Summary
使用慢病毒 shRNA 池的高通量 RNA 干扰 （RNAi） 筛选可以成为检测恶性肿瘤中治疗相关合成致死靶标的工具。我们提供一种合并的shRNA筛选方法来研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传效应子。
Abstract
了解获得性化疗耐药的临床相关驱动因素机制对于阐明规避急性髓系白血病 （AML） 患者耐药性和提高生存率的方法至关重要。一小部分在化疗后存活的白血病细胞具有稳定的表观遗传状态，可以耐受化疗损伤。进一步暴露于化疗使这些药物持久性细胞达到固定的表观遗传状态，这导致基因表达改变，导致这些耐药人群的增殖，并最终复发或难治性疾病。因此，确定需要耐药性白血病细胞存活的表观遗传调节至关重要。我们详细介绍了一种方案，用于鉴定表观遗传调节剂，该方案使用在获得性抗阿糖胞苷的AML细胞系中进行池化shRNA文库筛选来介导对核苷类似物阿糖胞苷（AraC）的抗性。该文库由5，485个shRNA构建体组成，靶向407个人类表观遗传因子，允许高通量表观遗传因子筛选。
Introduction
急性髓系白血病（AML）的治疗选择在过去近五十年中一直保持不变，阿糖胞苷（AraC）和蒽环类药物是治疗该疾病的基石。AML治疗成功的挑战之一是白血病干细胞对化疗的抵抗力，导致疾病复发1，2。表观遗传调控在癌症发病机制和耐药性中起着至关重要的作用，几种表观遗传因素已成为有希望的治疗靶点3，4，5。表观遗传调控机制影响持续暴露于化疗药物下的增殖和存活。非血液恶性肿瘤的研究表明，克服药物效应的一小部分细胞经历各种表观遗传学修饰，导致这些细胞的存活率6，7。然而，表观遗传因素在介导AML中对阿糖胞苷的获得性耐药性中的作用尚未得到探索。
高通量筛选是一种药物发现方法，随着时间的推移，它已经获得了全球的重要性，并已成为不同方面的标准方法，用于鉴定细胞机制中的潜在靶标，用于途径分析以及分子水平8，9。合成致死性概念涉及两个基因之间的相互作用，其中任何一个基因的扰动单独是可行的，但两个基因同时导致生存能力的丧失10。在癌症治疗中利用合成致死性可以帮助识别和机械地表征强大的合成致死遗传相互作用11。我们采用了具有合成致死性的高通量shRNA筛选的组合方法，以确定AML中导致获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因素。
已知由混系白血病基因（MLL 或 KMT2A）染色体易位引起的急性白血病与患者生存率低有关。由此产生的 MLL 基因重排的嵌合产物，即MLL融合蛋白（MLL-FPs），可以在多种表观遗传因素的参与下将造血干细胞/祖细胞（HSPC）转化为白血病原始细胞。这些表观遗传调节剂构成了一个复杂的网络，决定了白血病计划的维持，因此可能形成潜在的治疗靶点。在这种情况下，我们使用MV4-11细胞系（含有MLL融合基因MLL-AF4和FLT3-ITD突变;称为MV4-11 P）来开发获得性阿糖胞苷抗性细胞系，称为MV4-11 AraC R。细胞系暴露于增加剂量的阿糖胞苷，从药物治疗中间歇性恢复，称为药物假期。通过 体外 细胞毒性测定评估半最大抑制浓度（IC50）。
我们使用由具有pZIP慢病毒主链的hEF1a启动子驱动的合并表观遗传shRNA文库（参见 材料表）。该文库包含靶向407个表观遗传因子的shRNA。每个因子有5-24个shRNA，总共有5，485个shRNA，包括5个非靶向对照shRNA。修饰的“UltrmiR”miR-30支架已针对高效的初级shRNA生物发生和表达12，13进行了优化。
该实验的轮廓如图 1A所示。目前的方案侧重于使用MV4-11 AraC R细胞系（图1B）中的表观遗传因子shRNA文库进行RNAi筛选，这是一种悬浮细胞系。该方案可用于筛选自己选择的任何耐药细胞系中的任何靶向文库。应该注意的是，贴壁细胞的转导方案将有所不同。
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Protocol
遵循机构生物安全委员会（IBSC）指南，并使用适当的设施处理慢病毒（BSL-2）。应对人员进行慢病毒处理和处置方面的适当培训。该协议遵循韦洛尔基督教医学院的生物安全指南。
1. 选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达
注意：必须使用具有表达荧光蛋白的不同启动子的慢病毒载体进行转导实验，以鉴定在为实验选择的细胞系中提供稳定和长期表达shRNA的启动子。为此目的最常用的启动子是表达绿色荧光蛋白（GFP）的hEF1α（人伸长因子1α），hCMV（人巨细胞病毒）和SSFV（脾脏聚焦形成病毒）启动子（图2A）。
- 使用台盼蓝排除方法进行细胞计数。将MV4-11 AraC R细胞悬浮在含有8μg/ mL聚苯乙烯的10%RPMI培养基（含有10%FBS的RPMI，补充有100 U / mL青霉素和100 U / mL链霉素）中。将1×106 个细胞接种在1.5mL培养基/孔中，一式三份。
- 向每个孔中加入不同体积的浓缩慢病毒（例如，10 μL、20 μL 和 40 μL，具体取决于慢病毒的滴度）。轻轻旋转盘子以混合内容物。
- 通过在37°C下以920× g 离心90分钟进行自旋干燥。
- 立即在CO2 培养箱中孵育板（37°C下5%CO2 ）。
- 在荧光显微镜下观察48小时后GFP表达，以确保成功转导。
- 72小时后通过流式细胞术定量GFP表达以评估转导效率。
- 培养细胞共2周，并通过流式细胞术定期监测GFP表达。通过平均荧光强度和GFP +细胞百分比测量的GFP表达的降低表明启动子沉默。
- 在第10天对GFP +细胞进行分选，并在分选后培养细胞1周。在培养过程中定期检查GFP表达。
- 使用未转导的细胞来设置门。x 轴上向右超过1 x 10 1 比例的人口被视为 GFP 的阳性总体。
- 选择在细胞的长时间培养中显示GFP持续表达的启动子。
2. 合并慢病毒人表观遗传因子shRNA文库的制备
- 在每个平板中用8mL 10%DMEM培养基（DMEM与10%FBS含有100 U / ml青霉素和100 U / ml链霉素）的三个10cm细胞培养皿中培养293T细胞（以具有良好增殖率的低传代数）。
- 一旦细胞达到60%汇合度，用完整的培养基替换培养基。
- 制备含有无血清培养基、慢病毒包装（psPAX2）和包膜质粒（pMD2.G）、合并文库质粒的转染混合物（如 表1所述），最后是转染试剂。
- 点击混合物将其充分混合，并在室温下孵育15分钟。
- 将转染混合物加入293T细胞中，并通过旋转板轻轻混合。将板在CO2 培养箱中孵育（37°C下5%CO2 ）。24小时后更换培养基。
- 48小时后，在荧光显微镜下检查GFP表达，以确保293T细胞中的高转染效率。
- 在48小时，60小时和72小时后收集病毒上清液并将其储存在4°C。 收集病毒后，在每个时间点加入新鲜培养基（8毫升）。
- 合并病毒上清液。合并病毒的总体积为：~8 mL/板 x 3 个集合 = ~24 mL/板;约 24 mL/板 x 3 个板 = 来自 3 个板的 ~72 mL。
- 使用 0.4 μm 过滤器过滤合并的病毒。
- 为了获得高滴度的病毒，通过超速离心浓缩合并的病毒。将过滤的病毒上清液转移到两个70 Ti管（32mL /管）中，并以18，000×g 离心2小时，缓慢加速和减速。使用预冷至4°C的转子和离心机。
- 轻轻地从离心机中取出试管，完全除去上清液。
- 使用微量移液管，轻轻地将沉淀重悬于400μLDMEM（不含FBS和抗生素）中。在冰上孵育1小时，并从两个管中混合沉淀。
- 等分病毒并在-80°C下冷冻。
注意：在步骤2.10.-2.13期间，管子和病毒必须保持在冰上。避免起泡，同时用普通培养基重悬病毒。培养基应保持在4°C。 - 计算病毒的浓度（x），如下所示：
浓缩前的总体积 = 72 mL （72，000 μL）
浓缩后的体积 = 400 μL
浓度 = 72，000/400 = 180x
3. 慢病毒转导效率的估计
- 用不同体积（2μL，4μL，8μL）的浓缩病毒转导293T细胞，以确认慢病毒的成功制备。
注意：如果浓缩病毒在小体积（1-2μL）中显示出高转导效率（>50%），建议将浓缩病毒稀释为所需的量（100x至75x）。 - 用DMEM（不含FBS和抗生素）将浓缩病毒稀释至100倍，以在MV4-11 AraC R细胞系中进行滴定实验。
- 将1×106 个细胞（MV4-11 AraC R细胞系在1.5mL含有8μg/ mL聚苯乙烯的10%RPMI培养基中）在一孔六孔板中。准备四个孔，用不同体积的病毒进行转导。
- 添加四个不同体积（例如，1 μL、1.5 μL、2 μL 和 2.5 μL）的 100 倍病毒。
- 通过在37°C下以920× g 离心板90分钟进行旋转干燥。
- 72小时后，通过流式细胞术测量GFP +细胞的百分比。
- 确定病毒的体积，以获得30%的转导效率。这种低转导效率是为了确保每个细胞的单个shRNA整合。
4. 耐药细胞系中合并表观遗传shRNA文库的转导
- 将靶细胞系MV4-11 AraC R维持在0.5 x 106 细胞/ mL密度。确保细胞在培养物中处于指数生长阶段。
- 根据病毒整合物的数量计算实验的细胞数量，如下所示。
转导所需的细胞数 = 5，485 （shRNA 数量） × 500 （折叠 shRNA 表示） / 0.25 （MOI） = 10，982，000 ~11 x 106 个细胞 - 将1.1 x 107 个细胞重悬于16 mL的10%RPMI培养基中。
- 加入聚苯乙烯（8μg/mL）并充分混合。然后，添加所需体积的病毒，以获得30%的转导效率，如上一节所述。
- 将所有细胞以每孔1×106 细胞/ 1.5mL的10%RPMI培养基的密度接种在六孔板上。
- 在37°C下以920× g 离心板90分钟。
- 将板在CO2 培养箱中孵育过夜（5%CO2 在37°C下）。
- 24小时后，更换培养基并将转导细胞转移到T-75烧瓶中。
- 48小时后，在荧光显微镜下检查GFP以确保成功转导。
- 72小时后，通过流式细胞术定量GFP +细胞的百分比。
5. 富集GFP阳性细胞
注意：通过将转导细胞以0.5 x 106 个细胞/ mL的密度培养5-7天来扩增转导细胞。这些细胞是转导和未转导的混合群体，通过分选基于GFP选择，如下一步所述。
- 对GFP+转导细胞进行流动分选，流动分选设置为高纯度和低产量。使用未转导的细胞来设置门。向右方向超过 1 x 102 的人口被视为阳性人口。
- 收集5%RPMI（含有5%FBS的RPMI，补充100 U / mL青霉素和100 U / mL链霉素）的分类细胞。
- 在10%RPMI培养基中培养分选的细胞。
- 72 h后，对GFP+细胞的百分比进行分选后估计，以确保>95%的分选效率。
注意：分选后确保获得~3-5 x 106 GFP阳性细胞，以获得450x至~500x的shRNA文库代表。
6. 辍学筛查，以确定介导耐药性的表观遗传因素
- 将shRNA文库在10%RPMI中培养转导细胞长达5天。如果需要，在药物治疗之前，冷冻保存转导细胞以供将来的实验使用。
- 在25°C下以280×g离心1×107 个细胞，两次离心5分钟。 弃去上清液，并将沉淀储存在-80°C。 这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线参考。
- 将剩余的转导细胞作为重复物（R1和R2）培养，每个细胞计数保持在细胞计数，提供库的500x表示。
- 用药物（10μM阿糖胞苷）（R2）治疗其中一个重复物，另一个不使用药物治疗（R1）。
- 每72小时更换一次有药和不带药物的烧瓶培养基。重复培养基更换3次，累积药物暴露9天。
- 药物治疗9天后，用台盼蓝排除法检查细胞的活力。
- 在室温下以280× g 离心剩余的细胞5分钟。将细胞重悬于无菌PBS中并洗涤细胞。在室温下以280× g 离心5分钟。
- 弃去上清液并将沉淀储存在-80°C用于DNA提取。
7. 通过PCR扩增整合的shRNA
- 从转导的基线细胞（T）（步骤6.2）和用药物（R2）处理和未用药物（R1）处理的细胞中提取DNA。
- 使用荧光计检查样品的浓度。
- 计算PCR所需的DNA量，如下所示：
5，485 （编号× 500（shRNA 表示）× 1 x 6.6−12 （g/二倍体基因组）= 15 μg DNA - 对样品进行第一轮PCR。
注：PCR反应混合物在 表2 中描述了热循环仪的条件。引物的详细情况见 补充表1。 - 建立每个管含有850 ng DNA的多个反应（总共43个反应）。
注意：第一轮PCR扩增shRNA的侧翼区域，导致扩增子大小为397 bp。 - 池化PCR产物并使用3-4柱标准凝胶/ PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
注： 详细信息见表 3。 - 从每柱中用50μL缓冲液洗脱产物并池化洗脱液。
- 定量DNA并将其储存在-20°C。
注：试剂在 表 4 中与热循环仪条件一起制成表格。第二轮PCR利用具有在单流细胞中对NGS进行多重检测所需的INDEX序列的引物。因此，每个样本都应使用不同的索引进行标记。引物序列在 补充表1中提供。 - 对于每个样品和阴性对照，用500ng的原PCR产物在50μL的总反应体积中建立四个反应。
- 使用2%TBE琼脂糖凝胶加载整个产品进行电泳，并使用1 kb分子梯确认条带尺寸。扩增子的大小为399 bp。
- 在凝胶文档系统上可视化PCR产物。
- 切除特定条带并使用凝胶纯化试剂盒纯化。
注：使用试剂盒进行纯化的计算结果见 表3。 - 在最终体积为30μL的洗脱缓冲液中洗脱。每种淋洗液的近似浓度约为80-90 ng/μL，总体积为30 μL。
8. 下一代测序和数据分析
- 对步骤7.13中的凝胶纯化产物进行排序。在下一代定序器（例如，Illumina）上，以获得耗尽的shRNA的读取计数。
- 使用 Fastx 工具包（版本 0.7）修剪生成的 FastQ 读取的适配器序列。
- 使用 Bowtie 对齐器将过滤后的读取值与参考序列对齐，其参数为允许两个不匹配。确保适配器微调后的读取长度约为 21 bp。
- 使用 Samtools（版本 1.9）程序加载文件。使用 Flagstat 选项并计算对齐摘要。
- 在CRISPRCloud2（CC2）软件（https://crispr.nrihub.org/）中加载修剪的fastQ文件以及FASTA文件形式的参考shRNA序列，并按照说明进行分析。
- 单击 CC2 中的 “开始分析 ”链接。
- 选择屏幕类型作为生存和辍学屏幕。设置组的数量并键入每个组的名称。
- 以 FASTA 文件格式上传参考库。上传的数据将被处理。单击输出 URL 以获取结果。
注意：该软件使用β-二项式模型和修改后的学生t检验来测量sgRNA / shRNA水平的差异，然后使用Fisher的组合概率检验来估计基因水平的显着性。它以“p值”和“FDR值”计算处理（富集/耗尽）和未处理样品（基线）之间表观遗传因子的shRNA估计总对数2倍变化（Log2Fc）。
- 确保“辍学”屏幕的 FDR 值为“负”，生存屏幕的 FDR 值为“正”。
注意：CC2是一个分析平台，用于计算读数并计算样品之间shRNA的折叠表示（富集或耗尽）。 - 从CC2结果中鉴定显着富集和耗尽的shRNA（FDR <0.05）。
注意：每个因子有5-24个shRNA。检查每个 shRNA 的 FDR 值;考虑FDR，它是<0.01，并取所选shRNA的平均值。考虑前 40 个点击。根据 Log2Fc 或 FDR 负值绘制所选因子的图形。确保非靶向 shRNA 也具有显著的 FDR 值，以确保数据的真实性，因为它们充当对照 shRNA。
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Representative Results
整体筛选工作流程如图1A所示。MV4-11 AraC R的体外细胞毒性（48小时）显示MV4-11 AraC R中CYTARABINE的IC50高于MV4-11 P（图1B）。该细胞系在研究中被用作筛选导致阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子的模型。
图2A 显示了具有三种不同启动子的线性化pZIP载体图谱：hEF1α（人伸长因子1α），hCMV（人巨细胞病毒）和SSFV（脾脏聚焦形成病毒），其中加扰的shRNA在UltramiR序列中。 图2B 说明了文库实验中使用的pZIP载体图谱和靶向表观遗传因子的shRNA，其中Zsgreen和嘌呤霉素作为由hEF1a启动子驱动的可选标记。这些载体用于选择最有效的启动子实验。
选择最有效的启动子以在靶细胞中获得一致和延长的表达如图 3所示。MFI测量的GFP定量显示，在所有3种启动子的MV4-11 AraC R中72 h结束时转导效率均超过90%。GFP表达的直方图显示hCMV的异质群体，但在转导的第3天，hEF1a和SFFV的情况是同质的群体（图3A）。条形图显示了在MV4-11 AraC R转导的第3天由三种不同的启动子（hEF1α，hCMV和SFFV）驱动的GFP表达（图3B）。SFFV驱动的GFP在转导的第5天显示MFI降低（图3C）。在hEF1a驱动的GFP转导MV4-11亲本系分选后未观察到MFI降低。因此，hEF1a启动子被鉴定为细胞系的合适启动子（图3D）。
图4A 说明了转染48小时后293T细胞中混合的shRNA文库质粒的转染效率。GFP表达明亮，表明转染效率良好。病毒收集后，在293T细胞中以三种不同浓度（2μL，4μL和8μL）检查制备的合并病毒的转导效率。我们观察到，即使是2μL病毒也会产生与8μL病毒相同的效率，从而证实了高病毒滴度（图4B）。
图5 说明了MV4-11 AraC R细胞系中的合并文库转导和慢病毒滴度的测定。将合并的shRNA文库慢病毒稀释100倍，然后以不同的体积（1μL，1.5μL，2μL和2.5μL）加入MV4-11 AraC R细胞系中。在72小时结束时检查效率。对于2-2.5μL病毒，转导效率为30%，确认每个细胞1个shRNA整合（图5A）。在1.1 x 107 MV4-11 AraC R细胞中转导2.5μl合并的文库病毒导致30%的转导效率。对GFP阳性细胞进行分类，代表合并的shRNA文库（图5B）。
在MV4-11 AraC R细胞系中转导合并的shRNA表观遗传慢病毒后，在第5天或第7天对GFP阳性细胞进行分类（图6）。这些分类的细胞长时间暴露于阿糖胞苷9天。在第9天检查活力，并收集细胞进行DNA检测。（图 6A）。条形图显示了在阿糖胞苷存在下转导细胞增殖速率的降低（图6B）。
从样品中提取的DNA进行两轮PCR，最终凝胶洗脱产物代表NGS定量的富集shRNA。 图7A 显示了第一轮和第二轮PCR中使用的引物的结合区域，其中第一轮引物与整合的shRNA的侧翼区域结合，第二种前向引物与环序列结合。反向引物在第一轮PCR中与扩增载体的一个区域结合。 图7B 和 图7C 说明了PCR产物在第一轮（397 bp）和第二轮PCR（399 bp）结束时的条带尺寸，该PCR产物被凝胶洗脱，纯化并提交NGS分析。
在将DNA进行标准质量控制程序后，对样品进行处理以进行NGS分析。我们使用CRISPRCloud2，这是一个用户友好的基于云的分析平台，用于在合并的shRNA筛选中鉴定富集和耗尽的shRNA。 图8 说明了富集或耗尽的shRNA的表示，这些shRNA靶向可能介导AML中阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子。
图 1：研究的概要和模型。 （A） 工作流程概述的图示。（B）用增加的阿糖胞苷浓度（0.1μM至1000μM）处理的MV4-11亲本和AraC抗性细胞，并通过MTT测定评估活力。 请点击此处查看此图的大图。
图 2.线性化向量的图示。 （A）具有三种不同启动子的三种载体图谱，hEF1α（人伸长因子1α），hCMV（人巨细胞病毒）和SSFV（脾脏聚焦形成病毒），其中扰定的shRNA在UltramiR序列内。（B）用hEF1α启动子和靶向表观遗传因子的shRNA作为可选标记的文库实验中使用的载体图谱的图示。 请点击此处查看此图的大图。
图3：选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和延长表达。 （A）GFP的代表性流图，在72小时结束时通过流式细胞术对hEF1a，hCMV和SFFV启动子进行定量。hCMV显示异质峰，而hEF1a和SFFV显示单个均质峰。（B）MV4-11 AraC R细胞系中的启动子效率。（C） SFFV驱动的GFP在长期培养中显示GFP沉默。（D）hEF1a驱动的GFP细胞在分选后显示持续表达的细胞。 请点击此处查看此图的大图。
（A）荧光显微镜图像显示48小时结束时使用10倍放大倍率在293T中转染的合并shRNA文库的转染效率。（B）使用10倍放大率在具有不同病毒体积（2μL，4μL和8μL）的293T细胞中评估合并病毒的转导效率。请点击此处查看此图的大图。
图5：靶细胞系中的合并文库转导和慢病毒滴度测定 （A）MV4-11 AraC R细胞系用不同体积的病毒（1μL，1.5μL，2μL和2.5μL）转导。（B）将池化文库病毒转导在1×107 MV4-11 AraC R细胞中，达到30%的转导效率，然后对GFP阳性细胞进行分选。 请点击此处查看此图的大图。
图6：滴出筛选以识别介导耐药性的表观遗传因素。 （A）用于富集耐药细胞的药物治疗的示意图。将文库感染的细胞长期暴露于阿糖胞苷9天，然后检查活力并收集细胞进行DNA提取。（B）在耐药细胞系中长期暴露于阿糖胞苷的活力降低。 请点击此处查看此图的大图。
（A）第一轮和第二轮PCR中使用的引物的结合区域，其中第一轮引物与整合的shRNA的侧翼区域结合，第二种前向引物与环序列结合。反面结合到第一PCR中扩增的载体区域的区域。（B）第一轮PCR结束时PCR产物的条带尺寸图（397 bp）。（C）第二轮PCR产物（399bp）凝胶洗脱，纯化并给予NGS。请点击此处查看此图的大图。
图8：AML细胞系（MV-4-11 Ara-C R细胞系）的筛选结果。 在将DNA进行标准质量控制程序后，对样品进行处理以进行NGS分析。我们使用CRISPRCloud2，一个用户友好的基于云的分析平台，在池化shRNA筛选中鉴定富集和耗尽的shRNA。 该图代表富集或耗尽的shRNA靶向表观遗传因子，这些因子可能介导AML中的阿糖胞苷耐药性。 请点击此处查看此图的大图。
表1：转染质粒混合物的制备（10cm板的计算）请点击这里下载此表。
表2：第一轮PCR的PCR反应混合物请点击这里下载此表。
表3：1st PCR产物的纯化计算请点击这里下载此表。
表4：第二轮PCR的PCR反应混合物 请点击这里下载此表。
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Discussion
RNA干扰（RNAi）广泛用于功能基因组学研究，包括siRNA和shRNA筛选。shRNA的好处是它们可以掺入质粒载体中并整合到基因组DNA中，从而实现稳定的表达，从而延长靶mRNA的敲低时间。与传统的阵列筛选（siRNA）相比，合并的shRNA文库筛选具有稳健性和成本效益。在全基因组筛选中鉴定特定类别蛋白质的本质可能很麻烦。靶向筛选方法可以揭示单个蛋白质对特定类别中癌细胞存活或耐药性的重要性，同时降低噪声。该协议突出了表观遗传因子的RNAi筛选，以系统地询问必需和非必需基因，并证明了将这种方法用作功能平台，允许鉴定导致AML耐药性的靶标。
这种强大的技术要求在设计和执行实验时采取一定的预防措施。首先是选择在细胞培养过程中不经历显着沉默的启动子以表达shRNA，因为它们的稳健表达对于靶基因的敲低至关重要。其次，维持shRNA的代表性（每个shRNA转导的细胞数量）特别重要。在整个shRNA筛选过程中，每个shRNA构建体的平均>500个细胞的代表性增加了鉴定引起表型效应的shRNA的潜力。
RNAi筛选策略是一种竞争性的增长筛选;因此，确保靶细胞处于对数生长阶段并且在筛选过程中不会过度汇合，以最大限度地减少由生长受限引起的代表性损失至关重要。理想的情况是将细胞保持在50%-70%汇合处，以尽量减少实验变异。我们建议在所有筛分重复中保持一致的培养基、血清、病毒上清液、药物和组织培养塑料器皿，以减少实验变异。
建议进行试点实验以优化慢病毒的转导效率，以计算实现每个细胞的shRNA一次整合所需的病毒体积。为了实现每个细胞一个shRNA的整合，转导效率应小于30%。由于病毒的量，获得30%的转导细胞可以在用于实验的细胞系之间变化，因此需要对每个细胞系进行标准化实验。转导效率也可能受到细胞培养条件和细胞增殖速率的影响。因此，应在中试实验中使用与筛选实验中使用的相同条件来确定功能滴度。始终建议保持3-6次重复以获得具有统计学意义的命中率。
shRNA筛选方法的两个主要问题是shRNA16的脱靶效应和可变的敲低效率。这些可以通过使用每个基因的多个shRNA来克服。在哺乳动物细胞中调整原核免疫系统CRISPR-Cas9允许在培养的人类细胞中进行简单，高效且具有成本效益的基因组编辑。该系统已被广泛用于进行全基因组遗传筛选，类似于使用shRNA进行的遗传筛选。携带特定单向导RNA（sgRNA）序列的细胞的命运可以使用深度测序进行监测。这里概述的实验设置也可用于CRISPR筛选。
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Disclosures
作者没有利益冲突，也没有什么可披露的。
Acknowledgments
这项研究部分由生物技术部BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013向SRV拨款资助;和印度生物技术部BT /COE/34/SP13432/2015和印度科学技术部：EMR/2017/003880至P.B. RVS和P.B分别得到惠康DBT印度联盟IA/S/17/1/503118和IA/S/15/1/501842的支持。S.D.由CSIR-UGC奖学金支持，S.I.由ICMR高级研究奖学金支持。我们感谢Abhirup Bagchi，Sandya Rani和CSCR流式细胞术核心设施工作人员的帮助。我们还感谢MedGenome Inc.在高通量测序和数据分析方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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