 6280
Vaporizer Euthanex Corp. EZ-108SA

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Immunologie et infection numéro 182 maladie inflammatoire de l’intestin transplantation de microbiote fécal colite ulcéreuse maladie de Crohn dysbiose interleukine 10
Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10
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Xiao, Y., Zhong, X. S., Liu, X., Li, … More

Xiao, Y., Zhong, X. S., Liu, X., Li, Q. Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model. J. Vis. Exp. (182), e63350, doi:10.3791/63350 (2022).

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