Summary
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام تقنية الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحديد توزيع طول السلسلة (CLD) ومتوسط طول السلسلة (ACL) للجليكوجين.
Abstract
جزيئات الجليكوجين هي السكريات المتفرعة التي تتكون من سلاسل خطية من وحدات الجلوكوزيل المرتبطة بروابط α-1,4 غلوكوزيد. يتم إرفاق هذه الأخيرة ببعضها البعض عن طريق روابط α-1,6 من الجلوكوزيد ، يشار إليها باسم نقاط الفرع. من بين الأشكال المختلفة لتخزين الكربون (أي النشا β الجلوكان) ، ربما يكون الجليكوجين أحد أقدم وأنجح السكريات الموجودة في جميع أنحاء العالم الحي. يتم تنظيم سلاسل الجلوكان بحيث يمكن تخزين كمية كبيرة من الجلوكوز بسرعة أو تزويدها بالوقود في خلية عند الحاجة. تم تطوير العديد من التقنيات التكميلية على مدى العقود الماضية لحل البنية الدقيقة لجزيئات الجليكوجين. توضح هذه المقالة الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE). تحدد هذه الطريقة كمية سلاسل الجلوكان التي تتكون منها جسيم الجليكوجين. تعرف هذه المعلمة أيضا باسم توزيع طول السلسلة (CLD) ، وتعكس حجم الجسيمات والنسبة المئوية للتفرع. وهو أيضا شرط أساسي للنمذجة الرياضية للتخليق الحيوي للجليكوجين.
Introduction
الجليكوجين ، المستخدم كمخزن للكربون والطاقة ، هو بوليمر متجانس من الجلوكوز يتكون من سلاسل خطية من وحدات الجلوكوزيل المرتبطة بروابط (1 → 4) α وترتبط من خلال (1 → 6) - α روابط جليكوزيدية أو نقاط متفرعة. تظهر على شكل جزيئات β α في سيتوسول لمجموعة واسعة من الكائنات الحية. جسيمات β هي جزيئات صغيرة قابلة للذوبان في الماء لوحظت بشكل رئيسي في بدائيات النوى. يتراوح قطرها من 20-40 نانومتر ، ومن المحتمل أن تمليها إنزيمات استقلاب الجليكوجين والعائق الستيري 1,2.
تم وصف الجسيمات α الأكبر حجما لأول مرة في الخلايا الحيوانية ، ويصل قطرها إلى 300 نانومتر مع شكل يشبه القرنبيط. قد تنشأ هذه المنظمة الخاصة من تجميع العديد من جسيمات β أو قد تنشأ عن طريق التبرعم من جسيم βواحد 3. ومن المثير للاهتمام أن دراسة حديثة أفادت بوجود جسيمات α في الإشريكية القولونية4. ومع ذلك ، على عكس جزيئات α من الخلايا الحيوانية ، فإن هذا الأخير ينهار بسرعة أثناء عملية الاستخراج ، مما قد يفسر نقص البيانات في الأدبيات4. ينطوي ظهور جزيئات α في حقيقيات النوى وبدائيات النوى على إنزيمات استقلاب الجليكوجين غير المرتبطة بالوراثة5. وهذا يثير تساؤلات بشأن وظيفة هذه الجسيمات وطبيعة عوامل الارتباط المتبادل المحتملة بين β والجسيمات5.
على الرغم من اقتراح نموذجين رياضيين متعارضين لتشكيل جزيء الجليكوجين 6،7،8،9 ، فمن المقبول عموما أن جزيئات β قد تطورت استجابة لوظيفتها الأيضية كاحتياطي وقود عالي الكفاءة للإطلاق السريع لكميات كبيرة من الجلوكوز. تشير مجموعة كبيرة من الأدلة إلى أن خصائص الجليكوجين مثل قابلية الهضم والذوبان في الماء ترتبط بمتوسط طول السلسلة (ACL) ، والذي سيحدد بعد ذلك النسبة المئوية لنقاط التفرع وحجم الجسيمات 2,6,7,8,10,11 . يتم تعريف ACL من خلال النسبة بين العدد الإجمالي لبقايا الجلوكوز وعدد نقاط التفرع. عادة ، تختلف قيم ACL من 11-14 و 7-23 بقايا الجلوكوز في حقيقيات النوى وبدائيات النوى ، على التوالي10. في البشر ، ترجع العديد من أمراض اضطراب الجليكوجين إلى تراكم الجليكوجين غير الطبيعي. على سبيل المثال ، يرتبط مرض أندرسن بالنشاط الناقص لإنزيم متفرع من الجليكوجين ، مما يؤدي إلى تراكم الجليكوجين11 غير الطبيعي. في بدائيات النوى ، تشير الدراسات التراكمية إلى أن الرباط الصليبي الأمامي هو عامل حاسم يؤثر على معدل تدهور الجليكوجين والقدرة على البقاء على قيد الحياة البكتيرية12,13. وقد أفيد أن البكتيريا التي تقوم بتوليف جزيئات β ذات القيمة المنخفضة لدوري أبطال آسيا تتحلل ببطء أكبر وبالتالي تتحمل ظروف المجاعة لفترة أطول. وبالتالي ، فإن معرفة بنية جزيئات β ضرورية لفهم تكوين جزيئات الجليكوجين غير الطبيعية في أمراض تخزين الجليكوجين البشرية وبقاء بدائيات النوى في بيئة تعاني من نقص المغذيات.
منذ أول عزل للجليكوجين عن كبد الكلب من قبل عالم الفسيولوجيا الفرنسي كلود برنارد في أواخر القرن التاسع عشر14 ، تم تطوير العديد من التقنيات لتوصيف جزيئات الجليكوجين بالتفصيل. على سبيل المثال، المجهر الإلكتروني الناقل لمورفولوجيا الجليكوجين (α أو الجسيمات β)15، مطياف البروتون-الرنين المغناطيسي النووي لتحديد النسبة المئوية للروابط α-1,6 16، كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع كاشفات متعددة لاستنتاج الوزن الجزيئي، الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE)17 أو كروماتوغرافيا تبادل الأنيون عالية الأداء مع الكشف الأمبيرومتري النبضي (HPAEC-PAD) لكل من توزيع طول السلسلة (CLD) و ACL القرار18.
يركز هذا العمل على طريقة الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور ، والتي تعتمد على التثبيط المختزل لمجموعة نصف الأسيتال بواسطة وظيفة الأمين الأولية. تاريخيا ، تم استخدام حمض ثلاثي سلفونيك 8-amino-1,3,6-naphthalene (ANTS) لأول مرة لوضع العلامات. في وقت لاحق ، تم استبداله بالفلوروفور الأكثر حساسية ، 8-amino 1,3,6 pyrene trisulfonic acid (APTS)19.
الشكل 1: تفاعل الأمينات المختزلة مع 8-amino 1,3,6 pyrene trisulfonic acid (APTS). تفاعل الأمينات المختزلة لمجموعة نصف الأسيتال بواسطة دالة الأمين الأولية ل 8-amino 1,3,6 pyrene trisulfonic acid (APTS) في ظل ظروف مختزلة يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وكما هو موضح في الشكل 1، فإن دالة نصف الأسيتال للنهاية المختزلة لسلسلة الجلوكان تتفاعل مع الأمين الأساسي ل APTS في ظل ظروف التخفيض. تحمل مجموعات السلفونيك من APTS شحنات سالبة تمكن من فصل سلاسل الجلوكان وفقا لدرجة البلمرة (DP). تفاعل الأمين المختزل قابل للتكرار وفعال للغاية. يتم الحصول على متوسط كفاءة وضع العلامات بنسبة 80٪ ل DP3 إلى DP135 وما يصل إلى 88٪ و 97٪ للمالتوز (DP2) والجلوكوز ، على التوالي17,20. نظرا لأن جزيئا واحدا من APTS يتفاعل مع الطرف المختزل لكل سلسلة جلوكان ، يمكن تحديد السلاسل الفردية ومقارنتها ببعضها البعض على أساس مولي.
Protocol
1. الحضانة مع الإنزيمات المتفرعة
- امزج 200 ميكرولتر من الجليكوجين النقي عند 0.5-2 ملغم / مل مع 200 ميكرولتر من 100 مللي متر من المخزن المؤقت للخلات (الرقم الهيدروجيني 4.8). أضف 2 ميكرولتر من الإيزواميلاز (180 U / mg من البروتين) و 1.5 ميكرولتر من pullulanase (30 U / mg من البروتين) (انظر جدول المواد) ، واخلطه بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضنه عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: قد يحدث التحلل أو تلوث الأميليز أثناء عملية تنقية الجليكوجين. لتقدير وجود السكريات المالتو-قليلة السكريات الحرة ، يمكن احتضان العينات دون كوكتيل إنزيم إزالة التفرع بالتوازي. يتم تضمين معيار (على سبيل المثال ، maltoheptaose) في التحليل لتحديد العلاقة بين وقت الاستخلاص ودرجة البلمرة. - أوقف التفاعلات عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- جهاز طرد مركزي عند 16,100 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير وإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان.
- قم بإزالة المواد الفائقة باستخدام ماصة ونقلها إلى أنابيب مشروحة جديدة. قم بإزالة الملح من المواد الفائقة عن طريق إضافة ما يعادل 100 ميكرولتر من حبات راتنج تبادل الأنيون / الكاتيون (AG-501-X8 ، انظر جدول المواد) وتحريك.
- حرك الخرز بانتظام لمدة 5 دقائق. جمع العينات عن طريق السحب ووضعها في أنابيب جديدة مشروحة.
- قم بالتجميد أو استخدم مبخر فراغ تم إعداده (انظر جدول المواد) عند 30 درجة مئوية لتجفيف العينات.
- تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة أو عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات لمدة 1 شهر.
2. الأمينة الاختزالية
- امزج العينات المجففة مع 2 ميكرولتر من 1 M سيانوبوروهيدريد الصوديوم في رباعي هيدروفوران (THF) و 2 ميكرولتر من APTS (5 ملغ من APTS المعاد تعليقها في 48 ميكرولتر من حمض الخليك 15٪) (انظر جدول المواد).
- احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في الظلام.
تحذير: يتم التعامل مع سيانوبوروهيدريد الصوديوم مع معدات الحماية الشخصية المكيفة وتحت غطاء كيميائي. الاستنشاق وملامسة الجلد سمية للغاية ويمكن أن تكون قاتلة ، مما يسبب حروقا جلدية شديدة وتلف العين. يمكن توليد غازات شديدة السمية عند خلط سيانوبوروهيدريد الصوديوم مع حمض الخليك. عند ملامسته للماء ، يطلق سيانوبوروهيدريد الصوديوم غازات قابلة للاشتعال ، والتي قد تشتعل تلقائيا. يتم التعامل مع العينات المركزة تحت غطاء كيميائي واستخدام معدات الحماية الشخصية المكيفة بدءا من هذه الخطوة.
3. تحليل الوجه
- أضف 46 ميكرولتر من الماء فائق النقاء إلى كل عينة.
- قم بتخفيف العينات مباشرة إلى 1/50 في قوارير صغيرة من 100 ميكرولتر عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من العينة إلى 49 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. احتفظ بالعينات في الظلام أثناء ضبط FACE (5-10 دقائق).
- قم بإجراء الرحلان الكهربائي للقطبية العكسية باستخدام أداة الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام كاشف التألق الناجم عن الليزر (LIF) (انظر جدول المواد). اضبط القطبية على "الوضع العكسي" للفصل ، واضبط LIF على الطول الموجي للانبعاث 488 نانومتر والكاشف على 512 نانومتر.
- اضبط وقت الحقن لمدة 10 ثوان وضغط الحقن عند 0.5 رطل لكل بوصة مربعة.
- قم بإجراء فصل الجلوكان الموسوم ب APTS عند 30 كيلو فولت في شعيرة شعرية من السيليكا العارية المنصهرة بطول 60.2 سم مع قطر داخلي يبلغ 50 ميكرومتر (375 ميكرومتر قطره الخارجي) في المخزن المؤقت لفصل الكربوهيدرات المرتبط ب N المخفف إلى 1/3 في الماء فائق النقاء (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم استبدال المخزن المؤقت لفصل الكربوهيدرات المرتبط ب N كل 20 تشغيلا.
4. معالجة البيانات
- تصدير ". ASC "و". CDF "الملفات التي تحتوي على ملف تعريف الفيروغرام الكهربائي وبيانات التكامل ، على التوالي.
- افتح ملف . ASC ملف ورسم وحدة التألق النسبية وفقا للمخطط الزمني.
- افتح ملف . ملف CDF ، تابع أول تكامل تلقائي واضبط المعلمات التالية: العرض ؛ التكامل من الوادي إلى الوادي ؛ الحد الأدنى للمساحة.
- تحقق من أي حدث تكامل غير لائق وقم بتصحيحه يدويا.
Representative Results
تحديد متوسط طول سلسلة الجليكوجين
يمثل الشكل 2 سير العمل المطلوب لاستنتاج توزيع طول السلسلة ومتوسط طول السلسلة (ACL) للجليكوجين.
الشكل 2: سير العمل لتحديد توزيع طول السلسلة (CLD) ومتوسط طول السلسلة.
ويبين الشكل 3 الفيروجرامات الكهربائية للمالتوهيكساوس التجاري وجليكوجين الكبد البقري المتفرع. نشأت إشارات التألق التي لوحظت بين 4.13-4.67 دقيقة في جميع التجارب من APTS غير المتفاعلة. وقدر وقت استخلاص المالتوهيكساوس المسمى (DP6) ب 8.49 دقيقة (الشكل 3A). تم تحديد الجلوكان المسمى APTS من الجليكوجين البقري بناء على وقت الاستخلاص من DP6 (الشكل 3B). لم يتم الكشف عن أي أثر للمالتو-أوليغوساكاريد الحر في عينة التحكم (الجليكوجين غير المحتضن مع الإنزيمات المتفرعة) (الشكل 3C).
الشكل 3: الفيروجرامات الكهربائية لجليكوجين الكبد القياسي والبقري . (أ) تم استخدام الاستخلاص الزمني (8.49 دقيقة) لمعيار الجلوكان ، مالتوهيكساوز (DP6) ، كمرجع لتحديد درجة البلمرة (DP) للجلوكان المسمى APTS المنبعث من جليكوجين الكبد البقري بعد عمل أنشطة إنزيم إزالة التفرع (B ). تعرض اللوحة الداخلية فصلا بين سلاسل الجلوكان حتى 44 DP. وبالتوازي مع ذلك، تم وضع علامة على الجليكوجين البقري غير المعالج باستخدام APTS للكشف عن الآثار المحتملة لالسكريات القليلة المالتو-أوليغوساشاريد الحرة في العينة (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن الاستنتاج أن إطلاق الجلوكان المسمى APTS يرجع إلى انقسام النقاط المتفرعة بواسطة كل من أنشطة الأيزواميلاز والبولولاناز. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن إعادة رسم ملف تعريف الرحلان الكهربائي الشعري بتنسيق أكثر ملاءمة لإنشاء شخصية فسيفساء تحتوي على العديد من الملفات الشخصية. للقيام بذلك ، يتم إنشاء ملفات DATA التي تحتوي على قيم التألق بامتداد "asc" وفتحها في برنامج جدول البيانات عن طريق اختيار تنسيق CSV (قيمة مفصولة بفواصل). لسوء الحظ ، لا ترتبط قيم التألق المصدرة بوقت الاستخلاص المقابل. وبالتالي ، يجب إضافتها يدويا وفقا لإعداد تردد الاكتساب على جهاز FACE (4 هرتز يعني اكتساب قيمة واحدة كل 0.25 ثانية).
ثم تم الاستدلال على مناطق الذروة باستخدام التطبيق الأصلي لأداة FACE أو تصديرها كملف DATA مع امتداد "cdf" لاستخدام تطبيق آخر. يتم تصدير قيم المساحة في برنامج جدول بيانات وتطبيعها عن طريق التعبير عن DP كنسبة مئوية من إجمالي مساحة السطح (الشكل 4).
الشكل 4: تطبيع البيانات، وتوزيع طول السلسلة، ومتوسط قيمة طول السلسلة. تم استيراد مناطق ذروة التألق وتطبيعها في جدول بيانات. يظهر توزيع طول السلسلة كنسبة مئوية من DP لكل DP. يتم حساب متوسط طول السلسلة (ACL) عن طريق جمع كل سلسلة مئوية مضروبة في الدرجة المقابلة من البلمرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وأخيرا، يتم الاستدلال على متوسط طول السلسلة (ACL) عن طريق حساب مجموع كل سلسلة مئوية مضروبا في الدرجة المقابلة من البلمرة. وأجريت تجارب مماثلة في ثلاثة أضعاف على الجليكوجين في كبد الأرانب (الشكل 5 ألف)، وعلى الجليكوجين في الكبد البقري (الشكل 5 ب)، وجليكوجين المحار (الشكل 5 جيم).
الشكل 5: توزيع طول السلسلة للجليكوجين التجاري. تم احتضان كبد الأرانب (A) والكبد البقري (B) وجليكوجين المحار (C) في وجود إنزيمات إزالة التفرع (isoamylase و pullulanase). ثم تم فصل الجلوكان المسمى APTS وفقا لدرجة البلمرة (DP) باستخدام تحليل FACE. يمثل المالتوز (DP2) ، مالتوهيكساوس (DP6) مالتوهيبتاوز (DP7) الجلوكان الأكثر وفرة في كبد الأرانب والمحار وجليكوجين الكبد البقري ، على التوالي. تم الاستدلال على الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أظهر توزيع طول السلسلة من الجليكوجين في كبد الأرانب بوضوح محتوى أعلى من مالتو-أوليغوساكاريد قصير (DP2) من جليكوجين الكبد البقري (DP 7) أو جليكوجين المحار (DP6). ونتيجة لذلك ، يمتلك جليكوجين كبد الأرانب أدنى متوسط طول سلسلة (ACL = 9.8) مقارنة بجليكوجين الكبد البقري (ACL = 11.9) وجليكوجين المحار (ACL = 12.6). تجدر الإشارة إلى أن تلك الجليكوجينات التجارية تستخدم عادة لفحص فوسفوريلاز الجليكوجين أو نشاط سينثاز الجليكوجين. هذا يشير إلى أن تحديد المعلمات الحركية (Vmax و Km) لأنشطة إنزيم استقلاب الجليكوجين سيختلف وفقا لمصدر الجليكوجين.
التحليلات المطروحة
التحليل الطرحي هو طريقة بسيطة لمقارنة توزيع سلاسل الجلوكان لعينتين. على سبيل المثال ، تم تحديد CLDs من الجليكوجين الذي تنتجه سلالة Synechocystis PCC6803 من النوع البري (WT) والسلالات المتحولة المفردة isoogenic glgA1 و glgA2 (الشكل 6A).
الشكل 6: مقارنة توزيعات طول السلسلة باستخدام التحليل المطروح. (أ) تم تحديد توزيعات طول السلسلة للجليكوجين المنقى من سلالات البكتيريا الزرقاء: النمط البري (WT) Synechocystis PCC6803 والسلالات الطافرة المفردة isoogenic glgA1 و glgA2 باستخدام تحليل FACE. تم الاستدلال على الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) أجريت تحليلات الطرح بطرح النسبة المئوية لكل DP من WT إلى النسبة المئوية لكل DP من Δ glgA1 وطرح النسبة المئوية لكل DP من WT إلى النسبة المئوية لكل DP من DP ΔglgA2. يعرض هذا التلاعب الرياضي المباشر تغيير سلاسل الجلوكان في السلالات المتحولة (الخطوط السوداء). (ج) تم تطبيع متوسط توزيعات طول السلسلة للجليكوجين من النمط البري والطفرات من Synechocystis وفقا للذروة القصوى التي لوحظت لكل CLD (DP6 لجميع العينات). ويتضح مكونان من خلال رسم CLD العادي على مقياس لوغاريتمي (Nde (DP)). يشير كل مكون إلى آلية مختلفة لتوقف النمو (لمزيد من المعلومات، انظر المرجع2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
للتذكير ، تمتلك معظم سلالات البكتيريا الزرقاء جينين يشفران أنشطة سينثاز الجليكوجين: GlgA1 و GlgA221. ينقل كلا الإنزيمين الجلوكوز المتبقي من جلوكوز ADP-glucose إلى الأطراف غير المختزلة لسلاسل الجلوكان الخطية. وكما هو موضح في الشكل 6 ألف، من الصعب مقارنة العينات من خلال النظر فقط إلى ملفات تعريف توزيع طول السلسلة. يتكون التحليل الطرحي من طرح النسبة المئوية لكل DP بين العينات (الشكل 6B). يكشف التحليل الطرحي ل ٪ DP من WT ناقص ٪ من متحور DP ΔglgA1 عن وجود فائض DP3 و 4 و 5 (قيم سالبة) وانخفاض محتوى DP 10-20. في المقابل ، يشير التحليل الطرحي بين ٪ DP من WT و ٪ من متحور DP ΔglgA2 إلى تأثير معاكس. نظرا لأن ملفات تعريف التحليل الطرحي تختلف بين GlgA1 و GlgA2 ، فإن هذا يشير إلى وظيفة محددة لكل شكل متساوي لسينثاز الجليكوجين في التخليق الحيوي للجليكوجين21.
من المهم ملاحظة أن التحليل الطرحي لا ينطبق إلا على التجارب التي تنطوي على عينة مرجعية يتم إجراؤها بالتوازي مع العينات. خلاف ذلك ، يمكن أن يكون التحليل الطرحي تجريبيا لأنه يقع على CLD العادي للمرجع. في عام 2015 ، اقترح دينغ والمتعاونون معه ، الذين حققوا في إيقاف آليات نمو الجليكوجين في الفئران والبشر ، تخطيطا بديلا وتفسيرا ل CLDs الجليكوجين لمعالجة هذه المشكلة. تستخدم هذه المؤامرة الحد الأقصى لمنطقة الذروة لتطبيع كل CLD. ثم يتم رسم البيانات على مقياس لوغاريتمي يسلط الضوء على مكونين. يوضح هذا الأخير آليتين مختلفتين لإيقاف استطالة السلسلة2. من خلال رسم خطوط مناسبة لمكون DP الأعلى ، يمكن استخدام المعلمات المطلقة (أي المنحدرات واعتراضات الخطوط) لمقارنة CLD دون تطبيع إلى ملف تعريف مرجعي. تم رسم CLDs من سلالة Synechocystis PCC6803 من النوع البري (WT) وطفرات glgA1 و glgA2 أحادية المنشأ على مقياس سجل ، وتم تحديد خطوط مناسبة لكل ملف تعريف (الشكل 6C). كان المكون الأول مشابها إلى حد كبير بين العينات ، حيث بلغ ذروته بحد أقصى عند DP 6. هذا يوضح أن الإنزيم المتفرع ينتج صراحة الحد الأقصى من هذه السلاسل. ظهر المكون الثاني ككتف عريض ، والذي تم وصفه بالفعل للفئران والجليكوجين البشري2. نشأ ميل المكون الثاني عند DP أعلى في ΔglgA1 وكان ميل خط التركيب المقابل (الخط الأحمر) أقل من ملف تعريف wildtype. وبالتالي ، فإن عدم وجود GlgA1 يبطئ من اعتقال استطالة السلسلة أثناء التخليق الحيوي الذي اقترح أن يحدث عن طريق عائق ستيريك للفئران والجليكوجين البشري2. تشير هذه البيانات إلى أن الإنزيم المطول المتبقي (أي GlgA2) ينتج سلاسل أطول قبل ازدحام السلسلة. في Δ glgA2 ، لوحظ التأثير المعاكس مع انخفاض أكثر دراماتيكية في خط التركيب ، مما يؤكد أن السلاسل التي تنتجها GlgA1 المتبقية أقصر بشكل عام من تلك التي تم تصنيعها بواسطة GlgA2 وحدها قبل العائق الستيري. يشير هذا التحليل إلى أن كلا الشكلين المتماثلين يمتلكان حركية متميزة و / أو أن تضافر كل منهما مع نشاط الإنزيم المتفرع يختلف.
Discussion
ترتبط الخصائص الفيزيائية والكيميائية لجزيئات الجليكوجين (على سبيل المثال ، الحجم ، المورفولوجيا ، الذوبان) ارتباطا مباشرا بطول الجلوكان الذي يتكون من الجسيمات. أي اختلال في التوازن بين الإنزيمات الاصطناعية الحيوية والتقويضية يؤدي إلى تغيير توزيع طول السلسلة ، وفي حد ذاته ، تراكم الجليكوجين غير الطبيعي الذي يمكن أن يكون خطيرا على الخلية11. تحليل FACE هو طريقة مفضلة لتحديد توزيع طول سلسلة الجليكوجين (CLD). كما هو موضح في الشكل 2 ، يسمح تحديد CLD باستنتاج متوسط قيمة طول السلسلة للجليكوجين (ACL) ، والذي يعكس بنية جزيئات الجليكوجين. ترتبط الجليكوجينات الحيوانية ذات قيم ACL العالية بظهور جزيئات غير طبيعية. التحليل المطروح هو طريقة مفيدة لمقارنة عينتين من الجليكوجين من خلفيات جينية مختلفة (متحور مقابل وايلدتايب). من خلال التخطيط على مقياس لوغاريتمي CLDs تطبيع إلى أقصى ذروة، من ناحية أخرى، لديه ميزة مقارنة CLD بشكل مستقل عن مرجع وأعطانا معلومات عن آلية الجليكوجين المتنامية.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد تحليل FACE تقنية قوية لتوصيف الخصائص الحفازة لإنزيمات استقلاب الجليكوجين. على سبيل المثال ، تشق جميع إنزيمات الجليكوجين المتفرعة (1 → 4) روابط α وتنقل مجموعات oligomaltosyl إلى موضع (1 → 6) - α أو نقاط تفرع. يمكن تمييز الإنزيمات المتفرعة بسبب تقاربها مع السكريات المتعددة (على سبيل المثال ، أميلوبكتين ، جليكوجين) وطول الجلوكان المنقول على الرغم من الآلية الحفازة المماثلة22. وبالتالي ، يمكن وصف وتصنيف مصادر مختلفة للإنزيمات المتفرعة (الإنسان والنبات والبكتيريا) من خلال سلسلة من تجارب الحضانة ومقارنات CLD باستخدام تحليل FACE23.
كما ذكر في المقدمة ، فإن HPAEC-PAD هي أيضا طريقة بديلة لتحديد توزيع طول السلسلة18. تتطلب كلتا التقنيتين التحلل المائي الكامل للروابط (1 → 6) أو نقاط التفرع α بواسطة إنزيمات إزالة التفرع من نوع الأيزواميلاز قبل فصل مجموعة الجلوكان الخطية وفقا لدرجة البلمرة (DP). ومع ذلك ، فإن طريقة HPAEC-PAD تحمل عيبين مقارنة ب FACE: (1) تنخفض استجابة نبض الأمبيرومترية مع زيادة سلاسل الجلوكان ، والتي لا توفر معلومات كمية. يمكن التحايل على مشكلة التحيز الجماعي هذه باستخدام HPAEC-ENZ-PAD الذي يتضمن مفاعلا إنزيميا بعد العمود بين عمود تبادل الأنيون و PAD24. يقوم مفاعل إنزيم العمود بتحلل مالتو-أوليغوساشاريدات إلى بقايا الجلوكوز مما يسمح باستجابة أمبيرومترية ثابتة للنبض. (2) يسمح HPAEC-PAD بفصل سلاسل الجلوكان بدرجة من البلمرة تصل إلى 70. على الرغم من أن الدقة كافية لتحديد CLD لعينات الجليكوجين ، إلا أن FACE يفصل السلاسل مع DPs حتى 150 ، وهي مناسبة لعينات النشا17. من الضروري أن تضع في اعتبارك أن كلا من تحليل HPAEC-PAD و FACE لهما إيجابيات وسلبيات. على سبيل المثال ، يتطلب تفاعل amination مجموعة نصف أسيتال حرة للتفاعل مع وظيفة الأمين الأولية ل APTS. وهذا يعني أنه لا يمكن استخدام وسم APTS لسلاسل الجلوكان التي تفتقر إلى النهايات المختزلة (على سبيل المثال ، الأنسولين). لا تتطلب طريقة HPAEC-PAD وجود نهايات تخفيض. الجانب الثاني المثير للاهتمام في طريقة HPAEC-PAD هو أنه يمكن تحميل عمود تبادل الأنيون ببضعة ملليغرامات من الجلوكان الخطي ، مما يسمح بتنقية مالتو-أوليغوساكاريد باستخدام DP محدد أو 14C-radio-labeled malto-oligosaccharide للفحص الأنزيمي 18,25. وأخيرا، على الرغم من أن قياس الطيف الكتلي (على سبيل المثال، MALDI-TOF) هو تقنية سريعة وحساسة لتحديد توزيع طول السلسلة، يبدو أن هذه التقنية أقل قابلية للتكرار. إنه يبالغ في تقدير كمية سلاسل الجلوكان الطويلة26. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الأخير لتطبيق معين مثل تصوير MALDI لرسم خريطة لوجود الجليكوجين عبر الأنسجة الخلوية27.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح مرتبط بهذا العمل.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل CNRS ، وجامعة ليل CNRS ، ومنح ANR "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
