Summary
Энтомопатогенные грибковые колонии выделяют из образцов тропической почвы с помощью приманки Tenebrio , приманки Galleria , а также селективной искусственной среды, т. е. агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC).
Abstract
Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения энтомопатогенных грибов (EPF) из образцов почвы. Почва является богатой средой обитания для микроорганизмов, в том числе EPF, особенно принадлежащих к родам Metarhizium и Beauveria, которые могут регулировать вредителей членистоногих. Биопрепараты на основе грибов доступны на рынке в основном для борьбы с вредителями сельскохозяйственных членистоногих. Тем не менее, несмотря на высокое эндемичное биоразнообразие, лишь немногие штаммы используются в коммерческих биопродуктах во всем мире. В настоящем исследовании 524 образца почвы были выращены на агаре декстрозы картофеля, обогащенном дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC). Рост колоний грибов наблюдался в течение 3 недель. Все Metarhizium и Beauveria EPF были морфологически идентифицированы на уровне рода. Кроме того, некоторые изоляты были молекулярно идентифицированы на уровне видов. Двадцать четыре из этих 524 образцов почвы были также исследованы на предмет появления EPF с использованием метода приманки для насекомых (Galleria mellonella и Tenebrio molitor). В общей сложности 51 штамм EPF был выделен (41 Metarhizium spp. и 10 Beauveria spp.) из 524 образцов почвы. Все грибковые штаммы были выделены либо из пахотных земель, либо из лугов. Из 24 образцов, отобранных для сравнения, 91,7% были положительными на EPF с использованием приманки Galleria , 62,5% с использованием приманки Tenebrio и 41,7% с использованием CTC. Наши результаты показали, что использование приманок для насекомых для изоляции EPF от почвы более эффективно, чем использование среды CTC. Сравнение методов изоляции в дополнение к идентификации и сохранению EPF оказывает положительное влияние на знания о биоразнообразии. Улучшение коллекции EPF поддерживает научное развитие и технологические инновации.
Introduction
Почва является источником нескольких микроорганизмов, в том числе энтомопатогенных грибов (EPF). Эта конкретная группа грибов признана по их способности колонизировать и часто убивать членистоногих хозяев, особенно насекомых1. После выделения, характеризации, отбора вирулентных штаммов и регистрации EPF массово производятся для борьбы с членистоногими вредителями, что подтверждает их экономическую значимость2. Соответственно, выделение EPF считается первым шагом к разработке биопестицида. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) и Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) являются наиболее распространенными грибами, используемыми для борьбы с членистоногими и вредителями3. EPF были успешно выделены из почвы, членистоногих с видимым микозом, колонизированных растений и растительной ризосферы 4,5.
Выделение EPF также может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. В недавней литературе сообщалось, что использование EPF недооценивается, ссылаясь на несколько нетрадиционных применений EPF, таких как их способность улучшать рост растений4, удалять токсичные загрязняющие вещества из почвы и использоваться в медицине6. Настоящее исследование направлено на сравнение эффективности выделения EPF из почвы с использованием приманок насекомых с искусственной питательной средой 7,8,9. Использование Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) в качестве приманки для насекомых в контексте изоляции EPF было хорошо принято. Эти личинки используются во всем мире научным сообществом в качестве экспериментальной модели для изучения взаимодействий хозяин-патоген10,11. Личинка Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) считается еще одной моделью насекомого для исследований, связанных с вирулентностью и выделением EPF, поскольку это насекомое легко редко встречается в лаборатории при низкой стоимости 7,12.
Независимые от культуры методы, такие как использование различных методов ПЦР, могут быть применены для обнаружения и количественной оценки EPF на их субстратах, включая почву13,14. Тем не менее, чтобы правильно изолировать эти колонии грибов, их субстрат следует культивировать на селективной искусственной среде9, или грибы, присутствующие в образцах, могут быть приманены с использованием чувствительных насекомых15. С одной стороны, CTC представляет собой искусственную среду без додина, которая состоит из агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом. Эта среда была разработана Fernandes et al. 9 для максимального извлечения естественных Beauveria spp. и Metarhizium spp. из почвы. С другой стороны, личинки G. mellonella и T. molitor также могут быть успешно использованы в качестве приманок для получения изолятов EPF из почвы. Тем не менее, согласно Sharma et al.15, в меньшем количестве исследований сообщалось о сопутствующем использовании и сравнении этих двух насекомых-приманок. На почвах португальских виноградников наблюдалось значительное восстановление Metarhizium robertsii (Metscn.) Сорокин с использованием Т. личинки молитора по сравнению с личинками G. mellonella; напротив, Beauveria bassiana (Балс. -Крив.) Изоляция Vuill была связана с использованием приманок G. mellonella 15. Поэтому решение о том, какой метод изоляции EPF использовать (например, G. mellonella-bait, T. molitor-bait или CTC medium), следует рассматривать в соответствии с целью исследования и лабораторной инфраструктурой. Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения EPF из образцов почвы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Поскольку в настоящем исследовании был получен доступ к бразильскому генетическому наследию, исследование было зарегистрировано в Национальной системе управления генетическим наследием и связанными с ним традиционными знаниями (Sisgen) под кодом AA47CB6.
1. Отбор проб почвы
- Соберите 800 г почвы (с вторичными корнями растений или без них) на глубину до 10 см с помощью небольшой лопаты. Храните их в полипропиленовых мешках при комнатной температуре до начала эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие корни также могут быть собраны, поскольку СООБЩАЕТСЯ, что EPF обладают компетенцией в ризосфере. Чем быстрее обработка образцов, тем лучше, потому что споры грибов могут быть менее жизнеспособными с течением времени. В настоящем исследовании образцы анализировались не более чем через 7 дней после сбора. - Используйте GPS для определения местоположения собранных образцов по широте и долготе и классифицируйте собранную площадь в соответствии с типом почвы (например, луга, местные тропические леса, берега озер или пахотные земли).
2. Методы выделения энтомопатогенных грибов
- Изоляция с использованием селективной искусственной среды СТС.
- Для приготовления среды CTC [агар декстрозы картофеля плюс дрожжевой экстракт (PDAY), дополненный 0,5 г/л хлорамфеникола, 0,001 г/л тиабендазола и 0,25 г/л циклогексимида9], взвешивают все реагенты по отдельности, смешивают их в дистиллированной воде и стерилизуют среду в автоклаве. В шкафу биобезопасности пластина 23 мл среды в пластины Петри размером 60 мм х 15 мм.
ВНИМАНИЕ: При взвешивании реагентов CTC используйте лабораторный халат, маску, перчатки и очки, потому что циклогексимид и хлорамфеникол токсичны. - Взвесьте 0,35 ± 0,05 г каждого образца почвы (с корнями или без них) и поместите его в микропробирку объемом 1,5 мл.
- В шкаф биобезопасности добавляют 1 мл стерильной 0,01% (об./об.) водной суспензии моноолеата полиоксиэтиленсорбитана в микротрубку, содержащую почву и вихрь, в течение 30 с.
- Удалите 50 мкл супернатанта и нанесите его на центр пластин Петри со средой CTC. Равномерно рассеять суспензии по поверхности среды с помощью стерильного дригальского шпателя (диаметром 6 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца почвы должно быть подготовлено не менее трех реплик. - Инкубируют пластины в климатических камерах (25 ± 1 °C, относительная влажность ≥80%) в темноте и наблюдают рост колоний грибов после 7, 14 и 21 дня инкубации.
- Наблюдайте за макроморфологией и микроморфологией грибковых колоний, ищущих EPF. Переведите культуры EPF на среду агара декстрозы картофеля плюс 0,05% хлорамфеникола (PDAC) до получения чистых культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ключи описания, представленные ниже на этапе 3, для идентификации колоний EPF.
- Для приготовления среды CTC [агар декстрозы картофеля плюс дрожжевой экстракт (PDAY), дополненный 0,5 г/л хлорамфеникола, 0,001 г/л тиабендазола и 0,25 г/л циклогексимида9], взвешивают все реагенты по отдельности, смешивают их в дистиллированной воде и стерилизуют среду в автоклаве. В шкафу биобезопасности пластина 23 мл среды в пластины Петри размером 60 мм х 15 мм.
- Изоляция с использованием приманок от насекомых
- Используйте поверхностно-дезинфицированные личинки G. mellonella и T. molitor поздней стадии. Погрузить личинки в 0,5% гипохлорит натрия на 1 мин для стерилизации. Промыть личинок дважды стерильной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки G. mellonella из четвертой стадии были использованы в настоящем исследовании. Личиночные стадии T. molitor не были стандартизированы. - Используйте пластиковые горшки для сборки приманок. Добавьте 250 г собранной почвы в каждый пластиковый горшок (ширина 98 мм x высота 47 мм x длина 142 мм). Отделите по 15 личинок каждого вида (T. molitor и G. mellonella) и отложите по пять личинок на пластиковый горшок. Хранить кастрюли при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80% в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Просверлите 10 небольших отверстий (диаметром 2 мм) в крышках горшка, чтобы обеспечить вентиляцию. Для сверления отверстий можно использовать острое нагреваемое железное устройство. - Гомогенизируйте почву через день, чтобы обеспечить максимальный контакт личинок с почвой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Влага важна для поддержки грибковой инфекции личинок. Для поддержания влажности почвы распыляйте стерильную дистиллированную воду на поверхность почвы, когда это необходимо. Не замачивайте образец почвы в воде. - Ежедневно анализируйте горшки в поисках мертвых насекомых.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно наблюдайте за оставшимися личинками в колонии на предмет патологических признаков беспозвоночных, чтобы убедиться, что насекомые не инфицированы. В качестве альтернативы контрольные горшки со стерильной почвой могут быть включены в исследование для проверки состояния здоровья личинок насекомых. - Удалить мертвых насекомых и поверхностно стерилизовать их 0,5% гипохлоритом натрия в течение 1 мин. Поместите стерильных насекомых во влажную камеру (относительная влажность ≥ 80%) при 25 ± 1 °C в течение 7 дней, чтобы способствовать экстериоризации энтомопатогенных грибов (микоз).
- При микозе собирают конидии с поверхности насекомого. Используйте микробиологическую петлю для размещения конидий на среде PDAC под стереоскопическим микроскопом. В качестве альтернативы поместите целых инфицированных личинок в среду PDAC. Инкубируют культуральные пластины в климатической камере при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80%.
- Понаблюдайте за макроморфологией и микроморфологией грибковых колоний на пластинах, чтобы подтвердить идентичность EPF. Повторное культивирование на PDAC до получения чистых грибковых колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ключи описания, представленные ниже на этапе 3, для идентификации колоний EPF.
- Используйте поверхностно-дезинфицированные личинки G. mellonella и T. molitor поздней стадии. Погрузить личинки в 0,5% гипохлорит натрия на 1 мин для стерилизации. Промыть личинок дважды стерильной водой.
3. Идентификация EPF (Metarhizium spp. и Beauveria spp.)
- Проанализировать макроморфологические характеристики грибковых культур на пластинах (т.е. поверхность и реверс колоний, их форму, край, скорость роста, цвет, текстуру, диффузионный пигмент, экссудаты и воздушные конидии) через 14 дней при 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80%.
- Перенос воздушных конидий в скользящие культуры (метод микрокультуры)16 в течение 3 суток при 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80% и окрашивание лактофеноловым синим цветом для наблюдения микроскопических особенностей (т.е. расположения конидий, конидиофоров, формы и размера конидий)17,18,19,20.
- Наблюдайте за микроскопическими грибковыми структурами в 400 раз с помощью оптического микроскопа для подтверждения идентификации EPF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологические ключи для EPF описаны в отчетах Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. и Humber 17,18,19,20. Макро- и микроморфология колоний грибов являются наиболее частыми критериями, используемыми для идентификации нитевидных грибов на уровне рода. В зависимости от рода EPF эти морфологические характеристики будут меняться. Humber20 представляет собой идентификационный ключ к основным родам грибковых энтомопатогенов. Например, колонии Metarhizium spp. обычно круглые, порошкообразные, с различными оттенками зеленого и могут представлять экссудат. Микроскопически эти колонии имеют конидиогенные клетки, апикальные на широко разветвленных, плотно переплетенных конидиофорах, образующих компактный гимений, и цилиндрические к эллипсоидным конидиям в параллельных цепочках, образующих колонны или пластинчатые массы. Колонии Beauveria spp. обычно белые, порошкообразные или хлопкообразные. Они демонстрируют конидиогенные клетки с расширенной базальной частью, простирающейся апикально в зигзагообразном направлении. Конидиофоры Beauveria образуют плотные скопления глобусообразных конидий. Молекулярный анализ необходим для идентификации EPF на видовом уровне. - Выполнение молекулярного анализа изолятов для таксономической идентификации на видовом уровне. Для штаммов EPF, выделенных в этом исследовании, а именно Metarhizium spp. и Beauveria spp., выполняют молекулярный анализ на основе отчетов Bischoff et al.17 и Rehner et al.18.
- После подтверждения того, что изоляты являются EPF, поместите изоляты в коллекцию грибковых культур. В настоящем исследовании изоляты были помещены в коллекцию энтомопатогенных грибковых культур из Лаборатории микробного контроля (LCM) Федерального сельского университета Рио-де-Жанейро.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности 524 образца почвы были взяты с лугов: пастбищ скота (165 образцов), местных тропических лесов (90 образцов), берега озера (42 образца) и культивируемых / пахотных земель (227 образцов) в период с 2015 по 2018 год в штате Рио-де-Жанейро, Бразилия. Подробная информация о географических координатах проб, положительных на EPF, приведена в дополнительной таблице 1.
Из 524 образцов почвы 500 образцов были проанализированы только с использованием среды CTC, а 24 образца были одновременно проанализированы с использованием трех форм изоляции (Galleria-bait, Tenebrio-bait и селективная культуральная среда CTC), поэтому можно было оценить относительную эффективность этих методов. В общей сложности 51 штамм EPF был выделен из 524 образцов (41 Metarhizium spp. и 10 Beauveria spp.) (Рисунок 1). Микроморфологические характеристики некоторых изолятов показаны на рисунке 2. Все грибковые штаммы были выделены из лугопастбищных или пахотных земель (Дополнительная таблица 1). Результаты показали, что Metarhizium spp. более распространен, чем Beauveria spp. (Дополнительная таблица 1). Девять изолятов Metarhizium (от LCM S01 до LCM S09) были молекулярно идентифицированы с использованием гена21 ef1-a (фактор удлинения эукариотической трансляции 1-альфа). Из них семь изолятов (LCM S01-LCM S06 и LCM S08) были идентифицированы как Metarhizium anisopliae sensu stricto, в то время как два изолята (LCM S07 и LCM S09) были идентифицированы как Metarhizium pingshaense21.
Встречаемость EPF (% положительных образцов EPF) в 24 образцах почвы, изученных с использованием трех различных методов изоляции, показана в таблице 1. Коэффициенты извлечения EPF были проанализированы методом теста хи-квадрат. Как показано в таблице 1, приманка Galleria оказалась более эффективной при выделении EPF (91,7% (22/24) положительных образцов), за которой следуют приманка T. molitor (62,5% (15/24) положительных образцов EPF) и среда CTC (41,7% (14/24) положительных образцов EPF). Эти 24 образца почвы не показали восстановления Beauveria spp., а только Metarhizium.
Рисунок 1: Энтомопатогенные грибковые колонии штаммов, выделенных из образцов почвы. Колонии культивировались на искусственной среде СТС. (1) Пластина Петри, демонстрирующая грибковые колонии из образцов почвы через 14 дней после инкубации на селективной среде CTC до получения чистых культур; (2-42) Чистые колонии Metarhizium spp.; (43-52) Чистые колонии Beauveria spp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроморфологические характеристики энтомопатогенных грибов, выделенных из образцов почвы. Колонии инкубировали в течение 3 дней на агаре декстрозы картофеля при 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80%. Слайд микроскопа окрашивали раствором лактофенола синего цвета. Изображения показывают конидиофоры и конидии (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) изолируют LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. изолят LCM S03; (C) Metarhizium sp. изолят LCM S27; (Д-Ф) Beauveria spp. изолирует LCM S23, LCM S24 и LCM S20 соответственно. Все представленные здесь штаммы были выделены с использованием среды КТК. LCM S27 также был извлечен из почвы с использованием приманок для насекомых. * Конидиофоры и конидии. ** Конидиальные цепи показывают характерное параллельное размещение спор Metarhizium в соседних цепочках. Черные стрелки указывают на Metarhizium цилиндрическую на эллипсоидную конидию. Красными стрелками обозначена боверия в форме глобуса конидии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Способ изоляции | Энтомопатогенные грибы* | χ2** | |
| Положительная | Отрицательная | ||
| Галерея-приманка | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Тенебрио-приманка | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| Селективная среда СТС | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Были выделены только Metarhizium spp. | |||
| ** Хи-квадратный анализ, DF2. P = 0,0013 | |||
Таблица 1: Встречаемость энтомопатогенных грибов (% положительных образцов) в 24 образцах почвы с использованием различных методов изоляции.
Дополнительная таблица 1: Географические координаты, метод изоляции, код, год сбора и типы образцов землепользования, положительные на энтомопатогенные грибы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Естественные и сельскохозяйственные почвенные среды обитания являются типичными средами для EPF22 и отличным природным резервуаром. В настоящем исследовании рассматривались два метода изоляции EPF с использованием приманок от насекомых по сравнению с селективной средой. Первым шагом для изоляции является сбор образцов почвы. Правильное хранение и идентификация образцов почвы имеют решающее значение. Информация о широте, долготе, типе почвы и биоме имеет важное значение для исследований, связанных с эпидемиологическими, моделирующими и геопространственными субъектами23,24. После сбора рекомендуется, чтобы образцы были обработаны как можно скорее (предпочтительно в течение 7 дней), поскольку жизнеспособность конидий в этих образцах почвы может в конечном итоге снизиться. Критические этапы выделения EPF с использованием CTC включают: а) исследование пластин CTC через 1 и 2 недели после инкубации (первые недели имеют решающее значение, поскольку на более поздних стадиях другие колонии грибов могут сузить развитие EPF) и b) точное выявление колоний EPF на основе их макроморфологии и микроморфологии. Для изоляции с использованием приманок для насекомых важно держать образец почвы влажным, но не замачивать его в воде.
Результаты, полученные в нескольких исследованиях, привели к интерпретации, что M. anisopliae чаще встречается в культивируемых почвах, чем в естественных экосистемах 8,25,26. Различия в распространении и возникновении этих грибов могут возникать. В настоящем исследовании все штаммы были выделены либо из культивируемой почвы (сельскохозяйственных культур), либо из лугов, и было преобладание Metarhizium spp. над Beauveria spp. Предполагается, что методы возделывания и высокое содержание органических веществ благоприятствуют присутствию сапрофитных грибов в почве27. Соответственно, эффективные методы изоляции, ищущие EPF, должны учитывать уменьшение грибковых загрязнителей.
Селективные искусственные среды обычно используются для изоляции, потому что они просты в использовании и доказали свою эффективность в выделении энтомопатогенных грибов, в основном Metarhizium spp. и Beauveria spp.28. Эти селективные среды используют специфические химические вещества для уменьшения роста загрязняющих веществ. В 1980-х и 1990-х годах фунгицид додин стал широко используемой селективной средой для выделения Metarhizium spp. и Beauveria spp.29,30. Хотя эти искусственные среды эффективны, некоторые виды EPF, такие как Metarhizium acridum, могут быть восприимчивы к додину31. Именно поэтому в настоящем исследовании была выбрана среда КТК без додинов. Согласно Fernandes et al.9, CTC был разработан для максимального выделения встречающихся в природе энтомопатогенных грибов, включая M. acridum. Использование селективной среды, а не приманок от насекомых в изоляции EPF удобно, потому что первое требует меньше места при обработке образца. Основным недостатком использования КТК является тот факт, что некоторые его компоненты (т.е. циклогексимид и хлорамфеникол) токсичны, поэтому использование средств индивидуальной защиты является обязательным.
Как отмечалось в настоящем исследовании, более высокий процент положительных образцов был зарегистрирован с приманками от насекомых по сравнению с искусственными селективными средами для выделения EPF 15,32,33,34,35. Использование приманок от насекомых считается недорогой и высокоэффективной альтернативой в поиске новых EPF. Несмотря на это, есть и недостатки, связанные с использованием приманок от насекомых над селективными средами. Поскольку количество почвы для анализа с использованием насекомых выше, также необходимо иметь больше физического пространства для хранения образцов и инкубации горшков. Приобретение насекомых также может быть ограничением. В Бразилии, например, G. mellonella коммерчески недоступен, поэтому необходимо создать колонию в лаборатории, чтобы использовать этого насекомого в качестве приманки. Важно сохранять целебность колоний насекомых, избегая естественного заражения EPF. Инфекция EPF в колонии может сделать результаты изоляции ненадежными. Поэтому приходится наблюдать за оставшимися в колонии личинками в поисках беспозвоночных патологических признаков. В качестве альтернативы контрольные горшки со стерильной почвой могут быть включены в исследование для проверки состояния здоровья личинок насекомых.
Поиск новых грибковых изолятов с выдающимися чертами биоконтроля имеет решающее значение для повышения эффективности грибов в борьбе с членистоногими и вредителями. Грибы, выделенные из почвы, могут быть хорошо приспособлены к выращиванию в этой среде22, и они, вероятно, будут иметь высокую стойкость поля, что является важной характеристикой успешного EPF в борьбе с вредителями21. Соответственно, локально изолированные EPF могут улучшить биологический контроль над местными вредителями из-за их географической и временной конгруэнтности, увеличивая шансы на успех и уменьшая воздействие на окружающую среду, вызванное применением синтетических инсектицидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было частично профинансировано Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) из Бразилии, финансовый код 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (номер проекта E-26/010.001993/2015), и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) из Бразилии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
