Summary
RNA-interferens (RNAi) screening med hög genomströmning med hjälp av en pool av lentivirala shRNA kan vara ett verktyg för att detektera terapeutiskt relevanta syntetiska dödliga mål vid maligniteter. Vi tillhandahåller en poolad shRNA-screeningmetod för att undersöka de epigenetiska effektorerna vid akut myeloisk leukemi (AML).
Abstract
Att förstå kliniskt relevanta drivkraftsmekanismer för förvärvad kemoresistens är avgörande för att belysa sätt att kringgå resistens och förbättra överlevnaden hos patienter med akut myeloisk leukemi (AML). En liten del av leukemiska celler som överlever kemoterapi har ett redo epigenetiskt tillstånd för att tolerera kemoterapeutisk förolämpning. Ytterligare exponering för kemoterapi gör det möjligt för dessa läkemedelsbeständiga celler att uppnå ett fast epigenetiskt tillstånd, vilket leder till förändrat genuttryck, vilket resulterar i spridning av dessa läkemedelsresistenta populationer och så småningom återfall eller eldfast sjukdom. Därför är det viktigt att identifiera epigenetiska moduleringar som kräver överlevnad av läkemedelsresistenta leukemiska celler. Vi beskriver ett protokoll för att identifiera epigenetiska modulatorer som förmedlar resistens mot nukleosidanalog cytarabin (AraC) med hjälp av poolad shRNA-biblioteksscreening i en förvärvad cytarabinresistent AML-cellinje. Biblioteket består av 5 485 shRNA-konstruktioner riktade mot 407 humana epigenetiska faktorer, vilket möjliggör epigenetisk faktorscreening med hög genomströmning.
Introduction
Terapeutiska alternativ vid akut myeloisk leukemi (AML) har varit oförändrade under nästan de senaste fem decennierna, med cytarabin (AraC) och antracykliner som hörnstenen för behandling av sjukdomen. En av utmaningarna för framgången med AML-terapi är leukemiska stamcellers resistens mot kemoterapi, vilket leder till sjukdomsåterfall 1,2. Epigenetisk reglering spelar en viktig roll i cancerpatogenes och läkemedelsresistens, och flera epigenetiska faktorer har framkommit som lovande terapeutiska mål 3,4,5. Epigenetiska regleringsmekanismer påverkar proliferation och överlevnad under kontinuerlig exponering för kemoterapeutiska läkemedel. Studier av icke-hematologiska maligniteter har rapporterat att en liten del av cellerna som övervinner läkemedelseffekten genomgår olika epigenetikmodifieringar, vilket resulterar i dessa cellers överlevnad 6,7. Emellertid, den roll som epigenetiska faktorer spelar för att förmedla förvärvad resistens mot cytarabin i AML har inte undersökts.
Screening med hög genomströmning är ett tillvägagångssätt för läkemedelsupptäckt som har fått global betydelse över tid och har blivit en standardmetod i olika aspekter för att identifiera potentiella mål i cellulära mekanismer, för vägprofilering och på molekylär nivå 8,9. Det syntetiska dödlighetskonceptet involverar interaktionen mellan två gener där störningen av endera genen ensam är livskraftig men av båda generna samtidigt resulterar i förlust av livskraft10. Utnyttjande av syntetisk dödlighet vid cancerbehandling kan bidra till att identifiera och mekaniskt karakterisera robusta syntetiska dödliga genetiska interaktioner11. Vi har antagit ett kombinatoriskt tillvägagångssätt för shRNA-screening med hög genomströmning med syntetisk dödlighet för att identifiera de epigenetiska faktorer som är ansvariga för förvärvad cytarabinresistens vid AML.
Akuta leukemier som drivs av kromosomal translokation av den blandade leukemigenen (MLL eller KMT2A) är kända för att vara associerade med dålig överlevnad hos patienter. De resulterande chimärta produkterna av MLL-genomläggningar, dvs MLL-fusionsproteiner (MLL-FP), kan omvandla hematopoetiska stam- / stamceller (HSPC) till leukemiska blaster med inblandning av flera epigenetiska faktorer. Dessa epigenetiska regulatorer utgör ett komplicerat nätverk som dikterar upprätthållandet av leukemiprogrammet och kan därför bilda potentiella terapeutiska mål. I detta sammanhang använde vi MV4-11-cellinjen (som hyser MLL-fusionsgenen MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; benämnd MV4-11 P) för att utveckla den förvärvade cytarabinresistenta cellinjen, benämnd MV4-11 AraC R. Cellinjen utsattes för ökande doser av cytarabin med intermittent återhämtning från läkemedelsbehandlingen, känd som en läkemedelssemester. Den halvmaximatiska hämmande koncentrationen (IC50) bedömdes genom cytotoxicitetsanalys in vitro.
Vi använde det poolade epigenetiska shRNA-biblioteket (se Materialtabell) som drivs av hEF1a-promotorn med en pZIP-lentiviral ryggrad. Detta bibliotek består av shRNA som riktar sig till 407 epigenetiska faktorer. Varje faktor har 5-24 shRNA, med totalt 5 485 shRNA, inklusive fem icke-riktade kontrolls-shRNA. Den modifierade "UltrmiR" miR-30-ställningen har optimerats för effektiv primär shRNA-biogenes och uttryck12,13.
Konturerna av detta experiment illustreras i figur 1A. Det nuvarande protokollet fokuserar på RNAi-screening med användning av det epigenetiska faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellinjen (figur 1B), en suspensionscellinje. Detta protokoll kan användas för att screena alla riktade bibliotek i valfri läkemedelsresistent cellinje. Det bör noteras att transduktionsprotokollet kommer att vara annorlunda för vidhäftande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följ riktlinjerna från Institutional Biosafety Committee (IBSC) och använd rätt anläggning för att hantera lentivirus (BSL-2). Personalen bör ha lämplig utbildning i hantering och bortskaffande av lentivirus. Detta protokoll följer riktlinjerna för biosäkerhet från Christian Medical College, Vellore.
1. Val av den mest potenta promotorn för att erhålla ihållande och långvarigt uttryck av shRNA: erna
OBS: Det är viktigt att utföra ett transduktionsexperiment med lentivirala vektorer med olika promotorer som uttrycker fluorescensproteiner för att identifiera promotorn som ger ett stabilt och långsiktigt uttryck av shRNA i cellinjen som valts för experimentet. De vanligaste promotorerna för detta ändamål är hEF1α (human förlängningsfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) och SSFV (mjältefokusbildande virus) promotorer som uttrycker grönt fluorescensprotein (GFP) (Figur 2A).
- Utför cellantalet med hjälp av trypan blue-uteslutningsmetoden. Suspendera MV4-11 AraC R-cellerna i 10 % RPMI-medium (RPMI med 10 % FBS kompletterat med 100 U/ml penicillin och 100 U/ml streptomycin) innehållande 8 μg/ml polybren. Frö 1 x 106 celler i 1,5 ml medium/brunn av en sexbrunnsplatta i tre exemplar.
- Tillsätt olika volymer koncentrerade lentivirus (till exempel 10 μL, 20 μL och 40 μL beroende på titer av lentivirus) till varje brunn. Virvla försiktigt plattan för att blanda innehållet.
- Utför spinfektion genom centrifugering vid 920 x g vid 37 °C i 90 min.
- Inkubera omedelbart plattorna i enCO2-inkubator (5% CO2 vid 37 °C).
- Observera GFP-uttrycket efter 48 timmar under ett fluorescensmikroskop för att säkerställa framgångsrik transduktion.
- Kvantifiera GFP-uttrycket med flödescytometri efter 72 timmar för att utvärdera transduktionseffektiviteten.
- Odla cellerna i totalt 2 veckor och övervaka GFP-uttrycket regelbundet med flödescytometri. Minskningen av GFP-uttryck mätt med den genomsnittliga fluorescensintensiteten och procentandelen GFP+-celler indikerar promotorns tystnad.
- Sortera GFP+ -cellerna på den 10: e dagen och odla cellerna i 1 vecka efter sortering. Kontrollera GFP-uttrycket regelbundet under kulturen.
- Använd de oöversatta cellerna för att ställa in porten. En population bortom skalan 1 x10 1 till höger på x-axeln anses vara en positiv population för GFP.
- Välj promotorn som visar ett ihållande uttryck av GFP i cellernas långvariga kultur.
2. Beredning av poolat lentiviralt humant epigenetiskt faktor shRNA-bibliotek
- Odling 293T-celler (vid ett lågt passagetal med god proliferationshastighet) i tre 10 cm cellodlingsskålar med 8 ml 10% DMEM-medium (DMEM med 10% FBS innehållande 100 U / ml penicillin och 100 U / ml streptomycin) i varje platta.
- När cellerna uppnår 60% sammanflöde, ersätt mediet med ett komplett medium.
- Förbered transfektionsblandningen (enligt tabell 1) som innehåller serumfria medium, lentiviral förpackning (psPAX2) och kuvertplasmid (pMD2.G), poolade biblioteksplasmider och slutligen transfektionsreagenset.
- Tryck på blandningen för att blanda den väl och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tillsätt transfektionsblandningen till 293T-cellerna och blanda försiktigt genom att virvla plattorna. Inkubera plattorna i enCO2-inkubator (5% CO2 vid 37 °C). Byt medium efter 24 timmar.
- Efter 48 timmar, kontrollera om GFP-uttryck under ett fluorescensmikroskop säkerställer hög transfektionseffektivitet i 293T-cellerna.
- Samla viruset supernatanter efter 48 h, 60 h och 72 h och förvara dem vid 4 ° C. Tillsätt färskt medium (8 ml) vid varje tidpunkt efter insamling av viruset.
- Poola viruset supernatanter. Den totala volymen av de poolade virusen kommer att vara: ~ 8 ml / platta x 3 samlingar = ~ 24 ml / platta; ~ 24 ml / platta x 3 plattor = ~ 72 ml från 3 plattor.
- Filtrera de poolade virusen med 0,4 μm-filtret.
- För att erhålla en hög titer av virus, koncentrera de poolade virusen genom ultracentrifugering. Överför det filtrerade virussupernatanten till två 70 Ti-rör (32 ml/rör) och centrifugen vid 18 000x g i 2 timmar med långsam acceleration och retardation. Använd en rotor och centrifug förkyld till 4 °C.
- Ta försiktigt ut rören från centrifugen och ta bort supernatanten helt.
- Använd en mikropipett och försiktigt resuspendera pelletsen i 400 μL DMEM (utan FBS och antibiotika). Inkubera på isen i 1 timme och blanda pelletsen från båda rören.
- Alicitera virusen och frys vid −80 ° C.
OBS: Rören och virusen måste hållas på is under steg 2.10.-2.13. Undvik skumning medan du återanvänder viruset med det vanliga mediet. Mediet ska hållas vid 4 °C. - Beräkna koncentrationen (x) av virus enligt nedan:
Total volym före koncentration = 72 ml (72 000 μL)
Volym efter koncentrering = 400 μL
Koncentrationen = 72 000/400= 180x
3. Uppskattning av transduktionseffektiviteten hos lentivirus
- Transducera 293T-celler med det koncentrerade viruset i olika volymer (2 μL, 4 μL, 8 μL) för att bekräfta den framgångsrika beredningen av lentivirus.
OBS: Om koncentrerade virus visar hög transduktionseffektivitet (>50%) i små volymer (1-2 μL), är det lämpligt att späda det koncentrerade viruset i önskade mängder (100x till 75x). - Späd det koncentrerade viruset till 100x med DMEM (utan FBS och antibiotika) för att utföra titreringsexperiment i MV4-11 AraC R-cellinjen.
- Frö 1 x 106 celler (MV4-11 AraC R-cellinje i 1,5 ml 10% RPMI-medium innehållande 8 μg / ml polybren) i en brunn av en sexbrunnsplatta. Förbered fyra brunnar för kodning med olika volymer virus.
- Lägg till fyra olika volymer (till exempel 1 μL, 1,5 μL, 2 μL och 2,5 μL) av 100x virus.
- Utför spinfektion genom centrifugering av plattan vid 920 x g i 90 min vid 37 °C.
- Efter 72 timmar mäter du procentandelen GFP+-celler med flödescytometri.
- Bestäm virusvolymen för att erhålla 30% transduktionseffektivitet. Denna låga transduktionseffektivitet är att säkerställa en enda shRNA-integration per cell.
4. Transduktion av poolat epigenetiskt shRNA-bibliotek i den läkemedelsresistenta cellinjen
- Behåll målcellinjen MV4-11 AraC R vid en densitet på 0,5 x 106 celler/ml. Se till att cellerna befinner sig i exponentiell tillväxtfas i odlingen.
- Beräkna antalet celler som ska tas för experimentet enligt nedan baserat på antalet virala integranter.
Antal celler som krävs för transduktion = 5 485 (antal shRNA) × 500 (vik shRNA-representation) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~ 11 x 106 celler - Resuspend 1,1 x 107 celler i 16 ml 10% RPMI-medium.
- Tillsätt polybren (8 μg / ml) och blanda väl. Lägg sedan till den önskade volymen virus för att erhålla 30% transduktionseffektivitet enligt beräknad i föregående avsnitt.
- Frö alla celler på en sexbrunnsplatta med en densitet av 1 x 106 celler / 1,5 ml 10% RPMI-medium per brunn.
- Centrifugera plattan i 90 min vid 920 x g vid 37 °C.
- Inkubera plattan över natten i enCO2-inkubator (5% CO2 vid 37 ° C).
- Efter 24 timmar byter du mediet och överför de transducerade cellerna till en T-75-kolv.
- Efter 48 timmar, kontrollera GFP under ett fluorescensmikroskop för att säkerställa framgångsrik transduktion.
- Efter 72 timmar, kvantitera procentandelen GFP + -celler genom flödescytometri.
5. Anrikning av GFP-positiva celler
OBS: Expandera de transducerade cellerna genom att odla dem med en densitet av 0,5 x 106 celler / ml i 5-7 dagar. Dessa celler är en blandad population av transducerade och otransducerade, valda baserat på GFP genom sortering, som nämnts i nästa steg.
- Utför flödessortering av GFP+-transducerade celler med flödessorteringsinställningarna inställda som hög renhet och lågt utbyte. Använd de oöversatta cellerna för att ställa in porten. En befolkning bortom 1 x 102 mot höger anses vara en positiv befolkning.
- Samla de sorterade cellerna i 5% RPMI (RPMI med 5% FBS kompletterat med 100 U / ml penicillin och 100 U / ml streptomycin).
- Odla de sorterade cellerna i ett 10% RPMI-medium.
- Efter 72 timmar utför du eftersorteringsuppskattningen av procentandelen GFP+-celler för att säkerställa >95% sorteringseffektivitet.
OBS: Se till att få ~ 3-5 x 106 GFP-positiva celler efter sortering för att få 450x till ~ 500x representation av shRNA-biblioteket.
6. Dropout screening för att identifiera epigenetiska faktorer som förmedlar läkemedelsresistens
- Odla shRNA-bibliotekets transducerade celler i 10% RPMI i upp till 5 dagar. Kryokonservera de transducerade cellerna för framtida experiment, om det behövs, före läkemedelsbehandlingen.
- Centrifug 1 x 107 celler i dubbletter vid 280 x g i 5 min vid 25 °C. Kassera supernatanten och förvara pelletsen vid −80 °C. Dessa prover kommer att fungera som baslinjereferens för det epigenetiska shRNA-biblioteket.
- Odla de återstående transducerade cellerna som dubbletter (R1 och R2), var och en bibehållen vid ett cellantal som ger en 500x representation av biblioteket.
- Behandla en av dubbletterna med läkemedlet (10 μM cytarabin) (R2) och den andra utan läkemedelsbehandling (R1).
- Byt medium för kolvarna med och utan läkemedlet var 72: e timme. Upprepa medieförändringen 3x för en kumulativ läkemedelsexponering på 9 dagar.
- Efter 9 dagars läkemedelsbehandling, kontrollera cellernas livskraft med trypanblå uteslutningsmetoden.
- Centrifugera de återstående cellerna vid 280 x g i 5 min vid rumstemperatur. Resuspendera cellerna i steril PBS och tvätta cellerna. Centrifug vid 280 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och förvara pelletsen vid −80 °C för DNA-extraktion.
7. Förstärkning av de integrerade shRNA med PCR
- Extrahera DNA från de transducerade baslinjecellerna (T) (steg 6.2.) och cellerna som behandlas med läkemedlet (R2) och obehandlas med läkemedlet (R1).
- Kontrollera provets koncentration med hjälp av en fluorometer.
- Beräkna mängden DNA som krävs för PCR enligt nedan:
5 485 (nr. av shRNA) × 500 (shRNA-representation) × 1 x 6,6−12 (g/diploidgenom) = 15 μg DNA - Utsätt proverna för den första omgången PCR.
OBS: PCR-reaktionsblandningen visas i tabell 2 med termiska cykelförhållanden. Närmare uppgifter om primrar finns i kompletterande tabell 1. - Ställ in flera reaktioner innehållande 850 ng DNA per rör (för totalt 43 reaktioner).
OBS: Den första omgången av PCR förstärker shRNA: s flankerande regioner vilket resulterar i en amplikonstorlek på 397 bp. - Slå ihop PCR-produkterna och rena PCR-produkterna med 3-4 kolumner i en standard gel/PCR-reningssats.
ANMÄRKNING: Detaljer finns i tabell 3. - Eluera produkten i 50 μL buffert från varje kolonn och slå samman eluterna.
- Kvantifiera DNA och lagra det vid −20 °C.
OBS: Reagenserna är tabellerade i tabell 4 med termiska cykler. Den andra omgången PCR använder primrar med den INDEX-sekvens som krävs för multiplexering i NGS i en enflödescell. Så varje prov bör märkas med ett annat index. Primersekvenser finns i kompletterande tabell 1. - Ställ in fyra reaktioner med 500 ng av den primära PCR-produkten i en total reaktionsvolym på 50 μL för varje prov och den negativa kontrollen.
- Ladda hela produkten för elektrofores med 2% TBE agarosgel och bekräfta bandstorleken med en 1 kb molekylär stege. Amplikonens storlek är 399 bp.
- Visualisera PCR-produkterna på geldokumentationssystemet.
- Punktbeskatta det specifika bandet och rena med hjälp av ett gelreningssats.
OBS: Beräkningar för rening med satsen finns i tabell 3. - Eluera i en slutlig volym av 30 μL elueringsbuffert. Den ungefärliga koncentrationen av varje elueringsmedel kommer att vara cirka 80-90 ng / μL med en total volym på 30 μL.
8. Nästa generations sekvensering och dataanalys
- Sekvensera den gelrenade produkten från steg 7.13. på en nästa generations sequencer (t.ex. Illumina) för att få läsantalet för de utarmade shRNA: erna.
- Trimma adaptersekvenserna för de genererade FastQ-läsningarna med hjälp av Fastx-verktygssatsen (version 0.7).
- Justera de filtrerade läsningarna till referenssekvenser med hjälp av en Bowtie-justerare med parametern att tillåta två matchningsfel. Se till att läslängden efter adaptertrimning är cirka 21 bp.
- Ladda filerna med samtools (version 1.9) programmet. Använd alternativet Flaggstat och beräkna justeringssammanfattningen.
- Ladda de trimmade fastQ-filerna i CRISPRCloud2 (CC2) programvara (https://crispr.nrihub.org/) tillsammans med referens shRNA-sekvenserna i form av FASTA-filer och utför analysen enligt instruktionerna.
- Klicka på länken Starta analys i CC2.
- Välj skärmtyp som överlevnads- och avhoppsskärmar. Ange antalet grupper och skriv namnet för varje grupp.
- Ladda upp referensbiblioteket i FASTA-filformat. De uppladdade uppgifterna bearbetas. Klicka på utdata-URL:en för att få resultaten.
OBS: Denna programvara använder en beta-binomialmodell med ett modifierat studentens t-test för att mäta skillnader i sgRNA / shRNA-nivåer, följt av Fishers kombinerade sannolikhetstest för att uppskatta gennivåns betydelse. Den beräknar uppskattade totala log 2-faldiga förändringar (Log2Fc) av shRNA för de epigenetiska faktorerna mellan de behandlade (berikade/utarmade) och de obehandlade proverna (baslinjen) med "p-värden" och "FDR-värden".
- Se till att FDR-värdet är "Negativt" för en dropout-skärm och "positivt" för en överlevnadsskärm.
OBS: CC2 är en analysplattform för att räkna läsningarna och beräkna vikningsrepresentationen (anrikning eller utarmning) av shRNA mellan prover. - Identifiera de signifikant berikade och utarmade shRNA (FDR <0.05) från CC2-resultaten.
OBS: Det finns 5-24 shRNA mot varje faktor. Kontrollera FDR-värdena för var och en av shRNA: erna; tänk på FDR, som är <0,01, och ta ett genomsnitt för de valda shRNA: erna. Tänk på de 40 bästa träffarna. Rita diagrammet för de valda faktorerna baserat på Log2Fc- eller FDR-negativa värden. Se till att de icke-målinriktade shRNA:erna också har betydande FDR-värden för att säkerställa att data är autentiska eftersom de fungerar som kontroll-shRNA:er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det övergripande arbetsflödet för screening visas i figur 1A. Cytotoxiciteten in vitro hos MV4-11 AraC R (48 timmar) visade att IC50 till cytarabin i MV4-11 AraC R var högre än MV4-11 P (figur 1B). Denna cellinje användes i studien som modell för screening av de epigenetiska faktorer som är ansvariga för cytarabinresistens.
Figur 2A visar de linjäriserade pZIP-vektorkartorna med tre olika promotorer: hEF1α (human förlängningsfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) och SSFV (mjältefokusbildande virus), med det förvrängda shRNA inom UltramiR-sekvensen. Figur 2B illustrerar pZIP-vektorkartan som används i biblioteksexperimentet och shRNA som riktar sig mot den epigenetiska faktorn med Zsgreen och puromycin som den valbara markören som drivs av hEF1a-promotorn. Dessa vektorer användes vid valet av det mest potenta promotorexperimentet.
Valet av den mest potenta promotorn för att få ett konsekvent och långvarigt uttryck i målcellerna illustreras i figur 3. Kvantifieringen av GFP mätt med MFI visade mer än 90% transduktionseffektivitet i slutet av 72 timmar i MV4-11 AraC R för alla tre promotorerna. Histogrammet för GFP-uttryck visar en heterogen population för hCMV men en homogen population för hEF1a och SFFV vid dag 3 av transduktionen (figur 3A). Stapeldiagrammet visar GFP-uttrycket som drivs av tre olika promotorer (hEF1α, hCMV och SFFV) vid dag 3 av transduktionen i MV4-11 AraC R (figur 3B). SFFV-driven GFP visade en minskning av MFI på dag 5 av transduktionen (figur 3C). Ingen minskning av MFI observerades i den hEF1a-drivna GFP-transducerade MV4-11 föräldralinjen efter sortering. Således identifierades hEF1a-promotorn som en lämplig promotor för cellinjen (figur 3D).
Figur 4A illustrerar transfektionseffektiviteten hos de poolade shRNA-biblioteksplasmiderna i 293T-celler efter 48 timmars transfektion. GFP-uttrycket var ljust, vilket indikerar god transfektionseffektivitet. Efter virusinsamlingen kontrollerades transduktionseffektiviteten hos det beredda poolade viruset i 293T-celler i tre olika koncentrationer (2 μL, 4 μL och 8 μL). Vi observerade att även 2 μL-virus resulterade i samma effektivitet som 8 μL-viruset, vilket bekräftade den höga virala titern (figur 4B).
Figur 5 illustrerar den sammanförda bibliotekstransduktionen i MV4-11 AraC R-cellinjen och bestämningen av lentiviraltitern. Det poolade shRNA-biblioteket lentivirus späddes 100x och tillsattes sedan till MV4-11 AraC R-cellinjen i olika volymer (1 μL, 1,5 μL, 2 μL och 2,5 μL). Effektiviteten kontrollerades i slutet av 72 timmar. Transduktionseffektiviteten var 30% för 2-2,5 μL av viruset, vilket bekräftade en shRNA-integration per cell (figur 5A). Transduktion med 2,5 μl poolat biblioteksvirus i 1,1 x 107 MV4-11 AraC R-celler resulterade i 30% transduktionseffektivitet. GFP-positiva celler sorterades, vilket representerade det poolade shRNA-biblioteket (figur 5B).
Efter transduktionen av poolat shRNA-epigenetiskt lentivirus i MV4-11 AraC R-cellinjen sorterades de GFP-positiva cellerna på dag 5 eller dag 7 (Figur 6). Dessa sorterade celler utsattes för långvarig exponering för cytarabin i 9 dagar. Livskraften kontrollerades den 9: e dagen, och cellerna samlades in för DNA. (Figur 6A). Stapeldiagrammet visar minskningen av proliferationshastigheten för de transducerade cellerna i närvaro av cytarabin (figur 6B).
Det extraherade DNA: t från proverna utsattes för två omgångar PCR, och den slutliga geleluerade produkten representerade de berikade shRNA kvantifierade av NGS. Figur 7A visar bindningsregionerna för primern som används i den första och den andra omgången av PCR, där de första runda primrar binder till de flankerande regionerna i det integrerade shRNA och den andra framåtriktade primern binder till slingsekvensen. Den omvända primern binder till en region av den förstärkta vektorn i den första omgången av PCR. Figur 7B och figur 7C illustrerar bandstorleken för PCR-produkten i slutet av 1: a (397 bp) och den andra omgången PCR (399 bp), som geleluerades, renades och lämnades in för NGS-analys.
Efter att ha utsatt DNA för ett standardförfarande för kvalitetskontroll bearbetades proverna för NGS-analys. Vi använde CRISPRCloud2, en användarvänlig, molnbaserad analysplattform för att identifiera berikade och utarmade shRNA i den poolade shRNA-screeningen. Figur 8 illustrerar representationen av berikade eller utarmade shRNA som riktar sig mot epigenetiska faktorer som kan förmedla cytarabinresistens vid AML.
Figur 1: Översikt och modell av studien. (A) Illustration av översikten över arbetsflödet. (B) MV4-11 föräldra- och AraC-resistenta celler behandlade med ökande cytarabinkoncentrationer (0,1 μM till 1000 μM) och viabilitetsbedömda genom MTT-analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Illustration av de linjäriserade vektorerna. (A) De tre vektorkartorna med tre olika promotorer, hEF1α (human förlängningsfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) och SSFV (mjältefokusbildande virus), med det förvrängda shRNA inom UltramiR-sekvensen. (B) Illustration av vektorkartan som används i biblioteksexperimentet med hEF1α-promotorn och shRNA som riktar sig mot den epigenetiska faktorn med Zsgreen och puromycin som den valbara markören. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Val av den mest potenta promotorn för att erhålla ihållande och långvarigt uttryck av shRNA: erna. (A) Representativa flödesdiagram för GFP kvantifierade med flödescytometri i slutet av 72 timmar för hEF1a-, hCMV- och SFFV-promotorer. hCMV visar en heterogen topp, medan hEF1a och SFFV visar en enda homogen topp. (B) Promotoreffektivitet i MV4-11 AraC R-cellinjen. (C) SFFV-driven GFP visar tystnad av GFP i långvarig kultur. (D) hEF1a-drivna GFP-celler visar ihållande uttryck efter sortering av cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kontroll av effektiviteten hos det beredda poolade shRNA-lentiviruset. (A) Fluorescensmikroskopibilder visar transfektionseffektiviteten hos det poolade shRNA-biblioteket transfekterat i 293T i slutet av 48 timmar med 10x förstoring. (B) Transduktionseffektiviteten hos det poolade viruset bedömdes i 293T-celler med varierande virusvolymer (2μL, 4μL och 8μL) med användning av 10x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Poolad bibliotekstransduktion i målcellinjen och bestämning av lentiviral titer. (A) MV4-11 AraC R-cellinje transducerad med varierande virusvolymer (1μL, 1,5μL, 2μL och 2,5μL). Effektiviteten kontrollerades i slutet av 72 h. (B) Transduktion av poolat biblioteksvirus i 1 x 107 MV4-11 AraC R-celler för att uppnå 30% transduktionseffektivitet och sedan sortering av GFP-positiva celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Dropout screening för att identifiera epigenetiska faktorer som förmedlar läkemedelsresistens. (A) Schematisk illustration av läkemedelsbehandling för anrikning av resistenta celler. Biblioteksinfekterade celler utsattes för långvarig cytarabinexponering i 9 dagar, följt av att kontrollera livskraften och samla cellerna för DNA-extraktion. (B) Minskad viabilitet vid långvarig exponering för cytarabin i resistenta cellinjer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Framställning av amplikonerna som representerar det integrerade shRNA. (A) Bindningsregionerna för primern som används i den första och den andra omgången av PCR, där de första runda primrar binder till de flankerande regionerna i det integrerade shRNA och den andra framåtriktade primern binder till loopsekvensen. Det omvända binder till en region av den förstärkta vektorregionen i den första PCR. (B) Illustration av PCR-produktens bandstorlek i slutet av första omgången PCR (397 bp). (C) Den andra omgången PCR-produkten (399bp) var geleluerad, renad och given för NGS. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Screening resulterar i AML-cellinjen (MV-4-11 Ara-C R-cellinjen). Efter att ha utsatt DNA för ett standardförfarande för kvalitetskontroll bearbetades proverna för NGS-analys. Vi använde CRISPRCloud2, en användarvänlig, molnbaserad analysplattform, för att identifiera berikade och utarmade shRNA i den poolade shRNA-screeningen. Figuren representerar berikade eller utarmade shRNA som riktar sig mot epigenetiska faktorer som kan förmedla cytarabinresistens vid AML. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Beredning av transfektionsplasmidblandning (beräkning för 10 cm platta) Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: PCR-reaktionsblandning för 1:a pcr-omgången Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Beräkningar för rening av produkterna från 1st of PCR Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: PCR-reaktionsblandning för andra omgången PCR Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-interferens (RNAi) används i stor utsträckning för funktionella genomikstudier, som inkluderar siRNA- och shRNA-screening. Fördelen med shRNA är att de kan införlivas i plasmidvektorer och integreras i genomiskt DNA, vilket resulterar i stabilt uttryck och därmed mer långvarig knockdown av mål-mRNA. En poolad shRNA-biblioteksscreening är robust och kostnadseffektiv jämfört med de konventionella arrayed screens (siRNA). Att identifiera väsentligheten hos en specifik klass av proteiner i en genom-bred skärm kan vara besvärligt. Riktade screeningmetoder kan avslöja väsentligheten hos enskilda proteiner för cancercellöverlevnad eller läkemedelsresistens inom den specifika klassen med minskat brus. Detta protokoll belyser RNAi-skärmen av epigenetiska faktorer för att systematiskt förhöra både väsentliga och icke-väsentliga gener, och det visar användningen av detta tillvägagångssätt som en funktionell plattform som möjliggör identifiering av mål som är ansvariga för AML-läkemedelsresistens.
Denna kraftfulla teknik kräver vissa försiktighetsåtgärder vid utformning och utförande av experimenten. Den första är valet av promotorer som inte genomgår signifikant tystnad under cellkulturen för uttryck av shRNA eftersom deras robusta uttryck är avgörande för knockdown av målgener. För det andra är upprätthållandet av shRNA-representation (antalet celler som transduceras med varje shRNA) av särskild betydelse. Under hela shRNA-skärmen ökar en genomsnittlig representation av >500 celler per shRNA-konstruktion potentialen för att identifiera de shRNA som orsakar fenotypiska effekter.
RNAi-screeningstrategin är en konkurrenskraftig tillväxtskärm; Därför är det viktigt att säkerställa att målcellerna befinner sig i den logaritmiska tillväxtfasen och inte överkonfluent under skärmen för att minimera förlust av representation orsakad av begränsad tillväxt. Det är idealiskt att hålla cellerna vid 50% -70% sammanflöde för att minimera experimentella variationer. Vi rekommenderar att du upprätthåller konsekvent massor av media, sera, virala supernatanter, läkemedel och vävnadsodlingsplast för alla skärmreplikat för att minska experimentell variation.
Det är lämpligt att utföra pilotexperiment för att optimera lentivirusets transduktionseffektivitet för att beräkna volymen virus som krävs för att uppnå en integration av shRNA per cell. För att uppnå denna integration av ett shRNA per cell bör transduktionseffektiviteten vara mindre än 30%. Eftersom mängden virus för att erhålla 30% transducerade celler kan variera mellan cellinjerna som används för experimenten krävs ett standardiseringsexperiment för varje cellinje. Transduktionseffektivitet kan också påverkas av cellodlingsförhållanden och graden av cellproliferation. Därför bör funktionella titrar bestämmas i pilotexperimentet med samma förhållanden som används i screeningexperimentet. Att behålla 3-6 repliker är alltid tillrådligt för att få statistiskt signifikanta träffar.
De två största problemen med shRNA-screeningmetoden är off-target-effekterna och de variabla knockdown-effektiviteterna hos shRNA16. Dessa kan övervinnas genom att använda flera shRNA av varje gen. Anpassning av det prokaryota immunsystemet CRISPR-Cas9 i däggdjursceller har möjliggjort enkel, effektiv och kostnadseffektiv genomredigering i odlade mänskliga celler. Detta system har utnyttjats i stor utsträckning för att utföra genomomfattande genetiska skärmar som liknar dem som utförs med shRNA. Ödet för celler som hyser en viss en-styrd RNA (sgRNA) sekvens kan övervakas med hjälp av djup sekvensering. Den experimentella inställningen som beskrivs här kan också användas för CRISPR-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter och inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansieras delvis av ett bidrag från Institutionen för bioteknik BT/PR8742/AGR/36/773/2013 till SRV; och Institutionen för bioteknik Indien BT / COE / 34 / SP13432/2015 och Institutionen för vetenskap och teknik, Indien: EMR / 2017/003880 till P.B. RVS och P.B. stöds av Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/1 / 503118 respektive IA / S / 15/1 / 501842. S.D. stöds av CSIR-UGC-stipendiet, och S.I. stöds av ett ICMR senior research fellowship. Vi tackar Abhirup Bagchi, Sandya Rani och CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalen för deras hjälp. Vi tackar också MedGenome Inc. för att ha hjälpt till med sekvensering och dataanalys med hög genomströmning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
