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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

पूल shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग कारकों की पहचान करने के लिए जो एक दवा प्रतिरोध फेनोटाइप को संशोधित करते हैं

Published: June 17, 2022 doi: 10.3791/63383
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

Summary

उच्च-थ्रूपुट आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीनिंग लेंटिवायरल shrnas के एक पूल का उपयोग करके दुर्दमताओं में चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सिंथेटिक घातक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक उपकरण हो सकता है। हम तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में एपिजेनेटिक प्रभावकों की जांच करने के लिए एक पूल किए गए shRNA स्क्रीनिंग दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

Abstract

अधिग्रहित कीमो-प्रतिरोध के नैदानिक रूप से प्रासंगिक चालक तंत्र को समझना प्रतिरोध को दरकिनार करने और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) वाले रोगियों में अस्तित्व में सुधार करने के तरीकों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। ल्यूकेमिया कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश जो कीमोथेरेपी से बचजाता है, में कीमोथेरेपी अपमान को सहन करने के लिए एक तैयार एपिजेनेटिक स्थिति होती है। कीमोथेरेपी के लिए आगे के संपर्क में इन दवा persister कोशिकाओं को एक निश्चित epigenetic राज्य प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन दवा प्रतिरोधी आबादी का प्रसार होता है और अंततः पुनरावृत्ति या दुर्दम्य रोग होता है। इसलिए, एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन की पहचान करना जो दवा प्रतिरोधी ल्यूकेमिया कोशिकाओं के अस्तित्व की आवश्यकता होती है, महत्वपूर्ण है। हम एपिजेनेटिक मॉड्यूलेटर की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं जो एक अधिग्रहित साइटाराबिन-प्रतिरोधी एएमएल सेल लाइन में पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग का उपयोग करके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग साइटाराबिन (AraC) के प्रतिरोध की मध्यस्थता करते हैं। पुस्तकालय में 5,485 shRNA निर्माण शामिल हैं जो 407 मानव एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करते हैं, जो उच्च-थ्रूपुट एपिजेनेटिक कारक स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

Introduction

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में चिकित्सीय विकल्प लगभग पिछले पांच दशकों से अपरिवर्तित रहे हैं, जिसमें साइटाराबिन (एआरसी) और एंथ्रासाइक्लिन बीमारी के इलाज के लिए आधारशिला के रूप में हैं। एएमएल थेरेपी की सफलता के लिए चुनौतियों में से एक कीमोथेरेपी के लिए ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का प्रतिरोध है, जिससे रोगरिलैप्स 1,2 हो सकता है। एपिजेनेटिक विनियमन कैंसर रोगजनन और दवा प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और कई एपिजेनेटिक कारक आशाजनक चिकित्सीयलक्ष्यों 3,4,5 के रूप में उभरे हैं। एपिजेनेटिक नियामक तंत्र कीमोथेरेपी दवाओं के निरंतर संपर्क में प्रसार और अस्तित्व को प्रभावित करते हैं। गैर-हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में अध्ययन से पता चला है कि दवा के प्रभाव को दूर करने वाली कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश विभिन्न एपिजेनेटिक्स संशोधनों से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप उन कोशिकाओं का अस्तित्व 6,7 होता है। हालांकि, एएमएल में साइटाराबिन के लिए अधिग्रहित प्रतिरोध की मध्यस्थता में एपिजेनेटिक कारकों की भूमिका का पता नहीं लगाया गया है।

उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दवा की खोज के लिए एक दृष्टिकोण है जिसने समय के साथ वैश्विक महत्व प्राप्त किया है और सेलुलर तंत्र में संभावित लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विभिन्न पहलुओं में एक मानक विधि बन गई है, मार्ग प्रोफाइलिंग के लिए, और आणविक स्तर पर 8,9। सिंथेटिक घातकता अवधारणा में दो जीनों के बीच बातचीत शामिल है जहां अकेले जीन की गड़बड़ी व्यवहार्य है, लेकिन दोनों जीनों के परिणामस्वरूप एक साथ व्यवहार्यता10 का नुकसान होता है। कैंसर के उपचार में सिंथेटिक घातकता का शोषण करने से मजबूत सिंथेटिक घातक आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने और यांत्रिक रूप से चिह्नित करने में मदद मिल सकतीहै। हमने एएमएल में अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार एपिजेनेटिक कारकों की पहचान करने के लिए सिंथेटिक घातकता के साथ उच्च-थ्रूपुट shRNA स्क्रीनिंग का एक संयुक्त दृष्टिकोण अपनाया है।

मिश्रित-वंश ल्यूकेमिया जीन (एमएलएल या केएमटी 2 ए) के क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन द्वारा संचालित तीव्र ल्यूकेमिया को रोगियों में खराब अस्तित्व से जुड़ा होने के लिए जाना जाता है। एमएलएल जीन पुनर्व्यवस्था के परिणामी चिमेरिक उत्पाद, यानी, एमएलएल संलयन प्रोटीन (एमएलएल-एफपी), हेमटोपोइएटिक स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) को कई एपिजेनेटिक कारकों की भागीदारी के साथ ल्यूकेमिया विस्फोटों में बदल सकते हैं। ये एपिजेनेटिक नियामक एक जटिल नेटवर्क का गठन करते हैं जो ल्यूकेमिया कार्यक्रम के रखरखाव को निर्देशित करता है और इसलिए, संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बना सकता है। इस संदर्भ में, हमने अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोधी सेल लाइन को विकसित करने के लिए एमवी 4-11 सेल लाइन (एमएलएल संलयन जीन एमएलएल-एएफ 4 को एफएलटी 3-आईटीडी उत्परिवर्तन के साथ हार्बरिंग; एमवी 4-11 पी के रूप में जाना जाता है; जिसे एमवी 4-11 एआरसी आर के रूप में जाना जाता है) का उपयोग किया। सेल लाइन को दवा के उपचार से आंतरायिक वसूली के साथ साइटाराबिन की बढ़ती खुराक के संपर्क में लाया गया था, जिसे दवा की छुट्टी के रूप में जाना जाता है। आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) इन विट्रो cytotoxicity परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

हम एक pZIP lentiviral रीढ़ के साथ hEF1a प्रमोटर द्वारा संचालित pooled epigenetic shRNA पुस्तकालय (सामग्री की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय में 407 एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करने वाले एसएचआरएनए शामिल हैं। प्रत्येक कारक में 5-24 shrnas हैं, जिसमें कुल 5,485 shrnas हैं, जिसमें पांच गैर-लक्षित नियंत्रण shrnAs शामिल हैं। संशोधित "UltrmiR" miR-30 पाड़ कुशल प्राथमिक shRNA biogenesis और अभिव्यक्ति12,13 के लिए अनुकूलित किया गया है।

इस प्रयोग की रूपरेखा को चित्र 1A में दर्शाया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल MV4-11 AraC R सेल लाइन (चित्रा 1B), एक निलंबन सेल लाइन में epigenetic कारक shRNA पुस्तकालय का उपयोग करके RNAI स्क्रीनिंग पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी की पसंद के किसी भी दवा-प्रतिरोधी सेल लाइन में किसी भी लक्षित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल अनुयायी कोशिकाओं के लिए अलग होगा।

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Protocol

संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (IBSC) के दिशानिर्देशों का पालन करें और लेंटीवायरस (BSL-2) को संभालने के लिए उचित सुविधा का उपयोग करें। कार्मिकों को लेंटीवायरस के हैंडलिंग और निपटान में उचित रूप से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल क्रिश्चियन मेडिकल कॉलेज, वेल्लोर के जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. shRNas की लगातार और लंबे समय तक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सबसे शक्तिशाली प्रमोटर का चयन

नोट: विभिन्न प्रमोटरों के साथ लेंटिवरल वैक्टर का उपयोग करके एक ट्रांसडक्शन प्रयोग करना आवश्यक है जो प्रमोटर की पहचान करने के लिए प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त करता है जो प्रयोग के लिए चयनित सेल लाइन में shrnas की एक स्थिर और दीर्घकालिक अभिव्यक्ति प्रदान करता है। इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रमोटर hEF1α (मानव बढ़ाव कारक 1α), hCMV (मानव साइटोमेगालोवायरस), और SSFV (प्लीहा फोकस बनाने वाले वायरस) प्रमोटर हैं जो हरे रंग के प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) (चित्रा 2A) को व्यक्त करते हैं।

  1. ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके कक्ष गणना निष्पादित करें. 10% RPMI माध्यम में MV4-11 AraC R कोशिकाओं को निलंबित करें (10% FBS के साथ RPMI 100 U / mL पेनिसिलिन और 100 U / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) जिसमें 8 μg / mL पॉलीब्रेन होता है। बीज 1 x 106 कोशिकाओं मध्यम के 1.5 मिलीलीटर में /
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से केंद्रित lentiviruses (उदाहरण के लिए, 10 μL, 20 μL, और 40 μL lentiviruses के टिटर के आधार पर) के विभिन्न संस्करणों को जोड़ें। सामग्री को मिलाने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं।
  3. 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 920 x g पर centrifugation द्वारा spinfection प्रदर्शन करें।
  4. तुरंत एक सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ) में प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  5. सफल ट्रांसडक्शन सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत 48 घंटे के बाद जीएफपी अभिव्यक्ति का निरीक्षण करें।
  6. ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए 72 घंटे के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जीएफपी अभिव्यक्ति को मापें।
  7. कुल 2 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को संस्कृति दें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा समय-समय पर जीएफपी अभिव्यक्ति की निगरानी करें। औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता और जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत द्वारा मापा गया जीएफपी अभिव्यक्ति में कमी प्रमोटर मौन का संकेत देती है।
  8. 10 वें दिन GFP + कोशिकाओं को सॉर्ट करें और सॉर्टिंग के बाद 1 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को संस्कृति करें। संस्कृति के दौरान समय-समय पर जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें।
  9. गेट सेट करने के लिए अपरिवर्तित कक्षों का उपयोग करें. एक्स-अक्ष पर दाईं ओर 1 x10 1 पैमाने से परे एक आबादी को जीएफपी के लिए एक सकारात्मक आबादी माना जाता है।
  10. उस प्रमोटर को चुनें जो कोशिकाओं की लंबी संस्कृति में जीएफपी की लगातार अभिव्यक्ति दिखाता है।

2. pooled lentiviral मानव epigenetic कारक shRNA पुस्तकालय की तैयारी

  1. संस्कृति 293T कोशिकाओं (एक अच्छी प्रसार दर के साथ एक कम मार्ग संख्या पर) तीन 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजनों में 10% DMEM माध्यम के 8 mL के साथ (DMEM 10% FBS के साथ 100 U / ml पेनिसिलिन और 100 U / ml streptomycin युक्त) प्रत्येक प्लेट में।
  2. एक बार जब कोशिकाएं 60% confluency प्राप्त कर लेती हैं, तो माध्यम को एक पूर्ण माध्यम के साथ बदलें।
  3. अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें (जैसा कि तालिका 1 में उल्लिखित है) जिसमें सीरम-मुक्त माध्यम, लेंटिवायरल पैकेजिंग (psPAX2) और लिफाफा प्लास्मिड (pMD2.G), पूल किए गए लाइब्रेरी प्लास्मिड, और अंत में, अभिकर्मक अभिकर्मक शामिल हैं।
  4. इसे अच्छी तरह से मिलाने के लिए मिश्रण को टैप करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  5. 293T कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और प्लेटों घुमाकर धीरे से मिश्रण। एक सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ) में प्लेटों को इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद माध्यम बदलें।
  6. 48 घंटे के बाद, 293T कोशिकाओं में उच्च अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत GFP अभिव्यक्ति की जांच करें।
  7. 48 ज, 60 ज, और 72 घंटे के बाद वायरस supernatants ले लीजिए और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। वायरस को इकट्ठा करने के बाद प्रत्येक समय बिंदु पर ताजा माध्यम (8 एमएल) जोड़ें।
  8. पूल वायरस supernatants. पूल किए गए वायरस की कुल मात्रा होगी: ~ 8 एमएल / प्लेट एक्स 3 संग्रह = ~ 24 एमएल / प्लेट; ~ 24 mL / प्लेट x 3 प्लेटें = ~ 3 प्लेटों से ~ 72 एमएल।
  9. 0.4 μm फ़िल्टर के साथ pooled वायरस फ़िल्टर करें।
  10. वायरस का एक उच्च टिटर प्राप्त करने के लिए, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पूल किए गए वायरस को केंद्रित करें। फ़िल्टर किए गए वायरस supernatant को दो 70 Ti ट्यूबों (32 mL / ट्यूब) और सेंट्रीफ्यूज पर 18,000x g पर धीमी गति से त्वरण और मंदी के साथ 2 घंटे के लिए स्थानांतरित करें। एक रोटर और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें जो 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल्ड है।
  11. सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को धीरे से बाहर निकालें और supernatant को पूरी तरह से हटा दें।
  12. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करते हुए, धीरे से डीएमईएम के 400 μL (FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) में गोली को फिर से निलंबित करें। 1 ज के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें और दोनों ट्यूबों से छर्रों को मिलाएं।
  13. वायरस को एलीकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    नोट: ट्यूबों और वायरस को चरण 2.10.-2.13 के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए। सादे माध्यम के साथ वायरस को फिर से निलंबित करते समय झाग से बचें। माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए।
  14. नीचे दिए गए अनुसार वायरस की सांद्रता (x) की गणना करें:
    एकाग्रता से पहले कुल आयतन = 72 mL (72,000 μL)
    ध्यान केंद्रित करने के बाद आयतन = 400 μL
    सांद्रता = 72,000/400 = 180x

3. lentiviruses के transduction दक्षता का अनुमान

  1. लेंटिवायरस की सफल तैयारी की पुष्टि करने के लिए विभिन्न मात्राओं (2 μL, 4 μL, 8 μL) में केंद्रित वायरस के साथ ट्रांसड्यूस 293T कोशिकाओं।
    नोट: यदि केंद्रित वायरस छोटे वॉल्यूम (1-2 μL) में उच्च ट्रांसडक्शन क्षमता (>50%) दिखाते हैं, तो वांछित मात्रा (100x से 75x) में केंद्रित वायरस को पतला करने की सलाह दी जाती है।
  2. MV4-11 AraC R सेल लाइन में अनुमापन प्रयोग करने के लिए DMEM (FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) के साथ 100x तक केंद्रित वायरस को पतला करें।
  3. बीज 1 x 106 कोशिकाओं (MV4-11 AraC आर सेल लाइन 10% RPMI माध्यम के 1.5 mL में 8 μg / mL polybrene युक्त) एक छह अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में। वायरस के विभिन्न संस्करणों के साथ transducing के लिए चार कुओं को तैयार करें।
  4. 100x वायरस के चार अलग-अलग वॉल्यूम (उदाहरण के लिए, 1 μL, 1.5 μL, 2 μL, और 2.5 μL) जोड़ें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 920 x g पर प्लेट के centrifugation द्वारा spinfection प्रदर्शन।
  6. 72 घंटे के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत को मापें।
  7. 30% ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए वायरस की मात्रा निर्धारित करें। यह कम ट्रांसडक्शन दक्षता प्रति सेल एकल shRNA एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए है।

4. दवा प्रतिरोधी सेल लाइन में pooled epigenetic shRNA पुस्तकालय के transduction

  1. लक्ष्य सेल लाइन MV4-11 AraC R को 0.5 x 106 कोशिकाओं / mL घनत्व पर बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं संस्कृति में घातीय विकास चरण में हैं।
  2. वायरल इंटीग्रेंट्स की संख्या के आधार पर नीचे दिए गए प्रयोग के लिए ली जाने वाली कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    ट्रांसडक्शन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या = 5,485 (shRNA की संख्या) × 500 (गुना shRNA प्रतिनिधित्व) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 106 कोशिकाएं
  3. 10% RPMI माध्यम के 16 mL में 1.1 x 107 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  4. पॉलीब्रेन (8 μg/ mL) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। उसके बाद, पिछले अनुभाग में परिकलित के रूप में 30% ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए वायरस की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
  5. 1 x 106 कोशिकाओं / 10% RPMI माध्यम के 1.5 mL प्रति अच्छी तरह से के घनत्व पर एक छह अच्छी तरह से प्लेट पर सभी कोशिकाओं बीज।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 920 x g पर 90 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. एक सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ) में रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. 24 घंटे के बाद, माध्यम बदलें और ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  9. 48 घंटे के बाद, सफल ट्रांसडक्शन सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत जीएफपी की जांच करें।
  10. 72 घंटे के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत को क्वांटिटेट करें।

5. जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं का संवर्धन

नोट: 5-7 दिनों के लिए 0.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर उन्हें culturing द्वारा transduced कोशिकाओं का विस्तार करें। ये कोशिकाएं ट्रांसड्यूस्ड और अनट्रांसड्यूस्ड की एक मिश्रित आबादी हैं, जिन्हें छँटाई द्वारा जीएफपी के आधार पर चुना गया है, जैसा कि अगले चरण में उल्लेख किया गया है।

  1. उच्च शुद्धता और कम उपज के रूप में सेट प्रवाह-सॉर्टिंग सेटिंग्स के साथ GFP + ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की प्रवाह-सॉर्टिंग करें। गेट सेट करने के लिए अपरिवर्तित कक्षों का उपयोग करें. दाईं ओर 1 x 102 से परे की आबादी को एक सकारात्मक आबादी माना जाता है।
  2. 5% RPMI (5% FBS के साथ RPMI 100 U / mL पेनिसिलिन और 100 U / mL streptomycin के साथ पूरक) में क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  3. एक 10% RPMI माध्यम में क्रमबद्ध कोशिकाओं को संस्कृति.
  4. 72 घंटे के बाद, >95% सॉर्टिंग दक्षता सुनिश्चित करने के लिए GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत का पोस्ट-सॉर्टिंग अनुमान करें।
    नोट:: 450x से ~ 500x shRNA लायब्रेरी के प्रतिनिधित्व को प्राप्त करने के लिए सॉर्ट करने के बाद ~ 3-5 x 106 GFP सकारात्मक कक्षों को प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें।

6. ड्रॉपआउट स्क्रीनिंग epigenetic कारकों दवा प्रतिरोध मध्यस्थता की पहचान करने के लिए

  1. संस्कृति shRNA पुस्तकालय 5 दिनों के लिए 10% RPMI में कोशिकाओं transduced. Cryopreserve भविष्य के प्रयोगों के लिए transduced कोशिकाओं, यदि आवश्यक हो, दवा उपचार से पहले.
  2. सेंट्रीफ्यूज 1 x 10 7 कोशिकाओं कोडुप्लिकेट में 280 x g पर 5 मिनट के लिए 25 °C पर। supernatant को छोड़ दें, और छर्रों को -80 °C पर स्टोर करें। ये नमूने epigenetic shRNA पुस्तकालय के लिए आधार रेखा संदर्भ के रूप में काम करेंगे।
  3. शेष ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को डुप्लिकेट (R1 और R2) के रूप में संस्कृति करें, प्रत्येक को एक सेल गणना पर बनाए रखा गया जो लाइब्रेरी का 500x प्रतिनिधित्व प्रदान करता है।
  4. दवा (10 μM साइटाराबिन) (R2) के साथ डुप्लिकेट में से एक का इलाज करें और दवा उपचार (R1) के बिना दूसरा।
  5. हर 72 घंटे में दवा के साथ और बिना फ्लास्क के लिए माध्यम बदलें। 9 दिनों के संचयी दवा जोखिम के लिए मध्यम परिवर्तन 3x को दोहराएं।
  6. दवा उपचार के 9 दिनों के बाद, ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि द्वारा कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच करें।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर शेष कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। बाँझ पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को धोएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. supernatant त्यागें और डीएनए निष्कर्षण के लिए छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. पीसीआर द्वारा एकीकृत shrnas का प्रवर्धन

  1. ट्रांसड्यूस्ड बेसलाइन कोशिकाओं (टी) (चरण 6.2.) और दवा (आर 2) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं से डीएनए निकालें और दवा (आर 1) के साथ अनुपचारित।
  2. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके नमूने की एकाग्रता की जांच करें।
  3. नीचे दिए गए अनुसार पीसीआर के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा की गणना करें:
    5,485 (सं। shRNAs) × 500 (shRNA प्रतिनिधित्व) × 1 x 6.6−12 (g/द्विगुणित जीनोम) = DNA का 15 μg
  4. नमूनों को पीसीआर के पहले दौर के अधीन करें।
    नोट: PCR प्रतिक्रिया मिश्रण थर्मल cycler शर्तों के साथ तालिका 2 में दर्शाया गया है। प्राइमरों के ब्यौरे अनुपूरक सारणी 1 में दिए गए हैं।
  5. प्रति ट्यूब 850 एनजी डीएनए युक्त कई प्रतिक्रियाओं को सेट करें (कुल 43 प्रतिक्रियाओं के लिए)।
    नोट: पीसीआर का पहला दौर shRNA के flanking क्षेत्रों को बढ़ाता है जिसके परिणामस्वरूप 397 bp का एम्प्लिकॉन आकार होता है।
  6. पीसीआर उत्पादों को पूल करें और एक मानक जेल / पीसीआर शुद्धिकरण किट के 3-4 कॉलम का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
    नोट: विवरण तालिका 3 में दिए गए हैं।
  7. प्रत्येक कॉलम से बफर के 50 μL में उत्पाद elute और elutes पूल.
  8. डीएनए को मापें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    नोट:: अभिकर्मकों थर्मल cycler शर्तों के साथ तालिका 4 में सारणीबद्ध कर रहे हैं। दूसरे दौर के पीसीआर एक singleflow सेल में NGS में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए आवश्यक सूचकांक अनुक्रम के साथ प्राइमरों का उपयोग करता है। इसलिए, प्रत्येक नमूने को एक अलग सूचकांक के साथ टैग किया जाना चाहिए। प्राइमर अनुक्रम अनुपूरक सारणी 1 में दिए गए हैं।
  9. प्रत्येक नमूने और नकारात्मक नियंत्रण के लिए 50 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में प्राथमिक पीसीआर उत्पाद के 500 एनजी के साथ चार प्रतिक्रियाएं सेट करें।
  10. 2% TBE agarose जेल का उपयोग कर वैद्युतकणसंचलन के लिए पूरे उत्पाद लोड करें और एक 1 केबी आणविक सीढ़ी का उपयोग कर बैंड के आकार की पुष्टि करें। एम्प्लिकॉन का आकार 399 बीपी है।
  11. जेल प्रलेखन प्रणाली पर पीसीआर उत्पादों की कल्पना करें।
  12. विशिष्ट बैंड उत्पाद शुल्क और एक जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर शुद्ध.
    नोट:: किट के साथ शुद्धिकरण के लिए परिकलन तालिका 3 में प्रदान किए गए हैं।
  13. 30 μL के क्षालन बफर की एक अंतिम मात्रा में elute. प्रत्येक eluent की अनुमानित सांद्रता 30 μL की कुल मात्रा के साथ लगभग 80-90 ng / μL होगी।

8. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण

  1. चरण 7.13 से जेल-शुद्ध उत्पाद अनुक्रम. एक अगली पीढ़ी sequencer पर (उदाहरण के लिए, Illumina) समाप्त shRNAs के लिए पढ़ने की गिनती प्राप्त करने के लिए.
  2. Fastx-उपकरण किट (संस्करण 0.7) का उपयोग कर जनरेट किए गए FastQ पढ़ता है के एडाप्टर अनुक्रमों ट्रिम करें।
  3. दो बेमेल की अनुमति देने के पैरामीटर के साथ एक Bowtie aligner का उपयोग कर संदर्भ अनुक्रमों के लिए फ़िल्टर किए गए पठन संरेखित करें। सुनिश्चित करें कि एडाप्टर ट्रिमिंग के बाद पढ़ने की लंबाई लगभग 21 बीपी है।
  4. Samtools (संस्करण 1.9) प्रोग्राम का उपयोग कर फ़ाइलों को लोड करें। Flagstat विकल्प का उपयोग करें और संरेखण सारांश की गणना करें।
  5. CRISPRCloud2 (CC2) सॉफ़्टवेयर (https://crispr.nrihub.org/) में TRIMED fastQ फ़ाइलों को FASTA फ़ाइलों के रूप में संदर्भ shRNA अनुक्रमों के साथ लोड करें और निर्देशों के अनुसार विश्लेषण करें।
    1. CC2 में Start Analysis लिंक पर क्लिक करें।
    2. उत्तरजीविता और ड्रॉपआउट स्क्रीन के रूप में स्क्रीन प्रकार का चयन करें. समूहों की संख्या सेट करें और प्रत्येक समूह के लिए नाम लिखें.
    3. FASTA फ़ाइल स्वरूप में संदर्भ लायब्रेरी अपलोड करें। अपलोड किया गया डेटा संसाधित किया जाता है। परिणाम प्राप्त करने के लिए आउटपुट URL पर क्लिक करें।
      नोट: यह सॉफ़्टवेयर sgRNA / shRNA स्तरों में अंतर को मापने के लिए एक संशोधित छात्र के टी-टेस्ट के साथ एक बीटा-द्विपद मॉडल का उपयोग करता है, इसके बाद जीन-स्तर के महत्व का अनुमान लगाने के लिए फिशर के संयुक्त संभाव्यता परीक्षण द्वारा पीछा किया जाता है। यह अनुमानित समग्र लॉग2-गुना परिवर्तन (Log2Fc) shRNAs के उपचारित (समृद्ध / समाप्त) और अनुपचारित नमूने (बेसलाइन) के बीच epigenetic कारकों के लिए "p-values" और "FDR मानों" के साथ परिकलित करता है।
  6. सुनिश्चित करें कि FDR मान ड्रॉपआउट स्क्रीन के लिए "नकारात्मक" और उत्तरजीविता स्क्रीन के लिए "सकारात्मक" है।
    नोट: CC2 पढ़ता है गिनती और नमूनों के बीच shRNAs के गुना प्रतिनिधित्व (संवर्धन या कमी) की गणना के लिए एक विश्लेषण मंच है।
  7. CC2 परिणामों से काफी समृद्ध और समाप्त shRNAs (FDR <0.05) की पहचान करें।
    नोट: प्रत्येक कारक के विरुद्ध 5-24 shrnas हैं। shRNAs में से प्रत्येक के लिए FDR मानों की जाँच करें; FDR पर विचार करें, जो <0.01 है, और चयनित shRNAs के लिए एक औसत ले लो। शीर्ष 40 हिट पर विचार करें। Log2Fc या FDR नकारात्मक मानों पर आधारित चयनित कारकों के लिए ग्राफ़ प्लॉट करें। सुनिश्चित करें कि गैर-लक्ष्यीकरण shrnAs में डेटा की प्रामाणिकता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण FDR मान भी हैं क्योंकि वे नियंत्रण shRNAs के रूप में कार्य करते हैं।

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Representative Results

समग्र स्क्रीनिंग वर्कफ़्लो को चित्र 1A में दर्शाया गया है. MV4-11 AraC R (48 h) की इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी ने MV4-11 AraC R में CYTARABINE के लिए IC50 को MV4-11 P (चित्रा 1B) से अधिक होने का खुलासा किया। इस सेल लाइन का उपयोग अध्ययन में साइटाराबिन प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार एपिजेनेटिक कारकों की स्क्रीनिंग के लिए मॉडल के रूप में किया गया था।

चित्रा 2A तीन अलग-अलग प्रमोटरों के साथ linearized pZIP वेक्टर मानचित्र दिखाता है: hEF1α (मानव बढ़ाव कारक 1α), hCMV (मानव साइटोमेगालोवायरस), और SSFV (प्लीहा फोकस-बनाने वाला वायरस), UltramiR अनुक्रम के भीतर scrambled shRNA के साथ। चित्रा 2B पुस्तकालय प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले pZIP वेक्टर मानचित्र और shRNA को Zsgreen और puromycin के साथ epigenetic कारक को लक्षित करने वाले hEF1a प्रमोटर द्वारा संचालित चयन योग्य मार्कर के रूप में दर्शाता है। इन वैक्टरों का उपयोग सबसे शक्तिशाली प्रमोटर प्रयोग के चयन में किया गया था।

लक्ष्य कोशिकाओं में एक सुसंगत और लंबे समय तक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सबसे शक्तिशाली प्रमोटर का चयन चित्र 3 में चित्रित किया गया है। एमएफआई द्वारा मापा गया जीएफपी का परिमाणीकरण सभी तीन प्रवर्तकों के लिए एमवी 4-11 एआरसीएस आर में 72 घंटे के अंत में 90% से अधिक ट्रांसडक्शन दक्षता दिखाता है। जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए हिस्टोग्राम एचसीएमवी के लिए एक विषम आबादी दिखाता है, लेकिन ट्रांसडक्शन के दिन 3 पर एचईएफ 1 ए और एसएफएफवी के मामले में एक सजातीय एक (चित्रा 3 ए)। बार ग्राफ तीन अलग-अलग प्रमोटरों (hEF1α, hCMV, और SFFV) द्वारा संचालित GFP अभिव्यक्ति को MV4-11 AraC R (चित्रा 3B) में ट्रांसडक्शन के दिन 3 पर दिखाता है। SFFV-संचालित GFP ने ट्रांसडक्शन (चित्रा 3 C) के दिन 5 पर MFI में कमी दिखाई। एचईएफ 1 ए-संचालित जीएफपी ट्रांसड्यूस्ड एमवी 4-11 माता-पिता की लाइन पोस्ट सॉर्टिंग में एमएफआई में कोई कमी नहीं देखी गई थी। इस प्रकार, HEF1a प्रमोटर को सेल लाइन (चित्रा 3 D) के लिए एक उपयुक्त प्रमोटर के रूप में पहचाना गया था।

चित्रा 4A 293T कोशिकाओं में पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी प्लास्मिड की अभिकर्मक दक्षता को दर्शाता है, जो 48 h के बाद अभिकर्मक के बाद होता है। जीएफपी अभिव्यक्ति उज्ज्वल थी, जो अच्छी अभिकर्मक दक्षता का संकेत देती है। वायरस संग्रह के बाद, तैयार पूल किए गए वायरस की ट्रांसडक्शन दक्षता को तीन अलग-अलग सांद्रता (2 μL, 4 μL, और 8 μL) में 293T कोशिकाओं में जांचा गया था। हमने देखा कि यहां तक कि 2 μL वायरस के परिणामस्वरूप 8 μL वायरस के समान दक्षता हुई, जिससे उच्च वायरल टिटर (चित्रा 4 बी) की पुष्टि हुई।

चित्रा 5 MV4-11 AraC R सेल लाइन में pooled पुस्तकालय transduction और lentiviral titer के निर्धारण को दर्शाता है। पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी lentivirus को 100x पतला किया गया था और फिर विभिन्न संस्करणों (1 μL, 1.5 μL, 2 μL, और 2.5 μL) में MV4-11 AraC R सेल लाइन में जोड़ा गया था। दक्षता 72 घंटे के अंत में जांच की गई थी। ट्रांसडक्शन दक्षता वायरस के 2-2.5 μL के लिए 30% थी, जो प्रति सेल एक shRNA एकीकरण की पुष्टि करती है (चित्रा 5A)। 1.1 x 107 MV4-11 AraC R कोशिकाओं में पूल किए गए लाइब्रेरी वायरस के 2.5μl के साथ ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप 30% ट्रांसडक्शन दक्षता हुई। GFP-सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट किया गया था, जो पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी (चित्रा 5B) का प्रतिनिधित्व करता है।

MV4-11 AraC R सेल लाइन में पूल किए गए shRNA epigenetic lentivirus के ट्रांसडक्शन के बाद, GFP-positive कोशिकाओं को दिन 5 या दिन 7 (चित्रा 6) पर क्रमबद्ध किया गया था। इन क्रमबद्ध कोशिकाओं को 9 दिनों के लिए साइटाराबिन के लंबे समय तक संपर्क में रखा गया था। व्यवहार्यता की जांच 9 वें दिन की गई थी, और कोशिकाओं को डीएनए के लिए एकत्र किया गया था। (चित्र 6A)। बार ग्राफ साइटाराबिन (चित्रा 6 बी) की उपस्थिति में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की प्रसार दर में कमी को दर्शाता है।

नमूनों से निकाले गए डीएनए को पीसीआर के दो दौरों के अधीन किया गया था, और अंतिम जेल एल्यूटेड उत्पाद ने एनजीएस द्वारा परिमाणित समृद्ध एसआरएनए का प्रतिनिधित्व किया था। चित्रा 7A पीसीआर के पहले और दूसरे दौर में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर के बाध्यकारी क्षेत्रों को दर्शाता है, जहां पहले दौर के प्राइमर एकीकृत shRNA के flanking क्षेत्रों से बंधे होते हैं, और दूसरा फॉरवर्ड प्राइमर लूप अनुक्रम को बांधता है। रिवर्स प्राइमर पीसीआर के पहले दौर में प्रवर्धित वेक्टर के एक क्षेत्र को बांधता है। चित्रा 7B और चित्रा 7C पहले (397 bp) और दूसरे दौर PCR (399 bp) के अंत में PCR उत्पाद के बैंड आकार को दर्शाते हैं, जिसे जेल-eluted, शुद्ध किया गया था, और NGS विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया गया था।

डीएनए को एक मानक गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के अधीन करने के बाद, नमूनों को एनजीएस विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया था। हमने CRISPRCloud2 का उपयोग किया, जो पूल किए गए shRNA स्क्रीनिंग में समृद्ध और समाप्त shRNA की पहचान करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, क्लाउड-आधारित विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म है। चित्रा 8 समृद्ध या समाप्त shRNAs के प्रतिनिधित्व को दर्शाता है जो एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करता है जो एएमएल में साइटाराबिन प्रतिरोध की मध्यस्थता कर सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1: अध्ययन की बाह्यरेखा और मॉडल. (A) वर्कफ़्लो के अवलोकन का चित्रण. (बी) MV4-11 माता-पिता और AraC प्रतिरोधी कोशिकाओं को cytarabine सांद्रता (0.1 μM से 1000 μM) में वृद्धि के साथ इलाज किया जाता है और एमटीटी परख द्वारा व्यवहार्यता का आकलन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. रैखिक वेक्टर का चित्रण. (ए) तीन अलग-अलग प्रमोटरों के साथ तीन वेक्टर मानचित्र, hEF1α (मानव बढ़ाव कारक 1α), hCMV (मानव साइटोमेगालोवायरस), और SSFV (प्लीहा फोकस-बनाने वाले वायरस), अल्ट्रामिर अनुक्रम के भीतर तले हुए shRNA के साथ। (बी) एचईएफ 1 α प्रमोटर के साथ पुस्तकालय प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले वेक्टर मानचित्र का चित्रण और चयन योग्य मार्कर के रूप में जेडग्रीन और प्यूरोमाइसिन के साथ एपिजेनेटिक कारक को लक्षित करने वाले shRNA। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: shrnas की लगातार और लंबे समय तक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सबसे शक्तिशाली प्रमोटर का चयन। (A) GFP के लिए प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों को hEF1a, hCMV, और SFFV प्रमोटरों के लिए 72 h के अंत में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणित किया गया। hCMV एक विषम चोटी दिखाता है, जबकि hEF1a और SFFV एक एकल समरूप चोटी दिखाते हैं। (बी) एमवी 4-11 एआरसी आर सेल लाइन में प्रमोटर दक्षता। (ग) एसएफएफवी-चालित जीएफपी लंबे समय तक संस्कृति में जीएफपी के मौन को दर्शाता है। (डी) एचईएफ 1 ए-संचालित जीएफपी कोशिकाएं कोशिकाओं की छंटाई के बाद निरंतर अभिव्यक्ति दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: तैयार पूल किए गए shRNA lentivirus की दक्षता की जांच करना। (A) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां 10x आवर्धन का उपयोग करके 48 h के अंत में 293T में संक्रमित पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी की अभिकर्मक दक्षता को दर्शाती हैं। (बी) पूल किए गए वायरस की ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन 293 टी कोशिकाओं में 10x आवर्धन का उपयोग करके अलग-अलग वायरस वॉल्यूम (2μL, 4μL, और 8μL) के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लक्ष्य सेल लाइन में पूल किए गए पुस्तकालय ट्रांसडक्शन और लेंटिवायरल टिटर का निर्धारण(ए) एमवी 4-11 एआरसी आर सेल लाइन वायरस के अलग-अलग वॉल्यूम (1μL, 1.5μL, 2μL, और 2.5μL) के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। दक्षता की जांच 72 घंटे के अंत में की गई थी(बी) 30% ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए 1 x 107 एमवी 4-11 एआरसी आर कोशिकाओं में पूल किए गए लाइब्रेरी वायरस का ट्रांसडक्शन, फिर जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की छंटाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: दवा प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले एपिजेनेटिक कारकों की पहचान करने के लिए ड्रॉपआउट स्क्रीनिंग। (ए) प्रतिरोधी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए दवा उपचार का योजनाबद्ध चित्रण। पुस्तकालय संक्रमित कोशिकाओं को 9 दिनों के लिए लंबे समय तक साइटाराबिन एक्सपोजर के अधीन किया गया था, इसके बाद व्यवहार्यता की जांच की गई और डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा किया गया। (बी) प्रतिरोधी सेल लाइनों में लंबे समय तक साइटाराबिन एक्सपोजर की व्यवहार्यता में कमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र7: एकीकृत shRNA का प्रतिनिधित्व करने वाले एम्प्लिकॉन की तैयारी। (A) पीसीआर के पहले और दूसरे दौर में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर के बाध्यकारी क्षेत्र, जहां पहले दौर के प्राइमर एकीकृत shRNA के flanking क्षेत्रों से बंधे होते हैं और दूसरा फॉरवर्ड प्राइमर लूप अनुक्रम को बांधता है। रिवर्स पहले पीसीआर में प्रवर्धित वेक्टर क्षेत्र के एक क्षेत्र को बांधता है। (बी) पहले दौर के पीसीआर (397 बीपी) के अंत में पीसीआर उत्पाद के बैंड आकार का चित्रण। (c) दूसरा दौर PCR उत्पाद (399bp) जेल-eluted, शुद्ध, और NGS के लिए दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एएमएल सेल लाइन (MV-4-11 Ara-C R सेल लाइन) में स्क्रीनिंग परिणाम। डीएनए को एक मानक गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के अधीन करने के बाद, नमूनों को एनजीएस विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया था। हमने CRISPRCloud2, एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, क्लाउड-आधारित विश्लेषण मंच का उपयोग किया, ताकि पूल किए गए shRNA स्क्रीनिंग में समृद्ध और समाप्त shRNA की पहचान की जा सके।  यह आंकड़ा एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करने वाले समृद्ध या समाप्त shRNAs का प्रतिनिधित्व करता है जो एएमएल में साइटाराबिन प्रतिरोध की मध्यस्थता कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: अभिकर्मक प्लास्मिड मिक्स की तैयारी (10 सेमी प्लेट के लिए गणना) कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: पीसीआर के 1वें दौर के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: पीसीआर के 1 के उत्पादों के शुद्धिकरण के लिए गणना कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: पीसीआर के दूसरे दौर के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) का बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें एसआईआरएनए और एसआरएनए स्क्रीनिंग शामिल हैं। SHRNA का लाभ यह है कि उन्हें प्लास्मिड वैक्टर में शामिल किया जा सकता है और जीनोमिक डीएनए में एकीकृत किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थिर अभिव्यक्ति होती है और इस प्रकार, लक्ष्य mRNA का अधिक लंबे समय तक नॉकडाउन होता है। एक pooled shRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग मजबूत और लागत प्रभावी पारंपरिक arrayed स्क्रीन (siRNA) की तुलना में प्रभावी है। जीनोम-वाइड स्क्रीन में प्रोटीन के एक विशिष्ट वर्ग की अनिवार्यता की पहचान करना बोझिल हो सकता है। लक्षित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण कम शोर के साथ विशिष्ट वर्ग के भीतर कैंसर सेल अस्तित्व या दवा प्रतिरोध के लिए व्यक्तिगत प्रोटीन की अनिवार्यता को प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल आवश्यक और गैर-आवश्यक जीनों दोनों से व्यवस्थित रूप से पूछताछ करने के लिए एपिजेनेटिक कारकों की आरएनएआई स्क्रीन पर प्रकाश डालता है, और यह एएमएल दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार लक्ष्यों की पहचान की अनुमति देने वाले एक कार्यात्मक मंच के रूप में इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करता है।

यह शक्तिशाली तकनीक प्रयोगों के डिजाइन और निष्पादन में कुछ सावधानियों की मांग करती है। पहला उन प्रवर्तकों की पसंद है जो shrnas की अभिव्यक्ति के लिए सेल संस्कृति के दौरान महत्वपूर्ण मौन से नहीं गुजरते हैं क्योंकि उनकी मजबूत अभिव्यक्ति लक्ष्य जीन के नॉकडाउन के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, shRNA प्रतिनिधित्व का रखरखाव (प्रत्येक shRNA के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं की संख्या) विशेष महत्व का है। SHRNA स्क्रीन के दौरान, प्रति shRNA निर्माण >500 कोशिकाओं का औसत प्रतिनिधित्व shRNA की पहचान करने की क्षमता को बढ़ाता है जो फेनोटाइपिक प्रभाव का कारण बनता है।

आरएनएआई स्क्रीनिंग रणनीति एक प्रतिस्पर्धी विकास स्क्रीन है; इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लक्ष्य कोशिकाएं लॉगरिदमिक विकास चरण में हैं और प्रतिबंधित विकास के कारण प्रतिनिधित्व के नुकसान को कम करने के लिए स्क्रीन के दौरान अधिक confluent नहीं हैं। प्रयोगात्मक विविधताओं को कम करने के लिए कोशिकाओं को 50% -70% संगम पर बनाए रखना आदर्श है। हम प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने के लिए सभी स्क्रीन प्रतिकृतियों के लिए मीडिया, सेरा, वायरल supernatants, दवाओं, और ऊतक संस्कृति plasticware के सुसंगत बहुत सारे बनाए रखने की सलाह देते हैं।

प्रति सेल shRNA के एकीकरण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा की गणना करने के लिए lentivirus की transduction दक्षता को अनुकूलित करने के लिए पायलट प्रयोगों को निष्पादित करने की सलाह दी जाती है। प्रति सेल एक shRNA के इस एकीकरण को प्राप्त करने के लिए, ट्रांसडक्शन दक्षता 30% से कम होनी चाहिए। 30% ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वायरस की मात्रा के रूप में, प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकता है, प्रत्येक सेल लाइन के लिए एक मानकीकरण प्रयोग की आवश्यकता होती है। ट्रांसडक्शन क्षमता भी सेल संस्कृति की स्थिति और सेल प्रसार की दर से प्रभावित हो सकती है। इसलिए, स्क्रीनिंग प्रयोग में उपयोग की जाने वाली समान स्थितियों का उपयोग करके पायलट प्रयोग में कार्यात्मक टिटर्स को निर्धारित किया जाना चाहिए। 3-6 प्रतिकृतियों को बनाए रखना हमेशा सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हिट प्राप्त करने की सलाह दी जाती है।

SHRNA स्क्रीनिंग दृष्टिकोण की दो प्रमुख चिंताएं ऑफ-टारगेट प्रभाव और shrnas16 की परिवर्तनीय नॉकडाउन दक्षताएं हैं। इन्हें प्रत्येक जीन के कई shrnAs का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोकैरियोटिक प्रतिरक्षा प्रणाली CRISPR-Cas9 को अनुकूलित करने से सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में आसान, कुशल और लागत प्रभावी जीनोम संपादन की अनुमति मिली है। इस प्रणाली को जीनोम-वाइड जेनेटिक स्क्रीन करने के लिए बड़े पैमाने पर शोषण किया गया है, जो कि एसएचआरएनए का उपयोग करके किए गए लोगों के समान है। एक विशेष एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) अनुक्रम को आश्रय देने वाली कोशिकाओं के भाग्य की निगरानी गहरी अनुक्रमण का उपयोग करके की जा सकती है। यहां उल्लिखित प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग CRISPR स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है और खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा भाग में वित्त पोषित किया जाता है, जो एसआरवी को बीटी / पीआर 8742 / एजीआर / 36 / 773 / 2013 अनुदान देता है; और जैव प्रौद्योगिकी विभाग भारत बीटी / सीओई / 34 / एसपी 13432 / 2015 और विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग, भारत: ईएमआर / 2017 / 003880 से पी.B आरवीएस और पी.B क्रमशः वेलकम डीबीटी इंडिया एलायंस आईए / एस / 17 / 1 / 503118 और आईए / एस / 15 / 1 / 501842 द्वारा समर्थित हैं। एसडी सीएसआईआर-यूजीसी फैलोशिप द्वारा समर्थित है, और एसआई को आईसीएमआर वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। हम अभिरूप बागची, सांद्या रानी और सीएससीआर फ्लो साइटोमेट्री कोर फैसिलिटी स्टाफ को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण में मदद करने के लिए मेडजीनोम इंक को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
100 bp Ladder Hyper Ladder BIOLINE BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder BIOLINE BIO-33056
Agarose Lonza Seachekm 50004
Betaine (5mM) Sigma B03001VL
Boric Acid Qualigens 12005
Cell culture plasticware Corning as appicable
Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma C1768-500MG
DMEM MP BIO 91233354
DMSO Wak Chemie GMBH Cryosure DMSO 10ml
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide Sigma E1510-10 mL
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044
Gel/PCR Purification Kit MACHEREY-NAGEL REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 23400021
Glacial Acetic Acid Thermo Q11007
hCMV GFP Plasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFPlasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T ATCC CRL-11268
HL60 cell line ATCC CCL-240
KOD Hot Start Polymerase Merck 71086
Molm13 cell line Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
MV4-11 cell line ATCC CRL-9591
Penicillin streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
psPAX2 and pMD2.G Addgene Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen REF Q32854
SFFV  GFP Plasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics Transomics Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus Mirus Mirus Catalog Number: MIR2300
Tris MP Biomedicals 0219485591
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154-100ML
Ultra centrifuge Tubes Beckman Coulter  103319
Equipments
5% CO2 incubator Thermo Fisher
BD Aria III cell sorter Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation Beckman coulter
Centrifuge Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) Fluro Chem
Leica AF600 Leica
Light Microscope Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop Thermo Scientific
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen
Thermal Cycler BioRad

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 184 उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग आरएनएआई स्क्रीनिंग shRNA epigenetic कारक cytarabine AraC प्रतिरोध
पूल shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग कारकों की पहचान करने के लिए जो एक दवा प्रतिरोध फेनोटाइप को संशोधित करते हैं
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Das, S., Stallon Illangeswaran, R.… More

Das, S., Stallon Illangeswaran, R. S., Ijee, S., Kumar, S., Velayudhan, S. R., Balasubramanian, P. Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype. J. Vis. Exp. (184), e63383, doi:10.3791/63383 (2022).

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