Summary
在这里，描述了非侵入性方法，用于光感受器膜蛋白的定位和使用eGFP荧光评估 果蝇 复眼中的视网膜变性。
Abstract
膜蛋白运输调节受体和离子通道在质膜中的掺入和去除。这个过程对于神经元的细胞功能和细胞完整性至关重要。 果蝇 光感受器细胞已成为研究膜蛋白运输的模型。除了视紫红质，其在照明时从光感受器膜内化并降解外， 果蝇 中的瞬时受体电位样（TRPL）离子通道在横纹肌光感受器膜（位于黑暗中）和光感受器细胞体（在照明时被输送到）之间表现出光依赖性易位。TRPL的这种细胞内运输可以通过在光感受器细胞中表达eGFP标记的TRPL，以简单和非侵入性的方式进行研究。然后可以在深假瞰孔中或通过水浸显微镜观察eGFP荧光。这些方法允许在完整的眼睛中检测荧光，因此可用于高通量测定和遗传筛查在TRPL易位中有缺陷的 果蝇 突变体。在这里，详细解释了苍蝇的制备，微观技术以及用于研究TRPL的这种光触发易位的定量方法。这些方法也可用于其他 果蝇 光感受器蛋白的贩运研究，例如视紫红质。此外，通过使用eGFP标记的横纹肌蛋白，这些方法可用于评估光感受器细胞的变性。
Introduction
通过向质膜输送和去除蛋白质，神经元中的膜蛋白运输通过受体和离子通道控制质膜设备，从而调节神经元功能。蛋白质运输中的失调错误或缺陷通常会对细胞产生不利影响，并导致神经元变性。在人类中，这可能导致神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森病或 色素性视网膜炎1。 黑腹果蝇 复眼中的光感受器已成为研究膜蛋白运输的 体内 模型系统2。这不仅是由于 果蝇 的遗传多功能性允许有效的遗传筛选，而且还因为吸收光的光感受器膜的所有基本成分都得到了非常详细的表征，并且可以使用有效的微观技术应用于苍蝇眼。这些技术是本文的重点。
在果蝇光感受器细胞中，顶端质膜沿着细胞的一侧形成密集堆积的微绒毛堆叠，称为横纹肌。光感受器细胞R1-6的横纹肌以特征梯形模式排列，而光感受器细胞R7和R8在该梯形3的中心形成单个横纹肌。膜蛋白运输对于调节横纹肌膜蛋白（如视紫红质）和光激活TRP（瞬时受体电位）和TRPL（TRP样）离子通道的周转是必需的，以确保横纹肌中这些光转导蛋白的适当量。光感受器膜蛋白在内质网中合成，并通过高尔基体运输到横纹肌。在通过光激活视紫红质后，视紫红质分子可以通过吸收第二个光子而失活，或者可以通过克拉氏介导的内吞作用从横纹肌中除去。内吞视紫红质要么在溶酶体中降解，要么被回收回横纹肌4，5。离子通道TRPL在光转导级联激活后也被内化，并在横纹肌（当苍蝇保持在黑暗中时它位于那里）和细胞体内富含ER的储物箱（在照明后数小时内运输到该储物室）之间经历光依赖性易位6，7，8，9，10.与内吞视紫红质相反，只有少量的TRPL通过内溶酶体途径降解，并且大多数在细胞内储存并在黑暗适应时循环回横纹肌6。因此，TRPL可用于分析光触发的质膜蛋白运输。果蝇光感受器细胞也用于研究神经元变性。光感受器细胞变性通常通过评估横纹肌的结构来确定，横纹肌由于退行性过程而分解5。
为了研究TRPL和视紫红质在光感受器细胞或光感受器细胞变性中的亚细胞定位，这里应用了两种在分析速度和分辨率方面不同的荧光显微镜方法。一种非常快速，非侵入性的方法可用于遗传筛选，但空间分辨率有限，是检测深部假性pupil（DPP）中的荧光。DPP是节肢动物复眼的光学现象，其几何起源已被Franceschini和Kirschfeld在1971年详细解释过11。简而言之，在视网膜下方的几个光学平面上，可以观察到来自相邻卵形的横纹肌的叠加图像。在穿过眼睛曲率中心的焦平面上，这些叠加的投影形成一个图像，类似于横纹肌的梯形布局，在单个ommatidium中仅大几个数量级。这种现象也可以独立于荧光蛋白的外源性表达（例如TRPL：：eGFP8）观察到，这使得DPP更容易检测（图1A-A''）12。第二种非侵入性方法是水浸显微镜，该显微镜依赖于用水光学中和眼睛的屈光度装置后对荧光标记的蛋白质进行成像（图1B-C''）12。使用水浸法，可以定量评估单个光感受器细胞在横纹肌或细胞体中TRPL：：eGFP的相对量。此外，非易位荧光标记蛋白可用于评估横纹体完整性并以定量方式确定潜在变性的时间过程，如此处所述。
虽然民进党的记录是迄今为止这些方法中最简单，最快捷的，但它们生成的数据的空间分辨率是有限的。此外，DPP缺席的原因有很多，这些原因不一定可以通过DPP成像本身来识别。由于DPP表示几个ommatidia的总和，因此有关单个细胞的信息丢失。因此，低分辨率DPP成像在筛选大量苍蝇方面起着重要作用，但通常应通过水浸显微镜进行更高分辨率的记录。水浸显微照片可以解释单个细胞，发育缺陷，眼睛形态，蛋白质错位或视网膜变性以及这些效应的量化。该协议详细描述了这两种技术。
图1：本方案中介绍的果蝇眼的显微镜变化概述。（A-A''）荧光深假性假单胞菌（DPP）成像，（B-B''）荧光横纹肌的致死水浸显微镜和（C-C''）荧光横纹肌的非致命水滴显微镜的示意图和示例性显微照片。比例尺（A''）：100 μm。比例尺（B''-C''）：10 μm。该图已从参考文献13修改而来。请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
1. 一般注意事项
- 使用表达永久横纹肌位置荧光蛋白的 果蝇 储备进行形态学分析（例如，TRP：：eGFP，eGFP：：NINAC），并将易位蛋白用于蛋白质运输分析（例如，TRPL：：eGFP，Arr2：：eGFP）。
- 预先确定所选苍蝇的光照条件，用于实验方法。
- 为了适应黑暗，将苍蝇保存在25°C的暗箱中所需的时间。 对于易位实验中长达16小时的照明（例如，TRPL：：eGFP表达苍蝇），将苍蝇保持在室温下的荧光灯管下。
- 在评估光感受器变性的实验中（例如，TRP：：eGFP表达苍蝇），将苍蝇保持在荧光灯管下，在12小时光照/ 12小时黑暗循环中，在25°C下长期照明长达28天。
- 对于有色光的发光苍蝇，请使用不同颜色的透明塑料盒和荧光灯管。
- 如果使用有色素眼的苍蝇，则精确地对动物进行年龄比较分析，因为眼睛色素沉着可能随着年龄的增长而显着增加。
注意：对于数据解释，重要的是要注意，由于横纹肌结构的光波引导作用，存在信号偏差。因此，在DPP成像和水浸显微镜中，来自横纹肌的荧光信号相对于从细胞体获得的信号总是被放大到一定程度。这在色素沉着的眼睛中最为突出，其中来自横纹肌外的荧光被这些色素吸收，并且在检测细胞内易位融合蛋白时特别重要。因此，关于关键步骤，本研究分别考虑了白眼苍蝇和红眼苍蝇。 - 关于水浸显微镜，描述了两种变化。更快的致死变异以及非致死变异允许后续研究的恢复。
2. DPP成像
- 使用所需的设备和试剂准备工作空间，如图 2所示。麻醉一种基因型的苍蝇（1-3天大），该基因型在苍蝇垫上用CO2 表达荧光蛋白。选择动物在具有传统光源和低放大倍率（例如，10x）的体视显微镜下成像。
图 2：DPP 映像工作区。 所需的材料是（A）CO2 麻醉设备，（B）带有紫外灯和荧光滤光片组的立体显微镜，（C）光源，（D）带有（E）软件的显微镜安装相机，（F）油漆刷，（G）黑色纸板和（H）飞瓶。 请点击此处查看此图的大图。
- 对于DPP成像，保持选定的苍蝇麻醉，并将其中的一只置于显微镜物镜中心的侧面，以便左眼或右眼精确地径向物镜（图3A）。
注意：由于感光细胞的椭圆形布局在背中线上显示出镜像对称性，因此最好在眼睛赤道的上方或下方观察到DPP（图3B）。
图3：苍蝇在立体显微镜下的位置，用于DPP成像。 （A）苍蝇侧的图示，一只眼睛径向显微镜物镜。（B）需要稍微向上或向下转动蝇头，以便物镜聚焦在眼睛赤道上方或下方的点上，如红色箭头所示。 请点击此处查看此图的大图。
- 增加放大倍率以适合整个眼睛（例如，100x），并使眼睛的中心眼睑居中。降低显微镜的景深，例如，通过将双光圈振膜调整到浅设置（图4A-B'）。
- 关闭常规光源并以最大强度打开显微镜紫外灯，并根据眼睛中表达的荧光蛋白选择显微镜的荧光滤光片组（图4C-E）。设置指向显微镜安装相机的光路。
- 使用软件中的实时成像功能，通过调整曝光时间和增益值（例如，分别为80 ms和12x），将图像的亮度调整为仅检测来自眼睛的特定信号的设置。重新调整显微镜焦点“进入”眼睛（角膜下方）以生成DPP的叠加图像（图4C-E'）。
图4：DPP和荧光DPP成像的图示。 果蝇眼睛的示例性图像在传统和紫外线照明下使用GFP滤光片组，以不同的焦平面拍摄，以示意图横截面所示通过眼睛。（A）使用传统光源的明亮设置，30 ms曝光时间，1倍增益，深景深和角膜表面附近的焦平面记录的显微照片，如（A'）所示。（B）使用传统光源的明亮设置，30 ms曝光时间，1x增益，浅景深和角膜表面以下约180μm的焦平面记录的显微照片，如（B'）所示。民进党表示。（C-E）使用UV光源和GFP滤光片集的高强度设置，80 ms曝光时间，12倍增益，浅景深和焦平面（C'）附近，（D'）略低于或（E'）角膜表面以下约180μm记录的显微照片。荧光 DPP 用弯曲的箭头表示。比例尺 100 μm。请点击此处查看此图的大图。
- 拍摄荧光 DPP 的快照。将显微镜切换回可见光，并将光路切换回目镜。在苍蝇小瓶中回收成像的动物，以根据其DPP表型（例如，杂交）进行进一步处理。继续处理步骤 2.2 中的下一只动物。
3. 水浸显微镜
- 苍蝇准备
- 使用所需的设备和试剂准备工作空间，如图 5所示。将具有预定年龄和光照条件的苍蝇转移到预冷的15mL离心管中，并通过在冰上孵育15至30分钟进行麻醉。
注意：携带1天大的深色苍蝇作为参考。一般来说，适应黑暗的苍蝇应该被转移到黑暗中盖上盖子的冰箱里。适应光线的苍蝇可以在室内光线下转移到冰上。
- 使用所需的设备和试剂准备工作空间，如图 5所示。将具有预定年龄和光照条件的苍蝇转移到预冷的15mL离心管中，并通过在冰上孵育15至30分钟进行麻醉。
图5：水浸式显微镜工作区。 所需材料包括：（A）15 mL离心管，（B）冰片，（C）冷冻蒸馏水，（D）立体显微镜，（E）培养皿，（F）橡皮泥，（G）物体载玻片，（H）昆虫针或移液器吸头和手术刀，（I）带有（J）软件的荧光显微镜。 请点击此处查看此图的大图。
- 从下面描述的两种（3.1.3致死变异或3.1.7非致死变异）中选择适当的制剂，并且每当对色素眼和非色素眼进行区分时，请遵循相应的步骤。
- 为致命的变化准备苍蝇，如下所示。
- 将一块橡皮泥粘在物体载玻片上，另一块粘在培养皿的中心（例如，94毫米直径），并暂时将它们分开。用冰冷的蒸馏水和一些冰片填充培养皿（图6A）。
- 将一只冰麻醉的苍蝇放在涂有橡皮泥的物体载玻片顶部的立体显微镜下。转动苍蝇的背部，刺穿昆虫针穿过胸部中心（图6B）。将针脚水平固定在涂有橡皮泥的物体滑块上，并将苍蝇的左眼或右眼向上定向（图6C）。
- 小心地将物体滑块固定在培养皿中，使其无橡皮泥的一面朝下，防止苍蝇旋转。确保飞眼被水覆盖（图6D）。使用制备针仔细去除眼睛周围可能形成的任何气泡，并立即进行图像采集以获得最佳效果。
注意：图像采集的显著延迟会导致苍蝇的重新觉醒和运动，这可能导致图像模糊。
图6：制备致命的水浸显微镜。 图示：（A）橡皮泥涂层物体载玻片和培养皿，（B）将苍蝇穿过胸部固定在橡皮泥地面上，（C）在橡皮泥涂层物体载玻片上飞行方向，以及（D）最终实验设置。 请点击此处查看此图的大图。
- 为非致命变异准备苍蝇，如下所示。
- 将一只冰麻醉的苍蝇头头转移到200μL移液器吸头中，然后用压缩空气小心地将苍蝇推向吸头。
- 使用手术刀切除头部正前方的移液器尖端。使用镊子小心地将苍蝇推离尖端几毫米。再次切断移液器吸头，并用压缩空气将苍蝇推回吸头，以便只有苍蝇的头部从移液器吸头突出。
- 将一块橡皮泥粘在物体载玻片上，然后将移液器尖端按入其中，使苍蝇的左眼或右眼朝上（图7A）。在图像采集之前，使用实验室移液器将一大滴冷冻水粘附到水浸物镜的底面（图7B）。立即进行图像采集以获得最佳效果。
注意：图像采集的显著延迟会导致苍蝇的重新觉醒和运动，这可能导致图像模糊。
图7：非致命水滴显微镜的制备。 图示（A）将冷麻醉的苍蝇固定在安装在橡皮泥涂层物体载玻片上的200μL移液器吸头内，以及（B）在水浸物镜的底面上施加冷冻水滴。 请点击此处查看此图的大图。
- 图像采集
- 小心地将培养皿（步骤3.1.3）或装有准备好的飞物的物体载玻片（步骤3.1.7）放在显微镜载物台上，并选择水浸物镜。
- 手动降低水浸物镜，直到它接触到水面（步骤3.1.3）或苍蝇的眼睛接触到水滴（步骤3.1.7）（图8A，B）。
- 打开显微镜紫外灯并选择合适的滤光片组。使用目镜将苍蝇定位在物镜下方，并将显微镜聚焦在眼睛表面。
- 切换指向显微镜相机的光路，并在相应的软件中生成实时图像。重新调整相机的焦点并评估眼睛的方向，考虑到眼睛必须径向面对显微镜物镜，如图8C-E中更详细地所示。
图8：将苍蝇定位在荧光显微镜下进行水浸成像。 使用（A）致命或（B）非致命苍蝇制备方案进行图像采集的设置和最终方向。（C）飞向图，以获得水浸显微镜图像的最佳效果。聚焦于眼睛的理想点不是相对于前/后轴和背轴/腹轴的确切中心，而是略高于眼睛的赤道，如红色箭头所示。（D） 完美定位的眼睛的水浸图像示例。六边形椭圆平铺的所有三个对称轴都显示为直线，并且可以同时聚焦最大数量的异形。（E）眼睛位置不正确的水浸图像示例。图像包含弯曲的轴和较浅的景深。比例尺：20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
- 在成像软件中使用适当的LUT（查找表）来检测过饱和度（表示为红色像素）。
- 对于无色素的苍蝇，请调整曝光时间，使最亮的像素略低于每个图像的饱和度限制。
- 在有色素苍蝇和致命变化的情况下，调整曝光时间，使至少五只单独的1天大，适应黑暗的苍蝇的所有最亮像素都略低于饱和度限制。将计算出的平均曝光时间应用于所有其他实验条件（基因型，照明条件，时间点等）。
- 对于有色素的苍蝇（例如，红眼苍蝇）和非致命变化，请调整曝光时间，使所有最亮的像素都刚好低于每个1天大、适应黑暗的苍蝇的饱和度限制。将此曝光时间应用于该苍蝇的所有其他实验条件（照明条件，时间点等）。
- 记录图像并将其另存为原始文件，以存档记录的所有相应元数据。以.tif格式导出图像以进行以下量化。
注意：在非致死性变化的情况下，如果它们打算用于进一步的实验，则在图像采集后立即用红光（例如，630nm）照亮苍蝇5分钟。红光使光转换级联失活，该级联在图像采集过程中被强烈的短波光过度激活。
- 水浸显微照片中相对eGFP荧光的数据分析和定量
- 下载，安装和执行软件ImageJ /Fiji。
- 通过单击“ 分析”>“设置”来调整 ImageJ 设置...，然后仅选中“ 平均灰度值”框。通过单击“文件”导入.tif图像 > 打开... 或通过拖放。选择图像中具有代表性的焦点区域，然后通过反复按 Ctrl 和 + 将其放大到 200%-300%。
- 选择“ 椭圆形 ”工具，同时按 Shift 键，在图像中生成一个明显小于一个荧光横纹肌的圆形选区。在释放鼠标按钮之前，请在 ImageJ 主窗口中查找工具栏下方显示的确切大小。对所有分析使用相同大小的圆形选区。
注：圆形选区的确切大小（以像素或微米为单位）取决于特定设置。使用大约1天大的横纹体直径的1/3或1/4的圆圈，适应黑暗的对照蝇。 - 通过鼠标单击圆形选区并拖动或按键盘上的箭头键来移动圆形选区。
- 要测量圆形选择中的荧光强度，请将圆圈移动到第一个横纹肌（r1），然后单击“ 分析>测量 ”或使用快捷键 Ctrl + M。将弹出 一个结果 窗口，其中列出了测量的灰度值。
- 继续测量 r2-r6 作为重复测量和测量背景信号 （b）。在无色素苍蝇的情况下，对相应的细胞体区域（c1-c6）进行额外的测量（图9）。
图9：用于易位研究的相对横纹体荧光的定量。 通过在一个水浸显微镜图像中测量横纹肌（r），细胞体（c）和背景（b）的三种不同代表性ommatidia（白色圆圈）的荧光强度来量化横纹肌中相对eGFP荧光的图示;比例尺：10 μm。放大的ommatidium显示在右侧;比例尺：2 μm。 请点击此处查看此图的大图。
- 重复步骤 3.3.5 和 3.3.6，再进行两次 ommatidia，从而进行三次技术重复。使用 铅笔 工具标记分析的 ommatidia，并保存此图像以供文档记录。
- 从“ 结果 ”窗口中选择并复制测量的灰度值，然后将其粘贴到电子表格软件中以进行进一步计算。根据其来源对荧光强度值进行排序，分为横纹肌（r），细胞 体（c）和背景（b）类别。计算每个类别的平均强度（Ir，Ic，Ib）。
- 计算横纹肌（R）中存在的eGFP的相对量，使用以下公式（1）表示非色素沉着的眼睛，公式（2）表示色素沉着的眼睛：
(1)
(2) - 继续执行步骤 3.3.3 中的下一个映像。建议使用每个实验组至少五个个体的图像作为生物重复，以获得可靠的测量结果。
(1)
(2)- 通过eGFP荧光在水浸显微照片中对眼睛形态进行数据分析和量化
- 下载、安装和执行 ImageJ/Fiji 软件。通过单击“文件”> “打开...” 或拖放来导入.tif图像。在焦点图像的代表性区域中选择三个相邻的 ommatidia。
- 根据其eGFP强度，边缘清晰度以及与周围背景信号的对比度分别评估所选的18种横纹肌，以产生退化指数。评分清晰可见的横纹肌值为2，弱可见的横纹肌值为1，不存在的横纹肌值为0（图10）。
注意：这种量化方式使完全完整的眼睛得分为36分，完全退化的眼睛得分为0分。建议将退化指数的分数设置为36%至100%。
图10： 通过 横纹肌评估进行定量，用于变性研究。 通过在一张水浸显微镜图像中对三种不同的代表性ommatidia（白色圆圈）的横纹肌进行评分来量化眼睛形态的插图，其值为2（清晰可见;蓝色圆圈），1（弱可见;橙色圆圈）或0（不存在;红色圆圈）。比例尺：10 μm。放大的ommatidium显示在右侧;比例尺：2 μm。 请点击此处查看此图的大图。
- 打开下一个映像并继续执行步骤 3.4.2。建议使用每个实验组至少八个人的图像作为生物重复，以获得可靠的测量结果。
注意：由于这种定量方法不如通过荧光强度定量易位的方法客观，因此推荐的重复次数更高。
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Representative Results
在视紫红质1启动子的控制下，已经产生了表达TRPL：：eGFP融合蛋白的转基因 果 蝇。在这些苍蝇中，TRPL：：eGFP在复眼的光感受器细胞R1-6中表达，并显示照明依赖性定位。当苍蝇被保存在黑暗中时，TRPL：：eGFP被纳入外部的横纹肌中。照明数小时后，TRPL易位到细胞体内，将其储存在富含ER的隔室中。8，10 当TRPL：：eGFP位于横纹肌中时，其荧光可以在DPP中观察到。然而，由于TRPL：：eGFP的易位，横纹体荧光在光照下消失（图11A，B）。这已被用于对TRPL：：eGFP内部化中的突变体进行遗传筛选（图11C，D）14，15。为了分离潜在的纯合致死突变，该筛选使用酵母Flp / FRT系统进行，用于在发育中的眼组织（即镶嵌眼）中生成体细胞克隆。除了DPP测定的简单性外，这种荧光检测方法的其他主要优点是其高通量以及其非侵入性特征，允许鉴定活蝇中的突变并使用这些苍蝇来生成稳定的突变苍蝇种群。
图11：TRPL易位缺陷遗传筛查的代表性结果。 雄性苍蝇用甲磺酸乙酯（EMS）诱变，并在光感受器细胞R1-6中与表达TRPL：：eGFP的雌性苍蝇杂交。通过对一段时间的黑暗适应（左柱）和光适应（右柱）进行成像，对具有纯合突变Flp / FRT诱导的马赛克眼的F1代进行TRPL易位的成像， 以筛选出TRPL易位的缺陷。（A，B）将未突变的苍蝇作为常规光诱导TRPL易位的对照。非荧光 DPP 由箭头表示。（C，D）在光触发的 TRPL 易位中缺陷的分离突变体的示例性结果。比例尺：100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
从该遗传筛选中分离出的TRPL易位缺陷（ttd）突变体后来被鉴定出来，并且在水浸成像的帮助下更详细地表征了它们的缺陷。水浸显微镜已被应用于评估横纹肌和细胞体中蛋白质的定位，或定量跟踪由于光感受器变性引起的横纹肌结构缺陷，如协议中所述。 图12A，B 说明了在黑暗中，在光线下和第二次黑暗适应后，具有非突变体和 lolattd12 突变马赛克眼睛的苍蝇的横纹肌中存在的TRPL：：eGFP的量的量化。在对照（非突变）苍蝇中，TRPL：：eGFP在16小时的照明后从横纹肌易位到细胞体内，导致横纹肌TRPL：：eGFP与黑暗适应状态相比降低到约45%。第二次暗孵育将横纹肌荧光再次提高到初始值的95%。 lolattd12 突变体由于其TRPL易位缺陷而通过DPP筛选分离。因此，横纹肌水浸图像中的TRPL：：eGFP荧光图案在16 h的照明和随后的24 h黑暗适应后似乎没有发生剧烈变化。然而，图像还显示 lolattd12 突变体在发育上存在缺陷，这可以通过偶尔缺乏光感受器细胞来证明，如前所述，对于其他 lola 突变体16。这些形态学缺陷导致无法测量有效的背景信号，从而无法使用公式（1）进行正确的定量。相比之下， vps35MH20 是一种突变体，它显示TRPL易位缺陷，而不会以这种方式影响躯体形态10。在该突变体中，此处描述的定量方法可以检测到具有统计学意义的回收缺陷（图12C，D）。
图12： Lola 和 vps35 突变苍蝇中TRPL易位缺陷的代表性结果以及定量方法的局限性。 （A）TRPL：：表达eGFP的非突变和 lolattd12 突变的马赛克眼苍蝇在黑暗中孵育3天，用橙光照射16小时，第二次黑暗适应24小时。通过水浸显微镜拍摄荧光横纹肌的图像，以记录步骤3.2.6中描述的亚细胞TRPL：：eGFP定位。（B）使用式（1）对非突变（灰色）和 lolattd12 突变（绿色）动物的横纹体荧光进行定量，如步骤3.3.9中所述。（C）表达EGFP的非突变体和 vps35MH20 突变的马赛克眼苍蝇在黑暗中孵育3天，用橙光照射16小时，第二次黑暗适应24小时。通过水浸显微镜拍摄荧光横纹肌的图像，以记录步骤3.2.6中描述的亚细胞TRPL：：eGFP定位。（D）使用式（1）对非突变（灰色）和 vps35MH20 突变（红色）动物的横纹体荧光进行定量，如步骤3.3.9中所述。统计显著性计算为方差分析后与Bonferroni校正的多重比较（ns，不显著;*，p ≤0.05;***，p ≤0.001）。比例尺：10 μm。面板 C 和 D 已从参考文献10进行了修改。 请点击此处查看此图的大图。
正如协议中已经提到的，眼睛色素沉着会显着影响由此产生的水浸图像。白眼苍蝇可以检测来自横纹肌和细胞体的荧光信号，从而能够相当精确地确定TRPL：：eGFP分布比。相比之下，在红眼苍蝇中，TRPL：：eGFP信号仅在横纹肌中可检测到，但在细胞体内则不能检测到（图13A）。这是由于颜料分子吸收了来自TRPL：：eGFP的发射光。然而，通过使用公式（2）治疗色素沉着的眼睛，定量很好地揭示了白眼苍蝇和红眼苍蝇中的TRPL：：eGFP易位行为。因此，横纹霉荧光的相应值从黑暗适应状态下的100%下降到照明后的25%和5%，并且由于第二次黑暗孵育而再次增加到80%和90%（图13B）。
图13：TRPL：：eGFP荧光在白眼和红眼苍蝇中的代表性结果。 （A）TRPL：：eGFP表达白眼和红眼苍蝇在黑暗中孵育1天，用橙光照射16小时，第二次黑暗适应24小时。通过非致命水滴显微镜拍摄荧光横纹动物的图像，以记录步骤3.2.6（白眼苍蝇）和3.2.8（红眼苍蝇）中描述的亚细胞TRPL：：eGFP定位。（B）白眼（灰色）和红眼（红色）苍蝇中横纹体荧光的定量。如步骤3.3.9所述，使用公式（1）量化白眼蝇，使用公式（2）量化红眼蝇。误差线代表扫描电镜。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
为了评估光感受器变性，可以确定基于横纹肌中TRP：：eGFP荧光的变性指数（参见方案）。这种定量方法如图 10所示。在本文的代表性结果中，将非突变和 sdhAttd11 突变的马赛克眼蝇保持在12小时光照/ 12小时黑暗循环中2周，并通过用水浸没显微镜观察TRP：：eGFP每2-4天研究一次横纹动物的完整性（图14A）。由此产生的曲线显示突变体的变性指数下降，但在对照蝇中则不然（图14B）。
图14：sdhA突变果蝇中光诱导的视网膜变性的代表性结果。（A）TRP：：表达eGFP的非突变体和sdhAttd11突变的马赛克眼蝇在25°C下在12小时光照/ 12小时黑暗循环中孵育14天。 通过水浸显微镜以固定的时间间隔拍摄荧光横纹肌的图像，以记录视网膜健康状况。（B）如步骤3.4所述，对野生型（灰色）和sdhAttd11突变体（橙色）苍蝇的横纹体荧光进行定量。误差线代表扫描电镜。比例尺：10 μm。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
荧光蛋白的适用性以及通过DPP成像和视网膜水浸显微镜筛选的简单性已被许多组12证明是成功的。与这里介绍的策略类似的策略已被用于几种遗传筛选中，以在Rh1：：eGFP 17，18，19，20，21的帮助下检测视紫红质表达水平，稳态，视网膜组织或细胞完整性的缺陷。如上所述，像TRPL：：eGFP这样的易位融合蛋白可用于检测进出横纹肌的蛋白质运输过程是否受损，例如，在诱变筛查中。另一方面，永久性横纹肌融合蛋白如TRP：：eGFP可用于研究横纹肌形态。DPP和水浸显微镜被认为是果蝇眼模型中高通量分析和筛选的极好方法。然而，建议最终对分离的子宫颈或冷冻切片的视网膜组织进行（免疫）组织化学分析，以证实通过DPP或水浸显微镜获得的结果。与高分辨率荧光显微镜配合使用，这些技术可以解释精确的亚细胞定位。在下文中，提供了一些关于如何对DPP和视网膜水浸显微镜的成像过程进行故障排除的指南，这对于正确的定量分析尤为重要。
关于民进党，如果荧光的叠加模糊或模糊，设置可能不正确。一种可能性是眼睛没有精确地径向物镜，或者焦点被设置为眼睛的外围区域。由于感光细胞的椭圆形布局在背心中线处显示镜像对称性，如果从眼睛的两个半球检测到信号，则可以看到DPP中的异常模式。DPP的质量也严重依赖于浅景深通过复眼产生光学部分。如果飞板的表面显示自动荧光，则可以将苍蝇放在飞板顶部的一小块黑色非荧光纸板上。无法记录DPP可能与各种根本原因有关，包括苍蝇定位欠佳，荧光蛋白表达水平低，视网膜结构紊乱或退行性过程。在对DPP进行成像时，还应该注意的是，白眼苍蝇中的细胞质荧光可能扩散来自横纹肌的信号边界，并且蛋白质的表达水平可能在个体之间显着变化并影响所得DPP的质量。因此，在荧光DPP成像的情况下，使用具有色素眼的苍蝇是有利的。由于吸收来自细胞体的荧光信号，所得的DPP可能比白眼苍蝇看起来更清晰。
为了避免水浸显微镜中的图像模糊，需要在苍蝇准备后快速进行图像采集，以防止苍蝇的再唤醒和运动。对于高质量图像，如果使用白眼苍蝇，来自眼睛的最亮的荧光信号必须在所有图像中几乎达到饱和度。这可以通过在成像过程中调整曝光时间来实现。由于色素沉着阻碍了胞质eGFP荧光的检测，所描述的白眼苍蝇调整暴露时间的方法总是会导致色素眼中强烈的横纹体荧光信号，从而扭曲随后的解释和定量。此外，通过使用色素眼，由于强烈暴露于蓝光而导致的光漂白可能导致信号较弱，从而导致对数据的误解。根据上下文（即致死性或非致死性），色素眼的方案中提出了两种替代程序。一般来说，色素眼通常首选非致死性变异，因为同一只苍蝇可以重复测量，并且评估每只苍蝇的特定暴露时间比确定样品产生的平均暴露时间更精确，可产生更高的再现性。然而，非致命变异也需要在处理动物时更加小心，以确保它们在重复测量中的生存。这可以通过仅使用低压空气将苍蝇移动到移液器吸头中并在成像后小心地使用镊子将苍蝇从移液器吸头中释放出来来实现。由于在手术过程中苍蝇没有被淹没在冰冷的水中，因此重新醒来的风险增加。由于对单个标本的重复测量，只有当苍蝇从头到尾保持无害时，整个测量系列才有效。因此，非致命变异非常劳动密集且耗时。另一方面，致命的变化允许更高的吞吐量，因为可以连续将多个苍蝇固定在同一个昆虫针上，并在一轮图像采集中按顺序记录。然而，同一引脚上的多只苍蝇也需要更快的成像，以避免重新唤醒和移动。致死变异的最后一个缺点显然是在成像后无法恢复动物以进行后续应用（例如，交叉，重复测量）。
关于易位的定量，该方案提出了公式（1），该方案考虑了来自横纹肌和细胞体的荧光信号，从而对细胞内易位蛋白的相对分布产生了非常好的估计（图12D）。由于在色素沉着的眼睛的情况下缺乏来自细胞体的荧光测量，因此提供了公式（2），这对于这个经常遇到的问题非常有效（图13B）。除了眼睛色素沉着之外，还有其他情况会阻止用这些公式中的任何一个进行定量。其中一个实例在 图12A，B 中以 lolattd12 突变体的形式呈现。在该突变体中，具体而言，光感受器细胞R7的缺失显着影响视觉形态，从而能够从该区域获得背景荧光的合理强度测量。如果尽管存在这些问题，但仍使用相同的易位定量方法，则结果显示高方差，难以与对照组进行比较，并且可能被误解。因此， lolattd12 突变体的例子说明了这种定量方法的局限性，该方法不可避免地依赖于“野生型”样形态来进行正确的强度测量。在极少数情况下，蛋白质易位缺陷需要在形态学缺陷的ommatidia中量化，这里提出的协议失败了，必须相应地进行调整。这包括对公式进行适当更改，以排除无法合理获得的测量值，或包括其他代表性区域的其他测量值。
在对退行性过程进行定量的情况下，荧光强度阈值被证明不是一个好的指标，因为横纹肌内部和之间有太多的差异。在量化易位的方法中，对所有18种测量的横纹肌进行平均， 将此方差平均化。然而，由于在退化评估中对每个横纹肌的单独评估，荧光强度的方差不能被平均化。此外，强度只是需要考虑的特征之一。其他重要方面是对比度和边缘的锐度。因此，该方案提出了一种基于根据肉眼荧光对横纹肌形态进行分类的定量方法。这在某种程度上必然是主观的。然而，鉴于足够的经验，该协议已被证明是一种有用，快速且可重复的变性定量方法（图14），并且已经多次发表22，10。与所有主观评估一样，始终建议在盲目的背景下进行。来自其他组的实验方案通常仅使用两个类别来量化 果蝇 的视网膜变性（是否存在横纹肌），这可能不那么主观，但也不太精确。此外，这种量化方式仍然存在定义两个类别之间的分界点的问题，这可能同样难以客观地定义。
关于这里介绍的方法的修饰和高级应用，还可以通过双色成像同时评估两种荧光融合蛋白的相对量。例如，通过使用TRPL：：HcRed和TRP：：eGFP，TRPL：：HcRed易位已经评估了同一只苍蝇中横纹母的完整性23。双色成像也用于番茄/ GFP-FLP / FRT方法，例如，识别诱导细胞凋亡的因素24。这种变异使得 可以通过 ninaC：：eGFP在由ninaC：：tdTomato标记的荧光标记细胞克隆中可视化光感受器细胞的变性。水浸显微镜的另一个应用是监测光感受器中磷酸肌醇的周转。为此，使用荧光标记的磷酸肌醇结合结构域，例如来自PLCδ1的pleckstrin同源性（PH）结构域。这些荧光探针允许通过检测由探针从横纹肌到细胞质基质25，26的扩散引起的横纹体荧光的降低来跟踪磷酸肌醇随时间的降解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢多年来我们的学生研究人员。特别是Nina Meyer，Sibylle Mayer，Juliane Kaim和Laura Jaggy，他们的数据已在该协议中用作代表性结果。我们小组在这里介绍的研究是由德国法院（Hu 839/2-4，Hu 839/7-1）向Armin Huber提供的赠款资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
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