Summary
Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, entomopatojenik mantarları (EPF) toprak örneklerinden izole etmek için böcek yemlerinin yapay seçici ortama karşı kullanılmasının etkinliğini karşılaştırmaktır. Toprak, özellikle eklembacaklı zararlılarını düzenleyebilen Metarhizium ve Beauveria cinslerine ait EPF de dahil olmak üzere mikroorganizmalar için zengin bir yaşam alanıdır. Mantarlara dayalı biyolojik ürünler, esas olarak tarımsal eklembacaklı haşere kontrolü için piyasada mevcuttur. Bununla birlikte, yüksek endemik biyoçeşitliliğe rağmen, dünya çapında ticari biyoürünlerde sadece birkaç suş kullanılmaktadır. Bu çalışmada, kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya ekstresi ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agar üzerinde 524 toprak örneği kültüre alınmıştır. Mantar kolonilerinin büyümesi 3 hafta boyunca gözlendi. Tüm Metarhizium ve Beauveria EPF, cins düzeyinde morfolojik olarak tanımlanmıştır. Ek olarak, bazı izolatlar tür düzeyinde moleküler olarak tanımlanmıştır. Bu 524 toprak örneğinden yirmi dördü, böcek yemi yöntemi (Galleria mellonella ve Tenebrio molitor) kullanılarak EPF oluşumu için de araştırılmıştır. 524 toprak örneğinden toplam 51 EPF suşu (41 Metarhizium spp. ve 10 Beauveria spp.) izole edildi. Tüm mantar suşları ya ekili alanlardan ya da otlaklardan izole edildi. Karşılaştırma için seçilen 24 numunenin% 91.7'si Galleria yemi kullanan EPF, Tenebrio yemi kullanan% 62.5 ve CTC kullanarak% 41.7'si pozitifti. Sonuçlarımız, EPF'yi topraktan izole etmek için böcek yemlerinin kullanılmasının, CTC ortamını kullanmaktan daha verimli olduğunu göstermiştir. EPF'nin tanımlanması ve korunmasına ek olarak izolasyon yöntemlerinin karşılaştırılması, biyolojik çeşitlilik hakkındaki bilgiler üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. EPF koleksiyonunun iyileştirilmesi bilimsel gelişmeyi ve teknolojik yeniliği desteklemektedir.
Introduction
Toprak, entomopatojenik mantarlar (EPF) dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmaların kaynağıdır. Bu özel mantar grubu, eklembacaklı konakçıları, özellikle de böceklerikolonileştirme ve sıklıkla öldürme yetenekleriyle tanınır 1. İzolasyon, karakterizasyon, virülan suşların seçimi ve tescilden sonra, EPF, ekonomik alaka düzeylerini destekleyen eklembacaklı-haşere kontrolü için seri olarak üretilir2. Buna göre, EPF'nin izolasyonu, bir biyopestisit gelişiminin ilk adımı olarak kabul edilir. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) ve Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) eklembacaklı-haşere kontrolü için kullanılan en yaygın mantarlardır3. EPF topraktan, görünür mikozlu eklembacaklılardan, kolonize bitkilerden ve bitki rizosferinden başarıyla izole edilmiştir 4,5.
EPF'nin izolasyonu, bu belirli grubun çeşitliliğini, dağılımını ve ekolojisini incelemek için de yararlı olabilir. Son literatür, EPF'nin bitki büyümesini iyileştirmekapasiteleri 4, topraktan toksik kirleticileri uzaklaştırma ve tıpta kullanılma kapasiteleri gibi EPF'nin birkaç geleneksel olmayan uygulamasına atıfta bulunarak EPF kullanımının hafife alındığını bildirmiştir6. Bu çalışma, böcek yemleri kullanarak EPF'yi topraktan izole etmenin verimliliğini yapay kültür ortamı 7,8,9 ile karşılaştırmayı amaçlamaktadır. Galleria mellonella L.'nin (Lepidoptera: Phyralidae) EPF izolasyonu bağlamında bir böcek yemi olarak kullanılması iyi kabul edilmiştir. Bu larvalar dünya çapında bilimsel topluluk tarafından konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için deneysel bir model olarak kullanılmaktadır10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larvası, virülans içeren çalışmalar ve EPF'nin izolasyonu için başka bir böcek modeli olarak kabul edilir, çünkü bu böceğin laboratuvarda düşük maliyetle nadir görülmesi kolaydır 7,12.
Toprak13,14 dahil olmak üzere substratlarındaki EPF'yi tespit etmek ve ölçmek için çeşitli PCR teknikleri kullanmak gibi kültürden bağımsız yöntemler uygulanabilir. Bununla birlikte, bu mantar kolonilerini uygun şekilde izole etmek için, substratları seçici bir yapay ortam9 üzerine kültürlenmelidir veya örneklerde bulunan mantarlar hassas böcekler kullanılarak yemlenebilir15. Bir yandan, CTC, kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarından oluşan dodin içermeyen yapay bir ortamdır. Bu ortam Fernandes ve ark. tarafından geliştirilmiştir. 9 Doğal olarak oluşan Beauveria spp. ve Metarhizium spp.'nin topraktan geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak. Öte yandan, G. mellonella ve T. molitor larvaları, topraktan EPF izolatları elde etmek için yem olarak başarıyla kullanılabilir. Bununla birlikte, Sharma ve ark.15'e göre, daha az sayıda çalışma, bu iki yem böceğinin eşzamanlı kullanımını ve karşılaştırmasını bildirmiştir. Portekiz üzüm bağları toprakları, Metarhizium robertsii'nin (Metscn.) önemli geri kazanımlarını sergiledi. T. kullanarak Sorokin molitör larvaları G. mellonella larvalarına kıyasla; Buna karşılık, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill izolasyonu, G. mellonella yemleri15'in kullanımıyla bağlantılıydı. Bu nedenle, hangi EPF izolasyon yönteminin kullanılacağına dair karar (örneğin, G. mellonella-yem, T. molitor-yem veya CTC ortamı) çalışmanın amacına ve laboratuvar altyapısına göre düşünülmelidir. Bu çalışmanın amacı, EPF'yi toprak örneklerinden izole etmek için böcek yemlerinin yapay seçici ortama karşı kullanılmasının etkinliğini karşılaştırmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Brezilya genetik mirasına eriştiğinden, araştırma AA47CB6 kodu altında Ulusal Genetik Miras ve İlişkili Geleneksel Bilgi Yönetimi Sistemi'ne (Sisgen) kaydedildi.
1. Toprak örneklemesi
- Küçük bir kürek kullanarak 10 cm derinliğe kadar 800 g toprak (tesadüfi ikincil bitki kökleri olsun veya olmasın) toplayın. Deneyin başlangıcına kadar oda sıcaklığında polipropilen torbalarda saklayın.
NOT: EPF'nin rizosfer yeterliliğine sahip olduğu bildirildiği için küçük kökler de toplanabilir. Numunelerin işlenmesi ne kadar hızlı olursa, o kadar iyi olur, çünkü mantar sporları zamanla daha az uygulanabilir olabilir. Bu çalışmada, örnekler toplandıktan en fazla 7 gün sonra analiz edilmiştir. - Toplanan örneklerin enlem ve boylamdaki konumunu belirlemek ve toplanan alanı toprak türüne göre sınıflandırmak için bir GPS kullanın (örneğin, otlaklar, doğal yağmur ormanları, göl kıyıları veya ekim alanları).
2. Entomopatojenik mantarlar için izolasyon yöntemleri
- CTC seçici yapay ortam kullanılarak izolasyon.
- CTC ortamını hazırlamak için [0.5 g / L kloramfenikol, 0.001 g / L tiyabendazol ve 0.25 g / L sikloheksimid9 ile desteklenmiş patates dekstroz agar artı maya ekstresi (PDAY)], tüm reaktifleri ayrı ayrı tartın, damıtılmış suda karıştırın ve ortamı otoklavda sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabininde, ortamın 23 mL'sini 60 mm x 15 mm Petri plakalara tabaklayın.
DİKKAT: CTC reaktiflerini tararken bir laboratuvar önlüğü, maske, eldiven ve gözlük kullanın çünkü sikloheksimid ve kloramfenikol toksiktir. - Her toprak örneğinin 0,35 ± 0,05 g ağırlığında (köklü veya köksüz) ve 1,5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
- Bir biyogüvenlik kabininde, 30 s boyunca toprak ve vorteks içeren mikrotüpe 1 mL steril% 0.01 (hacim / hacim) polioksietilen sorbitan monooleat sulu süspansiyon ekleyin.
- Süpernatantın 50 μL'sini çıkarın ve CTC ortamına sahip Petri plakalarının ortasına pipetleyin. Steril bir Drigalski spatula (6 mm çapında) kullanarak süspansiyonları ortamın yüzeyine homojen olarak dağıtın.
NOT: Her toprak örneği için en az üç replika hazırlanmalıdır. - Plakaları iklim odalarında (25 ± 1 ° C, bağıl nemi ≥% 80) karanlıkta inkübe edin ve 7, 14 ve 21 günlük inkübasyondan sonra mantar kolonilerinin büyümesini gözlemleyin.
- EPF arayan mantar kolonilerinin makromorfolojisini ve mikromorfolojisini gözlemleyin. EPF kültürlerini, saf kültürler elde edilene kadar patates dekstroz agar ortamına artı% 0.05 kloramfenikol (PDAC) aktarın.
NOT: EPF kolonilerinin tanımlanması için adım 3'te aşağıda sunulan açıklama anahtarlarını kullanın.
- CTC ortamını hazırlamak için [0.5 g / L kloramfenikol, 0.001 g / L tiyabendazol ve 0.25 g / L sikloheksimid9 ile desteklenmiş patates dekstroz agar artı maya ekstresi (PDAY)], tüm reaktifleri ayrı ayrı tartın, damıtılmış suda karıştırın ve ortamı otoklavda sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabininde, ortamın 23 mL'sini 60 mm x 15 mm Petri plakalara tabaklayın.
- Böcek yemleri kullanarak izolasyon
- Yüzeyden dezenfekte edilmiş G. mellonella ve T. molitor geç evre larvaları kullanın. Larvaları sterilizasyon için 1 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorite batırın. Larvaları steril su kullanarak iki kez yıkayın.
NOT: Bu çalışmada dördüncü evreden G. mellonella larvaları kullanılmıştır. T. molitor larva evreleri standartlaştırılmamıştır. - Yemleri monte etmek için plastik kaplar kullanın. Her plastik tencereye 250 g toplanan toprak ekleyin (98 mm genişlik x 47 mm yükseklik x 142 mm uzunluk). Her türün 15 larvasını ayırın (T. molitor ve G. mellonella) ve plastik tencere başına beş larva biriktirin. Saksıları 25 ± 1 °C'de ve bağıl nemde karanlıkta% 80 ≥ saklayın.
NOT: Havalandırmaya izin vermek için tencere kapaklarına 10 küçük delik (2 mm çapında) açın. Delikleri delmek için keskin bir ısıtılmış demir cihaz kullanılabilir. - Larvaların toprakla maksimum temasına izin vermek için toprağı her gün homojenize edin.
NOT: Larvaların mantar enfeksiyonunu desteklemek için nem önemlidir. Topraktaki nemi korumak için, gerektiğinde toprak yüzeyine steril damıtılmış su püskürtün. Toprak örneğini suya batırmayın. - Ölü böcekleri arayan saksıları günlük olarak analiz edin.
NOT: Böceklerin enfekte olmadığından emin olmak için omurgasız patolojik belirtiler için kolonide kalan larvaları günlük olarak gözlemleyin. Alternatif olarak, böcek larvalarının sağlık durumunu kontrol etmek için steril topraklı kontrol saksıları çalışmaya dahil edilebilir. - Ölü böcekleri çıkarın ve yüzeysel olarak 1 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit ile sterilize edin. Entomopatojenik mantarların (mikoz) dışsallaşmasını desteklemek için steril böcekleri nemli bir odaya (bağıl nem ≥% 80) 7 gün boyunca 25 ± 1 ° C'de yerleştirin.
- Mikoz üzerine, konidiayı böcek yüzeyinden toplayın. Konidiayı stereoskopik mikroskop altında PDAC ortamına yerleştirmek için mikrobiyolojik bir döngü kullanın. Alternatif olarak, enfekte olmuş larvaların tamamını PDAC ortamına yerleştirin. Kültür plakalarını bir iklim odasında 25 ± 1 ° C'de ve bağıl nem% 80'≥ inkübe edin.
- EPF'nin kimliğini doğrulamak için plakalardaki mantar kolonilerinin makromorfolojisini ve mikromorfolojisini gözlemleyin. Saf mantar kolonileri elde edilene kadar PDAC üzerinde kültürlemeyi tekrarlayın.
NOT: EPF kolonilerinin tanımlanması için adım 3'te aşağıda sunulan açıklama anahtarlarını kullanın.
- Yüzeyden dezenfekte edilmiş G. mellonella ve T. molitor geç evre larvaları kullanın. Larvaları sterilizasyon için 1 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorite batırın. Larvaları steril su kullanarak iki kez yıkayın.
3. EPF'nin tanımlanması (Metarhizium spp. ve Beauveria spp.)
- Plakalardaki mantar kültürlerinin makromorfolojik özelliklerini (yani, kolonilerin yüzeyi ve tersi, şekilleri, kenarları, büyüme hızları, renkleri, dokuları, yayılabilir pigmentleri, eksüdaları ve hava konidiaları) 14 gün sonra 25 ± 1 ° C'de ve bağıl nem% 80'≥ analiz edin.
- Hava konidiasını 25 ± 1 °C'de 3 gün boyunca slayt kültürlerine (mikrokültür tekniği)16 aktarın ve bağıl nem% 80'≥ ve mikroskobik özellikleri (yani, konidia, konidioforların, şeklin ve konidia'nın boyutu) gözlemlemek için laktofenol mavisi ile lekeleyin17,18,19,20.
- EPF tanımlamasını doğrulamak için optik mikroskop kullanarak mikroskobik mantar yapılarını 400x'te gözlemleyin.
NOT: EPF için morfolojik anahtarlar Bischoff ve ark., Rehner ve ark., Seifert ve ark. ve Humber17,18,19,20 tarafından hazırlanan raporlarda açıklanmıştır. Mantar kolonilerinin makro ve mikromorfolojisi, filamentli mantarları cins düzeyinde tanımlamak için kullanılan en sık kriterlerdir. EPF'nin cinsine bağlı olarak, bu morfolojik özellikler değişecektir. Humber20, fungal entomopatojenlerin ana cinsleri için bir tanımlama anahtarı sunar. Metarhizium spp. kolonileri, örneğin, genellikle dairesel, tozludur, yeşilin değişen tonlarını sergiler ve eksüda sunabilir. Mikroskobik olarak, bu koloniler geniş dallı, yoğun iç içe geçmiş konidioforlar üzerinde apikal kompakt bir kızlık zarı oluşturan konidiojenik hücrelere ve sütunlar veya plaka benzeri kütleler oluşturan paralel zincirlerde silindirik ila elipsoid konidiaya sahiptir. Beauveria spp. kolonileri genellikle beyaz, toz veya pamuk benzeridir. Apikal olarak zikzak yönde uzanan genişlemiş bazal kısmı olan konidiojen hücreler sergilerler. Beauveria konidioforları, küre şeklindeki konidiaların yoğun kümelerini oluşturur. EPF'nin tür düzeyinde tanımlanması için moleküler analizlere ihtiyaç vardır. - Tür düzeyinde taksonomik tanımlama için izolatlar üzerinde moleküler analizler yapın. Bu çalışmada izole edilen EPF suşları için, yani Metarhizium spp. ve Beauveria spp., Bischoff ve ark.17 ve Rehner ve ark.18'in raporlarına dayanarak moleküler analizler gerçekleştirin.
- İzolatların EPF olduğunu doğruladıktan sonra, izolatları bir mantar kültürleri koleksiyonuna koyun. Bu çalışmada, izolatlar, Rio de Janeiro Federal Kırsal Üniversitesi'ndeki Mikrobiyal Kontrol Laboratuvarı'ndan (LCM) toplanan entomopatojenik mantar kültürlerinde biriktirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otlaklardan toplam 524 toprak örneği toplanmıştır: Brezilya'nın Rio de Janeiro Eyaleti'nde 2015 ve 2018 yılları arasında hayvancılık merası (165 örnek), yerli tropikal orman (90 örnek), göl kenarı (42 örnek) ve ekili / ekili / ekili arazi (227 örnek). EPF için pozitif olan örneklerin coğrafi koordinatlarının ayrıntıları Ek Tablo 1'de verilmiştir.
524 toprak örneğinden 500 örnek sadece CTC ortamı kullanılarak analiz edildi ve 24 numune üç izolasyon formu (Galleria-yem, Tenebrio-yem ve seçici CTC kültür ortamı) kullanılarak eşzamanlı olarak analiz edildi, böylece bu yöntemlerin göreceli verimliliği değerlendirilebildi. 524 örnekten (41 Metarhizium spp. ve 10 Beauveria spp.) toplam 51 EPF suşu izole edildi. (Şekil 1). Bazı izolatların mikromorfolojik özellikleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Tüm mantar suşları otlak veya ekili alanlardan izole edildi (Ek Tablo 1). Sonuçlar, Metarhizium spp.'nin Beauveria spp.'den daha yaygın olduğunu ortaya koymuştur (Ek Tablo 1). Metarhizium izolatlarının dokuzu (LCM S01 ila LCM S09), ef1-a (ökaryotik translasyon uzama faktörü 1-alfa) geni21 kullanılarak moleküler olarak tanımlanmıştır. Bunlardan yedi izolatı (LCM S01-LCM S06 ve LCM S08) Metarhizium anisopliae sensu stricto olarak tanımlanırken, iki izolatı (LCM S07 ve LCM S09) Metarhizium pingshaense21 olarak tanımlanmıştır.
Üç farklı izolasyon yöntemi kullanılarak incelenen 24 toprak örneğinde EPF'nin (pozitif EPF örneklerinin % 'si) oluşumu Tablo 1'de gösterilmiştir. EPF'nin iyileşme oranları ki-kare testi ile analiz edildi. Tablo 1'de gösterildiği gibi, Galleria yeminin EPF'nin (pozitif numunelerin% 91.7'si (22/24) izolasyonunda, ardından T. molitor yeminin (EPF pozitif numunelerin% 62.5'inin (15/24) ve CTC ortamının (EPF pozitif numunelerin% 41.7'sinin (14/24) izolasyonunda daha verimli olduğu kanıtlanmıştır. Bu 24 toprak örneği, Beauveria spp.'nin iyileşmesini göstermedi, sadece Metarhizium'u gösterdi.
Şekil 1: Toprak örneklerinden izole edilen suşların entomopatojenik mantar kolonileri. CTC yapay ortamında koloniler yetiştirildi. (1) Saf kültürler elde edilmeden önce CTC seçici ortamında inkübasyondan 14 gün sonra toprak örneklerinden mantar kolonileri sergileyen Petri plakası; (2-42) Saf Metarhizium spp. kolonileri; (43-52) Saf Beauveria spp. kolonileri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toprak örneklerinden izole edilen entomopatojenik mantarların mikromorfolojik özellikleri. Koloniler 3 gün boyunca patates dekstroz agarında 25 ± 1 ° C'de inkübe edildi ve% 80 bağıl nem ≥. Mikroskop slaytı laktofenol mavi solüsyon ile boyandı. Görüntüler (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) izole LCM S01'in konidioforlarını ve konidialarını göstermektedir; (B) Metarhizium anisopliae s.s. LCM S03'ü izole eder; (C) Metarhizium sp. LCM S27'yi izole eder; (D-F) Beauveria spp. sırasıyla LCM S23, LCM S24 ve LCM S20'yi izole eder. Burada temsil edilen tüm suşlar CTC ortamı kullanılarak izole edildi. LCM S27 ayrıca böcek yemleri kullanılarak topraktan kurtarıldı. * Konidioforlar ve konidia. ** Konidiyal zincirler, Metarhizium sporlarının bitişik zincirlerde karakteristik yan yana yerleşimini gösterir. Siyah oklar Metarhizium'u silindirik ila elipsoid konidiaya gösterir. Kırmızı oklar Beauveria küre şeklindeki conidia'yı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| İzolasyon yöntemi | Entomopatojenik mantarlar* | χ2** | |
| Pozitif | Negatif | ||
| Galleria-yem | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Tenebrio-yem | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| CTC seçici ortam | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Sadece Metarhizium spp. izole edildi | |||
| ** Ki-kare analizi, DF2. P = 0,0013 | |||
Tablo 1: Farklı izolasyon yöntemleri kullanılarak 24 toprak örneğinde entomopatojenik mantarların (pozitif numunelerin %'si) oluşumu.
Ek Tablo 1: Entomopatojenik mantarlar için pozitif örneklerin coğrafi koordinatları, izolasyon yöntemi, kodu, toplanma yılı ve arazi kullanım türleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğal ve tarımsal toprak habitatları, EPF22 için tipik ortamlar ve mükemmel bir doğal rezervuardır. Bu çalışmada, böcek yemlerine karşı seçici ortam kullanan iki EPF izolasyon yöntemi ele alınmıştır. İzolasyon için ilk adım, toprak örneklerinin toplanmasıdır. Toprak örneklerinin uygun şekilde depolanması ve tanımlanması çok önemlidir. Enlem, boylam, toprak tipi ve biyom hakkında bilgi, epidemiyolojik, modelleme ve jeo-uzamsal konuları içeren çalışmalar için gereklidir23,24. Toplandıktan sonra, numunelerin mümkün olan en kısa sürede (tercihen 7 gün içinde) işlenmesi önerilir, çünkü bu toprak numunelerinde konidianın yaşayabilirliği sonunda azalabilir. CTC kullanılarak EPF izolasyonundaki kritik adımlar şunları içerir: a) inkübasyondan 1 ve 2 hafta sonra CTC plakalarının araştırılması (ilk haftalar kritiktir, çünkü daha sonraki aşamalarda diğer mantar kolonileri EPF gelişimini daraltabilir) ve b) EPF kolonilerini makromorfolojilerine ve mikromorfolojilerine dayanarak doğru bir şekilde tanımlar. Böcek yemleri kullanılarak izolasyon için, toprak örneğini nemli tutmak, ancak suya batırmamak esastır.
Birkaç çalışma tarafından bildirilen sonuçlar, M. anisopliae'nin ekili topraklarda doğal ekosistemlerden daha yaygın olduğu yorumuna yol açmıştır 8,25,26. Bu mantarların dağılımında ve oluşumunda farklılıklar ortaya çıkabilir. Bu çalışmada, tüm suşlar ekili topraktan (mahsuller) veya otlaklardan izole edildi ve Beauveria spp üzerinde Metarhizium spp.'nin baskınlığı vardı. Yetiştirme uygulamalarının ve yüksek organik madde içeriğinin toprakta saprofitik mantarların varlığını desteklediği öne sürülmektedir27. Buna göre, EPF arayan etkili izolasyon teknikleri, mantar kirleticilerini azaltmayı düşünmelidir.
Seçici yapay ortamlar izolasyon için yaygın olarak kullanılır, çünkü kullanımı kolaydır ve başta Metarhizium spp. ve Beauveria spp.28 olmak üzere entomopatojenik mantarların izole edilmesinde etkili oldukları kanıtlanmıştır. Bu seçici ortamlar, kirleticilerin büyümesini azaltmak için belirli kimyasallar kullanır. 1980'lerde ve 1990'larda, mantar ilacı dodin, Metarhizium spp. ve Beauveria spp.29,30'u izole etmek için yaygın olarak kullanılan seçici bir ortam haline geldi. Bu yapay ortamlar etkili olmasına rağmen, Metarhizium acridum gibi bazı EPF türleri dodin31'e duyarlı olabilir. Bu nedenle bu çalışmada dodinsiz CTC ortamı seçilmiştir. Fernandes ve ark.9'a göre, CTC, M. acridum da dahil olmak üzere doğal olarak oluşan entomopatojenik mantarların izolasyonunu en üst düzeye çıkarmak için geliştirilmiştir. EPF'nin izolasyonunda böcek yemleri yerine seçici bir ortam kullanmak uygundur, çünkü birincisi numune işlemede daha az yer gerektirir. CTC kullanımındaki ana dezavantaj, bazı bileşenlerinin (yani, sikloheksimid ve kloramfenikol) toksik olmasına dayanır, bu nedenle kişisel koruma ekipmanının kullanımı zorunludur.
Bu çalışmada gözlemlendiği gibi, EPF 15,32,33,34,35'in izolasyonu için yapay seçici ortama kıyasla böcek yemleri ile pozitif örneklerin daha yüksek bir yüzdesi bildirilmiştir. Böcek yemlerinin kullanımı, yeni EPF arayışında düşük maliyetli ve yüksek verimli bir alternatif olarak kabul edilir. Buna rağmen, seçici ortamlar üzerinde böcek yemlerinin kullanımı ile ilgili dezavantajlar vardır. Böcekleri kullanarak analiz edilecek toprak miktarı daha yüksek olduğundan, örnekleri depolamak ve saksıları inkübe etmek için daha fazla fiziksel alana sahip olmak da gereklidir. Böceklerin edinilmesi de bir sınırlama olabilir. Örneğin Brezilya'da, G. mellonella ticari olarak temin edilemez, bu nedenle bu böceği yem olarak kullanmak için laboratuarda bir koloni kurmak gerekir. EPF tarafından doğal enfeksiyondan kaçınarak, böceklerin kolonilerinin sadeliğini korumak esastır. Kolonideki bir EPF enfeksiyonu, izolasyon sonuçlarını güvenilmez hale getirebilir. Bu nedenle, omurgasız patolojik belirtiler arayan kolonide kalan larvaları gözlemlemek gerekir. Alternatif olarak, böcek larvalarının sağlık durumunu kontrol etmek için steril topraklı kontrol saksıları çalışmaya dahil edilebilir.
Olağanüstü biyokontrol özelliklerine sahip yeni mantar izolatlarının aranması, mantarların eklembacaklı-haşere kontrolündeki etkinliğini arttırmak için çok önemlidir. Topraktan izole edilen mantarlar bu ortamda büyümeye iyi adapte olabilirler22 ve haşere kontrolünde başarılı EPF'nin temel bir özelliği olan yüksek alan kalıcılığına sahip olmaları muhtemeldir21. Buna göre, yerel olarak izole edilmiş EPF, coğrafi ve zamansal uyumları nedeniyle yerel zararlıların biyolojik kontrolünü iyileştirebilir, başarı şansını artırabilir ve sentetik insektisitlerin uygulanmasından kaynaklanan çevresel etkileri azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Brezilya'dan Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finans kodu 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (proje numarası E-26/010.001993/2015) ve Brezilya'dan Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S.
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
