Summary
Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).
Abstract
Comprendere i meccanismi driver clinicamente rilevanti della chemio-resistenza acquisita è fondamentale per chiarire i modi per aggirare la resistenza e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Una piccola frazione di cellule leucemiche che sopravvivono alla chemioterapia hanno uno stato epigenetico pronto a tollerare l'insulto chemioterapico. Un'ulteriore esposizione alla chemioterapia consente a queste cellule persistenti di raggiungere uno stato epigenetico fisso, che porta a un'alterata espressione genica, con conseguente proliferazione di queste popolazioni resistenti ai farmaci e infine malattia recidivante o refrattaria. Pertanto, identificare le modulazioni epigenetiche che richiedono la sopravvivenza delle cellule leucemiche resistenti ai farmaci è fondamentale. Descriviamo in dettaglio un protocollo per identificare i modulatori epigenetici che mediano la resistenza all'analogo nucleosidico citarabina (AraC) utilizzando lo screening della libreria di shRNA aggregato in una linea cellulare AML resistente alla citarabina acquisita. La libreria è composta da 5.485 costrutti shRNA mirati a 407 fattori epigenetici umani, che consentono lo screening dei fattori epigenetici ad alto rendimento.
Introduction
Le opzioni terapeutiche nella leucemia mieloide acuta (LMA) sono rimaste invariate per quasi gli ultimi cinque decenni, con citarabina (AraC) e antracicline come pietra angolare per il trattamento della malattia. Una delle sfide per il successo della terapia AML è la resistenza delle cellule staminali leucemiche alla chemioterapia, che porta alla recidivadella malattia 1,2. La regolazione epigenetica svolge un ruolo vitale nella patogenesi del cancro e nella resistenza ai farmaci, e diversi fattori epigenetici sono emersi come promettenti bersagli terapeutici 3,4,5. I meccanismi di regolazione epigenetica influenzano la proliferazione e la sopravvivenza in caso di esposizione continua a farmaci chemioterapici. Studi su tumori maligni non ematologici hanno riportato che una piccola frazione di cellule che superano l'effetto del farmaco subisce varie modificazioni epigenetiche, con conseguente sopravvivenza di quelle cellule 6,7. Tuttavia, il ruolo dei fattori epigenetici nel mediare la resistenza acquisita alla citarabina nella LMA non è stato esplorato.
Lo screening ad alto rendimento è un approccio alla scoperta di farmaci che ha acquisito importanza globale nel tempo ed è diventato un metodo standard in diversi aspetti per identificare potenziali bersagli nei meccanismi cellulari, per la profilazione dei percorsi e a livello molecolare 8,9. Il concetto di letalità sintetica coinvolge l'interazione tra due geni in cui la perturbazione di uno dei due geni da solo è praticabile ma di entrambi i geni provoca contemporaneamente la perdita di vitalità10. Sfruttare la letalità sintetica nel trattamento del cancro potrebbe aiutare a identificare e caratterizzare meccanicamente robuste interazioni genetiche sintetiche letali11. Abbiamo adottato un approccio combinatorio di screening shRNA ad alto rendimento con letalità sintetica per identificare i fattori epigenetici responsabili della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA.
Le leucemie acute guidate dalla traslocazione cromosomica del gene della leucemia a lignaggio misto (MLL o KMT2A) sono note per essere associate a scarsa sopravvivenza nei pazienti. I prodotti chimerici risultanti dei riarrangiamenti genici MLL , cioè le proteine di fusione MLL (MLL-FP), possono trasformare le cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPC) in blasti leucemici con il coinvolgimento di più fattori epigenetici. Questi regolatori epigenetici costituiscono una rete complicata che detta il mantenimento del programma di leucemia e, quindi, potrebbero formare potenziali bersagli terapeutici. In questo contesto, abbiamo utilizzato la linea cellulare MV4-11 (che ospita il gene di fusione MLL MLL-AF4 con la mutazione FLT3-ITD; definita come MV4-11 P) per sviluppare la linea cellulare resistente alla citarabina acquisita, definita come MV4-11 AraC R. La linea cellulare è stata esposta a dosi crescenti di citarabina con recupero intermittente dal trattamento farmacologico, noto come vacanza farmacologica. La concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro .
Abbiamo utilizzato la libreria di shRNA epigenetica aggregata (vedi Tabella dei materiali) guidata dal promotore hEF1a con una spina dorsale lentivirale pZIP. Questa libreria comprende shRNA mirati a 407 fattori epigenetici. Ogni fattore ha 5-24 shRNA, con un totale di 5.485 shRNA, tra cui cinque shRNA di controllo non mirati. L'impalcatura miR-30 "UltrmiR" modificata è stata ottimizzata per un'efficiente biogenesi ed espressionedello shRNA primario 12,13.
Lo schema di questo esperimento è illustrato nella Figura 1A. L'attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 AraC R (Figura 1B), una linea cellulare in sospensione. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di qualsiasi libreria mirata in qualsiasi linea cellulare resistente ai farmaci di propria scelta. Va notato che il protocollo di trasduzione sarà diverso per le cellule aderenti.
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Protocol
Seguire le linee guida dell'Institutional Biosafety Committee (IBSC) e utilizzare la struttura appropriata per gestire il lentivirus (BSL-2). Il personale deve essere adeguatamente addestrato alla manipolazione e allo smaltimento del lentivirus. Questo protocollo segue le linee guida sulla biosicurezza del Christian Medical College, Vellore.
1. Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA
NOTA: È essenziale eseguire un esperimento di trasduzione utilizzando vettori lentivirali con diversi promotori che esprimono proteine di fluorescenza per identificare il promotore che fornisce un'espressione stabile e a lungo termine di shRNA nella linea cellulare selezionata per l'esperimento. I promotori più comunemente usati per questo scopo sono i promotori hEF1α (fattore di allungamento umano 1α), hCMV (citomegalovirus umano) e SSFV (virus della formazione del focus della milza) che esprimono la proteina di fluorescenza verde (GFP) (Figura 2A).
- Eseguire il conteggio delle celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Sospendere le celle MV4-11 AraC R in mezzo RPMI al 10% (RPMI con 10% FBS integrato con 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicina) contenenti 8 μg/mL di polibrene. Seme 1 x 106 cellule in 1,5 mL di medio/pozzetto di una piastra a sei pozzetti in triplicati.
- Aggiungere diversi volumi di lentivirus concentrati (ad esempio, 10 μL, 20 μL e 40 μL a seconda del titolo dei lentivirus) a ciascun pozzetto. Ruotare delicatamente il piatto per mescolare il contenuto.
- Eseguire spinfection per centrifugazione a 920 x g a 37 °C per 90 min.
- Incubare immediatamente le piastre in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C).
- Osservare l'espressione GFP dopo 48 ore al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo.
- Quantificare l'espressione GFP mediante citometria a flusso dopo 72 ore per valutare l'efficienza di trasduzione.
- Coltivare le cellule per un totale di 2 settimane e monitorare periodicamente l'espressione della GFP mediante citometria a flusso. La riduzione dell'espressione GFP misurata dall'intensità media di fluorescenza e dalla percentuale di cellule GFP+ indica il silenziamento del promotore.
- Ordinare le cellule GFP + il 10 ° giorno e coltivare le cellule per 1 settimana dopo lo smistamento. Controllare periodicamente l'espressione GFP durante la coltura.
- Usa le celle non trasdotte per impostare il cancello. Una popolazione oltre la scala 1 x 101 verso destra sull'asse x è considerata una popolazione positiva per GFP.
- Scegli il promotore che mostra un'espressione persistente di GFP nella coltura prolungata delle cellule.
2. Preparazione della libreria di shRNA del fattore epigenetico umano lentivirale aggregato
- Coltura di cellule 293T (a basso numero di passaggio con un buon tasso di proliferazione) in tre piastre di coltura cellulare da 10 cm con 8 mL di mezzo DMEM al 10% (DMEM con 10% FBS contenente 100 U/ml di penicillina e 100 U/ml di streptomicina) in ogni piastra.
- Una volta che le cellule raggiungono il 60% di confluenza, sostituire il mezzo con un mezzo completo.
- Preparare la miscela di trasfezione (come indicato nella Tabella 1) che contiene il mezzo privo di siero, il plasmidio lentivirale (psPAX2) e l'involucro (pMD2.G), i plasmidi della libreria in pool e, infine, il reagente di trasfezione.
- Toccare il composto per mescolarlo bene e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle 293T e mescolare delicatamente facendo roteare le piastre. Incubare le piastre in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C). Cambiare il mezzo dopo 24 ore.
- Dopo 48 ore, controllare l'espressione GFP al microscopio a fluorescenza per garantire un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule 293T.
- Raccogliere i supernatanti virali dopo 48 ore, 60 ore e 72 ore e conservarli a 4 °C. Aggiungere un mezzo fresco (8 ml) in ogni punto temporale dopo aver raccolto il virus.
- Raggruppare i supernatanti del virus. Il volume totale dei virus raggruppati sarà: ~8 mL/piastra x 3 raccolte= ~24 mL/piastra; ~24 mL/piastra x 3 piastre = ~72 mL da 3 piastre.
- Filtrare i virus raggruppati con il filtro da 0,4 μm.
- Per ottenere un titolo elevato di virus, concentrare i virus raggruppati mediante ultracentrifugazione. Trasferire il surnatante del virus filtrato in due tubi da 70 Ti (32 ml/tubo) e centrifugare a 18.000x g per 2 ore con accelerazione e decelerazione lente. Utilizzare un rotore e una centrifuga preraffreddati a 4 °C.
- Estrarre delicatamente i tubi dalla centrifuga e rimuovere completamente il surnatante.
- Utilizzando una micropipetta, risospesare delicatamente il pellet in 400 μL di DMEM (senza FBS e antibiotici). Incubare sul ghiaccio per 1 ora e mescolare i pellet da entrambi i tubi.
- Aliquotare i virus e congelare a -80 °C.
NOTA: i tubi e i virus devono essere tenuti sul ghiaccio durante le fasi 2.10.-2.13. Evitare la schiuma mentre si risospende il virus con il mezzo semplice. Il mezzo deve essere mantenuto a 4 °C. - Calcolare la concentrazione (x) del virus come di seguito:
Volume totale prima della concentrazione = 72 mL (72.000 μL)
Volume dopo concentrazione = 400 μL
La concentrazione = 72.000/400= 180x
3. Stima dell'efficienza di trasduzione dei lentivirus
- Trasdurre cellule 293T con il virus concentrato in diversi volumi (2 μL, 4 μL, 8 μL) per confermare il successo della preparazione dei lentivirus.
NOTA: Se i virus concentrati mostrano elevate efficienze di trasduzione (>50%) in piccoli volumi (1-2 μL), è consigliabile diluire il virus concentrato nelle quantità desiderate (da 100x a 75x). - Diluire il virus concentrato a 100 volte con DMEM (senza FBS e antibiotici) per eseguire esperimenti di titolazione nella linea cellulare MV4-11 AraC R.
- Semina 1 x 106 celle (linea cellulare MV4-11 AraC R in 1,5 mL di mezzo RPMI al 10% contenente 8 μg/mL di polibrene) in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Preparare quattro pozzetti per la trasduzione con diversi volumi di virus.
- Aggiungere quattro volumi diversi (ad esempio, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL) di virus 100x.
- Eseguire la spinfettura mediante centrifugazione della piastra a 920 x g per 90 min a 37 °C.
- Dopo 72 ore, misurare la percentuale di cellule GFP+ mediante citometria a flusso.
- Determinare il volume dei virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30%. Questa bassa efficienza di trasduzione serve a garantire l'integrazione di un singolo shRNA per cella.
4. Trasduzione della libreria di shRNA epigenetici aggregati nella linea cellulare resistente ai farmaci
- Mantenere la linea cellulare target MV4-11 AraC R a una densità di 0,5 x 106 celle/ml. Assicurarsi che le cellule siano nella fase di crescita esponenziale in coltura.
- Calcola il numero di cellule da prelevare per l'esperimento come di seguito in base al numero di integranti virali.
Numero di cellule necessarie per la trasduzione = 5.485 (numero di shRNA) × 500 (rappresentazione shRNA piegata) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~ 11 x 106 celle - Risospesa 1,1 x 107 celle in 16 mL di supporto RPMI al 10%.
- Aggiungere il polibrene (8 μg/mL) e mescolare bene. Quindi, aggiungere il volume richiesto di virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30% come calcolato nella sezione precedente.
- Seminare tutte le cellule su una piastra a sei pozzetti ad una densità di 1 x 106 celle / 1,5 ml di 10% RPMI medio per pozzetto.
- Centrifugare la piastra per 90 min a 920 x g a 37 °C.
- Incubare la piastra durante la notte in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C).
- Dopo 24 ore, cambiare il mezzo e trasferire le cellule trasdotte in un pallone T-75.
- Dopo 48 ore, controllare la GFP al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo.
- Dopo 72 ore, quantificare la percentuale di cellule GFP+ mediante citometria a flusso.
5. Arricchimento delle cellule GFP positive
NOTA: Espandere le cellule trasdotte coltivandole ad una densità di 0,5 x 106 cellule/mL per 5-7 giorni. Queste cellule sono una popolazione mista di trasdotti e non trasdotti, selezionati in base alla GFP mediante ordinamento, come menzionato nel passaggio successivo.
- Esegui lo smistamento del flusso delle celle trasdotte GFP+ con le impostazioni di ordinamento del flusso impostate come elevata purezza e bassa resa. Usa le celle non trasdotte per impostare il cancello. Una popolazione superiore a 1 x 102 verso destra è considerata una popolazione positiva.
- Raccogliere le cellule selezionate in RPMI al 5% (RPMI con FBS al 5% integrato con 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicina).
- Coltivare le cellule selezionate in un mezzo RPMI al 10%.
- Dopo 72 ore, eseguire la stima post-ordinamento della percentuale di celle GFP+ per garantire >95% di efficienza di smistamento.
NOTA: Assicurarsi di ottenere ~ 3-5 x 106 celle GFP positive dopo l'ordinamento per ottenere una rappresentazione da 450x a ~ 500x della libreria shRNA.
6. Screening dropout per identificare i fattori epigenetici che mediano la resistenza ai farmaci
- Coltivare le cellule trasdotte della libreria shRNA in RPMI al 10% per un massimo di 5 giorni. Crioconservare le cellule trasdotte per esperimenti futuri, se necessario, prima del trattamento farmacologico.
- Centrifugare 1 x 107 celle in duplicati a 280 x g per 5 min a 25 °C. Scartare il surnatante e conservare il pellet a -80 °C. Questi campioni serviranno come riferimento di base per la libreria di shRNA epigenetici.
- Coltiva le cellule trasdotte rimanenti come duplicati (R1 e R2), ciascuna mantenuta a un conteggio delle cellule che fornisce una rappresentazione 500x della libreria.
- Trattare uno dei duplicati con il farmaco (10 μM citarabina) (R2) e l'altro senza il trattamento farmacologico (R1).
- Cambiare il mezzo per i palloni con e senza il farmaco ogni 72 ore. Ripetere il cambio medio 3 volte per un'esposizione cumulativa al farmaco di 9 giorni.
- Dopo 9 giorni di trattamento farmacologico, controllare la vitalità delle cellule con il metodo di esclusione del tripano blu.
- Centrifugare le celle rimanenti a 280 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospesciare le cellule in PBS sterile e lavare le cellule. Centrifugare a 280 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante e conservare il pellet a -80 °C per l'estrazione del DNA.
7. Amplificazione degli shRNA integrati mediante PCR
- Estrarre il DNA dalle cellule basali trasdotte (T) (fase 6.2.) e dalle cellule trattate con il farmaco (R2) e non trattate con il farmaco (R1).
- Controllare la concentrazione del campione utilizzando un fluorometro.
- Calcola la quantità di DNA richiesta per la PCR come di seguito:
5.485 (n. di shRNA) × 500 (rappresentazione shRNA) × 1 x 6,6−12 (genoma g/diploide) = 15 μg di DNA - Sottoporre i campioni al primo ciclo di PCR.
NOTA: La miscela di reazione PCR è illustrata nella Tabella 2 con le condizioni del ciclo termico. I dettagli dei primer sono forniti nella tabella supplementare 1. - Impostare reazioni multiple contenenti 850 ng di DNA per tubo (per un totale di 43 reazioni).
NOTA: Il primo ciclo di PCR amplifica le regioni fiancheggianti dello shRNA con conseguente dimensione dell'amplicon di 397 bp. - Raggruppare i prodotti PCR e purificare i prodotti PCR utilizzando 3-4 colonne di un kit di purificazione gel / PCR standard.
NOTA: i dettagli sono forniti nella Tabella 3. - Eluire il prodotto in 50 μL di tampone da ciascuna colonna e raggruppare gli eluimenti.
- Quantificare il DNA e memorizzarlo a -20 °C.
NOTA: I reagenti sono tabulati nella Tabella 4 con le condizioni del ciclo termico. La PCR di secondo turno utilizza i primer con la sequenza INDEX necessaria per il multiplexing in NGS in una cella a flusso singolo. Quindi, ogni campione dovrebbe essere contrassegnato con un indice diverso. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella supplementare 1. - Impostare quattro reazioni con 500 ng del prodotto PCR primario in un volume totale di reazione di 50 μL per ciascun campione e il controllo negativo.
- Caricare l'intero prodotto per l'elettroforesi utilizzando il gel di agarosio TBE al 2% e confermare la dimensione della banda utilizzando una scala molecolare da 1 kb. La dimensione dell'amplicon è 399 bp.
- Visualizza i prodotti PCR sul sistema di documentazione del gel.
- Asportare la fascia specifica e purificare utilizzando un kit di purificazione in gel.
NOTA: I calcoli per la purificazione con il kit sono forniti nella Tabella 3. - Eluire in un volume finale di 30 μL di tampone di eluizione. La concentrazione approssimativa di ciascun eluente sarà di circa 80-90 ng/μL con un volume totale di 30 μL.
8. Sequenziamento di nuova generazione e analisi dei dati
- Sequenziare il prodotto purificato in gel dal punto 7.13. su un sequencer di nuova generazione (ad esempio, Illumina) per ottenere il conteggio delle letture per gli shRNA esauriti.
- Tagliare le sequenze dell'adattatore delle letture FastQ generate utilizzando il kit di strumenti Fastx (versione 0.7).
- Allineare le letture filtrate alle sequenze di riferimento utilizzando un allineatore Bowtie con il parametro di consentire due mancate corrispondenze. Assicurarsi che la lunghezza di lettura dopo il taglio dell'adattatore sia di circa 21 bp.
- Caricare i file utilizzando il programma Samtools (versione 1.9). Utilizzare l'opzione Flagstat e calcolare il riepilogo dell'allineamento.
- Carica i file fastQ tagliati nel software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) insieme alle sequenze shRNA di riferimento sotto forma di file FASTA ed esegui l'analisi secondo le istruzioni.
- Fare clic sul collegamento Avvia analisi nel CC2.
- Seleziona il tipo di schermo come schermate Sopravvivenza e Dropout. Impostare il numero di gruppi e digitare il nome di ciascun gruppo.
- Carica la libreria di riferimento in formato fasta. I dati caricati vengono elaborati. Fare clic sull'URL di output per ottenere i risultati.
NOTA: Questo software utilizza un modello beta-binomiale con un t-test di Student modificato per misurare le differenze nei livelli di sgRNA / shRNA, seguito dal test di probabilità combinato di Fisher per stimare il significato a livello genetico. Calcola le variazioni complessive stimatedi log 2 volte (Log2Fc) degli shRNA per i fattori epigenetici tra i campioni trattati (arricchiti / impoveriti) e non trattati (basale) con "valori p" e "valori FDR".
- Assicurarsi che il valore FDR sia "Negativo" per una schermata Di estrazione e "Positivo" per una schermata di sopravvivenza.
NOTA: CC2 è una piattaforma di analisi per contare le letture e calcolare la rappresentazione della piega (arricchimento o esaurimento) degli shRNA tra i campioni. - Identificare gli shRNA significativamente arricchiti e impoveriti (FDR <0.05) dai risultati CC2.
NOTA: Ci sono 5-24 shRNA contro ogni fattore. Controllare i valori FDR per ciascuno degli shRNA; considerare l'FDR, che è <0.01, e prendere una media per gli shRNA selezionati. Considera i primi 40 successi. Traccia il grafico per i fattori selezionati in base ai valori negativi Log2Fc o FDR. Assicurarsi che gli shRNA non mirati abbiano anche valori FDR significativi per garantire l'autenticità dei dati in quanto fungono da shRNA di controllo.
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Representative Results
Il flusso di lavoro di screening complessivo è illustrato nella Figura 1A. La citotossicità in vitro dell'AraC R MV4-11 (48 h) ha rivelato che l'IC50 alla citarabina nell'MV4-11 AraC R è superiore all'MV4-11 P (Figura 1B). Questa linea cellulare è stata utilizzata nello studio come modello per lo screening dei fattori epigenetici responsabili della resistenza alla citarabina.
La Figura 2A mostra le mappe vettoriali pZIP linearizzate con tre diversi promotori: hEF1α (fattore di allungamento umano 1α), hCMV (citomegalovirus umano) e SSFV (virus che forma la milza), con lo shRNA strapazzato all'interno della sequenza UltramiR. La Figura 2B illustra la mappa vettoriale pZIP utilizzata nell'esperimento di libreria e lo shRNA che prende di mira il fattore epigenetico con Zsgreen e puromicina come marcatore selezionabile guidato dal promotore hEF1a. Questi vettori sono stati utilizzati nella selezione dell'esperimento promotore più potente.
La selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione coerente e prolungata nelle cellule bersaglio è illustrata nella Figura 3. La quantificazione della GFP misurata da MFI ha mostrato un'efficienza di trasduzione superiore al 90% alla fine di 72 ore in MV4-11 AraC R per tutti e tre i promotori. L'istogramma per l'espressione della GFP mostra una popolazione eterogenea per hCMV ma omogenea nel caso di hEF1a e SFFV al giorno 3 di trasduzione (Figura 3A). Il grafico a barre mostra l'espressione GFP guidata da tre diversi promotori (hEF1α, hCMV e SFFV) al giorno 3 della trasduzione in MV4-11 AraC R (Figura 3B). La GFP guidata da SFFV ha mostrato una riduzione dell'IFM il giorno 5 della trasduzione (Figura 3C). Non è stata osservata alcuna diminuzione dell'IFM nell'hEF1a-driven GFP trasdotto MV4-11 parental line post sorting. Pertanto, il promotore hEF1a è stato identificato come un promotore adatto per la linea cellulare (Figura 3D).
La Figura 4A illustra l'efficienza di trasfezione dei plasmidi della libreria shRNA aggregata in cellule 293T dopo 48 ore di trasfezione. L'espressione GFP era brillante, indicando una buona efficienza di trasfezione. Dopo la raccolta del virus, l'efficienza di trasduzione del virus in pool preparato è stata verificata in cellule 293T in tre diverse concentrazioni (2 μL, 4 μL e 8 μL). Abbiamo osservato che anche il virus da 2 μL ha prodotto la stessa efficienza di quello del virus da 8 μL, confermando così l'alto titolo virale (Figura 4B).
La Figura 5 illustra la trasduzione della libreria aggregata nella linea cellulare MV4-11 AraC R e la determinazione del titolo lentivirale. Il lentivirus della libreria shRNA aggregata è stato diluito 100x e quindi aggiunto alla linea cellulare MV4-11 AraC R in diversi volumi (1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL). L'efficienza è stata verificata alla fine di 72 h. L'efficienza di trasduzione è stata del 30% per 2-2,5 μL del virus, confermando un'integrazione di shRNA per cellula (Figura 5A). La trasduzione con 2,5 μl di virus in libreria aggregato in 1,1 x 107 celle AraC R MV4-11 ha portato a un'efficienza di trasduzione del 30%. Sono state ordinate le cellule GFP-positive, che rappresentano la libreria di shRNA aggregati (Figura 5B).
Dopo la trasduzione del lentivirus epigenetico shRNA aggregato nella linea cellulare MV4-11 AraC R, le cellule GFP-positive sono state ordinate il giorno 5 o il giorno 7 (Figura 6). Queste cellule selezionate sono state sottoposte a un'esposizione prolungata alla citarabina per 9 giorni. La vitalità è stata controllata il 9 ° giorno e le cellule sono state raccolte per il DNA. (Figura 6A). Il grafico a barre mostra la riduzione del tasso di proliferazione delle cellule trasdotte in presenza di citarabina (Figura 6B).
Il DNA estratto dai campioni è stato sottoposto a due cicli di PCR e il prodotto finale eluito in gel rappresentava gli shRNA arricchiti quantificati da NGS. La Figura 7A mostra le regioni di legame del primer utilizzate nel 1° e nel 2° round della PCR, dove i primer del 1° round si legano alle regioni fiancheggianti dello shRNA integrato e il 2° primer in avanti si lega alla sequenza del loop. Il primer inverso si lega a una regione del vettore amplificato nel 1 ° round di PCR. La Figura 7B e la Figura 7C illustrano la dimensione della banda del prodotto PCR alla fine del 1 ° (397 bp) e del 2 ° round PCR (399 bp), che è stato eluito in gel, purificato e sottoposto per l'analisi NGS.
Dopo aver sottoposto il DNA a una procedura standard di controllo della qualità, i campioni sono stati elaborati per l'analisi NGS. Abbiamo utilizzato CRISPRCloud2, una piattaforma di analisi basata su cloud di facile utilizzo per identificare shRNA arricchiti e impoveriti nello screening di shRNA in pool. La Figura 8 illustra la rappresentazione di shRNA arricchiti o impoveriti che prendono di mira fattori epigenetici che potrebbero mediare la resistenza alla citarabina nella LMA.
Figura 1: Schema e modello dello studio. (A) Illustrazione della panoramica del flusso di lavoro. (B) Cellule MV4-11 parentali e resistenti all'AraC trattate con concentrazioni crescenti di citarabina (da 0,1 μM a 1000 μM) e vitalità valutata mediante saggio MTT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Illustrazione dei vettori linearizzati. (A) Le tre mappe vettoriali con tre diversi promotori, hEF1α (fattore di allungamento umano 1α), hCMV (citomegalovirus umano) e SSFV (virus della formazione del focus della milza), con lo shRNA strapazzato all'interno della sequenza UltramiR. (B) Illustrazione della mappa vettoriale utilizzata nell'esperimento di libreria con il promotore hEF1α e lo shRNA che prende di mira il fattore epigenetico con Zsgreen e puromicina come marcatore selezionabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA. (A) Grafici di flusso rappresentativi per GFP quantificati mediante citometria a flusso alla fine di 72 ore per i promotori hEF1a, hCMV e SFFV. hCMV mostra un picco eterogeneo, mentre hEF1a e SFFV mostrano un singolo picco omogeneo. (B) Efficienza del promotore nella linea cellulare MV4-11 AraC R. (C) La GFP guidata da SFFV mostra il silenziamento della GFP in una coltura prolungata. (D) Le cellule GFP guidate da hEF1a mostrano un'espressione sostenuta dopo l'ordinamento delle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Controllo dell'efficienza del lentivirus shRNA in pool preparato. (A) Le immagini al microscopio a fluorescenza mostrano l'efficienza di trasfezione della libreria di shRNA in pool trasfettato in 293T alla fine di 48 ore utilizzando l'ingrandimento 10x. (B) L'efficienza di trasduzione del virus aggregato è stata valutata in cellule 293T con volumi di virus variabili (2μL, 4μL e 8μL) utilizzando un ingrandimento 10x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Trasduzione della libreria aggregata nella linea cellulare bersaglio e determinazione del titolo lentivirale. (A) Linea cellulare MV4-11 AraC R trasdotta con volumi variabili di virus (1μL, 1,5μL, 2μL e 2,5μL). L'efficienza è stata verificata alla fine di 72 h. (B) Trasduzione del virus della libreria aggregata in 1 x 107 celle AraC R MV4-11 per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30%, quindi smistamento delle cellule GFP-positive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Screening dell'abbandono per identificare i fattori epigenetici che mediano la resistenza ai farmaci. (A) Illustrazione schematica del trattamento farmacologico per l'arricchimento delle cellule resistenti. Le cellule infette della biblioteca sono state sottoposte a un'esposizione prolungata alla citarabina per 9 giorni, seguita dal controllo della vitalità e dalla raccolta delle cellule per l'estrazione del DNA. (B) Riduzione della vitalità all'esposizione prolungata alla citarabina in linee cellulari resistenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Preparazione degli ampliconi che rappresentano lo shRNA integrato. (A) Le regioni di legame del primer utilizzate nel 1° e nel 2° round della PCR, dove i primer del 1° round si legano alle regioni fiancheggianti dello shRNA integrato e il secondo primer in avanti si lega alla sequenza del loop. Il contrario si lega a una regione della regione vettoriale amplificata nella 1a PCR. (B) Illustrazione della dimensione della banda del prodotto PCR alla fine del 1° round PCR (397 bp). (C) Il prodotto PCR del 2° round (399bp) è stato eluito in gel, purificato e somministrato per NGS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Risultati dello screening nella linea cellulare AML (linea cellulare MV-4-11 Ara-C R). Dopo aver sottoposto il DNA a una procedura standard di controllo della qualità, i campioni sono stati elaborati per l'analisi NGS. Abbiamo utilizzato CRISPRCloud2, una piattaforma di analisi user-friendly basata su cloud, per identificare shRNA arricchiti e impoveriti nello screening shRNA aggregato. La figura rappresenta gli shRNA arricchiti o impoveriti che prendono di mira i fattori epigenetici che potrebbero mediare la resistenza alla citarabina nella LMA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Preparazione della miscela di plasmidi trasfezione (calcolo per piastra da 10 cm) Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Miscela di reazione PCR per 1° round di PCR Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Calcoli per la purificazione dei prodotti della 1a PCR Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Miscela di reazione PCR per il 2 ° round di PCR Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'interferenza dell'RNA (RNAi) è ampiamente utilizzata per gli studi di genomica funzionale, che includono lo screening di siRNA e shRNA. Il vantaggio dello shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico, con conseguente espressione stabile e, quindi, abbattimento più prolungato dell'mRNA bersaglio. Uno screening della libreria shRNA in pool è robusto ed economico rispetto agli schermi arrayed convenzionali (siRNA). Identificare l'essenzialità di una specifica classe di proteine in uno schermo a livello di genoma può essere complicato. Approcci di screening mirati possono rivelare l'essenzialità delle singole proteine per la sopravvivenza delle cellule tumorali o la resistenza ai farmaci all'interno della classe specifica con rumore ridotto. Questo protocollo evidenzia lo screening RNAi dei fattori epigenetici per interrogare sistematicamente geni essenziali e non essenziali e dimostra l'uso di questo approccio come piattaforma funzionale che consente l'identificazione di bersagli responsabili della resistenza ai farmaci AML.
Questa potente tecnologia richiede alcune precauzioni nella progettazione e nell'esecuzione degli esperimenti. Il primo è la scelta di promotori che non subiscono un silenziamento significativo durante la coltura cellulare per l'espressione di shRNA in quanto la loro espressione robusta è fondamentale per l'abbattimento dei geni bersaglio. In secondo luogo, il mantenimento della rappresentazione dello shRNA (il numero di cellule trasdotte con ogni shRNA) è di particolare importanza. In tutto lo schermo shRNA, una rappresentazione media di >500 cellule per costrutto shRNA aumenta il potenziale per identificare gli shRNA che causano effetti fenotipici.
La strategia di screening RNAi è uno schermo di crescita competitivo; pertanto, è fondamentale assicurarsi che le cellule bersaglio siano nella fase di crescita logaritmica e non eccessivamente confluenti durante lo schermo per ridurre al minimo la perdita di rappresentazione causata da una crescita limitata. È ideale per mantenere le cellule al 50% -70% di confluenza per ridurre al minimo le variazioni sperimentali. Raccomandiamo di mantenere un sacco di media, sieri, supernatanti virali, farmaci e plasticware per colture tissutali per tutte le repliche dello schermo per ridurre la variazione sperimentale.
Si consiglia di eseguire esperimenti pilota per ottimizzare l'efficienza di trasduzione del lentivirus per calcolare il volume di virus necessari per ottenere un'integrazione di shRNA per cellula. Per ottenere questa integrazione di uno shRNA per cellula, l'efficienza di trasduzione dovrebbe essere inferiore al 30%. Poiché la quantità di virus per ottenere il 30% di cellule trasdotte può variare tra le linee cellulari utilizzate per gli esperimenti, è necessario un esperimento di standardizzazione per ogni linea cellulare. Le efficienze di trasduzione possono anche essere influenzate dalle condizioni di coltura cellulare e dal tasso di proliferazione cellulare. Quindi, i titoli funzionali dovrebbero essere determinati nell'esperimento pilota usando le stesse condizioni utilizzate nell'esperimento di screening. Mantenere 3-6 repliche è sempre consigliabile per ottenere risultati statisticamente significativi.
Le due principali preoccupazioni dell'approccio di screening shRNA sono gli effetti off-target e le efficienze variabili di knockdown degli shRNA16. Questi possono essere superati utilizzando più shRNA di ciascun gene. L'adattamento del sistema immunitario procariotico CRISPR-Cas9 nelle cellule di mammifero ha permesso un editing del genoma facile, efficiente ed economico nelle cellule umane coltivate. Questo sistema è stato ampiamente sfruttato per eseguire screening genetici a livello di genoma simili a quelli effettuati utilizzando shRNA. Il destino delle cellule che ospitano una particolare sequenza di RNA a guida singola (sgRNA) può essere monitorato utilizzando il sequenziamento profondo. La configurazione sperimentale qui descritta può essere utilizzata anche per lo screening CRISPR.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse e nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è finanziato in parte da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; e Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 e Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS e P.B. sono supportati rispettivamente da Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842. S.D. è supportato dalla borsa di studio CSIR-UGC e S.I. è supportato da una borsa di ricerca senior ICMR. Ringraziamo Abhirup Bagchi, Sandya Rani e lo staff del CSCR Flow Cytometry Core Facility per il loro aiuto. Ringraziamo anche MedGenome Inc. per l'aiuto con il sequenziamento ad alto throughput e l'analisi dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
