Summary
בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) משמשת לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן.
Abstract
חלקיקי גליקוגן הם פוליסכרידים מסועפים המורכבים משרשראות ליניאריות של יחידות גלוקוזיל המקושרות על ידי קשרי גלוקוזיד α-1,4. האחרונים מחוברים זה לזה על ידי α-1,6 חוליות גלוקוזיד, המכונות נקודות הסתעפות. בין הצורות השונות של אחסון פחמן (כלומר, עמילן, β-גלוקן), גליקוגן הוא ככל הנראה אחד מפוליסכרי האחסון העתיקים והמוצלחים ביותר שנמצאו ברחבי העולם החי. שרשראות גלוקאן מאורגנות כך שניתן לאחסן במהירות כמות גדולה של גלוקוז או לתדלק בתא בעת הצורך. טכניקות משלימות רבות פותחו בעשורים האחרונים כדי לפתור את המבנה העדין של חלקיקי הגליקוגן. מאמר זה מתאר אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE). שיטה זו מכמתת את אוכלוסיית שרשראות הגלוקן המרכיבות חלקיק גליקוגן. פרמטר זה, הידוע גם בשם התפלגות אורך השרשרת (CLD), משקף את גודל החלקיקים ואת אחוז ההסתעפות. זוהי גם דרישה חיונית למודלים מתמטיים של ביוסינתזה של גליקוגן.
Introduction
גליקוגן, המשמש כאגירת פחמן ואנרגיה, הוא הומופולימר של גלוקוז המורכב משרשראות ליניאריות של יחידות גלוקוזיל המקושרות על ידי (1 → 4)-α קשרים ומחוברים דרך (1 → 6)-α קשרים גליקוזידיים או נקודות הסתעפות. הם מופיעים כחלקיקים β ו-α בציטוזול של מגוון רחב של אורגניזמים. חלקיקי β הם חלקיקים זעירים מסיסים במים שנצפו בעיקר בפרוקריוטים. קוטרם נע בין 20-40 ננומטר, ככל הנראה מוכתב על ידי אנזימי חילוף החומרים של הגליקוגן והעכבה הסטרית 1,2.
החלקיקים α הגדולים יותר, שתוארו לראשונה בתאי בעלי חיים, מציגים קוטר של עד 300 ננומטר עם צורה דמוית כרובית. ארגון מסוים זה עשוי לנבוע מצבירה של מספר חלקיקי β או להיווצר על ידי ניצנים מתוך חלקיק βיחיד 3. באופן מעניין, מחקר שנערך לאחרונה דיווח על נוכחותם של חלקיקי α ב-Escherichia coli4. עם זאת, בניגוד לחלקיקים α מתאי בעלי חיים, האחרון מתפרק במהירות במהלך תהליך החילוץ, מה שעשוי להסביר את היעדר הנתונים בספרות4. הופעתם של חלקיקי α באאוקריוטים ובפרוקריוטים כרוכה באנזימי מטבוליזם גליקוגן שאינם קשורים פילוגנטית5. זה מעלה שאלות לגבי תפקידם של חלקיקים כאלה ואופיים של חומרים מקשרים צולבים פוטנציאליים בין β חלקיקים5.
אף על פי ששני מודלים מתמטיים מנוגדים הוצעו להיווצרות מולקולות גליקוגן 6,7,8,9, מקובל לחשוב שחלקיקים β התפתחו בתגובה לתפקודם המטבולי כמאגר דלק יעיל ביותר לשחרור מהיר של כמויות גדולות של גלוקוז. גוף גדול של ראיות מצביע על כך שתכונות גליקוגן כגון יכולת עיכול ומסיסות במים מתואמות עם אורך השרשרת הממוצע (ACL), אשר לאחר מכן יכתיב את אחוז נקודות ההסתעפות ואת גודל החלקיק 2,6,7,7,8,10,11 . ACL מוגדר על ידי היחס בין המספר הכולל של שאריות גלוקוז לבין מספר נקודות ההסתעפות. בדרך כלל, ערכי ACL נעים בין 11-14 ו-7-23 שאריות גלוקוז באאוקריוטים ובפרוקריוטים, בהתאמה10. בבני אדם, מספר מחלות של הפרעת גליקוגן נובעות מהצטברות גליקוגן חריגה. לדוגמה, מחלת אנדרסן קשורה לפעילות לקויה של אנזים מסתעף גליקוגן, וכתוצאה מכך להצטברות של גליקוגן11 לא תקין. אצל פרוקריוטים, מחקרים מצטברים מצביעים על כך ש-ACL הוא גורם קריטי המשפיע על קצב הפירוק של הגליקוגן ויכולת ההישרדות של החיידקים12,13. דווח כי חיידקים המסנתזים β חלקיקים בעלי ערך ACL נמוך מתפרקים לאט יותר ולכן עומדים בתנאי רעב ארוכים יותר. לפיכך, הידע על הארכיטקטורה של חלקיקי β חיוני להבנת היווצרותם של חלקיקי גליקוגן חריגים במחלות אחסון גליקוגן אנושיות והישרדות פרוקריוטים בסביבה חסרת חומרים מזינים.
מאז הבידוד הראשון של גליקוגן מכבד הכלב על ידי הפיזיולוג הצרפתי קלוד ברנאר בסוף המאה התשע עשרה14, פותחו טכניקות רבות לאפיון חלקיקי גליקוגן בפירוט. לדוגמה, מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה עבור מורפולוגיה של גליקוגן (α או β-חלקיקים)15, ספקטרומטריית פרוטון-NMR לקביעת אחוז הקישורים α-1,616, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל עם גלאים מרובים להסקת המשקל המולקולרי, אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)17 או כרומטוגרפיית חילופי אניון בעלת ביצועים גבוהים עם זיהוי אמפרומטרי פועם (HPAEC-PAD) הן עבור התפלגות אורך השרשרת (CLD) והן עבור ACL קביעה 18.
עבודה זו מתמקדת בשיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור, המסתמכת על המינוי הרדוקטיבי של קבוצת ההמיאצטלים על ידי פונקציית אמין ראשונית. מבחינה היסטורית, 8-אמינו-1,3,6-נפטלין חומצה טריסולפונית (ANTS) שימשה לראשונה לתיוג. מאוחר יותר, הוא הוחלף על ידי פלואורופור רגיש יותר, 8-אמינו 1,3,6 חומצה פירן טריסולפונית (APTS)19.
איור 1: תגובת האמינוציה הרדוקציוניסטית עם 8-אמינו 1,3,6 חומצה טריסולפונית פירנית (APTS). תגובת המינוי הרדוקטיבית של קבוצת ההמיאצטלים על ידי פונקציית אמין ראשונית של 8-אמינו 1,3,6 חומצה טריסולפונית פירן (APTS) בתנאים רדוקטיביים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כפי שמתואר באיור 1, הפונקציה ההמיאצטלית של הקצה המפחית של שרשרת גלוקן מתקשרת עם האמין העיקרי של APTS בתנאים מפחיתים. הקבוצות הסולפוניות של APTS נושאות מטענים שליליים המאפשרים הפרדת שרשראות גלוקן בהתאם למידת הפילמור שלהן (DP). תגובת האמין הרדוקציוניסטית ניתנת לשחזור ויעילה ביותר. התוויית יעילות ממוצעת של 80% מתקבלת עבור DP3 עד DP135 ועד 88% ו-97% עבור מלטוז (DP2) וגלוקוז, בהתאמה17,20. מאחר שמולקולה אחת של APTS מגיבה עם הקצה המפחית של כל שרשרת גלוקן, ניתן לכמת שרשראות בודדות ולהשוות אותן זו לזו על בסיס טוחן.
Protocol
1. דגירה עם אנזימי פירוק
- מערבבים 200 μL של גליקוגן מטוהר ב-0.5-2 מ"ג/מ"ל עם 200 μL של 100 mM של מאגר אצטט (pH 4.8). הוסיפו 2 μL של איזואמילאז (180 U/mg של חלבון) ו-1.5 μL של פולולנאז (30 U/mg של חלבון) (ראו טבלת חומרים), ערבבו בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, ודגרו בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בצינור של 1.5 מ"ל.
הערה: השפלה או זיהום עמילאז עלולים להתרחש במהלך תהליך טיהור הגליקוגן. כדי להעריך את נוכחותם של מלטו-אוליגוסכרידים חופשיים, ניתן לדגום דגימות ללא קוקטייל האנזים המתפרק במקביל. תקן (למשל, מלטוהפטאוז) נכלל בניתוח כדי לקבוע את הקשר בין זמן האלוטציה לבין מידת הפילמור. - עצור את התגובות על ידי דגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- צנטריפוגה ב 16,100 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לכדור ולהסיר כל חומר בלתי מסיס.
- הסר את הסופרנאטים באמצעות פיפטה והעביר אותם לצינורות מבוארים חדשים. התפלת הסופרנאטים על ידי הוספת המקבילה של 100 μL של חרוזי שרף חילופי אניון/קטיון (AG-501-X8, ראה טבלת חומרים) ו- agitate.
- באופן קבוע להתסיס את החרוזים במשך 5 דקות. אספו את הדגימות על ידי צנרת והניחו אותן בצינורות מבוארים חדשים.
- הקפאה-יבשה או השתמש במערך מאייד ואקום (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 30 °C (70 °F) כדי לייבש את הדגימות.
- אחסן דוגמיות מיובשות בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן את הדוגמאות למשך חודש אחד.
2. מועמדות רדוקטיבית
- ערבבו את הדגימות המיובשות עם 2 μL של 1 M נתרן ציאנובורוהידריד בטטרהידרופורן (THF) ו-2 μL של APTS (5 מ"ג של APTS שעברו החייאה ב-48 μL של 15% חומצה אצטית) (ראו טבלת חומרים).
- דגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בחושך.
אזהרה: נתרן ציאנובורוהידריד מטופל עם ציוד הגנה אישי מותאם ותחת מכסה מנוע כימי. שאיפה ומגע עם העור הם רעילים מאוד ועלולים להיות קטלניים, ולגרום לכוויות עור קשות ולפגיעה בעיניים. גזים רעילים מאוד יכולים להיווצר בעת ערבוב נתרן ציאנובורוהידריד עם חומצה אצטית. במגע עם מים, נתרן ציאנובורוהידריד משחרר גזים דליקים, אשר עשויים להתלקח באופן ספונטני. דגימות מרוכזות מטופלות תחת מכסה מנוע כימי ובאמצעות ציוד הגנה אישי מותאם החל משלב זה.
3. ניתוח פנים
- הוסיפו 46 μL של מים אולטרה-אפורים לכל דגימה.
- דיללו את הדגימות ישירות ל-1/50 במיקרו בקבוקונים של 100 μL על ידי הוספת 1 μL מהדגימה ל-49 μL של מים אולטרה-פוריים. שמור את הדגימות בחושך בעת הגדרת ה- FACE (5-10 דקות).
- בצע אלקטרופורזה של קוטביות הפוכה באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימי עם גלאי פלואורסצנטי המושרה בלייזר (LIF) (ראה טבלת חומרים). הגדר את הקוטביות ל"מצב הפוך" להפרדה, הגדר את ה-LIF באורך גל של פליטת 488 ננומטר ואת הגלאי ל-512 ננומטר.
- קבעו את זמן ההזרקה ל-10 שניות ואת לחץ ההזרקה על 0.5 psi.
- בצע את הפרדת הגלוקנים המסומנים ב-APTS במהירות של 30 קילו-וולט בנימי סיליקה מתמזגים חשופים באורך של 60.2 ס"מ בקוטר פנימי של 50 מיקרומטר (קוטר חיצוני של 375 מיקרומטר) במאגר הפרדת הפחמימות המקושר ל-N המדולל ל-1/3 במים אולטרה-אפורים (ראו טבלת חומרים).
הערה: מאגר הפרדת הפחמימות המקושר ל-N מוחלף בכל 20 ריצות.
4. עיבוד נתונים
- ייצא את ". ASC "ו-". CDF "קבצים המכילים את פרופיל האלקטרופרוגרמה ואת נתוני האינטגרציה, בהתאמה.
- פתח את . קובץ ASC וצייר את היחידה הפלואורסצנטית היחסית בהתאם לתרשים הזמן.
- פתח את . קובץ CDF , המשך עם שילוב אוטומטי ראשון והתאם את הפרמטרים הבאים: רוחב; אינטגרציה בין עמק לעמק; שטח מינימלי.
- בדוק ותקן כל אירוע אינטגרציה לא תקין באופן ידני.
Representative Results
קביעת אורך השרשרת הממוצע של גליקוגן
איור 2 מייצג את זרימת העבודה הנדרשת כדי להסיק את התפלגות אורך השרשרת ואת אורך השרשרת הממוצע (ACL) של הגליקוגן.
איור 2: זרימת עבודה לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3 מציג את האלקטרופרוגרמים של מלטוהקסאוז מסחרי וגליקוגן של כבד בקר. האותות הפלואורסצנטיים שנצפו בין 4.13-4.67 דקות בכל הניסויים מקורם ב-APTS שלא שוחזר. זמן ההמלטה של מלטוהקסאוז (DP6) הוערך ב-8.49 דקות (איור 3A). הגלוקנים המסומנים ב-APTS של גליקוגן בקר זוהו על סמך זמן האלוטציה של DP6 (איור 3B). בדגימת הביקורת לא זוהתה זכר למלטו-אוליגוסכריד חופשי (גליקוגן שאינו מודגר עם אנזימי התייבשות) (איור 3C).
איור 3: אלקטרופרוגרמות של גליקוגן רגיל וגליקוגן בכבד בקר. (A) זמן ההברקה (8.49 דקות) של תקן גלוקאן, מלטוהקסאוז (DP6), שימש כהתייחסות לקביעת מידת הפילמור (DP) של גלוקנים בעלי תווית APTS ששוחררו מגליקוגן של כבד בקר לאחר פעולת פעילות האנזים של פירוק (B) ). לוח הכניסה מראה הפרדת שרשראות גלוקן עד 44 DP. במקביל, גליקוגן בקר שלא טופל סומן ב-APTS כדי לזהות עקבות אפשריים של מלטו-אוליגוסכרידים חופשיים בדגימה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ניתן להסיק כי שחרורו של גלוקן עם תווית APTS נובע מהבקיעה של נקודות הסתעפות על ידי פעילויות איזואמילאז ופולולנאז. יש לשים לב כי ניתן לשרטט מחדש את פרופיל האלקטרופורזה הנימי בפורמט מתאים יותר כדי ליצור דמות פסיפס המכילה מספר פרופילים. לשם כך, קבצי DATA המכילים ערכי פלואורסצנציה נוצרים עם סיומת "asc" ונפתחים בתוכנית הגיליון האלקטרוני על-ידי בחירה בתבנית CSV (ערך מופרד בפסיקים). למרבה הצער, ערכי הפלואורסצנציה המיוצאים אינם משויכים לזמן האלוטציה המתאים. כתוצאה מכך, יש להוסיף אותם באופן ידני על פי הגדרת תדר הרכישה במנגנון FACE (4 הרץ פירושו רכישת ערך אחד כל 0.25 שניות).
לאחר מכן הוסקו אזורי שיא באמצעות היישום המקורי של מכשיר FACE או יוצאו כקובץ DATA עם סיומת "cdf" לשימוש ביישום אחר. ערכי השטח מיוצאים בתוכנית גיליון אלקטרוני ומנורמלים על-ידי הבעת ה-DP כאחוז משטח הפנים הכולל (איור 4).
איור 4: נורמליזציה של נתונים, התפלגות אורך שרשרת וערך אורך שרשרת ממוצע. אזורי שיא פלואורסצנטיים יובאו ונורמלו בגיליון אלקטרוני. התפלגות אורך השרשרת מוצגת כאחוז של DP עבור כל DP. אורך השרשרת הממוצע (ACL) מחושב על ידי סיכום כל שרשרת אחוזים פי שניים ממידת הפילמור המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לבסוף, אורך השרשרת הממוצע (ACL) מסיק על ידי חישוב הסכום של כל שרשרת אחוזים כפול מידת הפילמור המתאימה. ניסויים דומים נערכו בטריפליקט על גליקוגן של כבד ארנב (איור 5A), על גליקוגן של כבד בקר (איור 5B) ועל גליקוגן צדפות (איור 5C).
איור 5: התפלגות אורך שרשרת של גליקוגן מסחרי. כבד הארנב (A), כבד בקר (B) וגליקוגן צדפות (C) דוגרו בנוכחות אנזימי פירוק (איזואמילאאז ופולולנאז). לאחר מכן הופרדו הגלוקנים המסומנים ב-APTS בהתאם למידת הפילמור שלהם (DP) באמצעות ניתוח פנים. מלטוז (DP2), מלטוהקסאז (DP6) מלטוהפטאוז (DP7) מייצגים את הגלוקנים הנפוצים ביותר בגליקוגן של כבד ארנב, צדפות וכבד בקר, בהתאמה. שגיאת התקן של ממוצע (SEM) הוסקה משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
התפלגות אורך השרשרת של גליקוגן בכבד הארנב הראתה בבירור תכולה גבוהה יותר של מלטו-אוליגוסכריד קצר (DP2) מאשר גליקוגן בכבד בקר (DP 7) או גליקוגן צדפות (DP6). כתוצאה מכך, גליקוגן כבד הארנב הוא בעל אורך השרשרת הממוצע הנמוך ביותר (ACL = 9.8) בהשוואה לגליקוגן בכבד בקר (ACL = 11.9) וגליקוגן צדפות (ACL = 12.6). יש לציין כי אותם גליקוגנים מסחריים משמשים בדרך כלל לבדיקת פעילות גליקוגן פוספורילאז או גליקוגן סינתאז. עובדה זו מצביעה על כך שקביעת הפרמטרים הקינטיים (Vmax ו-Km) של פעילות אנזים מטבוליזציה של גליקוגן תשתנה בהתאם למקור הגליקוגן.
ניתוחים תת-קרקעיים
הניתוח המשני הוא שיטה פשוטה להשוואת התפלגות שרשראות הגלוקן של שתי דגימות. לדוגמה, נקבעו CLDs של גליקוגן שיוצרו על-ידי זן ה-Synechocystis PCC6803 של הסוג הבר (WT) Synechocystis PCC6803 ושל זנים מוטנטיים איזוגניים בודדים מסוג glgA1 ו-glgA2 (איור 6A).
איור 6: השוואה של התפלגויות אורך שרשרת באמצעות אנליזה תת-קרקעית. (A) התפלגויות אורך השרשרת של גליקוגן המטוהר מזנים ציאנובקטריאליים: wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 וזנים מוטנטיים איזוגניים בודדים של glgA1 ו-glgA2 נקבעו באמצעות ניתוח פנים. שגיאת התקן של ממוצע (SEM) הוסקה משלושה ניסויים עצמאיים. (B) ניתוחי Subtractive בוצעו על ידי הפחתת האחוז של כל DP של WT לאחוז של כל DP של ΔglgA1 והפחתת האחוז של כל DP של WT לאחוז של כל DP של DP ΔglgA2. מניפולציה מתמטית פשוטה זו מציגה את השינוי של שרשראות גלוקן בזנים מוטנטיים (קווים שחורים). (C) התפלגויות אורך השרשרת הממוצעות של גליקוגן מ-wildtype ומוטנטים של Synechocystis נורמלו על פי השיא המרבי שנצפה עבור כל CLD (DP6 עבור כל הדגימות). שני מרכיבים מתווכחים על ידי התוויית ה-CLD המנורמל בסולם לוגריתמי (Nde (DP)). כל רכיב מציין מנגנון שונה של הפסקת גדילה (למידע נוסף, ראה הפניה2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כזכור, רוב זני הציאנובקטריה מכילים שני גנים המקודדים פעילויות גליקוגן סינתאז: GlgA1 ו-GlgA221. שני האנזימים מעבירים את שאריות הגלוקוז של ADP-גלוקוז אל הקצוות שאינם מפחיתים של שרשראות גלוקן ליניאריות. כפי שמתואר באיור 6A, קשה להשוות דגימות רק על ידי התבוננות בפרופילי התפלגות אורך השרשרת בלבד. הניתוח המשני מורכב מחיסור האחוז של כל DP בין דגימות (איור 6B). הניתוח המשני של %DP של WT מינוס % של מוטציה DP ΔglgA1 חושף עודף של DP3, 4 ו-5 (ערכים שליליים) וירידה בתוכן של DP 10-20. לעומת זאת, הניתוח המשני בין %DP של WT לבין % של מוטציה DP ΔglgA2 מצביע על השפעה הפוכה. מאחר שפרופילי האנליזה התת-קרקעית שונים בין GlgA1 ל-GlgA2, הדבר מצביע על פונקציה מסוימת של כל איזופורם של גליקוגן סינתאז בביוסינתזה של גליקוגן21.
חשוב לציין כי אנליזה תת-קרקעית חלה רק על ניסויים הכוללים דגימת ייחוס שבוצעה במקביל לדגימות. אחרת, ניתוח תת-קרקעי יכול להיות אמפירי שכן הוא שוכב על ה- CLD המנורמל של ההפניה. בשנת 2015, דנג ושותפיו, שחקרו מנגנוני עצירה של צמיחת גליקוגן בעכברים ובבני אדם, הציעו שרטוט ופרשנות חלופית של CLDs של גליקוגן כדי לטפל בבעיה זו. חלקה זו משתמשת באזור השיא המרבי כדי לנרמל כל CLD. לאחר מכן הנתונים מתווים בסולם לוגריתמי המדגיש שני מרכיבים. זה האחרון ממחיש שני מנגנונים שונים להארכת שרשרת עצירה2. על ידי ציור קווים המתאימים לרכיב DP הגבוה יותר, ניתן להשתמש בפרמטרים מוחלטים (כלומר, שיפועים ויירוטים של הקווים) להשוואת CLD ללא נורמליזציה לפרופיל ייחוס. CLDs של זן ה-wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 והמוטנטים האיזוגניים היחידים glgA1 ו-glgA2 שורטטו על סולם בולי עץ, וקווים מתאימים נקבעו עבור כל פרופיל (איור 6C). הרכיב הראשון היה דומה מאוד בין הדגימות, והגיע לשיא עם מקסימום ב-DP 6. זה ממחיש כי האנזים המסתעף מייצר במפורש מקסימום של שרשראות כאלה. המרכיב השני הופיע ככתף רחבה, שכבר תוארה עבור עכברים וגליקוגנים אנושיים2. הנטייה של הרכיב השני עלתה ב-DP גבוה יותר ב-ΔglgA1 והשיפוע של הקו ההולם המתאים (הקו האדום) היה נמוך יותר מפרופיל ה-wildtype. לפיכך, היעדר GlgA1 מאט את מעצר התארכות השרשרת במהלך הביוסינתזה שהוצעה להתרחש על ידי הפרעה סטרית לעכברים ולגליקוגן אנושי2. נתונים אלה מצביעים על כך שהאנזים המוארך הנותר (כלומר, GlgA2) מייצר שרשראות ארוכות יותר לפני צפיפות השרשראות. ב-ΔglgA2, האפקט ההפוך נצפה עם ירידה דרמטית יותר של קו ההתאמה, מה שמאשש כי השרשראות המיוצרות על ידי ה-GlgA1 הנותרות קצרות יותר בסך הכל מאלו שסונתזו על-ידי GlgA2 בלבד לפני ההפרעה הסטרית. ניתוח זה מצביע על כך ששני האיזופורמים הם בעלי קינטיקה מובחנת ו/או שההתאמה שלהם לפעילות האנזים המסתעף שונה.
Discussion
התכונות הפיזיקוכימיות של חלקיקי הגליקוגן (למשל, גודל, מורפולוגיה, מסיסות) קשורות ישירות לאורך הגלוקנים המרכיבים את החלקיקים. כל חוסר איזון בין אנזימים ביו-סינטטיים וקבוליים גורם לשינוי בהתפלגות אורך השרשרת, ולכל עצמה, להצטברות של גליקוגן לא תקין שעלול להיות מסוכן עבור התא11. ניתוח FACE הוא שיטה נבחרת לקביעת התפלגות אורך השרשרת של הגליקוגן (CLD). כפי שמתואר באיור 2, קביעת CLD מאפשרת להסיק את הערך הממוצע של אורך השרשרת של גליקוגן (ACL), המשקף את המבנה של חלקיקי גליקוגן. גליקוגנים של בעלי חיים עם ערכי ACL גבוהים קשורים להופעת חלקיקים לא תקינים. הניתוח המשני הוא שיטה מועילה להשוואת שתי דגימות גליקוגן מרקעים גנטיים שונים (מוטציה לעומת wildtype). על ידי התוויה בקנה מידה לוגריתמי CLDs מנורמלים לשיא המקסימלי, לעומת זאת, יש את היתרון של השוואת CLD ללא תלות בהתייחסות ונתנו לנו מידע על מנגנון הגליקוגן הגדל.
בנוסף, ניתוח FACE הוא טכניקה רבת עוצמה לאפיון התכונות הקטליטיות של אנזימים מטבוליזם גליקוגן. לדוגמה, כל האנזימים המסתעפים של הגליקוגן מבקעים (1 → 4)-α מקשרים ומעבירים קבוצות אוליגומלטוסיל למיקום או נקודות הסתעפות של (1 → 6)-α. ניתן להבחין בין אנזימי הסתעפות בשל זיקתם לפוליסכרידים (למשל, אמילופקטין, גליקוגן) ואורך הגלוקנים המועברים למרות המנגנון הקטליטי הדומה22. לפיכך, ניתן לאפיין ולסווג מקורות שונים של אנזימים מסתעפים (אדם, צמח, חיידקים) באמצעות סדרה של ניסויי דגירה והשוואות CLD באמצעות ניתוח פנים23.
כפי שצוין בהקדמה, HPAEC-PAD היא גם שיטה חלופית לקביעת התפלגות אורך השרשרת18. שתי הטכניקות דורשות הידרוליזה מלאה של (1 → 6)-α קשרים או נקודות הסתעפות על ידי אנזימי דברנצ'ינג מסוג איזואמילאז לפני הפרדת מאגר הגלוקנים הליניאריים בהתאם למידת הפילמור שלהם (DP). עם זאת, שיטת HPAEC-PAD טומנת בחובה שני חסרונות בהשוואה לפנים: (1) תגובת הדופק האמפרומטרית פוחתת ככל ששרשראות הגלוקן גדלות, מה שאינו מספק מידע כמותי. ניתן לעקוף את בעיית ההטיה ההמונית הזו באמצעות HPAEC-ENZ-PAD הכולל כור אנזים לאחר טור בין עמודת חילופי האניונים לבין PAD24. כור אנזים העמודה עושה הידרוליזה של מלטו-אוליגוסכרידים לשאריות גלוקוז המאפשרות תגובה אמפרומטרית קבועה של דופק. (2) ה- HPAEC-PAD מאפשר הפרדת שרשראות גלוקאן עם מידה של פילמור עד 70. למרות שהרזולוציה מספיקה לקביעת ה-CLD של דגימות גליקוגן, FACE מפרידה בין שרשראות עם עקורים עד 150, המתאימות לדגימות עמילן17. חשוב לזכור שגם לניתוח HPAEC-PAD וגם לניתוח פנים יש יתרונות וחסרונות. לדוגמה, תגובת המינוי דורשת קבוצה המיאצטלית חופשית כדי להגיב עם פונקציית האמין העיקרית של ה-APTS. משמעות הדבר היא שלא ניתן להשתמש בתיוג APTS עבור שרשראות גלוקן חסרות קצוות מפחיתים (למשל, אינולין). שיטת HPAEC-PAD אינה דורשת נוכחות של קצוות מצמצמים. היבט מעניין נוסף של שיטת HPAEC-PAD הוא שניתן לטעון את עמודת חילופי האניונים בכמה מיליגרמים של גלוקנים ליניאריים, מה שמאפשר טיהור של מלטו-אוליגוסכריד עם DP ספציפי או 14C-radiolabeled malto-oligosaccharide עבור בדיקה אנזימטית 18,25. לבסוף, למרות שספקטרומטריית מסה (למשל, MALDI-TOF) היא טכניקה מהירה ורגישה לקביעת התפלגות אורך השרשרת, נראה כי טכניקה זו פחות ניתנת לשחזור. הוא מעריך יתר על המידה את כמות שרשראות הגלוקן הארוכות26. עם זאת, האחרון יכול לשמש ליישום ספציפי כגון הדמיית MALDI כדי למפות את נוכחותו של גליקוגן על פני רקמה תאית27.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי CNRS, אוניברסיטת ליל CNRS, ומענקי ANR "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
