Summary
여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.
Abstract
막 단백질 밀매는 원형질막으로의 수용체 및 이온 채널의 혼입 및 제거를 조절한다. 이 과정은 뉴런의 세포 기능과 세포 완전성에 근본적으로 중요합니다. 초파리 광수용체 세포는 막 단백질 밀매를 연구하기 위한 모델이 되었다. 조명시 광수용체 막으로부터 내재화되고 분해되는 로돕신 외에, 초파리 의 일시적인 수용체 전위 유사 (TRPL) 이온 채널은 횡문근 광수용체 막 (어둠 속에 위치하는 곳)과 광수용체 세포체 (조명시 운반되는) 사이의 광 의존적 전좌를 나타낸다. TRPL의 이러한 세포내 수송은 광수용체 세포에서 eGFP 태깅된 TRPL을 발현시킴으로써 간단하고 비침습적인 방식으로 연구될 수 있다. eGFP 형광은 깊은 의사 동공에서 또는 물 침지 현미경에 의해 관찰 될 수 있습니다. 이러한 방법은 온전한 눈에서 형광의 검출을 허용하므로 TRPL 전좌에 결함 이있는 초파리 돌연변이체에 대한 고처리량 분석 및 유전자 스크리닝에 유용합니다. 여기에서, 파리의 제조, 현미경적 기술, 뿐만 아니라 TRPL의 광-촉발 전좌를 연구하기 위해 사용되는 정량화 방법이 상세히 설명된다. 이들 방법은 다른 초파리 광수용체 단백질, 예를 들어 로돕신에 대한 밀매 연구에도 적용될 수 있다. 또한, eGFP 태깅된 횡문근 단백질을 사용하여, 이들 방법은 광수용체 세포의 변성을 평가하는데 사용될 수 있다.
Introduction
원형질막으로 단백질을 전달하고 제거함으로써, 뉴런의 막 단백질 밀매는 이온 채널뿐만 아니라 수용체로 원형질막 장비를 제어하고, 결과적으로 신경 기능을 조절합니다. 단백질 밀매의 잘못된 조절 또는 결함은 일반적으로 세포에 해로운 영향을 미치고 신경 세포 변성을 초래합니다. 인간에서, 이것은 알츠하이머 및 파킨슨 병 또는 망막염 색소 침착증 1과 같은 신경 퇴행성 질환을 일으킬 수 있습니다. Drosophila melanogaster의 복합 눈에있는 광수용체는 막 단백질 밀매2를 연구하기위한 생체 내 모델 시스템이되었습니다. 이것은 효과적인 유전자 스크리닝을 허용하는 초파리의 유전 적 다양성 때문 일뿐만 아니라 광흡수 광수용체 막의 모든 필수 구성 요소가 매우 상세하고 효율적인 현미경 기술을 사용하여 플라이 아이에 적용 할 수 있기 때문입니다. 이러한 기술은 이 문서의 초점입니다.
초파리 광수용체 세포에서, 정점 원형질막은 횡문근이라고 불리는 세포의 한쪽을 따라 미세 융모의 조밀하게 포장 된 스택을 형성합니다. 광수용체 세포 R1-6의 횡문근은 특징적인 사다리꼴 패턴으로 배열되어 있으며, 광수용체 세포 R7 및 R8은 이 사다리꼴3의 중앙에 단일 횡문근을 형성한다. 막 단백질 트래피킹은 횡문관에서 이러한 광전달 단백질의 적절한 양을 보장하기 위해 로돕신 및 광활성화된 TRP(transient receptor potential) 및 TRPL(TRP-like) 이온 채널과 같은 횡문막 막 단백질의 조절된 턴오버를 위해 필요하다. 광수용체 막 단백질은 소포체에서 합성되고 골지 장치를 통해 횡문근으로 운반된다. 빛에 의한 로돕신의 활성화 후, 로돕신 분자는 두 번째 광자의 흡수에 의해 불활성화되거나 클라트린 매개 엔도사이토시스에 의해 횡문근으로부터 제거될 수 있다. 엔도사이토시스화된 로돕신은 리소좀에서 분해되거나 횡문근 4,5로 다시 재순환된다. 이온 채널 TRPL은 또한 광전달 캐스케이드의 활성화에 따라 내재화되고 횡문관 (파리가 어둠 속에 보관 될 때 위치하는 곳)과 세포 몸체의 ER 농축 저장 구획 (조명시 몇 시간 이내에 운반되는 곳) 사이의 광 의존적 전좌를 겪습니다.6,7,8,9,10 . 엔도사이토시드된 로돕신과는 달리, 단지 소량의 TRPL만이 엔도리소좀 경로를 통해 분해되고, 대부분은 대신 세포내 저장되고 어두운 적응 시 횡문근으로 다시 재순환된다6. 따라서 TRPL은 원형질막 단백질의 광촉발 밀매를 분석하는데 사용될 수 있다. 초파리 광수용체 세포는 또한 신경 변성을 연구하기 위해 사용된다. 광수용체 세포 변성은 퇴행성 과정5의 결과로 분해되는 횡문근의 구조를 평가함으로써 자주 결정된다.
광수용체 세포에서 TRPL 및 로돕신의 세포내 국재화 또는 광수용체 세포 변성을 연구하기 위해, 분석 속도 및 분해능에 관하여 상이한 두 개의 형광 현미경 방법이 여기에 적용되었다. 유전자 스크리닝에 사용할 수 있지만 제한된 공간 분해능을 가진 매우 빠르고 비 침습적 인 방법은 심부 의사 동공 (DPP)에서 형광을 검출하는 것입니다. DPP는 절지 동물 복합 눈의 광학 현상으로, 1971 년 Franceschini와 Kirschfeld에 의해 기하학적 기원이 자세히 설명되었습니다11. 요컨대, 망막 오버레이 아래의 여러 광학 평면에서 인접한 옴마티디아로부터의 횡문근의 이미지가 관찰 될 수 있습니다. 눈의 곡률의 중심을 통과하는 초점 평면에서,이 중첩 된 투영은 단일 옴마티듐에서 횡문근의 사다리꼴 레이아웃과 유사한 이미지를 형성합니다. 이러한 현상은 형광 단백질의 외인성 발현(예를 들어 TRPL::eGFP8)과 독립적으로 관찰될 수 있으며, 그럼에도 불구하고 DPP를 검출하기 쉽게 만든다(도 1A-A'')12. 두 번째 비침습적 방법은 눈의 이관형 장치를 물로 광학적으로 중화시킨 후 형광으로 태그된 단백질을 영상화하는 데 의존하는 침지 현미경 검사입니다(도 1B-C'')12. 수침 방법을 사용하여, 횡문근 또는 세포체에서 TRPL::eGFP의 상대적인 양은 개별 광수용체 세포에 대해 정량적으로 평가될 수 있다. 더욱이, 비-전좌 형광-태깅된 단백질은 횡문근 완전성을 평가하고 여기에 기술된 바와 같이 정량적 방식으로 잠재적인 변성의 시간 경과를 결정하기 위해 이용될 수 있다.
DPP의 기록은 이러한 방법 중 가장 쉽고 빠르게 수행 할 수 있지만 생성 된 데이터의 공간 해상도는 제한적입니다. 또한 DPP가 부재 할 수있는 데는 여러 가지 이유가 있으며, 이는 DPP 이미징 자체만으로 식별 할 수있는 것은 아닙니다. DPP는 여러 옴마티디아의 합산을 나타내기 때문에 개별 세포에 대한 정보가 손실됩니다. 따라서 저해상도 DPP 이미징은 많은 수의 파리를 선별하는 데 중요한 기능을 수행하지만 일반적으로 침수 현미경을 통해 더 높은 해상도의 기록이 뒤따라야합니다. 물 침지 현미경 사진은 개별 세포, 발달 결함, 눈 형태학, 단백질 잘못 국소화 또는 망막 변성에 대한 해석뿐만 아니라 이러한 효과의 정량화를 허용합니다. 이 프로토콜은 이 두 가지 기술을 자세히 설명합니다.
그림 1: 이 프로토콜에 제시된 초파리 눈의 현미경 검사 변형에 대한 개요. (A-A'') 형광 심부 유사동공 (DPP) 영상화, (B-B'') 형광 횡문근막의 치명적인 물 침지 현미경 검사, 및 (C-C''') 형광 횡문근막의 비치명적인 물방울 현미경의 개략적인 표현 및 예시적인 현미경 사진. 스케일 바 (A''): 100 μm. 스케일 바 (B''-C''): 10 μm. 도면은 참조13에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 일반적인 고려 사항
- 형태학적 분석을 위해 영구적으로 횡문질적으로 위치된 형광 단백질을 발현하는 초파리 스톡(예: TRP::eGFP, eGFP::NINAC)과 단백질 밀매에 관한 분석을 위해 단백질 전좌(예: TRPL::eGFP, Arr2::eGFP)를 사용합니다.
- 실험 접근법을 위해 선택된 파리의 광 노출 조건을 미리 결정하십시오.
- 어두운 적응을 위해 파리를 25 °C에서 원하는 기간 동안 어두운 상자에 보관하십시오. 전좌 실험에서 최대 16 시간의 조명 (예 : TRPL : : 파리를 발현하는 eGFP)의 경우 파리를 실온에서 형광 튜브 아래에 보관하십시오.
- 광수용체 변성을 평가하는 실험(예를 들어, TRP::eGFP 발현 파리)에서, 파리를 형광 튜브 하에 25°C에서 12시간 광/12시간 어두운 주기로 유지하여 백색광으로 최대 28일의 장기 조명을 실시한다.
- 색깔이있는 빛으로 파리를 비추려면 형광 튜브와 함께 다른 색의 투명한 플라스틱 상자를 사용하십시오.
- 색소 침착 된 눈을 가진 비행 스톡을 사용하는 경우, 눈 색소 침착이 나이에 따라 크게 증가 할 수 있기 때문에 비교 분석을 위해 정확하게 동물을 노화시킵니다.
참고: 데이터 해석의 경우, 횡문근 구조의 광 도파관 효과로 인해 신호 바이어스가 존재한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서, 횡문근으로부터의 형광 신호는 세포체로부터 수득된 신호에 대하여 DPP 이미징 및 수침 현미경에서 항상 어느 정도 증폭될 것이다. 이것은 색소 침착 된 눈에서 가장 두드러지게 관찰되며, 횡문근 외부로부터의 형광이 이들 안료에 의해 흡수되며 세포 내 전좌 융합 단백질이 검출 될 때 특히 중요합니다. 따라서 중요한 단계와 관련하여이 연구는 흰 눈과 붉은 눈의 파리를 별도로 고려합니다. - 침수 현미경과 관련하여 두 가지 변형이 설명되어 있습니다. 더 빠른 치명적인 변이와 치명적이지 않은 변이가 후속 연구를 위해 회복을 가능하게합니다.
2. DPP 이미징
- 그림 2와 같이 필요한 장비 및 시약으로 작업 공간을 준비합니다. 플라이패드 상에서CO2를 갖는 광수용체 세포에서 형광 단백질을 발현하는 유전자형의 파리(1-3일령)를 마취한다. 기존의 광원과 낮은 배율(예: 10x)으로 스테레오 현미경으로 이미징할 동물을 선택합니다.
그림 2: DPP 이미징 작업 영역. 필요한 재료는 (A)CO2 마취 장치, (B) UV 램프 및 형광 필터 세트가있는 스테레오 현미경, (C) 광원, (D) (E) 소프트웨어가있는 현미경 장착 카메라, (F) 페인트 브러시, (G) 검은 판지 및 (H) 플라이 바이알입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- DPP 이미징의 경우, 선택된 파리를 마취 상태로 유지하고 그 중 하나를 현미경 목표물의 중앙에 배치하여 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 목표를 방사상으로 정확하게 향하게하십시오 (그림 3A).
참고: 광수용체 세포의 옴마티드 레이아웃은 등쪽 복부 중간선에서 거울 대칭을 표시하기 때문에 DPP는 눈의 적도 위 또는 아래에서 약간 관찰되는 것이 가장 좋습니다(그림 3B).
그림 3: DPP 이미징을 위한 입체현미경 아래 파리의 위치. (A) 한쪽 눈이 현미경 대물을 방사상으로 향하고 있는 옆구리의 파리의 그림. (B) 비행 헤드는 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 목표물이 눈의 적도보다 약간 위 또는 아래에있는 지점에 초점을 맞추도록 약간 위 또는 아래로 돌릴 필요가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 전체 눈 (예를 들어, 100x)에 맞도록 배율을 증가시키고 눈의 중앙 옴마티디아를 중심으로합니다. 예를 들어, 이중 아이리스 다이어프램을 얕은 설정으로 조정하여 현미경의 피사계 심도를 줄입니다 (그림 4A-B').
- 기존 광원을 끄고 최대 강도로 현미경 UV 램프를 켜고 눈에서 발현되는 형광 단백질에 따라 현미경의 형광 필터 세트를 선택합니다 (그림 4C-E). 현미경 장착 카메라를 향한 조명 경로를 설정합니다.
- 소프트웨어 내의 라이브 이미징 기능을 사용하여 노출 시간과 이득 값(예: 각각 80ms 및 12x)을 조정하여 눈에서 특정 신호만 감지하는 설정으로 이미지의 밝기를 조정합니다. 현미경 초점을 눈(각막 아래)에 "맞은" 상태로 다시 조정하여 DPP의 중첩된 이미지를 생성합니다(그림 4C-E').
그림 4: DPP 및 형광 DPP 이미징의 그림. GFP 필터 세트를 사용한 통상적인 UV 조명 하에서의 초파리 눈의 예시적인 이미지는, 눈을 통해 개략적인 단면에 예시된 다양한 초점면으로 촬영된다. (A) (A')에 예시된 바와 같이 종래의 광원의 밝은 설정, 30ms 노출 시간, 1x 게인, 피사계 심도 및 각막의 표면 근처의 초점면으로 기록된 현미경 사진. (b) (B')에 예시된 바와 같이 종래의 광원의 밝은 설정, 30ms 노출 시간, 1x 게인, 얕은 피사계 심도, 및 각막의 표면 아래 대략 180 μm 아래의 초점면으로 기록된 현미경 사진. DPP가 지적했다. (C-E) UV 광원 및 GFP 필터 세트의 고강도 설정, 80ms 노출 시간, 12x 게인, 얕은 피사계 심도, 및 각막 표면 아래 (C') 근처, (D') 약간 아래, 또는 (E') 약 180 μm 아래의 초점면으로 기록된 현미경 사진. 형광 DPP는 곡선 화살표로 표시된다. 스케일 바 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 형광 DPP의 스냅 샷을 찍습니다. 현미경을 다시 가시광선으로 전환하고 빛 경로를 다시 안구로 전환합니다. 영상화된 동물을 그의 DPP 표현형(예를 들어, 십자가)에 따라 추가의 진행을 위해 플라이 바이알에서 회수한다. 2.2단계에서 다음 동물로 계속하십시오.
3. 물 침수 현미경 검사
- 비행 준비
- 그림 5와 같이 필요한 장비 및 시약으로 작업 공간을 준비합니다. 미리 결정된 나이 및 조명 조건으로 파리를 미리 냉각된 15 mL 원심분리 튜브에 옮기고 이를 얼음 상에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션하여 마취시킨다.
참고 : 1 일령의 어두운 적응 파리를 참고로 휴대하십시오. 일반적으로 어둠에 적응 된 파리는 어둠 속에서 뚜껑이있는 아이스 박스로 옮겨야합니다. 빛에 적응 된 파리는 실내 조명의 얼음으로 옮겨 질 수 있습니다.
- 그림 5와 같이 필요한 장비 및 시약으로 작업 공간을 준비합니다. 미리 결정된 나이 및 조명 조건으로 파리를 미리 냉각된 15 mL 원심분리 튜브에 옮기고 이를 얼음 상에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션하여 마취시킨다.
그림 5: 침수 현미경 작업 공간. 필요한 재료는 (A) 15 mL 원심 분리 튜브, (B) 얼음 플레이크, (C) 차가운 증류수, (D) 입체 현미경, (E) 페트리 접시, (F) plasticine, (G) 물체 슬라이드, (H) 곤충 핀 또는 피펫 팁과 메스, (I) (J) 소프트웨어를 사용한 형광 현미경입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 아래에 설명 된 두 가지 (3.1.3 치사 변이 또는 3.1.7 비 치사 변이) 중에서 적절한 제제를 선택하고 색소 침착 된 눈과 비 색소 눈 사이의 분화가 이루어질 때마다 각 단계를 따르십시오.
- 다음과 같이 치명적인 변이에 대한 파리를 준비하십시오.
- 플라스틱 조각을 물체 슬라이드에 붙이고 다른 조각을 페트리 접시 (예 : 94mm Ø)의 중앙에 부착하고 지금은 분리하십시오. 페트리 접시에 얼음처럼 식힌 증류수와 얼음 플레이크를 채운다(그림 6A).
- 얼음 마취 된 플라이 하나를 입체 현미경 아래에 올려 놓고 plasticine이 코팅 된 물체 슬라이드 위에 놓습니다. 파리를 등에 대고 흉부 중앙을 통해 곤충 핀을 관통합니다 (그림 6B). plasticine 코팅 물체 슬라이드에 핀을 수평으로 고정하고 플라이의 왼쪽 또는 오른쪽 눈을 위쪽으로 향하게 합니다(그림 6C).
- 플라스의 회전을 막는 페트리 접시에 플라스틱 프리 사이드가 아래쪽을 향하도록 오브젝트 슬라이드를 조심스럽게 고정하십시오. 플라이 아이(fly eye)가 물로 덮여 있는지 확인합니다(그림 6D). 준비 바늘을 사용하여 눈 주위에 형성되었을 수있는 기포를 조심스럽게 제거하고 최상의 결과를 얻기 위해 즉시 이미지 수집을 진행하십시오.
참고: 이미지 획득이 크게 지연되면 다시 깨어나고 파리의 움직임이 생겨 흐릿한 이미지가 생길 수 있습니다.
도 6: 치명적인 물 침지 현미경을 위한 준비. (A) plasticine 코팅된 물체 슬라이드 및 페트리 접시, (B) plasticine 지면에 흉부를 통해 파리를 고정하는 그림, (C) plasticine-coated object slide 상의 비행 배향, 및 (D) 최종 실험 설정의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 다음과 같이 치명적이지 않은 변이에 대한 파리를 준비하십시오.
- 얼음 마취 된 플라이 헤드 퍼스트 하나를 200 μL 피펫 팁으로 옮기고 압축 공기로 플라이를 팁 쪽으로 조심스럽게 밀어 넣으십시오.
- 메스를 사용하여 머리 바로 앞의 피펫 팁을 잘라냅니다. 핀셋을 사용하여 조심스럽게 파리를 팁에서 몇 밀리미터 떨어진 곳으로 밀어 넣으십시오. 피펫 팁을 다시 차단하고 플라이를 압축 공기로 팁 쪽으로 다시 밀어 피펫 팁에서 플라이의 헤드만 돌출되도록 합니다.
- 플라스틱 조각을 물체 슬라이드에 부착하고 피펫 팁을 눌러 플라이의 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 위쪽을 향하도록 합니다(그림 7A). 이미지 수집 직전에 실험실 피펫을 사용하여 큰 양의 차가운 물을 물 침수 목표의 아래쪽에 부착하십시오(그림 7B). 최상의 결과를 위해 즉시 이미지 수집을 진행하십시오.
참고: 이미지 획득이 크게 지연되면 다시 깨어나고 파리의 움직임이 생겨 흐릿한 이미지가 생길 수 있습니다.
도 7: 치명적이지 않은 물방울 현미경을 위한 제조. (A) plasticine 코팅 대상 슬라이드에 장착된 200 μL 피펫 팁 내부에 고정된 냉마취 플라이 및 (B) 수침 목적의 밑면에 냉수 방울을 도포하는 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이미지 수집
- 준비된 플라이와 함께 페트리 접시(단계 3.1.3) 또는 물체 슬라이드(단계 3.1.7)를 현미경 단계 상에 조심스럽게 놓고 침지 목표를 선택한다.
- 물 표면에 닿거나(단계 3.1.3) 파리의 눈이 방울에 닿을 때까지(단계 3.1.7) 수침 목표를 수동으로 내립니다(그림 8A,B).
- 현미경 UV 램프를 켜고 적절한 필터 세트를 선택하십시오. 아이피스를 사용하여 물체를 목표 아래에 놓고 현미경을 눈 표면에 집중시킵니다.
- 조명 경로를 현미경 카메라로 전환하고 해당 소프트웨어에서 라이브 이미지를 생성합니다. 카메라의 초점을 재조정하고 눈의 방향을 평가하며, 도 8C-E에 더 자세히 도시된 바와 같이 눈이 현미경 대물을 방사상으로 향해야 한다는 점을 고려한다.
도 8: 물 침지 영상화를 위한 형광 현미경 하에서의 파리의 위치. (A) 치사 또는 (B) 비치사파리 준비 프로토콜을 이용한 영상 획득을 위한 설정 및 최종 배향. (C) 수침 현미경 이미지의 최상의 결과를 얻기 위한 비행 방향의 그림. 눈에 초점을 맞추는 이상적인 지점은 전방 / 후부 및 등쪽 / 복부 축에 대한 정확한 중심이 아니지만 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 눈의 적도 위에 약간 있습니다. (d) 완벽하게 배치된 눈을 위한 수침 영상의 예. 육각형 오마티디얼 타일링의 세 대칭 축은 모두 직선으로 나타나며 옴마티디아의 최대 양은 동시에 초점을 맞출 수 있습니다. (e) 부적절하게 위치된 눈의 침지 이미지의 예. 이미지에는 곡선 축과 얕은 피사계 심도가 포함되어 있습니다. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이미징 소프트웨어 내에서 적절한 LUT(룩업 테이블)를 사용하여 과포화(빨간색 픽셀로 표시됨)를 감지합니다.
- 색소가 묻지 않은 파리의 경우 가장 밝은 픽셀이 모든 이미지의 채도 한계보다 약간 낮도록 노출 시간을 조정합니다.
- 색소 침착 된 파리와 치명적인 변형의 경우, 노출 시간을 조정하여 적어도 다섯 개의 개별 1 일 된 어두운 적응 파리에서 가장 밝은 픽셀이 채도 한계보다 약간 낮도록하십시오. 계산된 평균 노출 시간을 다른 모든 실험 조건(유전자형, 조명 조건, 시점 등)에 적용합니다.
- 색소 침착 파리(예를 들어, 적목 현상) 및 치명적이지 않은 변형의 경우, 가장 밝은 모든 픽셀이 개별적으로 1일 된 어두운 적응 파리에 대한 포화 한계 바로 아래에 있도록 노출 시간을 조정한다. 이 노출 시간을이 파리의 다른 모든 실험 조건 (조명 조건, 시간 지점 등)에 적용하십시오.
- 이미지를 기록하고 원시 파일로 저장하여 녹화의 모든 해당 메타데이터를 보관합니다. 다음 정량화를 위해 이미지를 .tif 형식으로 내보냅니다.
참고: 치명적이지 않은 변형의 경우, 추가 실험에 사용되도록 의도된 경우 이미지 획득 직후에 적색광(예: 630nm)으로 파리를 5분 동안 비추십시오. 적색광은 이미지 획득 중에 강렬한 단파장 빛에 의해 과도하게 활성화된 광전달 캐스케이드를 비활성화합니다.
- 데이터 분석 및 물 침지 현미경 사진의 횡문관에서 상대적 eGFP 형광의 정량화
- 다운로드, 설치 및 소프트웨어 ImageJ / 피지를 실행합니다.
- 분석 > 측정 설정을 클릭하여 ImageJ 설정을 조정하십시오 ... 평균 회색 값에 대한 상자 만 선택하십시오. 파일 .tif 열기를 클릭하여 > 이미지 가져 오기 ... 또는 드래그 앤 드롭으로. 초점이 맞춰진 이미지의 대표 영역을 선택하고 Ctrl 및 + 를 반복해서 눌러 200 % -300 %로 확대하십시오.
- 타원형 도구를 선택하고 Shift 키를 누른 상태에서 하나의 형광 횡문근보다 훨씬 작은 원형 선택 항목을 이미지에 생성합니다. 마우스 단추를 놓기 전에 ImageJ 주 창의 도구 모음 아래에 표시된 정확한 크기를 찾습니다. 모든 분석에 대해 동일한 크기의 원형 선택을 사용합니다.
참고: 픽셀 또는 미크론 단위의 원형 선택 영역의 정확한 크기는 특정 설정에 따라 다릅니다. 1 일 된 횡문근 직경의 약 1/3 또는 1/4의 원을 사용하여 1 일 된 어두운 적응 제어 파리를 사용하십시오. - 원형 선택 영역을 마우스 단위로 클릭하고 드래그하거나 키보드의 화살표 키를 눌러 이동합니다.
- 원형 선택 내의 형광 강도를 측정하려면 원을 첫 번째 횡문근 (r1)으로 이동하고 분석 > 측정 을 클릭하거나 바로 가기 Ctrl + M을 사용하십시오. 측정된 회색 값을 나열하는 결과 창이 나타납니다.
- 반복 측정 및 배경 신호 (b)의 측정으로 r2-r6의 측정을 계속하십시오. 색소가 묻지 않은 파리의 경우 해당 세포체 영역(c1-c6)을 추가로 측정합니다(그림 9).
도 9: 전좌 연구를 위한 상대적 횡문근 형광의 정량화. 하나의 수침 현미경 이미지에서 세 개의 서로 다른 대표적인 옴마티디아(흰색 원)의 횡문근(r), 세포체(c) 및 배경(b)의 형광 강도를 측정함으로써 횡문근에서의 상대적 eGFP 형광의 정량화에 관한 그림; 스케일 바: 10 μm. 확대 된 ommatidium이 오른쪽에 표시됩니다. 스케일 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 두 번 더 옴마티디아에 대해 3.3.5단계와 3.3.6단계를 반복하면 세 번의 기술적 반복실험이 발생합니다. 연필 도구를 사용하여 분석된 옴마티디아를 표시하고 문서화를 위해 이 이미지를 저장합니다.
- 결과 창에서 측정된 회색 값을 선택하여 복사한 다음 추가 계산을 위해 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다. 그들의 기원에 따라 형광 강도의 값을 횡문근 (r), 세포체 (c) 및 배경 (b)의 범주로 정렬한다. 각 범주의 평균 강도를 계산합니다 (I r, Ic, Ib).
- 횡문근(R)에 존재하는 eGFP의 상대적 양을 계산하고, 비색소에 대해서는 다음 화학식 1을, 색소침착된 눈에는 화학식 2를 사용한다.
(1)
(2) - 3.3.3단계의 다음 이미지를 계속 진행합니다. 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 각 실험 그룹의 적어도 다섯 명의 개인의 이미지를 생물학적 복제물로 사용하는 것이 좋습니다.
(1)
(2)- 수침 현미경 사진에서 eGFP 형광에 의한 눈 형태학의 데이터 분석 및 정량화
- ImageJ / Fiji 소프트웨어를 다운로드, 설치 및 실행하십시오. 파일 .tif 열기... 를 클릭하거나 드래그 앤 드롭하여 > 이미지를 가져옵니다. 초점이 맞춰진 이미지의 대표 영역에서 인접한 세 개의 ommatidia를 선택합니다.
- 주변 배경 신호에 대하여 eGFP 강도, 가장자리 선명도 및 대비에 따라 선택의 18개의 횡문근을 개별적으로 평가하여 퇴행 지수를 생성합니다. 값이 2인 뚜렷하게 보이는 횡문문, 값이 1인 약하게 보이는 횡문문, 0의 값을 가진 횡문근이 없는 경우 점수를 매깁니다(그림 10).
참고: 이러한 정량화 방법은 완전히 손상되지 않은 눈의 경우 36점, 완전히 퇴화된 눈의 경우 0점을 획득합니다. 퇴행성 지수에서 36 ~ 100 %의 점수를 설정하는 것이 좋습니다.
그림 10: 퇴행 연구를 위한 횡문근 평가를 통한 정량화. 하나의 수침 현미경 이미지에서 세 가지 다른 대표 옴마티디아 (흰색 원)의 횡문근을 2 (명확하게 보이는; 파란색 원), 1 (약하게 보이는; 주황색 원) 또는 0 (부재; 빨간색 원)의 값으로 채점하여 눈 형태의 정량화에 관한 그림. 스케일 바: 10 μm. 확대 된 ommatidium이 오른쪽에 표시됩니다. 스케일 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 다음 이미지를 열고 3.4.2단계를 계속합니다. 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 각 실험 그룹의 적어도 여덟 명의 개인의 이미지를 생물학적 복제물로 사용하는 것이 좋습니다.
참고: 이 정량화 방법은 형광 강도에 의한 전좌를 정량화하는 방법보다 객관적이지 않기 때문에 권장되는 반복실험 횟수가 더 높습니다.
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Representative Results
TRPL::eGFP 융합 단백질을 발현하는 형질전환 초파리 파리는 로돕신 1 프로모터의 제어 하에 생성되었다. 이 파리에서, TRPL::eGFP는 화합물 눈의 광수용체 세포 R1-6에서 발현되고 조명 의존적 국소화를 표시한다. 파리가 어둠 속에 보관되면 TRPL::eGFP가 외부 횡문근에 통합됩니다. 몇 시간 동안 조명을 한 후, TRPL은 세포체로 전좌되어 ER이 풍부한 구획에 저장됩니다. 8,10 TRPL::eGFP가 횡문근에 위치할 때, DPP에서 그 형광을 관찰할 수 있다. 그러나, 횡문근 형광은 TRPL::eGFP의 전좌의 결과로 빛에서 사라진다(도 11A,B). 이것은 TRPL::eGFP의 내재화에 결함이 있는 돌연변이체에 대한 유전자 스크리닝을 수행하는데 사용되어 왔다(도 11C,D)14,15. 잠재적으로 동형접합성 치명적인 돌연변이의 단리를 허용하기 위해, 이 스크린은 발달하는 안구 조직(즉, 모자이크 눈)에서 체세포 클론의 생성을 위해 효모 Flp/FRT 시스템을 사용하여 수행되었다. DPP 분석의 단순성 외에도,이 형광 검출 방법의 다른 큰 장점은 높은 처리량뿐만 아니라 살아있는 파리의 돌연변이를 확인하고 안정적인 돌연변이 파리 주식의 생성을 위해이 파리를 사용할 수있는 비 침습적 특성입니다.
도 11: TRPL 전좌 결함에 대한 유전자 스크린으로부터의 대표적인 결과. 수컷 파리는 에틸 메탄설포네이트 (EMS)로 돌연변이를 일으키고 광수용체 세포 R1-6에서 TRPL::eGFP를 발현하는 암컷에게 교차시켰다. 동형접합성 돌연변이 Flp/FRT 유도 모자이크 눈을 가진 결과적인 F1 세대는 어두운 적응 기간 (왼쪽 열) 및 빛 적응 (오른쪽 열) 후에 형광 깊은 의사 동공 (DPP)을 이미징하여 TRPL 전좌의 결함을 스크리닝했습니다. (A, B) 돌연변이되지 않은 파리는 규칙적인 광유도 TRPL 전좌를 위한 대조군으로서 함께 운반되었다. 비형광 DPP는 화살표로 표시된다. (C,D) 광-촉발 TRPL 전좌에 결함이 있는 단리된 돌연변이체의 예시적인 결과. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 유전적 스크린으로부터 단리된 TRPL 전좌 결함(ttd) 돌연변이체는 나중에 확인되었고, 이들의 결함은 수침 영상화의 도움으로 더욱 상세하게 특징지어졌다. 물 침지 현미경은 횡문근 및 세포체에서 단백질의 국소화를 평가하거나 프로토콜에 요약된 바와 같이 광수용체 변성으로 인한 횡문근 구조의 결함을 정량적으로 추적하기 위해 적용되었다. 도 12A,B는 어둠 속에서, 빛에서, 그리고 두 번째 어두운 적응 후에 돌연변이가 없는 및 롤라ttd12 돌연변이 모자이크 눈을 가진 파리의 횡문관에 존재하는 TRPL::eGFP의 양을 정량화하는 것을 도시한다. 대조군 (돌연변이가 아닌) 파리에서, TRPL::eGFP는 16시간의 조명 후에 횡문근에서 세포체로 전좌되어 횡문근 TRPL::eGFP가 어두운 적응 상태에 비해 약 45%로 감소한다. 두 번째 어두운 인큐베이션은 횡문근 형광을 다시 초기 값의 95%로 올립니다. 롤라ttd12 돌연변이체를 그의 TRPL 전좌 결함으로 인해 DPP 스크리닝에 의해 단리하였다. 따라서, 횡문근의 수침 이미지에서의 TRPL::eGFP 형광 패턴은 16시간의 조명 및 24시간 동안의 후속 암흑 적응 후에 급격하게 변화하지 않는 것으로 보인다. 그러나, 이미지는 또한 롤라 ttd12 돌연변이체가 발달적으로 결함이 있음을 밝혀내며, 이는 다른 롤라 돌연변이체(16)에 대해 이전에 기술된 바와 같이 광수용체 세포의 가끔 부재에 의해 입증된다. 이러한 형태학적 결함은 유효한 배경 신호를 측정할 수 없게 하여, 수식 (1)을 사용하여 정확한 정량화를 방해한다. 대조적으로, vps35MH20은 이러한 방식으로 형질모폴로지에 영향을 주지 않으면서 TRPL 전좌 결함을 표시하는 돌연변이체이다(10). 이 돌연변이체에서, 여기에 설명된 정량화 방법은 통계적으로 매우 유의한 재활용 결함을 검출할 수 있다(도 12C, D).
도 12: 롤라 및 vps35 돌연변이 파리에서 TRPL 전좌 결함의 대표적인 결과 및 정량화 방법의 한계. (A) TRPL::eGFP 발현 비돌연변이체 및 롤라ttd12 돌연변이체 모자이크-아이드 파리를 3일 동안 어둠 속에서 인큐베이션하고, 16시간 동안 오렌지 빛으로 조명하고, 암-적응시킨 후 24시간 동안 두 번째로 적응시켰다. 형광 횡문근의 이미지는 단계 3.2.6에 기재된 바와 같이 세포 내 TRPL::eGFP 국소화를 기록하기 위해 수침 현미경을 통해 촬영되었다. (b) 화학식 1을 사용하여 단계 3.3.9에 기재된 바와 같이 비돌연변이체(회색) 및 롤라ttd12 돌연변이체(녹색) 동물의 횡문근 형광을 정량화한다. 에러 바는 SEM을 나타낸다. (C) TRPL::eGFP-발현 비돌연변이체 및 vps35MH20 돌연변이체 모자이크-아이드 파리를 3일 동안 어둠 속에서 인큐베이션하고, 16 h 동안 오렌지 빛으로 조명하고, 암-적응 24 h 동안 두번째로 적응시켰다. 형광 횡문근의 이미지는 단계 3.2.6에 기재된 바와 같이 세포 내 TRPL::eGFP 국소화를 기록하기 위해 수침 현미경을 통해 촬영되었다. (d) 화학식 1을 사용하여 단계 3.3.9에 기재된 바와 같은 비돌연변이체(회색) 및 vps35MH20 돌연변이체(적색) 동물의 횡문근 형광의 정량화. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 ANOVA 후 본페로니 보정과의 다중 비교로서 계산되었다 (ns, 유의하지 않음; *, p ≤ 0.05; ***, p ≤ 0.001). 스케일 바: 10 μm. 패널 C 및 D는 기준10으로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프로토콜에서 이미 언급했듯이, 눈 색소 침착은 결과 침수 이미지에 상당한 영향을 미칩니다. 흰 눈동자 파리는 횡문근과 세포체 모두에서 형광 신호를 검출 할 수 있으므로 TRPL : : eGFP 분포 비율을 상당히 정확하게 결정할 수 있습니다. 대조적으로, 적목 파리에서 TRPL::eGFP 신호는 횡문근에서만 검출될 수 있지만 세포체에서는 검출되지 않는다(도 13A). 이것은 TRPL::eGFP에서 방출된 빛을 흡수하는 안료 분자 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 색소 침착 된 눈에 대해 식 (2)를 사용함으로써, 정량화는 적목 파리뿐만 아니라 흰 눈의 TRPL : : eGFP 전좌 행동을 멋지게 보여줍니다. 따라서, 횡문근 형광의 상응하는 값은 어두운 적응 상태에서 100%에서 조명 후 25% 및 5%로 감소하고, 두 번째 어두운 인큐베이션의 결과로서 다시 80% 및 90%로 증가한다(도 13B).
도 13: 백색 및 적목 파리에서 TRPL::eGFP 형광의 대표적인 결과. (A) TRPL::eGFP를 발현하는 백색 및 적목 파리는 1일 동안 어둠 속에서 배양되었고, 16시간 동안 주황색 빛으로 조명되었고, 24시간 동안 암흑-적응되었다. 형광 횡문근의 이미지는 단계 3.2.6 (흰 눈 파리) 및 3.2.8 (적목 파리)에 설명 된대로 세포 내 TRPL::eGFP 국소화를 기록하기 위해 치명적이지 않은 물방울 현미경을 통해 촬영되었습니다. (B) 흰 눈동자 (회색) 및 적목 (적색) 파리에서 횡문근 형광의 정량화. 흰 눈의 파리는 단계 3.3.9에 기재된 바와 같이 화학식 1 및 적목 파리를 사용하여 화학식 2를 사용하여 정량화하였다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 배율 표시줄: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
광수용체 변성을 평가하기 위해, 횡문근에서 TRP::eGFP의 형광에 기초한 변성 지수가 결정될 수 있다(프로토콜 참조). 이러한 정량화 방법은 도 10에 예시되어 있다. 여기의 대표적인 결과에서, 비돌연변이체 및 sdhAttd11 돌연변이체 모자이크-아이드 파리를 2주 동안 12 h 빛/12 h 암주기에 보관하였고, 수침 현미경을 사용하여 TRP::eGFP를 관찰함으로써 횡문근의 완전성을 2-4일마다 조사하였다(도 14A). 결과 곡선은 돌연변이체에서 변성 지수의 감소를 보여주지만 대조군 파리에서는 그렇지 않다(도 14B).
도 14: sdhA 돌연변이체 파리에서 광-유도된 망막 변성의 대표적인 결과 . (A) TRP::eGFP 발현 비돌연변이체 및 sdhAttd11 돌연변이체 모자이크-아이드 파리는 25°C에서 12시간 광/12시간 암주기에서 14일 동안 배양되었다. 형광 횡문근의 이미지는 망막 건강을 기록하기 위해 일정한 시간 간격으로 물 침지 현미경을 통해 촬영되었습니다. (b) 단계 3.4에 기재된 바와 같이 야생형(회색) 및 sdhAttd11 돌연변이체(오렌지) 파리의 횡문근 형광의 정량화. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 배율 표시줄: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
형광 단백질의 적용 가능성과 DPP 이미징 및 망막 침지 현미경에 의한 스크리닝의 단순성은 많은 그룹12에 의해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 여기에 제시된 것과 유사한 전략은 Rh1::eGFP17,18,19,20,21의 도움으로 로돕신 발현 수준, 항상성, 망막 조직 또는 세포 완전성의 결함을 검출하기 위해 여러 유전자 스크린에서 사용되었습니다. 위에서 설명한 바와 같이, TRPL::eGFP와 같은 융합 단백질을 트랜스로케이팅하는 것은 횡문관으로부터 그리고 횡문근으로의 단백질 트래피킹 과정이 예를 들어, 돌연변이유발 스크린에서 손상되는지를 검출하는데 사용될 수 있다. 한편, TRP::eGFP와 같은 영구적인 횡문근 융합 단백질은 횡문근 형태를 조사하는데 사용될 수 있다. DPP 및 수침 현미경 검사는 초파리 눈 모델 내에서 고처리량 분석 및 스크린을위한 훌륭한 방법으로 간주됩니다. 그러나 DPP 또는 수침 현미경으로 얻은 결과를 확증하기 위해 궁극적으로 분리 된 옴마티디아 또는 냉동 절편 망막 조직의 (면역학) 조직 화학적 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 고해상도 형광 현미경과 함께 이러한 기술은 정확한 세포 내 국소화에 대한 해석을 허용합니다. 다음에서는 정확한 정량 분석에 특히 중요한 DPP 및 망막 침수 현미경 검사의 이미징 프로세스 문제를 해결하는 방법에 대한 몇 가지 지침이 제공됩니다.
DPP와 관련하여 형광의 중첩이 흐릿하거나 뚜렷하지 않으면 설정이 올바르지 않을 수 있습니다. 한 가지 가능성은 눈이 목표를 정확하게 방사상으로 향하지 않거나 초점이 눈의 주변 영역으로 설정된다는 것입니다. 광수용체 세포의 옴마티드 레이아웃은 등복부 중간선에서 거울 대칭을 표시하기 때문에, 신호가 눈의 양쪽 반구에서 검출되면 DPP에서 비정상적인 패턴이 보일 수 있다. DPP의 품질은 또한 복합 눈을 통해 광학 섹션을 생성하기 위해 얕은 피사계 심도에 크게 의존합니다. 플라이패드의 표면이 자형광을 표시하는 경우, 플라이패드는 플라이패드의 상부에 있는 검은색 비형광 판지의 작은 조각 상에 놓일 수 있다. DPP를 기록할 수 없는 것은 차선책의 파리 위치, 형광 단백질의 낮은 발현 수준, 무질서한 망막 구조, 또는 퇴행성 과정을 포함하는 다양한 근본적인 원인과 연결될 수 있다. DPP를 이미징 할 때, 흰 눈의 파리의 세포질 형광은 횡문근에서 신호의 경계를 확산시킬 수 있으며 단백질의 발현 수준은 개인마다 크게 다를 수 있으며 결과 DPP의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 형광 DPP 영상화의 경우, 색소침착된 눈으로 파리를 사용하는 것이 유리하다. 세포체로부터의 형광 신호의 흡수로 인해, 생성된 DPP는 흰 눈의 파리에서보다 더 날카롭게 나타날 수 있다.
수침 현미경에서 흐릿한 이미지를 피하려면 비행 준비 후 신속하게 이미지 수집을 수행하여 파리의 재각성과 움직임을 방지해야합니다. 고품질 이미지의 경우, 흰 눈동자 파리를 사용하는 경우 눈에서 가장 밝은 형광 신호가 모든 이미지에서 거의 포화에 도달해야합니다. 이는 이미징 동안 노출 시간을 조정함으로써 달성될 수 있다. 색소 침착은 세포질 eGFP 형광의 검출을 방해하기 때문에, 노출 시간을 조정하기 위해 흰 눈동자 파리에 대한 설명 된 접근법은 항상 색소 침착 된 눈에서 강한 횡문근 형광 신호를 초래하여 후속 해석 및 정량화를 왜곡시킵니다. 또한, 착색 된 눈을 사용함으로써, 청색광에 대한 강한 노출로 인한 광표백은 약한 신호로 이어질 수 있으며 따라서 데이터의 오해를 초래할 수 있습니다. 문맥에 따라(즉, 치사성 또는 비-치명적인), 색소침착된 눈에 대한 프로토콜에 두 가지 대안적인 절차가 제시된다. 일반적으로, 비-치사성 변이는 동일한 파리가 반복적으로 측정될 수 있고, 각각의 개별 파리에 대한 특정 노출 시간의 평가가 샘플로부터 생성된 평균 노출 시간의 결정보다 더 정밀한 정량화 및 더 높은 재현성을 초래하기 때문에 색소침착된 눈과 함께 바람직할 것이다. 그러나 치명적이지 않은 변이는 반복적 인 측정 중에 생존을 보장하기 위해 동물을 다루는 데 더 많은주의가 필요합니다. 이것은 낮은 압력의 공기 만 사용하여 파리를 피펫 팁으로 옮기고 핀셋을 조심스럽게 사용하여 이미징 후 피펫 팁에서 파리를 풀어 냄으로써 달성 될 수 있습니다. 파리는 절차 중에 얼음처럼 차가운 물에 잠기지 않기 때문에 재각성의 위험이 증가합니다. 개별 표본에서 반복적으로 측정 한 결과, 전체 일련의 측정은 파리가 처음부터 끝까지 손상되지 않은 경우에만 유효합니다. 결과적으로, 치명적이지 않은 변동은 매우 노동 집약적이며 시간이 많이 걸립니다. 반면에 치명적인 변형은 여러 파리를 동일한 곤충 핀에 연속적으로 고정하고 하나의 이미지 수집 라운드에서 순차적으로 기록 할 수 있기 때문에 더 높은 처리량을 허용합니다. 그러나 동일한 핀에서 여러 번 비행하는 것은 재각성과 움직임을 피하기 위해 더 빠른 이미징이 필요합니다. 치명적인 변이의 마지막 단점은 분명히 후속 적용 (예를 들어, 교차, 반복 측정)을 위해 이미징 후 동물을 회수 할 수 없다는 것입니다.
전좌의 정량화와 관련하여, 이 프로토콜은 횡문관뿐만 아니라 세포체로부터의 형광 신호를 고려하고, 따라서 세포 내 전좌 단백질의 상대적 분포에 대한 매우 양호한 추정치를 생성하는 식 (1)을 제시한다 (도 12D). 색소가 침착 된 눈의 경우 세포체로부터의 형광 측정이 부족하기 때문에 수식 (2)가 제공되며,이 자주 발생하는 문제에 잘 작동합니다 (그림 13B). 눈 색소 침착 외에도 이러한 수식 중 하나를 사용하여 정량화를 방해하는 다른 상황이 있습니다. 이들 사례 중 하나는 롤라ttd12 돌연변이체의 형태로 도 12A,B에 제시된다. 이 돌연변이체에서, 구체적으로, 광수용체 세포 R7의 부재는 옴마티드 형태학 및 따라서 이 영역으로부터 배경 형광의 합리적인 강도 측정을 획득하는 능력에 유의하게 영향을 미친다. 이러한 문제에도 불구하고 동일한 전좌 정량화 방법이 사용되는 경우 결과는 많은 양의 분산을 표시하고 컨트롤과 비교하기가 어려우며 잠재적으로 잘못 해석 될 수 있습니다. 따라서 롤라ttd12 돌연변이체의 예는 정확한 강도 측정을 위해 필연적으로 "야생형"과 유사한 형태학에 의존하는 이러한 정량화 방법의 한계를 예시한다. 드물게 단백질 전좌 결함이 형태학적으로 결함이있는 옴마티디아에서 정량화되어야하는 경우, 여기에 제시된 프로토콜은 실패하고 그에 따라 조정되어야합니다. 여기에는 합리적으로 얻을 수 없는 측정값을 제외하거나 다른 대표 영역의 추가 측정값을 포함하기 위해 수식에 대한 적절한 변경이 포함됩니다.
퇴행성 과정의 정량화의 경우, 형광 강도 역치는 횡문선 내부와 사이에 너무 많은 차이가 있기 때문에 좋은 지표가 아닌 것으로 판명되었습니다. 이 분산은 전좌를 정량화하는 방법에서 측정된 18개의 횡문근 모두에 대해 평균화됩니다. 그러나 변성 평가에서 각 횡문근의 개별 평가로 인해 형광 강도의 분산을 평균화 할 수 없습니다. 또한 강도는 고려해야 할 특성 중 하나 일뿐입니다. 다른 중요한 측면은 대비와 가장자리의 선명도입니다. 결과적으로,이 프로토콜은 눈의 형광에 따라 횡문근의 형태를 분류하는 것에 기초한 정량화 방법을 제시합니다. 이것은 필연적으로 어느 정도 주관적입니다. 그럼에도 불구하고, 충분한 경험을 감안할 때, 이 프로토콜은 퇴행에 대한 유용하고, 빠르고, 재현 가능한 정량화 방법을 입증했으며(그림 14), 22,10번 여러 번 출판되었다. 모든 주관적인 평가와 마찬가지로, 맹목적인 맥락에서 수행하는 것이 항상 권장됩니다. 다른 그룹의 프로토콜은 일반적으로 초파리 (횡문근의 존재 또는 부재)에서 망막 변성을 정량화하기 위해 두 가지 범주 만 사용하며, 이는 덜 주관적 일 수 있지만 덜 정확 할 수도 있습니다. 또한, 이러한 정량화 방법은 여전히 두 범주 사이의 컷오프 포인트를 정의하는 문제를 가지고 있으며, 이는 객관적으로 정의하기가 똑같이 어려울 수 있습니다.
여기에 제시된 방법의 변형 및 고급 적용과 관련하여, 이중 컬러 이미징에 의해 동시에 두 개의 형광 융합 단백질의 상대적 양을 평가할 수도 있다. 예를 들어, TRPL::HcRed 및 TRP::eGFP를 사용하여, TRPL::HcRed 전좌는 동일한 플라이(23)에서의 횡문근성 완전성을 고려하여 평가되었다. 이중 컬러 이미징은 또한 토마토/GFP-FLP/FRT 방법, 예를 들어, 아폽토시스(24)를 유도하는 인자를 식별하기 위해 사용된다. 이 변형은 ninaC::tdTomato로 표시된 형광 표지된 세포 클론에서 ninaC::eGFP를 통해 광수용체 세포의 변성을 시각화할 수 있게 합니다. 수침 현미경의 또 다른 응용 프로그램은 광수용체에서 포스포이노시타이드 회전율을 모니터링하는 것입니다. 이러한 목적을 위해, 형광 태깅된 포스포이노시타이드-결합 도메인, 예컨대 PLCδ1로부터의 플레크스트린 상동성(PH) 도메인이 사용된다. 이들 형광 프로브는 횡문관으로부터 시토졸25,26으로의 프로브의 확산에 의해 야기되는 횡문근 형광의 감소를 검출함으로써 시간에 따른 포스포이노시타이드 분해의 추적을 허용한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 수년에 걸쳐 우리의 학생 연구원에게 감사하고 싶습니다. 특히 Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim 및 Laura Jaggy는이 프로토콜에서 대표적인 결과로 활용되었습니다. 여기에 제시된 우리 그룹의 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1)에서 Armin Huber에게 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
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