Summary
В настоящем протоколе метод флуорофорно-вспомогательного углеводного электрофореза (FACE) используется для определения распределения длины цепи (CLD) и средней длины цепи (ACL) гликогена.
Abstract
Частицы гликогена представляют собой разветвленные полисахариды, состоящие из линейных цепочек глюкозильных звеньев, связанных α-1,4 глюкозидными связями. Последние прикрепляются друг к другу α-1,6 глюкозидными связями, называемыми точками ответвлений. Среди различных форм хранения углерода (то есть крахмала, β глюкана), гликоген, вероятно, является одним из старейших и наиболее успешных полисахаридов хранения, найденных во всем живом мире. Глюкановые цепи организованы таким образом, что большое количество глюкозы может быть быстро сохранено или заправлено в клетку, когда это необходимо. За последние десятилетия были разработаны многочисленные дополнительные методы для решения тонкой структуры частиц гликогена. В этой статье описывается флуорофорный углеводный электрофорез (FACE). Этот метод количественно оценивает популяцию глюканных цепей, которые составляют частицу гликогена. Также известный как распределение длины цепи (CLD), этот параметр отражает размер частиц и процент ветвления. Это также является существенным требованием для математического моделирования биосинтеза гликогена.
Introduction
Гликоген, используемый в качестве хранения углерода и энергии, представляет собой гомополимер глюкозы, состоящий из линейных цепочек глюкозильных единиц, связанных (1 → 4)-α связями и присоединенных через (1 → 6)-α гликозидные связи или точки ветвления. Они появляются в виде β и α частиц в цитозоле широкого спектра организмов. β частицы представляют собой крошечные водорастворимые частицы, в основном наблюдаемые у прокариот. Их диаметр колеблется в пределах 20-40 нм, вероятно, продиктованных гликогеном метаболизирующими ферментами и стерическим препятствием 1,2.
Впервые описанные в клетках животных, более крупные α частицы имеют диаметр до 300 нм с формой, похожей на цветную капусту. Эта конкретная организация может возникать в результате агрегации нескольких β-частиц или может возникать путем почкования из однойβ-частицы 3. Интересно, что недавнее исследование сообщило о присутствии α частиц в Escherichia coli4. Однако, в отличие от α-частиц из клеток животных, последние быстро разваливаются в процессе экстракции, что может объяснить отсутствие данных в литературе4. Появление α-частиц у эукариот и прокариот включает филогенетически не связанные ферменты, метаболизирующие гликоген5. Это поднимает вопросы относительно функции таких частиц и природы потенциальных сшивающих агентов между β-частицами5.
Хотя были предложены две противоположные математические модели для образования молекул гликогена 6,7,8,9, общепризнано, что β-частицы эволюционировали в ответ на их метаболическую функцию в качестве высокоэффективного запаса топлива для быстрого высвобождения больших количеств глюкозы. Большое количество доказательств указывает на то, что свойства гликогена, такие как усвояемость и растворимость в воде, коррелируют со средней длиной цепи (ACL), которая затем будет диктовать процент точек ветвления и размер частиц 2,6,7,8,10,11 . ACL определяется соотношением между общим количеством остатков глюкозы и количеством точек ветвления. Как правило, значения ACL варьируют от 11-14 и 7-23 остатков глюкозы у эукариот и прокариот соответственно10. У людей некоторые заболевания гликогенными расстройствами связаны с аномальным накоплением гликогена. Например, болезнь Андерсена связана с недостаточной активностью фермента ветвления гликогена, что приводит к накоплению аномального гликогена11. У прокариот кумулятивные исследования показывают, что ACL является критическим фактором, влияющим на скорость деградации гликогена и способность бактериальной выживаемости12,13. Сообщалось, что бактерии, синтезирующие β-частицы с низким значением ACL, разлагаются медленнее и, следовательно, дольше выдерживают условия голодания. Таким образом, знание архитектуры β-частиц имеет важное значение для понимания образования аномальных частиц гликогена при заболеваниях хранения гликогена человека и выживания прокариот в среде с дефицитом питательных веществ.
С момента первого выделения гликогена из печени собаки французским физиологом Клодом Бернаром в конце девятнадцатого века14 века было разработано множество методов для детальной характеристики частиц гликогена. Например, просвечивающая электронная микроскопия для морфологии гликогена (α- или β-частиц)15, протонно-ЯМР-спектрометрия для определения процента связей α-1,616, эксклюзионная хроматография с несколькими детекторами для вывода молекулярной массы, флуорофорный углеводный электрофорез (FACE)17 или высокоэффективная анионообменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD) как для распределения длины цепи (CLD), так и для ACL определение18.
Эта работа посвящена методу электрофореза углеводов с помощью флуорофора, который опирается на восстановительное аминирование гемиацетальной группы первичной функцией амина. Исторически сложилось так, что 8-амино-1,3,6-нафталин трисульфоновая кислота (ANTS) впервые была использована для маркировки. Позже он был заменен более чувствительным флуорофором, 8-амино 1,3,6 пирентрисульфоновой кислотой (APTS)19.
Рисунок 1: Реакция восстановительного аминирования с 8-амино 1,3,6 пирентрисульфоновой кислотой (APTS). Реакция восстановительного аминирования гемиацетальной группы первичной аминной функцией 8-амино-1,3,6 пирентрисульфоновой кислоты (APTS) в восстановительных условиях Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Как показано на рисунке 1, гемиацетальная функция восстановительного конца глюкановой цепи взаимодействует с первичным амином APTS в восстановительных условиях. Сульфонные группы APTS несут отрицательные заряды, которые позволяют разделять глюканные цепи в соответствии со степенью их полимеризации (DP). Восстановительная аминовая реакция обладает высокой воспроизводимостью и эффективностью. Средняя эффективность маркировки составляет 80% для DP3 до DP135 и до 88% и 97% для мальтозы (DP2) и глюкозы соответственно17,20. Поскольку одна молекула APTS реагирует с редуцирующим концом каждой глюкановой цепи, отдельные цепи могут быть количественно определены и сопоставлены друг с другом на молярной основе.
Protocol
1. Инкубация с разветривающими ферментами
- Смешайте 200 мкл очищенного гликогена при 0,5-2 мг/мл с 200 мкл 100 мМ ацетатного буфера (рН 4,8). Добавьте 2 мкл изоамилазы (180 Ед/мг белка) и 1,5 мкл пуллуланазы (30 Ед/мг белка) (см. Таблицу материалов), аккуратно перемешайте путем пипетки вверх и вниз и инкубируйте при 42 °C в течение 16 ч в пробирке объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Деградация или загрязнение амилазой может произойти в процессе очистки гликогена. Чтобы оценить наличие свободных мальто-олигосахаридов, образцы могут быть инкубированы без параллельного разветвляющего ферментного коктейля. Стандарт (например, мальтогептаоза) включается в анализ для определения взаимосвязи между временем элюирования и степенью полимеризации. - Остановить реакции путем инкубации при 95 °C в течение 5 мин.
- Центрифугу при 16 100 х г в течение 5 мин при комнатной температуре до гранулируют и удаляют любой нерастворимый материал.
- Удалите супернатанты с помощью пипетки и перенесите их в новые аннотированные трубки. Обессоливание супернатантов путем добавления эквивалента 100 мкл шариков анионно-катионообменной смолы (AG-501-X8, см. Таблицу материалов) и перемешивания.
- Регулярно перемешивайте бусины в течение 5 мин. Соберите образцы путем пипетки и поместите их в новые аннотированные трубки.
- Сублимационная сушка или использование вакуумного испарителя, установленного (см. Таблицу материалов) при температуре 30 °C для сушки образцов.
- Храните высушенные образцы при комнатной температуре или при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в течение 1 месяца.
2. Восстановительное аминирование
- Смешайте высушенные образцы с 2 мкл 1 М цианоборогидрида натрия в тетрагидрофуране (ТГФ) и 2 мкл APTS (5 мг APTS, повторно суспендированных в 48 мкл 15% уксусной кислоты) (см. Таблицу материалов).
- Инкубировать при 42 °C в течение 16 ч в темноте.
ВНИМАНИЕ: Цианоборогидрид натрия обрабатывается с помощью адаптированных средств индивидуальной защиты и под химическим капотом. Вдыхание и контакт с кожей очень токсичны и могут привести к летальному исходу, вызывая сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Высокотоксичные газы могут образовываться при смешивании цианоборогидрида натрия с уксусной кислотой. При контакте с водой цианоборогидрид натрия выделяет легковоспламеняющиеся газы, которые могут самовоспламениться. Концентрированные образцы обрабатываются под химическим капотом и с использованием адаптированных средств индивидуальной защиты, начиная с этого этапа.
3. Анализ ЛИЦА
- Добавьте 46 мкл сверхчистой воды к каждому образцу.
- Разбавляют образцы непосредственно до 1/50 в микропузырьках по 100 мкл путем добавления 1 мкл образца к 49 мкл сверхчистой воды. Держите образцы в темноте во время установки FACE (5-10 мин).
- Выполнить электрофорез обратной полярности с помощью инструмента капиллярного электрофореза с лазерно-индуцированным флуоресцентным (LIF) детектором (см. Таблицу материалов). Установите полярность в «обратный режим» для разделения, установите LIF на длину волны излучения 488 нм, а детектор на 512 нм.
- Установите время впрыска на 10 с и давление впрыска на уровне 0,5 фунтов на квадратный дюйм.
- Проводят разделение глюканов с маркировкой APTS при 30 кВ в голом плавленом капилляре кремнезема длиной 60,2 см с внутренним диаметром 50 мкм (наружный диаметр 375 мкм) в N-связанном буфере разделения углеводов, разведенном до 1/3 в сверхчистой воде (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: N-связанный буфер разделения углеводов заменяется каждые 20 прогонов.
4. Обработка ДАННЫХ
- Экспортируйте ". ИСС" и ". CDF" файлы, содержащие профиль электроферограммы и данные интеграции соответственно.
- Откройте платформу . ASC файл и нарисуйте относительную флуоресцентную единицу в соответствии с временной диаграммой.
- Откройте платформу . CDF файл, продолжайте первую автоматическую интеграцию и настройте следующие параметры: ширина; интеграция между долинами; минимальная площадь.
- Проверяйте и исправляйте любые неправильные события интеграции вручную.
Representative Results
Определение средней длины цепи гликогена
На рисунке 2 представлен рабочий процесс, необходимый для вывода распределения длины цепи и средней длины цепи (ACL) гликогена.
Рисунок 2: Рабочий процесс для определения распределения длины цепи (CLD) и средней длины цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На фиг.3 показаны электроферограммы коммерческой мальтогексаозы и разветвленного гликогена печени крупного рогатого скота. Флуоресцентные сигналы, наблюдаемые между 4,13-4,67 мин во всех экспериментах, исходили от нереактированного APTS. Время элюирования меченой мальтогексаозы (DP6) оценивали в 8,49 мин (рисунок 3А). Маркированные APTS глюканы бычьего гликогена были идентифицированы на основе времени элюирования DP6 (рисунок 3B). В контрольном образце (гликоген, не инкубированный с ферментами деветривания) не было обнаружено следов свободного мальто-олигосахарида (рисунок 3С).
Рисунок 3: Электроферограммы стандартного и гликогена печени крупного рогатого скота. (A) Время элюирования (8,49 мин) стандарта глюкана, мальтогексаозы (DP6), использовалось в качестве эталона для определения степени полимеризации (DP) меченых APTS глюканов, высвобождаемых из гликогена печени крупного рогатого скота после действия деветвирующих ферментных активностей (B ). На врезной панели показано разделение глюканных цепей до 44 DP. Параллельно необработанный бычий гликоген маркировали APTS для обнаружения возможных следов свободных мальто-олигосахаридов в образце (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Можно сделать вывод, что высвобождение глюкана, меченого APTS, обусловлено расщеплением точек ветвления как изоамилазой, так и пуллулазой. Следует отметить, что профиль капиллярного электрофореза может быть перерисован в более подходящем формате для создания мозаичной фигуры, содержащей несколько профилей. Для этого файлы DATA, содержащие значения флуоресценции, генерируются с расширением "asc" и открываются в программе электронных таблиц путем выбора формата CSV (значение, разделенное запятыми). К сожалению, экспортируемые значения флуоресценции не связаны с соответствующим временем элюирования. Следовательно, они должны быть добавлены вручную в соответствии с настройкой частоты сбора на устройстве FACE (4 Гц означает одно получение значения каждые 0,25 с).
Пиковые области затем выводились с помощью собственного приложения инструмента FACE или экспортировались в виде файла DATA с расширением «cdf» для использования другого приложения. Значения площадей экспортируются в программу электронных таблиц и нормализуются путем выражения DP в процентах от общей площади поверхности (рисунок 4).
Рисунок 4: Нормализация данных, распределение длины цепи и среднее значение длины цепи. Области пика флуоресценции были импортированы и нормализованы в электронной таблице. Распределение длины цепи отображается в процентах DP для каждого DP. Средняя длина цепи (ACL) рассчитывается путем суммирования каждой процентной цепи на соответствующую степень полимеризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, средняя длина цепи (ACL) выводится путем вычисления суммы каждой процентной цепи, умноженной на соответствующую степень полимеризации. Аналогичные эксперименты проводились в трех экземплярах на гликогене печени кролика (рисунок 5А), на гликогене печени крупного рогатого скота (рисунок 5В) и гликогене устриц (рисунок 5С).
Рисунок 5: Распределение коммерческого гликогена по длине цепи. Печень кролика (А), печень крупного рогатого скота (В) и устричный гликоген (С) инкубировали в присутствии разветвляющихся ферментов (изоамилазы и пуллулазы). Затем глюканы, меченные APTS, были разделены в соответствии со степенью их полимеризации (DP) с использованием анализа FACE. Мальтоза (DP2), мальтогексаоза (DP6), мальтогептаоза (DP7) представляют собой наиболее распространенные глюканы в печени кролика, устрице и гликогене печени крупного рогатого скота соответственно. Стандартная погрешность среднего значения (SEM) была выведена из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Распределение гликогена печени кролика по длине цепи ясно показало более высокое содержание короткого мальто-олигосахарида (DP2), чем гликогена печени крупного рогатого скота (DP 7) или устричного гликогена (DP6). В результате гликоген печени кролика обладает самой низкой средней длиной цепи (ACL = 9,8) по сравнению с гликогеном печени крупного рогатого скота (ACL = 11,9) и устричным гликогеном (ACL = 12,6). Следует отметить, что эти коммерческие гликогены обычно используются для анализа активности гликогенфосфорилазы или гликогенсинтазы. Это говорит о том, что определение кинетических параметров (Vmax и Km) активности метаболизирующего фермента гликогена будет варьироваться в зависимости от источника гликогена.
Субтрактивный анализ
Субтрактивный анализ представляет собой простой метод сравнения распределения глюканных цепей двух образцов. Например, были определены CLD гликогена, продуцируемого штаммом Synechocystis PCC6803 дикого типа (WT) и одиночными изогенными мутантными штаммами glgA1 и glgA2 (рисунок 6A).
Рисунок 6: Сравнение распределений длины цепи с использованием субтрактивного анализа. (A) Распределение гликогена по длине цепи, очищенного от цианобактериальных штаммов: Дикого типа (WT) Synechocystis PCC6803 и одиночных изогенных мутантных штаммов glgA1 и glgA2 определяли с помощью анализа FACE. Стандартная погрешность среднего значения (SEM) была выведена из трех независимых экспериментов. (B) Субтрактивный анализ проводился путем вычитания % каждого DP WT в % каждого DP ΔglgA1 и вычитания % каждого DP WT в % каждого DP DP DP ΔglgA2. Эта простая математическая манипуляция отображает изменение цепочек глюканов в мутантных штаммах (черных линиях). (C) Среднее распределение гликогена по длине цепи из дикого типа и мутантов Synechocystis было нормализовано в соответствии с максимальным пиком, наблюдаемым для каждого CLD (DP6 для всех образцов). О двух компонентах свидетельствует построение нормализованного CLD на логарифмической шкале (Nde (DP)). Каждый компонент указывает на различный механизм остановки роста (для получения дополнительной информации см. Ссылку2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Напомним, что большинство штаммов цианобактерий обладают двумя генами, кодирующими активность гликогенсинтазы: GlgA1 и GlgA221. Оба фермента переносят остаток глюкозы АДФ-глюкозы на невосстанавливающие концы линейных глюканных цепей. Как показано на рисунке 6A, сравнивать образцы сложно, глядя только на профили распределения длины цепи. Субтрактивный анализ состоит из вычитания процента каждого DP между выборками (рисунок 6B). Субтрактивный анализ %DP МАСС минус % мутанта DP ΔglgA1 выявляет избыток DP3, 4 и 5 (отрицательные значения) и пониженное содержание DP 10-20. Напротив, субтрактивный анализ между %DP wt и % DP ΔglgA2 мутанта указывает на противоположный эффект. Поскольку профили субтрактивного анализа различаются между GlgA1 и GlgA2, это говорит о специфической функции каждой изоформы гликогенсинтазы в биосинтезе гликогена21.
Важно отметить, что субтрактивный анализ применим только к экспериментам, которые включают эталонный образец, выполняемый параллельно с образцами. В противном случае субтрактивный анализ может быть эмпирическим, поскольку он лежит на нормализованной CLD ссылки. В 2015 году Дэн и его коллеги, которые исследовали механизмы остановки роста гликогена у мышей и людей, предложили альтернативное построение и интерпретацию Гликогенных CLD для решения этой проблемы. Этот график использует максимальную пиковую область для нормализации каждого CLD. Затем данные строятся на логарифмической шкале, выделяющей два компонента. Последние иллюстрируют два различных механизма остановки удлинения цепи2. Путем рисования линий, соответствующих более высокому компоненту DP, абсолютные параметры (т.е. наклоны и перехваты линий) могут быть использованы для сравнения CLD без нормализации в эталонный профиль. CLD штамма Synechocystis PCC6803 дикого типа (WT) и одиночных изогенных мутантов glgA1 и glgA2 были нанесены на логарифмическую шкалу, и для каждого профиля были определены линии подгонки (рисунок 6C). Первый компонент был очень похож между образцами, достигнув максимума при DP 6. Это показывает, что ветвящийся фермент явно производит максимум таких цепей. Второй компонент появился в виде широкого плеча, которое уже было описано для мышей и человеческих гликогенов2. Наклон второго компонента возник при более высоком DP в ΔglgA1 и наклон соответствующей линии подгонки (красной линии) был ниже профиля wildtype. Таким образом, недостаток GlgA1 замедляет остановку удлинения цепи при биосинтезе, что, как было предложено, происходит при стерической помехе для мышей и человеческого гликогена2. Эти данные свидетельствуют о том, что оставшийся удлиняющий фермент (т.е. GlgA2) производит более длинные цепи перед скученностью цепи. В ΔglgA2 наблюдался противоположный эффект с более резким падением линии фитинга, подтверждая, что цепи, производимые оставшимся GlgA1, в целом короче, чем цепи, синтезированные только GlgA2 до стерического препятствия. Этот анализ показывает, что обе изоформы обладают различной кинетикой и/или что их соответствующая согласованность с активностью ветвящихся ферментов различается.
Discussion
Физико-химические свойства частиц гликогена (например, размер, морфология, растворимость) напрямую связаны с длиной глюканов, составляющих частицы. Любой дисбаланс между биосинтетическими и катаболическими ферментами приводит к изменению распределения длины цепи и, как таковому, накоплению аномального гликогена, который может быть опасен для клетки11. Анализ FACE является методом выбора для определения распределения длины цепи гликогена (CLD). Как показано на рисунке 2, определение CLD позволяет вывести среднее значение длины цепи гликогена (ACL), которое отражает структуру частиц гликогена. Животные гликогены с высокими значениями ACL связаны с появлением аномальных частиц. Субтрактивный анализ является полезным методом для сравнения двух образцов гликогена из разных генетических фонов (мутант против дикого типа). Построение графиков в логарифмической шкале CLD, нормализованных до максимального пика, с другой стороны, имеет преимущество сравнения CLD независимо от эталона и дало нам информацию о механизме роста гликогена.
Кроме того, анализ FACE является мощным методом для характеристики каталитических свойств ферментов, метаболизирующих гликоген. Например, все ферменты ветвления гликогена расщепляют (1 → 4)-α связи и переносят олигомалтозиловые группы в (1 → 6)-α положение или точки ветвления. Ветвящиеся ферменты различимы благодаря их сродству к полисахаридам (например, амилопектину, гликогену) и длине переносимых глюканов, несмотря на аналогичный каталитический механизм22. Таким образом, различные источники ветвящихся ферментов (человек, растение, бактерии) могут быть охарактеризованы и классифицированы с помощью серии инкубационных экспериментов и сравнений CLD с использованием анализа FACE23.
Как упоминалось во введении, HPAEC-PAD также является альтернативным методом определения распределения длиныцепи 18. Оба метода требуют полного гидролиза (1 → 6)-α связей или точек ветвления ферментами деветривания типа изоамилазы перед разделением пула линейных глюканов в соответствии со степенью их полимеризации (DP). Однако метод HPAEC-PAD имеет два недостатка по сравнению с FACE: (1) амперометрический импульсный отклик уменьшается по мере увеличения глюканных цепей, что не дает количественной информации. Эту проблему смещения массы можно обойти с помощью HPAEC-ENZ-PAD, которая включает в себя ферментный реактор между анионообменной колонной и PAD24. Колонный ферментный реактор гидролизует мальто-олигосахариды в остатки глюкозы, обеспечивая постоянный импульсный амперометрический ответ. (2) HPAEC-PAD позволяет разделять глюканные цепи со степенью полимеризации до 70. Хотя разрешения достаточно для определения CLD образцов гликогена, FACE разделяет цепи с DP до 150, пригодные для образцов крахмала17. Важно иметь в виду, что как HPAEC-PAD, так и анализ FACE имеют свои плюсы и минусы. Например, реакция аминирования требует, чтобы свободная гемахетальная группа реагировала с первичной аминной функцией APTS. Это означает, что маркировка APTS не может использоваться для глюканных цепей, не имеющих редуцирующих концов (например, инулина). Метод HPAEC-PAD не требует наличия редуцирующих концов. Второй интересный аспект метода HPAEC-PAD заключается в том, что анионообменная колонна может быть загружена несколькими миллиграммами линейных глюканов, что позволяет очищать мальто-олигосахарид специфическим DP или 14C-радиомеченным мальто-олигосахаридом для ферментативного анализа18,25. Наконец, хотя масс-спектрометрия (например, MALDI-TOF) является быстрой и чувствительной техникой для определения распределения длины цепи, эта техника, по-видимому, менее воспроизводима. Это завышает количество длинных глюканных цепей26. Тем не менее, последний может быть использован для конкретного применения, такого как визуализация MALDI, для картирования присутствия гликогена в клеточной ткани27.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, связанного с данной работой.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана CNRS, Университетом Лилля CNRS и грантами ANR «MathTest» (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
