Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقارنة طرق عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63353
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1,3, 1,3
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Summary

يتم عزل المستعمرات الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة الاستوائية باستخدام طعم تينيبريو ، طعم غاليريا ، وكذلك الوسط الاصطناعي الانتقائي ، أي أجار سكر العنب البطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول ، الثيابيندازول ، وسيكلوهيكسيميد (وسط CTC).

Abstract

الهدف من هذه الدراسة هو مقارنة فعالية استخدام الطعوم الحشرية مقابل الوسط الانتقائي الاصطناعي لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) من عينات التربة. التربة هي موطن غني للكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك EPF التي تنتمي بشكل خاص إلى الأجناس Metarhizium و Beauveria ، والتي يمكن أن تنظم آفات المفصليات. تتوفر المنتجات البيولوجية القائمة على الفطريات في السوق بشكل رئيسي لمكافحة الآفات المفصلية الزراعية. ومع ذلك، وعلى الرغم من التنوع البيولوجي المتوطن المرتفع، لا يستخدم سوى عدد قليل من السلالات في المنتجات الحيوية التجارية في جميع أنحاء العالم. في هذه الدراسة ، تم استزراع 524 عينة تربة على أجار سكر العنب المخصب بالبطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول والثيابيندازول والسيكلوهيكسيميد (وسط CTC). لوحظ نمو المستعمرات الفطرية لمدة 3 أسابيع. تم تحديد جميع Metarhizium و Beauveria EPF مورفولوجيا على مستوى الجنس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد بعض العزلات جزيئيا على مستوى الأنواع. كما تم مسح 24 عينة من أصل 524 عينة من عينات التربة هذه بحثا عن حدوث EPF باستخدام طريقة طعم الحشرات (Galleria mellonella و Tenebrio molitor). تم عزل ما مجموعه 51 سلالة EPF (41 Metarhizium spp. و 10 Beauveria spp.) من عينات التربة 524. تم عزل جميع السلالات الفطرية إما عن الأراضي الزراعية أو الأراضي العشبية. ومن بين العينات ال 24 المختارة للمقارنة، كانت 91.7 في المائة إيجابية ل EPF باستخدام طعم غاليريا ، و 62.5 في المائة باستخدام طعم تينيبريو ، و 41.7 في المائة باستخدام CTC. أشارت نتائجنا إلى أن استخدام طعوم الحشرات لعزل EPF عن التربة أكثر كفاءة من استخدام وسط CTC. إن مقارنة طرق العزل بالإضافة إلى تحديد وحفظ EPF لها تأثير إيجابي على المعرفة حول التنوع البيولوجي. تحسين مجموعة EPF يدعم التطور العلمي والابتكار التكنولوجي.

Introduction

التربة هي مصدر العديد من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF). يتم التعرف على هذه المجموعة الخاصة من الفطريات من خلال قدرتها على استعمار وغالبا ما تقتل مضيفات المفصليات ، وخاصة الحشرات1. بعد العزل والتوصيف واختيار السلالات الخبيثة والتسجيل ، يتم إنتاج EPF بكميات كبيرة لمكافحة الآفات المفصلية ، مما يدعم أهميتها الاقتصادية2. وفقا لذلك ، يعتبر عزل EPF الخطوة الأولى لتطوير مبيد حيوي. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) و Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) هي الفطريات الأكثر شيوعا المستخدمة لمكافحة الآفات المفصلية3. تم عزل EPF بنجاح من التربة ، والمفصليات مع الفطار المرئي ، والنباتات المستعمرة ، وريزوسفير النبات 4,5.

يمكن أن تكون عزلة EPF مفيدة أيضا لدراسة تنوع وتوزيع وبيئة هذه المجموعة بالذات. ذكرت الأدبيات الحديثة أن استخدام EPF يتم التقليل من شأنه ، مستشهدا بالعديد من التطبيقات غير التقليدية ل EPF مثل قدرتها على تحسين نمو النبات4 ، لإزالة الملوثات السامة من التربة ، واستخدامها في الطب6. تهدف هذه الدراسة إلى مقارنة كفاءة عزل EPF عن التربة باستخدام طعوم الحشرات مقابل وسط الاستزراع الاصطناعي 7,8,9. تم قبول استخدام Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) كطعم للحشرات في سياق عزل EPF بشكل جيد. تستخدم هذه اليرقات في جميع أنحاء العالم من قبل المجتمع العلمي كنموذج تجريبي لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض10,11. تعتبر يرقة Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) نموذجا آخر للحشرات للدراسات التي تنطوي على ضراوة ولعزل EPF لأن هذه الحشرة من السهل ندرتها في المختبر بتكلفة منخفضة 7,12.

يمكن تطبيق طرق مستقلة عن الثقافة مثل استخدام مجموعة متنوعة من تقنيات PCR للكشف عن EPF وتحديده كميا على ركائزها ، بما في ذلك التربة13,14. ومع ذلك ، لعزل هذه المستعمرات الفطرية بشكل صحيح ، يجب استزراع ركيزتها على وسط اصطناعي انتقائي9 ، أو يمكن اصطياد الفطريات الموجودة في العينات باستخدام الحشرات الحساسة15. من ناحية ، CTC هو وسط اصطناعي خال من الدودين يتكون من أجار سكر العنب المخصب بالبطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول والثيابيندازول والسيكلوهيكسيميد. تم تطوير هذه الوسيلة من قبل فرنانديز وآخرون. 9 لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من Beauveria spp. و Metarhizium spp. من التربة. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا استخدام يرقات G. mellonella و T. molitor بنجاح كطعوم للحصول على عزلات EPF من التربة. ومع ذلك ، وفقا ل Sharma et al.15 ، أبلغ عدد أقل من الدراسات عن الاستخدام المصاحب والمقارنة بين هاتين الحشرتين الطعم. أظهرت تربة مزارع الكروم البرتغالية عمليات استرداد كبيرة ل Metarhizium robertsii (Metscn). سوروكين باستخدام T. يرقات موليتور بالمقارنة مع يرقات G. mellonella ؛ في المقابل ، بوفيريا باسيانا (Bals. -Criv.) تم ربط عزل Vuill باستخدام G. mellonella baits15. ولذلك، ينبغي النظر في القرار المتعلق بطريقة عزل EPF التي يجب استخدامها (أي G. mellonella-bait أو T. molitor-bait أو CTC medium) وفقا لهدف الدراسة والبنية التحتية للمختبر. الهدف من هذه الدراسة هو مقارنة فعالية استخدام طعوم الحشرات مقابل الوسط الانتقائي الاصطناعي لعزل EPF عن عينات التربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وبما أن هذه الدراسة قد توصلت إلى التراث الوراثي البرازيلي، فقد سجل البحث في النظام الوطني لإدارة التراث الوراثي والمعارف التقليدية المرتبطة به (Sisgen) تحت الرمز AA47CB6.

1. أخذ عينات التربة

  1. اجمع 800 غرام من التربة (مع أو بدون جذور نباتية ثانوية حادثة) على عمق 10 سم باستخدام مجرفة صغيرة. تخزينها في أكياس البولي بروبلين في درجة حرارة الغرفة حتى بداية التجربة.
    ملاحظة: يمكن أيضا جمع الجذور الصغيرة حيث يتم الإبلاغ عن أن EPF لديها كفاءة ريزوسفير. كلما كانت معالجة العينات أسرع ، كان ذلك أفضل لأن الجراثيم الفطرية قد تكون أقل قابلية للتطبيق بمرور الوقت. في هذه الدراسة ، تم تحليل العينات بعد ما لا يزيد عن 7 أيام من الجمع.
  2. استخدم نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) لتحديد موقع العينات التي تم جمعها في خطوط الطول والعرض وتصنيف المنطقة المجمعة وفقا لنوع التربة (على سبيل المثال ، الأراضي العشبية أو الغابات المطيرة الأصلية أو شواطئ البحيرات أو الأراضي الزراعية).

2. طرق عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية

  1. العزل باستخدام وسط اصطناعي انتقائي CTC.
    1. لتحضير وسط CTC [أجار سكر العنب البطاطس بالإضافة إلى مستخلص الخميرة (PDAY) المكمل ب 0.5 جم / لتر من الكلورامفينيكول ، و 0.001 جم / لتر من الثيابيندازول ، و 0.25 جم / لتر من السيكلوهيكسيميد9] ، قم بوزن جميع الكواشف بشكل فردي ، واخلطها في الماء المقطر ، وقم بتعقيم الوسط في الأوتوكلاف. في خزانة السلامة الأحيائية، لوحة 23 مل من الوسط إلى لوحات بتري 60 مم × 15 مم.
      تنبيه: أثناء وزن كواشف CTC ، استخدم معطفا مختبريا وقناعا وقفازات ونظارات واقية لأن السيكلوهيكسيميد والكلورامفينيكول سامان.
    2. يزن 0.35 ± 0.05 جم من كل عينة تربة (مع أو بدون جذور) ويضعها في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
    3. في خزانة السلامة الأحيائية، أضف 1 مل من التعليق المائي الأحادي المعقم بنسبة 0.01٪ (vol/vol) من البولي أوكسي إيثيلين سوربيتان إلى الأنبوب الصغير الذي يحتوي على التربة والدوامة لمدة 30 ثانية.
    4. قم بإزالة 50 ميكرولتر من المادة الفائقة وقم بوضعها على وسط ألواح بتري باستخدام وسط CTC. قم بتفريق المعلقات بشكل متجانس على سطح الوسط باستخدام ملعقة Drigalski معقمة (قطرها 6 مم).
      ملاحظة: يجب إعداد ما لا يقل عن ثلاثة نسخ طبق الأصل لكل عينة تربة.
    5. احتضان الألواح في غرف المناخ (25 ± 1 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية ≥80 ٪) في الظلام ومراقبة نمو المستعمرات الفطرية بعد 7 و 14 و 21 يوما من الحضانة.
    6. راقب المورفولوجيا الكبيرة والدقيقة للمستعمرات الفطرية التي تبحث عن EPF. انقل مزارع EPF إلى وسط أجار سكر العنب البطاطا بالإضافة إلى 0.05٪ كلورامفينيكول (PDAC) حتى يتم الحصول على ثقافات نقية.
      ملاحظة: استخدم مفاتيح الوصف الموضحة أدناه في الخطوة 3 لتحديد مستعمرات EPF.
  2. العزل باستخدام طعوم الحشرات
    1. استخدم يرقات G. mellonella و T. molitor المطهرة سطحيا في المرحلة المتأخرة. اغمر اليرقات في هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 0.5٪ لمدة 1 دقيقة للتعقيم. اغسل اليرقات مرتين باستخدام ماء معقم.
      ملاحظة: تم استخدام يرقات G. mellonella من المرحلة الرابعة في هذه الدراسة. لم يتم توحيد مراحل يرقات T. molitor.
    2. استخدم الأواني البلاستيكية لتجميع الطعوم. أضف 250 جم من التربة المجمعة إلى كل وعاء بلاستيكي (عرض 98 مم × ارتفاع 47 مم × طول 142 مم). فصل 15 يرقات من كل نوع (T. molitor و G. mellonella) وإيداع خمس يرقات لكل وعاء بلاستيكي. تخزين الأواني في 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية ≥ 80 ٪ في الظلام.
      ملاحظة: قم بحفر 10 ثقوب صغيرة (قطرها 2 مم) في أغطية الأواني للسماح بالتهوية. يمكن استخدام جهاز حديدي ساخن حاد لحفر الثقوب.
    3. تجانس التربة كل يومين للسماح بأقصى قدر من الاتصال بين اليرقات والتربة.
      ملاحظة: الرطوبة مهمة لدعم العدوى الفطرية لليرقات. للحفاظ على الرطوبة في التربة ، رش الماء المقطر المعقم على سطح التربة كلما لزم الأمر. لا تنقع عينة التربة في الماء.
    4. تحليل الأواني يوميا بحثا عن الحشرات الميتة.
      ملاحظة: راقب اليرقات المتبقية في المستعمرة يوميا بحثا عن علامات مرضية لللافقاريات للتأكد من عدم إصابة الحشرات. كبديل ، يمكن تضمين أواني التحكم ذات التربة المعقمة في الدراسة للتحقق من الحالة الصحية ليرقات الحشرات.
    5. إزالة الحشرات الميتة وتعقيمها سطحيا مع هيبوكلوريت الصوديوم 0.5 ٪ لمدة 1 دقيقة. ضع الحشرات المعقمة في غرفة رطبة (الرطوبة النسبية ≥ 80٪) عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 7 أيام لصالح إضفاء الطابع الخارجي على الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (الفطار).
    6. عند الفطار ، حصاد الكونيديا من سطح الحشرة. استخدم حلقة ميكروبيولوجية لوضع الكونيديا على وسط PDAC تحت مجهر مجسم. كبديل ، ضع اليرقات المصابة بأكملها على وسط PDAC. احتضان لوحات الاستزراع في غرفة المناخ عند 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية ≥ 80٪.
    7. راقب المورفولوجيا الكبيرة والدقيقة للمستعمرات الفطرية على الألواح لتأكيد هوية EPF. كرر الزراعة على PDAC حتى يتم الحصول على مستعمرات فطرية نقية.
      ملاحظة: استخدم مفاتيح الوصف الموضحة أدناه في الخطوة 3 لتحديد مستعمرات EPF.

3. تحديد EPF (Metarhizium spp. و Beauveria spp.)

  1. تحليل الخصائص المورفولوجية الكبيرة للثقافات الفطرية على الألواح (أي سطح وعكس المستعمرات ، وشكلها ، وحافتها ، ومعدل نموها ، ولونها ، وملمسها ، وصبغتها القابلة للانتشار ، وإفرازاتها ، وكونيديا هوائية) بعد 14 يوما عند 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية ≥ 80٪.
  2. نقل الكونيديا الهوائية إلى مزارع الانزلاق (تقنية الزراعة الدقيقة)16 لمدة 3 أيام عند 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية ≥ 80٪ والبقع باللون الأزرق لاكتوفينول لمراقبة الميزات المجهرية (أي ترتيب الكونيديا ، الكونيديوفورات ، شكل وحجم الكونيديا)17،18،19،20.
  3. راقب الهياكل الفطرية المجهرية عند 400x باستخدام المجهر الضوئي لتأكيد تحديد EPF.
    ملاحظة: تم وصف المفاتيح المورفولوجية ل EPF في التقارير التي أعدها Bischoff et al. و Rehner et al. و Seifert et al. و Humber17,18,19,20. المورفولوجيا الكلية والدقيقة للمستعمرات الفطرية هي المعايير الأكثر شيوعا المستخدمة لتحديد الفطريات الخيطية على مستوى الجنس. اعتمادا على جنس EPF ، ستتغير هذه الخصائص المورفولوجية. يقدم Humber20 مفتاح تعريف للأجناس الرئيسية من مسببات الأمراض الحشرية الفطرية. مستعمرات Metarhizium spp. ، على سبيل المثال ، عادة ما تكون دائرية ، مسحوقة ، تظهر ظلال مختلفة من اللون الأخضر ، ويمكن أن تقدم إفرازات. مجهريا ، تحتوي هذه المستعمرات على خلايا مخروطية المنشأ قمية على كونيديوفور متفرعة على نطاق واسع ومتشابكة بكثافة تشكل غشاء البكارة المضغوط ، وأسطوانية إلى كونيديا إهليلجية في سلاسل متوازية تشكل أعمدة أو كتلا تشبه اللوحة. عادة ما تكون مستعمرات Beauveria spp. بيضاء أو مسحوقة أو تشبه القطن. وهي تظهر خلايا مخروطية المنشأ مع جزء قاعدي موسع يمتد بشكل قمي في اتجاه متعرج. تشكل Beauveria conidiophores مجموعات كثيفة من الكونيديا على شكل كرة أرضية. هناك حاجة إلى تحليلات جزيئية لتحديد EPF على مستوى الأنواع.
  4. إجراء التحليلات الجزيئية على العزلات لتحديد التصنيف على مستوى الأنواع. بالنسبة لسلالات EPF المعزولة في هذه الدراسة ، وهي Metarhizium spp. و Beauveria spp. ، قم بإجراء تحليلات جزيئية استنادا إلى تقارير Bischoff et al.17 و Rehner et al.18.
  5. بعد التأكد من أن العزلات هي EPF ، قم بإيداع العزلات في مجموعة من الثقافات الفطرية. في هذه الدراسة ، تم ترسيب العزلات في مجموعة الثقافات الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من مختبر مكافحة الميكروبات (LCM) في الجامعة الريفية الفيدرالية في ريو دي جانيرو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم جمع ما مجموعه 524 عينة تربة من الأراضي العشبية: مراعي الماشية (165 عينة) ، والغابات الاستوائية الأصلية (90 عينة) ، وضفاف البحيرة (42 عينة) ، والأراضي المزروعة / الزراعية (227 عينة) بين عامي 2015 و 2018 في ولاية ريو دي جانيرو ، البرازيل. وترد في الجدول التكميلي 1 تفاصيل الإحداثيات الجغرافية للعينات الإيجابية ل EPF.

ومن بين 524 عينة من التربة، تم تحليل 500 عينة فقط باستخدام وسط CTC، وتم تحليل 24 عينة بالتزامن باستخدام ثلاثة أشكال من العزل (Galleria-bait، و Tenebrio-bait، ووسط ثقافة CTC الانتقائي)، لذلك يمكن تقييم الكفاءة النسبية لهذه الأساليب. تم عزل ما مجموعه 51 سلالة EPF من 524 عينة (41 Metarhizium spp. و 10 Beauveria spp.) (الشكل 1). ويبين الشكل 2 الخصائص الميكرومورفولوجية لبعض العزلات. تم عزل جميع السلالات الفطرية من الأراضي العشبية أو الأراضي الزراعية (الجدول التكميلي 1). كشفت النتائج أن Metarhizium spp. أكثر انتشارا من Beauveria spp. (الجدول التكميلي 1). تم تحديد تسعة من عزلات Metarhizium (LCM S01 إلى LCM S09) جزيئيا باستخدام الجين ef1-a (عامل استطالة الترجمة حقيقية النواة 1-alpha)21. ومن بين هذه العزلات، تم تحديد سبعة عزلات (LCM S01-LCM S06 و LCM S08) على أنها Metarhizium anisopliae sensu stricto بينما تم تحديد عزلين (LCM S07 و LCM S09) باسم Metarhizium pingshaense21.

ويبين الجدول 1 حدوث EPF (٪ من عينات EPF الإيجابية) في عينات التربة ال 24 التي تمت دراستها باستخدام الطرق الثلاث المختلفة للعزل. تم تحليل معدلات استرداد EPF بواسطة اختبار chi-square. وكما هو مبين في الجدول 1، أثبت طعم غاليريا أنه أكثر كفاءة في عزل EPF (91.7٪ (22/24) من العينات الإيجابية) يليه طعم T. molitor (62.5٪ (15/24) من العينات الإيجابية EPF) ووسط CTC (41.7٪ (14/24) من العينات الإيجابية EPF). لم تظهر عينات التربة ال 24 هذه أي استرداد ل Beauveria spp. ، ولكن فقط Metarhizium.

Figure 1
الشكل 1: مستعمرات فطرية مسببة للأمراض الحشرية من السلالات المعزولة من عينات التربة. وزرعت المستعمرات على وسط اصطناعي من لجنة مكافحة الإرهاب. (1) صفيحة بتري تعرض مستعمرات فطرية من عينات التربة بعد 14 يوما من حضانتها على وسط انتقائي من CTC قبل الحصول على مزارع نقية؛ (2-42) مستعمرات ميتاريزيوم النقية. (43-52) مستعمرات بيوفيريا النقية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الخصائص الميكرومورفولوجية للفطريات المسببة للأمراض الحشرية المعزولة من عينات التربة. تم احتضان المستعمرات لمدة 3 أيام على أجار سكر العنب البطاطس عند 25 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية ≥ 80٪. كانت شريحة المجهر ملطخة بمحلول أزرق لاكتوفينول. تظهر الصور كونيديوفور وكونيديا من (أ) ميتاريزيوم أنيسوبليا سينسو ستريمسو (s.s) عزل LCM S01; (ب) ميتاريزيوم أنيسوبلياي س. س. عزل LCM S03؛ (ج) Metarhizium sp. عزل LCM S27 ؛ (مد إلى واو) يعزل Beauveria spp. LCM S23 و LCM S24 و LCM S20 ، على التوالي. تم عزل جميع السلالات الممثلة هنا باستخدام وسيط CTC. كما تم استرداد LCM S27 من التربة باستخدام طعوم الحشرات. * كونيديوفور وكونيديا. ** تظهر السلاسل الكونيديالية الوضع المميز جنبا إلى جنب لجراثيم Metarhizium في السلاسل المجاورة. تشير الأسهم السوداء إلى Metarhizium أسطواني إلى كونيديا إهليلجي. تشير الأسهم الحمراء إلى كونيديا على شكل كرة أرضية بوفيريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طريقة العزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية * χ2**
موجب سالب
غاليريا الطعم 91.7% (22/24) 8.3% (2/24) 13.4
تينيبريو-الطعم 62.5% (15/24) 37.2% (9/24)
CTC الوسط الانتقائي 41.7% (10/24) 58.3% (14/24)
* تم عزل Metarhizium spp. فقط
** تحليل مربع تشي ، DF2. P = 0.0013

الجدول 1: حدوث الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (٪ من العينات الإيجابية) في 24 عينة تربة باستخدام طرق عزل مختلفة.

الجدول التكميلي 1: الإحداثيات الجغرافية، وطريقة العزل، والرمز، وسنة الجمع، وأنواع استخدام الأراضي للعينات الإيجابية للفطريات المسببة للأمراض الحشرية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

موائل التربة الطبيعية والزراعية هي بيئات نموذجية ل EPF22 وخزان طبيعي ممتاز. في هذه الدراسة ، تم تناول طريقتين لعزل EPF باستخدام طعوم الحشرات مقابل الوسط الانتقائي. الخطوة الأولى للعزل هي جمع عينات التربة. التخزين السليم وتحديد عينات التربة أمر بالغ الأهمية. تعد المعلومات المتعلقة بخطوط الطول والعرض ونوع التربة والمنطقة الأحيائية ضرورية للدراسات التي تنطوي على مواضيع وبائية ونمذجة وجيومكانية23,24. بعد الجمع ، يوصى بمعالجة العينات في أقرب وقت ممكن (يفضل أن يكون ذلك في غضون 7 أيام) لأن صلاحية الكونيديا في عينات التربة هذه يمكن أن تنخفض في النهاية. وتشمل الخطوات الحاسمة في عزل ال EPF باستخدام CTC ما يلي: أ) التحقيق في صفائح CTC بعد 1 و 2 أسابيع من الحضانة (الأسابيع الأولى حرجة لأنه ، في مراحل لاحقة ، يمكن للمستعمرات الفطرية الأخرى أن تضيق نطاق تطور EPF) ، و ب) تحديد مستعمرات EPF بدقة بناء على شكلها الكلي وميكرومورفولوجيا. للعزل باستخدام طعوم الحشرات ، من الضروري الحفاظ على عينة التربة رطبة ولكن ليس نقعها في الماء.

أدت النتائج التي أبلغت عنها العديد من الدراسات إلى تفسير مفاده أن M. anisopliae أكثر شيوعا في التربة المزروعة من النظم الإيكولوجية الطبيعية8،25،26. يمكن أن تحدث اختلافات في توزيع وحدوث هذه الفطريات. في هذه الدراسة ، تم عزل جميع السلالات إما من التربة المزروعة (المحاصيل) أو الأراضي العشبية ، وكان هناك غلبة ل Metarhizium spp. على Beauveria spp. يقترح أن ممارسات الزراعة والمحتوى العالي من المواد العضوية تفضل وجود الفطريات الوقائية في التربة27. وبناء على ذلك ، يجب أن تنظر تقنيات العزل الفعالة التي تسعى إلى EPF في الحد من الملوثات الفطرية.

تستخدم الوسائط الاصطناعية الانتقائية بشكل شائع للعزل لأنها سهلة الاستخدام وقد أثبتت كفاءتها في عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية ، وخاصة Metarhizium spp. و Beauveria spp.28. تستخدم هذه الوسائط الانتقائية مواد كيميائية محددة للحد من نمو الملوثات. في 1980s و 1990s ، أصبح دودين مبيد الفطريات وسيطا انتقائيا يستخدم على نطاق واسع لعزل Metarhizium spp. و Beauveria spp.29,30. على الرغم من أن هذه الوسائط الاصطناعية فعالة ، إلا أن بعض أنواع EPF مثل Metarhizium acridum يمكن أن تكون عرضة للدودين31. هذا هو السبب في اختيار وسيط CTC الخالي من دودين في هذه الدراسة. وفقا ل Fernandes et al.9 ، تم تطوير CTC لزيادة عزلة الفطريات المسببة للأمراض الحشرية التي تحدث بشكل طبيعي ، بما في ذلك M. acridum. يعد استخدام وسط انتقائي بدلا من طعوم الحشرات في عزل EPF أمرا مناسبا لأن الأول يتطلب مساحة أقل في معالجة العينات. ويعتمد العيب الرئيسي في استخدام مركبات الكربون الكلورية فلورية على أن بعض مكوناتها (أي السيكلوهيكسيميد والكلورامفينيكول) سامة، وبالتالي فإن استخدام معدات الحماية الشخصية إلزامي.

كما لوحظ في هذه الدراسة ، تم الإبلاغ عن نسبة أعلى من العينات الإيجابية مع طعوم الحشرات مقارنة بالوسائط الانتقائية الاصطناعية لعزل EPF15،32،33،34،35. يعتبر استخدام طعوم الحشرات بديلا منخفض التكلفة وعالي الكفاءة في البحث عن EPF جديد. على الرغم من ذلك ، هناك عيوب مرتبطة باستخدام طعوم الحشرات على الوسائط الانتقائية. نظرا لأن كمية التربة التي يجب تحليلها باستخدام الحشرات أعلى ، فمن الضروري أيضا أن يكون لديك مساحة مادية أكبر لتخزين العينات واحتضان الأواني. يمكن أن يكون اقتناء الحشرات أيضا قيدا على ذلك. في البرازيل ، على سبيل المثال ، G. mellonella غير متاح تجاريا ، لذلك من الضروري إنشاء مستعمرة في المختبر لاستخدام هذه الحشرة كطعم. من الضروري الحفاظ على سلامة مستعمرات الحشرات ، وتجنب العدوى الطبيعية بواسطة EPF. يمكن أن تجعل عدوى EPF في المستعمرة نتائج العزل غير موثوقة. لذلك ، يجب على المرء أن يلاحظ اليرقات المتبقية في المستعمرة التي تبحث عن علامات مرضية لافقارية. كبديل ، يمكن تضمين أواني التحكم ذات التربة المعقمة في الدراسة للتحقق من الحالة الصحية ليرقات الحشرات.

إن البحث عن عزلات فطرية جديدة ذات سمات مكافحة بيولوجية بارزة أمر بالغ الأهمية لزيادة فعالية الفطريات في مكافحة الآفات المفصلية. يمكن تكييف الفطريات المعزولة من التربة بشكل جيد مع النمو في هذه البيئة22 ، ومن المرجح أن يكون لها ثبات ميداني مرتفع ، وهي سمة أساسية لنجاح EPF في مكافحة الآفات21. وبناء على ذلك، يمكن للصندوق الأوروبي للآفات المعزول محليا أن يحسن المكافحة البيولوجية للآفات المحلية بسبب تطابقها الجغرافي والزمني، مما يزيد من فرص النجاح ويقلل من الآثار البيئية الناجمة عن استخدام المبيدات الحشرية الاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد مولت هذه الدراسة جزئيا من قبل لجنة الدراسات العليا في البرازيل (CAPES) ورمز التمويل 001 ومؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لإنفاذ الحقوق الدستورية في منطقة الأعمال العليا في ريو دي جانيرو (FAPERJ) (رقم المشروع E-26/010.001993/2015)، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) من البرازيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave Phoenix Luferco 9451
Biosafety cabinet Airstream ESCO AC2-4E3
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Climate chambers Eletrolab EL212/3
Coverslip RBR 3871
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Drigalski spatula Marienfeld 1800024
GPS app Geolocation app 2.1.2005
Lactophenol blue solution Sigma-Aldrich 61335
Microscope Zeiss Axio star plus 1169 149
Microscope camera Zeiss Axiocam 105 color 426555-0000-000
Microscope softwere Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide Olen k5-7105-1
Microtube BRAND Z336769-1PAK
Petri plates Kasvi K30-6015
Pipette tip Vatten VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette HTL - Labmatepro LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots Prafesta descartáveis 8314
Polypropylene bags Extrusa 38034273/5561
Potato dextrose agar Kasvi K25-1022
Prism software 9.1.2 Graph Pad
Shovel Tramontina 77907009
Tenebrio mollitor Safari QP98DLZ36
Thiabendazole Sigma-Aldrich T8904
Tween 80 Vetec 60REAVET003662
Vortex Biomixer QL-901
Yeast extract Kasvi K25-1702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

Tags

علم الأحياء ، العدد 179 ، Metarhizium ، Beauveria ، ميكروبات التربة ، طعم الحشرات ، المكافحة البيولوجية ، التنقيب البيولوجي ، Tenebrio ، Galleria ، الوسط الانتقائي
مقارنة طرق عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Correa, T. A., Santos, F. S.,… More

Correa, T. A., Santos, F. S., Camargo, M. G., Quinelato, S., Bittencourt, V. R. E. P., Golo, P. S. Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples. J. Vis. Exp. (179), e63353, doi:10.3791/63353 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter