Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63353
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1,3, 1,3
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Summary

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

Abstract

מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. האדמה היא בית גידול עשיר למיקרואורגניזמים, כולל EPF השייך במיוחד לסוגים Metarhizium ו - Beauveria, שיכולים לווסת מזיקים פרוקי רגליים. מוצרים ביולוגיים המבוססים על פטריות זמינים בשוק בעיקר להדברת פרוקי רגליים חקלאיים. עם זאת, למרות המגוון הביולוגי האנדמי הגבוה, רק זנים מעטים משמשים בתוצרים ביולוגיים מסחריים ברחבי העולם. במחקר הנוכחי, 524 דגימות קרקע הועתקו בתרבית על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלורמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC). הצמיחה של מושבות פטריות נצפתה במשך 3 שבועות. כל Metarhizium ו - Beauveria EPF זוהו באופן מורפולוגי ברמת הסוג. בנוסף, חלק מהמבודדים זוהו מולקולרית ברמת המין. 24 מתוך 524 דגימות הקרקע הללו נסקרו גם הן לצורך התרחשות EPF בשיטת פיתיון החרקים (Galleria mellonella ו-Tenebrio molitor). בסך הכל בודדו 51 זני EPF (41 זני Metarhizium spp. ו-10 Beauveria spp.) מתוך 524 דגימות הקרקע. כל הזנים הפטרייתיים בודדו משטחי יבול או מרעה. מתוך 24 הדגימות שנבחרו להשוואה, 91.7% היו חיוביות ל-EPF באמצעות פיתיון גלריה , 62.5% השתמשו בפיתיון Tenebrio ו-41.7% השתמשו ב-CTC. התוצאות שלנו הצביעו על כך ששימוש בפיתיונות חרקים כדי לבודד את ה-EPF מהאדמה יעיל יותר משימוש במדיום CTC. להשוואת שיטות הבידוד בנוסף לזיהוי ולשימור של EPF יש השפעה חיובית על הידע על המגוון הביולוגי. השיפור של אוסף EPF תומך בפיתוח מדעי ובחדשנות טכנולוגית.

Introduction

אדמה היא המקור למספר מיקרואורגניזמים, כולל פטריות אנטומופתוגניות (EPF). קבוצה מסוימת זו של פטריות מוכרת על ידי יכולתן להתיישב ולעתים קרובות להרוג פונדקאים של פרוקי רגליים, במיוחד חרקים1. לאחר בידוד, אפיון, בחירת זנים ארסיים ורישום, EPF מיוצרים בייצור המוני להדברת פרוקי רגליים, התומכת ברלוונטיות הכלכלית שלהם2. לפיכך, הבידוד של EPF נחשב הצעד הראשון לפיתוח של biopesticide. Beauveria spp. (היפוקריאלס: Cordycipitaceae) ו-Metarhizium spp. (היפוקריאלס: Clavicipitaceae) הן הפטריות הנפוצות ביותר המשמשות להדברת פרוקי רגליים3. EPF בודדו בהצלחה מהאדמה, פרוקי רגליים עם מיקוזיס נראית לעין, צמחים מיושבים וריזוספירה צמחית 4,5.

בידוד של EPF יכול להיות שימושי גם כדי לחקור את המגוון, ההפצה והאקולוגיה של קבוצה מסוימת זו. ספרות עדכנית דיווחה כי השימוש ב- EPF אינו מוערך כראוי, וציטט מספר יישומים לא קונבנציונליים של EPF כגון יכולתם לשפר את צמיחת הצמח4, להסיר מזהמים רעילים מהאדמה, ולהשתמש בהם ברפואה6. המחקר הנוכחי נועד להשוות את היעילות של בידוד EPF מהאדמה באמצעות פיתיונות חרקים לעומת תווך תרבית מלאכותית 7,8,9. השימוש ב-Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) כפיתיון חרקים בהקשר של בידוד EPF התקבל היטב. זחלים אלה משמשים ברחבי העולם את הקהילה המדעית כמודל ניסיוני לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגנים10,11. זחל Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) נחשב למודל חרקים נוסף למחקרים המערבים אלימות ובידוד של EPF מכיוון שחרק זה קל לנדיר במעבדה בעלות נמוכהשל 7,12.

ניתן ליישם שיטות שאינן תלויות בתרבית כגון שימוש במגוון טכניקות PCR כדי לזהות ולכמת EPF על המצעים שלהם, כולל קרקע13,14. עם זאת, כדי לבודד כראוי את המושבות הפטרייתיות הללו, יש לתרבת את המצע שלהן על מדיום מלאכותי סלקטיבי9, או שניתן יהיה לפתות את הפטריות הקיימות בדגימות באמצעות חרקים רגישים15. מצד אחד, CTC הוא מדיום מלאכותי נטול Dodine המורכב מתפוחי אדמה דקסטרוז אגר מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד. מדיום זה פותח על ידי פרננדס ואחרים. 9 כדי למקסם את ההתאוששות של Beauveria spp. ו- Metarhizium spp. ממקור טבעי מהאדמה. מצד שני, זחלי G. mellonella ו- T. molitor יכולים לשמש בהצלחה גם כפיתיונות כדי להשיג מבודדי EPF מהאדמה. עם זאת, על פי שארמה ואחרים,15, פחות מחקרים דיווחו על שימוש והשוואה מקבילים בין שני חרקי הפיתיון הללו. בקרקעות הכרמים הפורטוגזיות נמצאו שחזורים משמעותיים של Metarhizium robertsii (Metscn.) סורוקין משתמש ב-T. זחלי מוליטור בהשוואה לזחלי G. mellonella; לעומת זאת, בובריה בסיאנה (בלס. -Criv.) בידוד Vuill נקשר לשימוש בפיתיונות G. mellonella 15. לפיכך, יש לשקול את ההחלטה באיזו שיטת בידוד EPF להשתמש (כלומר, G. mellonella-fiit, T. molitor-fiit או CTC medium) בהתאם למטרת המחקר ולתשתית המעבדה. מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד EPF מדגימות קרקע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כאשר המחקר הנוכחי ניגש למורשת הגנטית הברזילאית, המחקר נרשם במערכת הלאומית לניהול מורשת גנטית וידע מסורתי משויך (Sisgen) תחת הקוד AA47CB6.

1. דגימת קרקע

  1. אספו 800 גרם אדמה (עם או בלי שורשי צמחים משניים) לעומק של 10 ס"מ באמצעות חפירה קטנה. אחסנו אותם בשקיות פוליפרופילן בטמפרטורת החדר עד לתחילת הניסוי.
    הערה: ניתן גם לאסוף שורשים קטנים מכיוון שדווח כי ל-EPF יש יכולת ריזוספרה. ככל שהעיבוד של הדגימות מהיר יותר, כך ייטב משום שהנבגים הפטרייתיים עשויים להיות פחות ברי קיימא לאורך זמן. במחקר הנוכחי נותחו דגימות לא יותר מ-7 ימים לאחר האיסוף.
  2. השתמש ב-GPS כדי לזהות את מיקומן של הדגימות שנאספו בקווי הרוחב והאורך ולסווג את השטח שנאסף לפי סוג הקרקע (לדוגמה, שטחי מרעה, יערות גשם מקומיים, חופי אגמים או שטחי יבול).

2. שיטות בידוד לפטריות אנטומופתוגניות

  1. בידוד באמצעות מדיום מלאכותי סלקטיבי CTC.
    1. כדי להכין את מדיום CTC [אגר דקסטרוז תפוחי אדמה בתוספת תמצית שמרים (PDAY) בתוספת 0.5 גרם/ליטר של כלוראמפניקול, 0.001 גרם/ל' של תיאבנדזול, ו-0.25 גרם/ליטר של ציקלוהקסימיד9], שקלו את כל הריאגנטים בנפרד, ערבבו אותם במים מזוקקים ועקרו את המדיום באוטוקלב. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת 23 מ"ל של המדיום לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ לוחות פטרי.
      אזהרה: בעת שקילת ריאגנטים של CTC, השתמש במעיל מעבדה, מסכה, כפפות ומשקפי מגן מכיוון שציקלוהקסימיד וכלוראמפניקול רעילים.
    2. שקלו 0.35 ± 0.05 גרם מכל דגימת קרקע (עם או בלי שורשים) והניחו אותה במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל.
    3. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו 1 מ"ל של תרחיף מימי סטרילי של פוליאוקסיאתילן סורביטן מונוליאט 0.01% (vol/vol) פוליאוקסיאתילן סורביטן מונואולאט למיקרו-צינור המכיל אדמה ומערבולת במשך 30 שניות.
    4. הסר 50 μL של supernatant ו pipette אותו על מרכז לוחות פטרי עם מדיום CTC. מפזרים באופן הומוגני את ההשעיות על פני השטח של המדיום באמצעות מרית דריגלשי סטרילית (בקוטר 6 מ"מ).
      הערה: יש להכין לפחות שלושה שכפולים עבור כל דגימת קרקע.
    5. דגירה של הצלחות בתאי האקלים (25 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות יחסית ≥80%) בחושך וצפו בצמיחת המושבות הפטרייתיות לאחר 7, 14 ו -21 ימים של דגירה.
    6. שימו לב למקרומורפיולוגיה ולמיקרומורפולוגיה של המושבות הפטרייתיות המחפשות EPF. העבר את תרביות ה- EPF למדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה בתוספת 0.05% כלוראמפניקול (PDAC) עד לקבלת תרביות טהורות.
      הערה: השתמש במפתחות התיאור המוצגים להלן בשלב 3 לזיהוי מושבות EPF.
  2. בידוד באמצעות פיתיונות חרקים
    1. השתמש בזחלים בעלי חיטוי פני השטח G. mellonella ו- T. molitor בשלב מאוחר. מטבלים את הזחלים לתוך 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת לעיקור. לשטוף את הזחלים פעמיים באמצעות מים סטריליים.
      הערה: זחלי G. mellonella מהשלב הרביעי שימשו במחקר הנוכחי. שלבי הזחל של T. molitor לא היו סטנדרטיים.
    2. השתמשו בסירי פלסטיק כדי להרכיב את הפיתיונות. הוסיפו 250 גרם של אדמה שנאספה לכל סיר פלסטיק (רוחב 98 מ"מ x גובה 47 מ"מ x 142 מ"מ אורך). הפרד 15 זחלים מכל מין (T. molitor ו- G. mellonella) והפקיד חמישה זחלים לכל סיר פלסטיק. אחסנו את הסירים בטמפרטורה של 25 ± מעלות צלזיוס והלחות היחסית ≥-80% בחושך.
      הערה: לקדוח 10 חורים קטנים (בקוטר 2 מ"מ) במכסי הסיר כדי לאפשר אוורור. ניתן להשתמש במכשיר ברזל מחומם חד כדי לקדוח את החורים.
    3. הומוגניזציה של הקרקע כל יומיים כדי לאפשר מגע מקסימלי של זחלים עם אדמה.
      הערה: לחות חשובה לתמיכה בזיהום הפטרייתי של הזחלים. כדי לשמור על הלחות בקרקע, יש לרסס מים מזוקקים סטריליים על פני הקרקע בעת הצורך. אין להשרות את דגימת הקרקע במים.
    4. לנתח את הסירים מדי יום בחיפוש אחר חרקים מתים.
      הערה: שימו לב לזחלים הנותרים במושבה מדי יום אחר סימנים פתולוגיים של חסרי חוליות כדי לוודא שהחרקים אינם נגועים. כחלופה, ניתן לכלול במחקר סירי הדברה עם אדמה סטרילית כדי לבדוק את מצבם הבריאותי של זחלי החרקים.
    5. מסירים חרקים מתים ומעקרים אותם באופן שטחי עם 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת. ממקמים את החרקים הסטריליים בתא לח (לחות יחסית ≥ 80%) בטמפרטורה של 25 ±-1 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים כדי להעדיף את ההחצנה של פטריות אנטומופתוגניות (מיקוזיס).
    6. עם המיקוזיס, לקצור את הקונידיה מפני השטח של החרקים. השתמש בלולאה מיקרוביולוגית כדי למקם את הקונידיה על מדיום PDAC תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. כחלופה, הניחו את כל הזחלים הנגועים על מדיום ה-PDAC. דגירה של לוחות התרבית בתא אקלים בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80%.
    7. שימו לב למקרומורפיולוגיה ולמיקרומורפולוגיה של המושבות הפטרייתיות על הלוחות כדי לאשר את זהותו של EPF. חזור על התרבות ב- PDAC עד לקבלת מושבות פטרייתיות טהורות.
      הערה: השתמש במפתחות התיאור המוצגים להלן בשלב 3 לזיהוי מושבות EPF.

3. זיהוי EPF (Metarhizium spp. ו - Beauveria spp.)

  1. נתחו את המאפיינים המקרומורפיולוגיים של התרבויות הפטרייתיות על הלוחות (כלומר, פני השטח וההיפוך של המושבות, צורתן, קצהן, קצב הגדילה שלהן, צבען, מרקמן, פיגמנט מתפזר, אקסודטים וקונידיה אווירית) לאחר 14 יום בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80%.
  2. העבר את הקונידיה האווירית לתרביות החלקה (טכניקת מיקרו-תרבות)16 למשך 3 ימים בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80% וכתם בכחול לקטופנול כדי לצפות בתכונות המיקרוסקופיות (כלומר, סידור של קונידיה, קונידיופורים, צורה וגודל של קונידיה)17,18,19,20.
  3. צפו במבנים הפטרייתיים המיקרוסקופיים פי 400 באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר את זיהוי ה-EPF.
    הערה: מפתחות מורפולוגיים עבור EPF מתוארים בדוחות על ידי Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., ו- Humber 17,18,19,20. המאקרו והמיקרומורפולוגיה של מושבות פטריות הם הקריטריונים השכיחים ביותר המשמשים לזיהוי פטריות נימה ברמת הסוג. בהתאם לסוג של EPF, מאפיינים מורפולוגיים אלה ישתנו. Humber20 מציג מפתח זיהוי לסוגים עיקריים של אנטומופתוגנים פטרייתיים. מושבות Metarhizium spp. לדוגמה, הן בדרך כלל עגולות, אבקתיות, מציגות גוונים משתנים של ירוק, ויכולות להציג הפרשה. באופן מיקרוסקופי, למושבות אלה יש תאים חרוטיים אפיים על קונידיופורים מסועפים בצפיפות, השזורים זה בזה בצפיפות ויוצרים קרום הבתולים הקומפקטי, וקונידיה גלילית עד אליפסואידית בשרשראות מקבילות היוצרות עמודים או מסות דמויות צלחת. מושבות Beauveria spp. הן בדרך כלל לבנות, אבקתיות או דמויות כותנה. הם מציגים תאים חרוטיים עם חלק בסיסי מורחב המשתרע באופן אפיפי בכיוון זיגזג. Beauveria conidiophores יוצרים אשכולות צפופים של קונידיה בצורת גלובוס. יש צורך בניתוחים מולקולריים לזיהוי EPF ברמת המין.
  4. בצע ניתוחים מולקולריים על המבודדים לזיהוי טקסונומי ברמת המין. עבור זני ה-EPF שבודדו במחקר זה, כלומר, Metarhizium spp. ו-Beauveria spp., מבצעים ניתוחים מולקולריים המבוססים על הדיווחים של Bischoff et al.17 ו-Rehner et al.18.
  5. לאחר אישור המבודדים להיות EPF, להפקיד את מבודדים באוסף של תרבויות פטרייתיות. במחקר הנוכחי, המבודדים הופקדו באוסף תרביות פטרייתיות אנטומופתוגניות מהמעבדה לבקרה מיקרוביאלית (LCM) באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסך הכל נאספו 524 דגימות קרקע משטחי מרעה: מרעה של בעלי חיים (165 דגימות), יער טרופי מקומי (90 דגימות), שפת האגם (42 דגימות) ושטחי יבול מעובדים/מעובדים (227 דגימות) בין 2015 ל-2018 במדינת ריו דה ז'ניירו, ברזיל. פרטים על קואורדינטות גיאוגרפיות של דגימות חיוביות ל-EPF מובאים בטבלה משלימה 1.

מתוך 524 דגימות הקרקע, 500 דגימות נותחו רק באמצעות מדיום CTC, ו-24 דגימות נותחו במקביל באמצעות שלוש צורות של בידוד (Galleria-fiit, Tenebrio-fiit, ומדיום תרבית CTC הסלקטיבי), כך שניתן היה להעריך את היעילות היחסית של שיטות אלה. בסך הכל בודדו 51 זני EPF מ-524 דגימות (41 Metarhizium spp. ו-10 Beauveria spp.) (איור 1). מאפיינים מיקרומורפולוגיים של מבודדים מסוימים מוצגים באיור 2. כל הזנים הפטרייתיים בודדו משטחי מרעה או משטחי יבול (טבלה משלימה 1). התוצאות גילו כי Metarhizium spp. נפוץ יותר מאשר Beauveria spp. (טבלה משלימה 1). תשעה ממבודדים המטהריזיום (LCM S01 עד LCM S09) זוהו מולקולרית באמצעות הגן ef1-a (גורם התארכות התרגום האאוקריוטי 1-אלפא)21. מתוכם, שבעה מבודדים (LCM S01-LCM S06 ו-LCM S08) זוהו כ-Metarhizium anisopliae sensu stricto ואילו שני מבודדים (LCM S07 ו-LCM S09) זוהו כמטאריזיום פינגשאנס21.

הופעת EPF (% מדגימות ה-EPF החיוביות) ב-24 דגימות הקרקע שנחקרו באמצעות שלוש שיטות הבידוד השונות מוצגת בטבלה 1. שיעורי ההתאוששות של EPF נותחו על ידי בדיקת צ'י בריבוע. כפי שניתן לראות בטבלה 1, פיתיון גלריה הוכיח את עצמו כיעיל יותר בבידוד של EPF (91.7% (22/24) מדגימות חיוביות) ואחריו פיתיון T. molitor (62.5% (15/24) של דגימות חיוביות של EPF) ומדיום CTC (41.7% (14/24) של דגימות חיוביות ל-EPF). 24 דגימות קרקע אלה לא הראו התאוששות של Beauveria spp., אלא רק Metarhizium.

Figure 1
איור 1: מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות של זנים שבודדו מדגימות קרקע. מושבות טופחו על גבי מדיום מלאכותי CTC. (1) צלחת פטרי המציגה מושבות פטרייתיות מדגימות קרקע 14 יום לאחר הדגירה על מדיום סלקטיבי CTC לפני קבלת תרביות טהורות; (2-42) מטאריזיום טהור spp. מושבות; (43-52) ביובריה טהורה spp. מושבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מאפיינים מיקרומורפולוגיים של פטריות אנטומופתוגניות שבודדו מדגימות קרקע. מושבות דוגרו במשך 3 ימים על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80%. שקופית המיקרוסקופ הייתה מוכתמת בתמיסה כחולה לקטופנול. תמונות מראות קונידיופורים וקונידיה של (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) מבודדים LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. לבודד LCM S03; (C) Metarhizium sp. לבודד LCM S27; (ד-ו) Beauveria spp. מבודד את LCM S23, LCM S24 ו-LCM S20, בהתאמה. כל הזנים המיוצגים כאן בודדו באמצעות מדיום CTC. LCM S27 גם התאושש מהאדמה באמצעות פיתיונות חרקים. * קונידיופורים וקונידיה. ** שרשראות קונידיאליות מראות את המיקום האופייני זה לצד זה של נבגי Metarhizium בשרשראות סמוכות. חצים שחורים מצביעים על Metarhizium גלילי עד אליפסואידי conidia. חיצים אדומים מצביעים על קונידיה בצורת גלובוס של בובריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שיטת הבידוד פטריות אנטומופתוגניות* χ2**
חיובי שלילי
גלריה-פיתיון 91.7% (22/24) 8.3% (2/24) 13.4
Tenebrio-bait 62.5% (15/24) 37.2% (9/24)
CTC מדיום סלקטיבי 41.7% (10/24) 58.3% (14/24)
* רק Metarhizium spp. בודדו
** ניתוח ריבוע צ'י, DF2. P = 0.0013

טבלה 1: התרחשות של פטריות אנטומופתוגניות (% מהדגימות החיוביות) ב-24 דגימות קרקע בשיטות בידוד שונות.

טבלה משלימה 1: קואורדינטות גיאוגרפיות, שיטת בידוד, קוד, שנת איסוף וסוגי דגימות לשימוש בקרקע חיוביים לפטריות אנטומופתוגניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בתי גידול טבעיים וחקלאיים בקרקע הם סביבות אופייניות ל-EPF22 ומאגר טבעי מצוין. במחקר הנוכחי טופלו שתי שיטות לבידוד EPF באמצעות פיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי. הצעד הראשון לבידוד הוא איסוף דגימות הקרקע. אחסון וזיהוי נכונים של דגימות קרקע הם חיוניים. מידע על קו הרוחב, קו האורך, סוג הקרקע והביום חיוני למחקרים הכוללים נושאים אפידמיולוגיים, מידול וגיאו-מרחביים23,24. לאחר האיסוף, מומלץ שהדגימות יעובדו בהקדם האפשרי (רצוי תוך 7 ימים) מכיוון שהכדאיות של קונידיה בדגימות קרקע אלה יכולה בסופו של דבר לרדת. שלבים קריטיים בבידוד ה-EPF באמצעות CTC כוללים: א) חקירה של לוחות CTC 1 ו-2 שבועות לאחר הדגירה (השבועות הראשונים הם קריטיים מכיוון שבשלבים מאוחרים יותר, מושבות פטרייתיות אחרות יכולות לצמצם את התפתחות ה-EPF), וב) זיהוי מדויק של מושבות EPF על סמך המקרומורפולוגיה והמיקרומורפולוגיה שלהן. לבידוד באמצעות פיתיונות חרקים, חיוני לשמור על דגימת הקרקע לחה אך לא להשרות אותה במים.

התוצאות שדווחו על ידי מספר מחקרים הובילו לפרשנות כי M. anisopliae נפוץ יותר בקרקעות מעובדות מאשר במערכות אקולוגיות טבעיות 8,25,26. הבדלים בהתפלגות ובהתרחשות של פטריות אלה יכולים להתרחש. במחקר הנוכחי, כל הזנים בודדו מאדמה מעובדת (יבולים) או משטחי מרעה, והייתה דומיננטיות של Metarhizium spp. על פני Beauveria spp. מוצע כי שיטות גידול והתכולה הגבוהה של החומר האורגני מעדיפים את נוכחותן של פטריות ספרופיטיות באדמה27. בהתאם לכך, טכניקות בידוד יעילות המחפשות EPF צריכות לשקול הפחתת מזהמים פטרייתיים.

מדיה מלאכותית סלקטיבית משמשת בדרך כלל לבידוד מכיוון שהם קלים לשימוש והוכחו כיעילים בבידוד פטריות אנטומופתוגניות, בעיקר Metarhizium spp. ו- Beauveria spp.28. המדיה הסלקטיבית הזו משתמשת בכימיקלים ספציפיים כדי להפחית את הצמיחה של מזהמים. בשנות ה-80 וה-90 של המאה ה-20, דאודן קוטל הפטריות הפך למדיום סלקטיבי נפוץ לבידוד Metarhizium spp. ו-Beauveria spp.29,30. למרות שהתקשורת המלאכותית הזו יעילה, כמה מיני EPF כגון Metarhizium acridum יכולים להיות רגישים לדודין31. זו הסיבה שמדיום CTC ללא יוד נבחר במחקר הנוכחי. על פי Fernandes et al.9, CTC פותח כדי למקסם את הבידוד של פטריות אנטומופתוגניות המתרחשות באופן טבעי, כולל M. acridum. שימוש במדיום סלקטיבי ולא בפיתיונות חרקים בבידוד של EPF הוא נוח מכיוון שהראשון דורש פחות מקום בעיבוד הדגימה. החיסרון העיקרי בשימוש ב- CTC מסתמך על העובדה שחלק ממרכיביו (כלומר, ציקלוהקסימיד וכלורמפניקול) הם רעילים, ולכן השימוש בציוד הגנה אישי הוא חובה.

כפי שנצפה במחקר הנוכחי, אחוז גבוה יותר של דגימות חיוביות דווח עם פיתיונות חרקים בהשוואה למדיה סלקטיבית מלאכותית לבידוד של EPF 15,32,33,34,35. השימוש בפיתיונות חרקים נחשב לחלופה בעלות נמוכה ויעילות גבוהה בחיפוש אחר EPF חדש. למרות זאת, ישנם חסרונות הקשורים לשימוש בפיתיונות חרקים על פני מדיה סלקטיבית. מכיוון שכמות האדמה לניתוח באמצעות חרקים גבוהה יותר, יש צורך גם במרחב פיזי רב יותר לאחסון הדגימות ולדגירה של העציצים. רכישת חרקים יכולה גם להיות מגבלה. בברזיל, למשל, G. mellonella אינו זמין מסחרית, ולכן יש צורך להקים מושבה במעבדה כדי להשתמש בחרק זה כפיתיון. זה חיוני כדי לשמור על ההצלה של מושבות החרקים, הימנעות זיהום טבעי על ידי EPF. זיהום EPF במושבה יכול להפוך את תוצאות הבידוד ללא אמינות. לכן, יש להתבונן בזחלים הנותרים במושבה המחפשים סימנים פתולוגיים חסרי חוליות. כחלופה, ניתן לכלול במחקר סירי הדברה עם אדמה סטרילית כדי לבדוק את מצבם הבריאותי של זחלי החרקים.

חיפוש אחר מבודדים פטרייתיים חדשים עם תכונות ביו-שליטה יוצאות דופן הוא חיוני להגברת היעילות של פטריות בהדברת פרוקי רגליים. פטריות שבודדו מהאדמה יכולות להיות מותאמות היטב לגידול בסביבה זו22, וסביר להניח שיש להן התמדה גבוהה בשדה, שהיא מאפיין חיוני של EPF מוצלח בהדברה21. בהתאם לכך, EPF מבודד מקומי יכול לשפר את ההדברה הביולוגית של מזיקים מקומיים בגלל ההתאמה הגיאוגרפית והזמנית שלהם, מה שמגדיל את סיכויי ההצלחה ומפחית את ההשפעות הסביבתיות הנגרמות אחרת על ידי יישום של קוטלי חרקים סינתטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) מברזיל, קוד מימון 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (מספר פרויקט E-26/010.001993/2015), ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) מברזיל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave Phoenix Luferco 9451
Biosafety cabinet Airstream ESCO AC2-4E3
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Climate chambers Eletrolab EL212/3
Coverslip RBR 3871
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Drigalski spatula Marienfeld 1800024
GPS app Geolocation app 2.1.2005
Lactophenol blue solution Sigma-Aldrich 61335
Microscope Zeiss Axio star plus 1169 149
Microscope camera Zeiss Axiocam 105 color 426555-0000-000
Microscope softwere Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide Olen k5-7105-1
Microtube BRAND Z336769-1PAK
Petri plates Kasvi K30-6015
Pipette tip Vatten VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette HTL - Labmatepro LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots Prafesta descartáveis 8314
Polypropylene bags Extrusa 38034273/5561
Potato dextrose agar Kasvi K25-1022
Prism software 9.1.2 Graph Pad
Shovel Tramontina 77907009
Tenebrio mollitor Safari QP98DLZ36
Thiabendazole Sigma-Aldrich T8904
Tween 80 Vetec 60REAVET003662
Vortex Biomixer QL-901
Yeast extract Kasvi K25-1702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 179 Metarhizium Beauveria מיקרוביוטה של הקרקע פיתיון חרקים הדברה ביולוגית bioprospecting Tenebrio גלריה מדיום סלקטיבי
השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Correa, T. A., Santos, F. S.,… More

Correa, T. A., Santos, F. S., Camargo, M. G., Quinelato, S., Bittencourt, V. R. E. P., Golo, P. S. Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples. J. Vis. Exp. (179), e63353, doi:10.3791/63353 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter