Summary
Mevcut protokolde, glikojenin zincir uzunluğu dağılımını (CLD) ve ortalama zincir uzunluğunu (ACL) belirlemek için Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) tekniği kullanılmaktadır.
Abstract
Glikojen parçacıkları, α-1,4 glukozit bağları ile bağlanmış glukozil birimlerin doğrusal zincirlerinden oluşan dallanmış polisakkaritlerdir. İkincisi, dallanma noktaları olarak adlandırılan α-1,6 glukozit bağlantıları ile birbirine bağlanır. Farklı karbon depolama biçimleri arasında (yani, nişasta, β-glukan), glikojen muhtemelen canlı dünyada bulunan en eski ve en başarılı depolama polisakkaritlerinden biridir. Glukan zincirleri, gerektiğinde büyük miktarda glikozun bir hücrede hızlı bir şekilde depolanabilmesi veya yakıt doldurulabilmesi için düzenlenir. Glikojen parçacıklarının ince yapısını çözmek için son yıllarda çok sayıda tamamlayıcı teknik geliştirilmiştir. Bu makalede Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir glikojen parçacığı oluşturan glukan zincirlerinin popülasyonunu ölçer. Zincir uzunluğu dağılımı (CLD) olarak da bilinen bu parametre, parçacık boyutunu ve dallanma yüzdesini yansıtır. Aynı zamanda glikojen biyosentezinin matematiksel modellemesi için de önemli bir gerekliliktir.
Introduction
Karbon ve enerji deposu olarak kullanılan glikojen, (1 → 4)-α bağları ile bağlanmış ve (1 → 6)-α glikosidik bağlar veya dallanma noktaları ile bağlanmış glukozil birimlerin doğrusal zincirlerinden oluşan bir glikoz homopolimeridir. Çok çeşitli organizmaların sitozolünde β ve α parçacıkları olarak görünürler. β parçacıkları, esas olarak prokaryotlarda gözlenen suda çözünür küçük parçacıklardır. Çapları 20-40 nm arasında değişir, muhtemelen glikojen metabolize edici enzimler ve sterik engel 1,2 tarafından belirlenir.
İlk olarak hayvan hücrelerinde tanımlanan daha büyük α parçacıkları, karnabahar benzeri bir şekle sahip 300 nm çapa kadar gösterir. Bu özel organizasyon, birkaç β parçacığın toplanmasından kaynaklanabilir veya tek bir β-parçacık3'ten tomurcuklanarak ortaya çıkabilir. İlginç bir şekilde, yakın tarihli bir çalışma, Escherichia coli4'te α parçacıklarının varlığını bildirmiştir. Bununla birlikte, hayvan hücrelerinden α parçacıkların aksine, ikincisi ekstraksiyon işlemi sırasında hızla parçalanır ve bu da literatürdeki veri eksikliğini açıklayabilir4. Ökaryotlarda ve prokaryotlarda α parçacıklarının ortaya çıkması, filogenetik olarak ilgisiz glikojen metabolize edici enzimleriiçerir 5. Bu, bu tür parçacıkların işlevi ve β-parçacıklar arasındaki potansiyel çapraz bağlayıcı ajanların doğası ile ilgili soruları gündeme getirmektedir5.
Glikojen molekül oluşumu 6,7,8,9 için iki karşıt matematiksel model önerilmiş olsa da, β parçacıklarının, büyük miktarlarda glikozun hızlı bir şekilde salınması için oldukça verimli bir yakıt rezervi olarak metabolik işlevlerine yanıt olarak evrimleştiği genel olarak kabul edilmektedir. Büyük bir kanıt grubu, suda sindirilebilirlik ve çözünürlük gibi glikojen özelliklerinin ortalama zincir uzunluğu (ACL) ile ilişkili olduğunu ve daha sonra dallanma noktalarının yüzdesini ve parçacık büyüklüğü 2,6,7,8,10,11'i belirleyeceğini göstermektedir. . ACL, toplam glikoz kalıntısı sayısı ile dallanma noktalarının sayısı arasındaki oranla tanımlanır. Tipik olarak, ACL değerleri ökaryotlarda ve prokaryotlarda sırasıyla 11-14 ve 7-23 glikoz kalıntıları arasında değişir,10. İnsanlarda, çeşitli glikojen bozukluğu hastalıkları anormal glikojen birikimine bağlıdır. Örneğin, Andersen hastalığı, bir glikojen dallanma enziminin eksik aktivitesi ile ilişkilidir ve anormal glikojen11'in birikmesine neden olur. Prokaryotlarda, kümülatif çalışmalar ACL'nin glikojen yıkım oranını ve bakteriyel sağkalım yeteneğini etkileyen kritik bir faktör olduğunu göstermektedir12,13. Düşük ACL değerine sahip β parçacıklarını sentezleyen bakterilerin daha yavaş bozunduğu ve bu nedenle açlık koşullarına daha uzun süre dayandığı bildirilmiştir. Bu nedenle, β parçacıklarının mimarisinin bilinmesi, insan glikojen depolama hastalıklarında anormal glikojen parçacıklarının oluşumunu ve besin eksikliği olan bir ortamda prokaryotların hayatta kalmasını anlamak için gereklidir.
On dokuzuncu yüzyılın sonlarında Fransız fizyolog Claude Bernard tarafından köpek karaciğerinden glikojen ilk izolasyonundanbu yana 14, glikojen parçacıklarını ayrıntılı olarak karakterize etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Örneğin, glikojen morfolojisi için transmisyon elektron mikroskobu (α veya β parçacıklar)15, α-1,6 bağlantılarının yüzdesini belirlemek için proton-NMR spektrometresi 16, moleküler ağırlığı çıkarmak için çoklu dedektörlü boyut dışlama kromatografisi, Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE)17 veya hem zincir uzunluğu dağılımı (CLD) hem de ACL için Darbeli Amperometrik Algılamalı Yüksek Performanslı Anyon değişim kromatografisi (HPAEC-PAD) belirleme18.
Bu çalışma, primer amin fonksiyonu ile hemiasetal grubun indirgeyici amination'ına dayanan florofor yardımlı karbonhidrat elektroforezi yöntemine odaklanmaktadır. Tarihsel olarak, 8-amino-1,3,6-naftalin trisülfonik asit (ANTS) ilk olarak etiketleme için kullanılmıştır. Daha sonra, daha hassas florofor, 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asit (APTS) 19 ile değiştirildi.
Resim 1: 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asit (APTS) ile indirgeyici aminasyon reaksiyonu. Hemasetal grubun, indirgeyici koşullar altında 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asidin (APTS) primer amin fonksiyonu ile indirgeyici aminasyon reaksiyonu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir glukan zincirinin indirgeyici ucunun hemiasetal fonksiyonu, indirgeme koşulları altında APTS'nin birincil amini ile etkileşime girer. APTS'nin sülfonik grupları, glukan zincirlerinin polimerizasyon derecelerine (DP) göre ayrılmasını sağlayan negatif yükler taşır. İndirgeyici amin reaksiyonu yüksek oranda tekrarlanabilir ve verimlidir. DP3 ila DP135 için ortalama %80 ve maltoz (DP2) ve glikoz için sırasıyla %88 ve %97'ye kadar17,20 verimlilik etiketi elde edilir. APTS'nin bir molekülü, her glukan zincirinin indirgeyici ucu ile reaksiyona girdiğinden, bireysel zincirler molar bazda ölçülebilir ve birbirleriyle karşılaştırılabilir.
Protocol
1. Debranching enzimleri ile inkübasyon
- 200 μL saflaştırılmış glikojen 0.5-2 mg / mL'de 200 μL 100 mM asetat tamponu (pH 4.8) ile karıştırın. 2 μL izoamilaz (180 U / mg protein) ve 1.5 μL pullulanaz (30 U / mg protein) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın ve 1.5 mL'lik bir tüpte 16 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
NOT: Glikojen saflaştırma işlemi sırasında bozulma veya amilaz kontaminasyonu meydana gelebilir. Serbest malto-oligosakkaritlerin varlığını takdir etmek için, numuneler paralel olarak daldan arındırıcı enzim kokteyli olmadan inkübe edilebilir. Elüsyon süresi ile polimerizasyon derecesi arasındaki ilişkiyi belirlemek için analize bir standart (örneğin, maltoheptaoz) dahil edilmiştir. - 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe ederek reaksiyonları durdurun.
- Çözünmeyen malzemeleri peletlemek ve çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16.100 x g'de santrifüj yapın.
- Bir pipet kullanarak süpernatantları çıkarın ve yeni açıklamalı tüplere aktarın. 100 μL anyon / katyon değişim reçinesi boncuklarının eşdeğerini ekleyerek süpernatantların tuzunu çözün (AG-501-X8, bakınız Malzeme Tablosu) ve çalkalayın.
- Boncukları düzenli olarak 5 dakika çalkalayın. Pipetleme yaparak numuneleri toplayın ve yeni açıklamalı tüplere yerleştirin.
- Numuneleri kurutmak için 30 °C'de dondurarak kurutun veya bir vakum evaporatörü (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.
- Kurutulmuş numuneleri oda sıcaklığında veya -20 °C'de saklayın.
NOT: Numuneler 1 ay boyunca saklanabilir.
2. İndirgeyici aminasyon
- Kurutulmuş numuneleri tetrahidrofuran (THF) içinde 2 μL 1 M sodyum siyanoborohidrit ve 2 μL APTS (48 μL% 15 asetik asit içinde yeniden askıya alınmış 5 mg APTS) ile karıştırın (bkz.
- Karanlıkta 16 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
DİKKAT: Sodyum siyanoborohidrit, uyarlanmış kişisel koruma ekipmanı ile ve kimyasal bir başlık altında işlenir. Solunması ve ciltle teması oldukça toksiktir ve ölümcül olabilir, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Sodyum siyanoborohidrit asetik asit ile karıştırıldığında yüksek derecede toksik gazlar üretilebilir. Su ile temas halinde, sodyum siyanoborohidrit, kendiliğinden tutuşabilen yanıcı gazları serbest bırakır. Konsantre numuneler kimyasal bir başlık altında ve bu adımdan başlayarak uyarlanmış kişisel koruma ekipmanı kullanılarak işlenir.
3. YÜZ analizi
- Her numuneye 46 μL ultra saf su ekleyin.
- 49 μL ultra saf suya numunenin 1 μL'sini ekleyerek numuneleri 100 μL'lik mikro şişelerde doğrudan 1/50'ye kadar seyreltin. FACE'i ayarlarken örnekleri karanlıkta tutun (5-10 dk).
- Lazer kaynaklı floresan (LIF) dedektörlü kılcal elektroforez aleti ile ters polarite elektroforezi yapın (bkz. Polariteyi ayırma için "ters moda" ayarlayın, LIF'i 488 nm emisyon dalga boyuna ve dedektörü 512 nm olarak ayarlayın.
- Enjeksiyon süresini 10 s ve enjeksiyon basıncını 0,5 psi olarak ayarlayın.
- APTS etiketli glukan separasyonunu, ultra saf suda 1/3'e seyreltilmiş N'ye bağlı karbonhidrat ayırma tamponunda 50 μm (375 μm dış çap) iç çapa sahip 60,2 cm uzunluğunda çıplak kaynaşmış silika kılcal damarda 30 kV'da gerçekleştirin (bkz.
NOT: N'ye bağlı karbonhidrat ayırma tamponu her 20 çalışmada bir değiştirilir.
4. VERİ İŞLEME
- İhracat ". ASC "ve ". CDF "sırasıyla elektroferogram profilini ve entegrasyon verilerini içeren dosyalar.
- . ASC dosyasını dosyalayın ve zaman çizelgesine göre göreceli floresan birimini çizin.
- . CDF dosyası, ilk otomatik entegrasyon ile devam edin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: genişlik; vadiden vadiye entegrasyon; minimum alan.
- Herhangi bir yanlış entegrasyon olayını manuel olarak kontrol edin ve düzeltin.
Representative Results
Glikojen ortalama zincir uzunluğunun belirlenmesi
Şekil 2 , zincir uzunluğu dağılımını ve glikojenin ortalama zincir uzunluğunu (ACL) çıkarmak için gereken iş akışını temsil eder.
Şekil 2: Zincir uzunluğu dağılımını (CLD) ve ortalama zincir uzunluğunu belirlemek için iş akışı. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 , ticari maltoheksaz ve daldan arındırılmış sığır karaciğeri glikojeninin elektroferogramlarını göstermektedir. Tüm deneylerde 4.13-4.67 dakika arasında gözlenen floresan sinyalleri, reaksiyona girmemiş APTS'den kaynaklanmıştır. Etiketli maltoheksaozun (DP6) elüsyon süresi 8.49 dakika olarak tahmin edilmiştir (Şekil 3A). Sığır glikojen APTS etiketli glukanları, DP6'nın elüsyon süresine dayanarak tanımlanmıştır (Şekil 3B). Kontrol örneğinde serbest malto-oligosakkarit izi saptanmadı (debranching enzimleri ile inkübe edilmemiş glikojen ) (Şekil 3C).
Şekil 3: Standart ve sığır karaciğer glikojeninin elektroferogramları . (A) Bir glukan standardı olan maltoheksaozun (DP6) zaman elüsyonu (8.49 dk), debranching enzim aktivitelerinin (B) etkisinden sonra sığır karaciğeri glikojeninden salınan APTS etiketli glukanların polimerizasyon derecesini (DP) belirlemek için referans olarak kullanılmıştır. ). İç panel, 44 DP'ye kadar glukan zincirlerinin ayrılmasını gösterir. Paralel olarak, tedavi edilmemiş sığır glikojen, numunede (C) serbest malto-oligosakkaritlerin olası izlerini tespit etmek için APTS ile etiketlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
APTS etiketli glukan salınımının, dallanma noktalarının hem izoamilaz hem de pullulanaz aktiviteleri ile bölünmesinden kaynaklandığı sonucuna varılabilir. Kılcal elektroforez profilinin, birkaç profil içeren bir mozaik figür oluşturmak için daha uygun bir formatta yeniden çizilebileceği unutulmamalıdır. Bunun için floresan değerleri içeren DATA dosyaları "asc" uzantısı ile oluşturulur ve CSV (virgülle ayrılmış değer) formatı seçilerek elektronik tablo programında açılır. Ne yazık ki, ihraç edilen floresan değerleri, karşılık gelen elüsyon süresi ile ilişkili değildir. Sonuç olarak, FACE cihazındaki edinme frekansı kurulumuna göre manuel olarak eklenmeleri gerekir (4 Hz, her 0,25 saniyede bir değer kazanımı anlamına gelir).
Yoğun alanlar daha sonra FACE aracının yerel uygulaması kullanılarak çıkarıldı veya başka bir uygulama kullanmak için "cdf" uzantılı bir DATA dosyası olarak dışa aktarıldı. Alan değerleri bir elektronik tablo programında dışa aktarılır ve DP'yi toplam yüzey alanının yüzdesi olarak ifade ederek normalleştirilir (Şekil 4).
Şekil 4: Veri normalleştirme, zincir uzunluğu dağılımı ve ortalama zincir uzunluğu değeri. Floresan tepe alanları bir elektronik tabloda içe aktarıldı ve normalleştirildi. Zincir uzunluğu dağılımı, her DP için DP yüzdesi olarak gösterilir. Ortalama zincir uzunluğu (ACL), her yüzde zincir çarpımının karşılık gelen polimerizasyon derecesinin toplanmasıyla hesaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, ortalama zincir uzunluğu (ACL), her yüzde zincir çarpısının toplamının, karşılık gelen polimerizasyon derecesinin hesaplanmasıyla çıkarılır. Benzer deneyler tavşan karaciğeri glikojen (Şekil 5A), sığır karaciğeri glikojen (Şekil 5B) ve istiridye glikojen (Şekil 5C) üzerinde üçlü olarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 5: Ticari glikojenin zincir uzunluğu dağılımı. Tavşan karaciğeri (A), sığır karaciğeri (B) ve istiridye glikojen (C), daldan arındırıcı enzimlerin (izoamilaz ve pullulanaz) varlığında inkübe edildi. APTS etiketli glukanlar daha sonra FACE analizi kullanılarak polimerizasyon derecelerine (DP) göre ayrıldı. Maltoz (DP2), maltoheksaz (DP6) maltoheptaoz (DP7), sırasıyla tavşan karaciğeri, istiridye ve sığır karaciğeri glikojeninde en bol glukanları temsil eder. Standart Ortalama Hatası (SEM) üç bağımsız deneyden çıkarılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tavşan karaciğeri glikojen zincir uzunluğu dağılımı, sığır karaciğeri glikojen (DP 7) veya istiridye glikojen (DP6) 'den daha yüksek bir malto-oligosakkarit (DP2) içeriği göstermiştir. Sonuç olarak, tavşan karaciğeri glikojen (ACL = 11.9) ve istiridye glikojen (ACL = 12.6) ile karşılaştırıldığında en düşük ortalama zincir uzunluğuna (ACL = 9.8) sahiptir. Bu ticari glikojenlerin genellikle glikojen fosforilaz veya glikojen sentaz aktivitesini test etmek için kullanıldığı belirtilmelidir. Bu, glikojen metabolize edici enzim aktivitelerinin kinetik parametrelerinin (Vmax ve Km) belirlenmesinin glikojen kaynağına göre değişeceğini düşündürmektedir.
Çıkarma analizleri
Çıkarma analizi, iki numunenin glukan zincirleri dağılımını karşılaştırmak için basit bir yöntemdir. Örneğin, wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 suşu ve tek izojenik glgA1 ve glgA2 mutant suşları tarafından üretilen glikojen CLD'leri belirlenmiştir (Şekil 6A).
Şekil 6: Zincir uzunluğu dağılımlarının çıkarma analizi kullanılarak karşılaştırılması. (A) Siyanobakteriyel suşlardan saflaştırılan glikojen zincir uzunluğu dağılımları: wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 ve tek izojenik glgA1 ve glgA2 mutant suşları FACE analizi kullanılarak belirlendi. Standart Ortalama Hatası (SEM) üç bağımsız deneyden çıkarılmıştır. (B) Çıkarma analizleri, WT'nin her DP'sinin % 'si ile Δ glgA1 arasındaki her DP'nin % 'si ve WT 'nin her DP % 'si DP ΔglgA2 her DP % 'si çıkarılarak gerçekleştirilmiştir. Bu basit matematiksel manipülasyon, mutant suşlardaki glukan zincirlerinin değişimini gösterir (siyah çizgiler). (C) Wildtype ve Synechocystis mutantlarından glikojen ortalama zincir uzunluğu dağılımları, her CLD için gözlemlenen maksimum zirveye göre normalleştirildi (tüm numuneler için DP6). İki bileşen, normalleştirilmiş CLD'nin logaritmik bir ölçekte (Nde (DP)) çizilmesiyle kanıtlanmıştır. Her bileşen farklı bir büyüme durdurma mekanizmasını gösterir (daha fazla bilgi için bkz. Referans2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hatırlamak gerekirse, çoğu siyanobakteri suşu glikojen sentaz aktivitelerini kodlayan iki gene sahiptir: GlgA1 ve GlgA221. Her iki enzim de ADP-glukozun kalıntı glikozunu lineer glukan zincirlerinin indirgeyici olmayan uçlarına aktarır. Şekil 6A'da gösterildiği gibi, numuneleri yalnızca zincir uzunluğu dağılım profillerine bakarak karşılaştırmak zordur. Çıkarma analizi, numuneler arasındaki her DP'nin yüzdesinin çıkarılmasından oluşur (Şekil 6B). DP Δ glgA1 mutantının WT eksi % DP'sinin eksi %DP'sinin çıkarma analizi, DP3, 4 ve 5'in (negatif değerler) fazlalığını ve DP 10-20 içeriğinin azaldığını ortaya koymaktadır. Buna karşılık, WT'nin %DP'si ile DP ΔglgA2 mutantının %'si arasındaki çıkarma analizi zıt bir etkiye işaret eder. Çıkarma analiz profilleri GlgA1 ve GlgA2 arasında farklı olduğundan, glikojen biyosentezi21'deki her bir glikojen sentaz izoformunun spesifik bir fonksiyonunu göstermektedir.
Çıkarma analizinin yalnızca numunelere paralel olarak gerçekleştirilen bir referans numuneyi içeren deneyler için geçerli olduğunu belirtmek önemlidir. Aksi takdirde, çıkarma analizi, referansın normalleştirilmiş CLD'sinde yattığı için ampirik olabilir. 2015 yılında, farelerde ve insanlarda glikojen büyümesinin durdurma mekanizmalarını araştıran Deng ve işbirlikçileri, bu sorunu ele almak için glikojen CLD'leri alternatif bir şekilde çizmeyi ve yorumlamayı önerdi. Bu grafik, her CLD'yi normalleştirmek için maksimum tepe alanını kullanır. Veriler daha sonra iki bileşeni vurgulayan logaritmik bir ölçekte çizilir. İkincisi, zincir uzamasının2'yi durdurması için iki farklı mekanizmayı göstermektedir. Daha yüksek DP bileşenine uyan çizgiler çizerek, mutlak parametreler (yani, çizgilerin eğimleri ve kesişmeleri), bir referans profiline normalleştirmeden CLD karşılaştırması için kullanılabilir. Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 suşu ve tek izojenik glgA1 ve glgA2 mutantlarının CLD'leri log ölçeğinde çizildi ve her profil için uydurma çizgileri belirlendi (Şekil 6C). İlk bileşen, numuneler arasında oldukça benzerdi ve DP 6'da maksimumda zirveye ulaştı. Bu, dallanan enzimin açıkça bu tür zincirlerin maksimumunu ürettiğini göstermektedir. İkinci bileşen, fareler ve insan glikojen2 için zaten tanımlanmış olan geniş bir omuz olarak ortaya çıktı. İkinci bileşenin eğimi, ΔglgA1'de daha yüksek bir DP'de ortaya çıktı ve karşılık gelen bağlantı çizgisinin (kırmızı çizgi) eğimi, wildtype profilinden daha düşüktü. Bu nedenle, GlgA1 eksikliği, fareler ve insan glikojen2 için sterik engelleme ile ortaya çıkması önerilen biyosentez sırasında zincir uzamasının durmasını yavaşlatır. Bu veriler, kalan uzamakta olan enzimin (yani GlgA2) zincir kalabalıklaşmasından önce daha uzun zincirler ürettiğini göstermektedir. Δ glgA2'de, montaj hattının daha dramatik bir düşüşüyle zıt etki gözlendi ve kalan GlgA1 tarafından üretilen zincirlerin, sterik engellemeden önce yalnızca GlgA2 tarafından sentezlenenlerden genel olarak daha kısa olduğunu doğruladı. Bu analiz, her iki izoformun da farklı kinetiklere sahip olduğunu ve / veya dallanma enzim aktivitesi ile ilgili uyumlarının farklı olduğunu göstermektedir.
Discussion
Glikojen parçacıklarının fizikokimyasal özellikleri (örneğin, boyut, morfoloji, çözünürlük), parçacıkları oluşturan glukanların uzunluğu ile doğrudan ilişkilidir. Biyosentetik ve katabolik enzimler arasındaki herhangi bir dengesizlik, zincir uzunluğu dağılımının değişmesine ve kendi başına, hücre11 için tehlikeli olabilecek anormal glikojen birikimine neden olur. FACE analizi, glikojenin zincir uzunluğu dağılımını (CLD) belirlemek için tercih edilen bir yöntemdir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CLD'nin belirlenmesi, glikojen parçacıklarının yapısını yansıtan glikojen (ACL) ortalama zincir uzunluğu değerinin çıkarılmasına izin verir. Yüksek ACL değerlerine sahip hayvan glikojenleri, anormal parçacıkların ortaya çıkması ile ilişkilidir. Çıkarma analizi, farklı genetik geçmişlerden (mutantlara karşı vahşi tip) iki glikojen örneğini karşılaştırmak için yararlı bir yöntemdir. Logaritmik bir ölçekte çizim yaparak, CLD'ler maksimum zirveye normalleştirilmiş, diğer taraftan, CLD'yi bir referanstan bağımsız olarak karşılaştırma avantajına sahiptir ve bize büyüyen glikojen mekanizması hakkında bilgi vermiştir.
Ek olarak, FACE analizi, glikojen metabolize edici enzimlerin katalitik özelliklerini karakterize etmek için güçlü bir tekniktir. Örneğin, tüm glikojen dallanma enzimleri (1 → 4)-α bağlantılarını ayırır ve oligomaltosil gruplarını (1 → 6)-α pozisyonuna veya dallanma noktalarına aktarır. Dallanma enzimleri, polisakkaritlere (örneğin, amilopektin, glikojen) afiniteleri ve benzer katalitik mekanizmaya rağmen transfer edilen glukanların uzunluğu nedeniyle ayırt edilebilirler22. Böylece, çeşitli dallanma enzimleri kaynakları (insan, bitki, bakteri), FACE analizi23 kullanılarak bir dizi inkübasyon deneyi ve CLD karşılaştırmaları ile karakterize edilebilir ve sınıflandırılabilir.
Girişte belirtildiği gibi, HPAEC-PAD ayrıca zincir uzunluğu dağılımını belirlemek için alternatif bir yöntemdir18. Her iki teknik de, lineer glukan havuzunu polimerizasyon derecelerine (DP) göre ayırmadan önce (1 → 6)-α bağlantılarının veya dallanma noktalarının izoamilaz tipi dallanma enzimleri tarafından tam hidrolizini gerektirir. Bununla birlikte, HPAEC-PAD yöntemi, FACE'e kıyasla iki dezavantaj barındırır: (1) glukan zincirleri arttıkça amperometrik darbe yanıtı azalır, bu da nicel bilgi sağlamaz. Bu kütle yanlılığı sorunu, anyon değişim sütunu ile PAD24 arasında bir post-kolon enzim reaktörü içeren HPAEC-ENZ-PAD kullanılarak atlatılabilir. Kolon enzim reaktörü, malto-oligosakkaritleri glikoz kalıntılarına hidrolize ederek sabit bir darbe amperometrik tepkisine izin verir. (2) HPAEC-PAD, glukan zincirlerinin 70'e kadar polimerizasyon derecesi ile ayrılmasını sağlar. Çözünürlük, glikojen numunelerinin CLD'sini belirlemek için yeterli olsa da, FACE, nişasta numuneleri için uygun olan 150'ye kadar DP'li zincirleri ayırır17. Hem HPAEC-PAD hem de FACE analizinin artıları ve eksileri olduğunu akılda tutmak önemlidir. Örneğin, aminasyon reaksiyonu, APTS'nin birincil amin fonksiyonu ile reaksiyona girmek için serbest bir hemiasetal grup gerektirir. Bu, APTS etiketlemesinin, indirgeyici uçları olmayan glukan zincirleri (örneğin, inülin) için kullanılamayacağı anlamına gelir. HPAEC-PAD yöntemi, indirgeyici uçların varlığını gerektirmez. HPAEC-PAD yönteminin ikinci ilginç yönü, anyon değişim kolonunun birkaç miligram doğrusal glukan ile yüklenebilmesidir ve enzimatik tahlil18,25 için malto-oligosakkaritin spesifik bir DP veya 14C radyo etiketli malto-oligosakkarit ile saflaştırılmasına izin verir. Son olarak, kütle spektrometresi (örneğin, MALDI-TOF) zincir uzunluğu dağılımını belirlemek için hızlı ve hassas bir teknik olmasına rağmen, bu teknik daha az tekrarlanabilir görünmektedir. Uzun glukan zincirlerinin miktarını abartıyor26. Bununla birlikte, ikincisi, hücresel doku boyunca glikojen varlığını haritalamak için MALDI görüntüleme gibi belirli bir uygulama için kullanılabilir27.
Disclosures
Yazarların bu çalışmayla ilişkili çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma CNRS, Université de Lille CNRS tarafından desteklendi ve ANR "MathTest" (ANR-18-CE13-0027) verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
