Summary
In het huidige protocol wordt de Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) techniek gebruikt om de ketenlengteverdeling (CLD) en de gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen te bepalen.
Abstract
Glycogeendeeltjes zijn vertakte polysacchariden die bestaan uit lineaire ketens van glucosyleenheden verbonden door α-1,4 glucosidebindingen. Deze laatste zijn aan elkaar bevestigd door α-1,6 glucoside-verbindingen, aangeduid als vertakkingspunten. Onder de verschillende vormen van koolstofopslag (d.w.z. zetmeel, β-glucaan), is glycogeen waarschijnlijk een van de oudste en meest succesvolle opslagpolysacchariden die in de levende wereld worden aangetroffen. Glucaanketens zijn zo georganiseerd dat een grote hoeveelheid glucose snel kan worden opgeslagen of gevoed in een cel wanneer dat nodig is. In de afgelopen decennia zijn tal van complementaire technieken ontwikkeld om de fijne structuur van glycogeendeeltjes op te lossen. Dit artikel beschrijft Fluorofoor-geassisteerde koolhydraat elektroforese (FACE). Deze methode kwantificeert de populatie van glucaanketens waaruit een glycogeendeeltje bestaat. Deze parameter, ook bekend als chain length distribution (CLD), weerspiegelt de deeltjesgrootte en het percentage vertakkingen. Het is ook een essentiële vereiste voor de wiskundige modellering van glycogeenbiosynthese.
Introduction
Glycogeen, gebruikt als koolstof- en energieopslag, is een homopolymeer van glucose dat bestaat uit lineaire ketens van glucosyleenheden verbonden door (1 → 4)-α bindingen en bevestigd door (1 → 6)-α glycosidische bindingen of vertakkingspunten. Ze verschijnen als β- en α deeltjes in het cytosol van een breed scala aan organismen. β-deeltjes zijn kleine in water oplosbare deeltjes die voornamelijk worden waargenomen in prokaryoten. Hun diameter varieert van 20-40 nm, waarschijnlijk gedicteerd door de glycogeen metaboliserende enzymen en sterische belemmering 1,2.
Voor het eerst beschreven in dierlijke cellen, vertonen de grotere α deeltjes een diameter tot 300 nm met een bloemkoolachtige vorm. Deze specifieke organisatie kan voortkomen uit de aggregatie van verschillende β-deeltjes of kan ontstaan door ontluikend uit een enkele β-deeltje3. Interessant is dat een recente studie de aanwezigheid van α-deeltjes in Escherichia coli4 heeft gemeld. In tegenstelling tot α deeltjes uit dierlijke cellen valt deze laatste echter snel uit elkaar tijdens het extractieproces, wat het gebrek aan gegevens in de literatuur kan verklaren4. Het verschijnen van α-deeltjes in eukaryoten en prokaryoten omvat fylogenetisch niet-gerelateerde glycogeen metaboliserende enzymen5. Dit roept vragen op over de functie van dergelijke deeltjes en de aard van potentiële cross-linker agenten tussen β-deeltjes5.
Hoewel twee tegengestelde wiskundige modellen werden voorgesteld voor de vorming van glycogeenmoleculen 6,7,8,9, wordt algemeen aangenomen dat β deeltjes zijn geëvolueerd als reactie op hun metabolische functie als een zeer efficiënte brandstofreserve voor de snelle afgifte van grote hoeveelheden glucose. Een grote hoeveelheid bewijsmateriaal geeft aan dat glycogeeneigenschappen zoals verteerbaarheid en oplosbaarheid in water gecorreleerd zijn met de gemiddelde ketenlengte (ACL), die vervolgens het percentage vertakkingspunten en de deeltjesgrootte 2,6,7,8,10,11 zal dicteren . ACL wordt gedefinieerd door de verhouding tussen het totale aantal glucoseresiduen en het aantal vertakkingspunten. Doorgaans variëren de ACL-waarden van 11-14 en 7-23 glucoseresiduen in eukaryoten en prokaryoten, respectievelijk10. Bij mensen zijn verschillende glycogeenziekteziekten te wijten aan abnormale glycogeenaccumulatie. De ziekte van Andersen wordt bijvoorbeeld geassocieerd met de gebrekkige activiteit van een glycogeenvertakkend enzym, wat resulteert in de accumulatie van abnormaal glycogeen11. In prokaryoten suggereren cumulatieve studies dat ACL een kritische factor is die van invloed is op de afbraaksnelheid van glycogeen en bacteriële overlevingscapaciteit12,13. Er is gemeld dat bacteriën die β deeltjes met een lage ACL-waarde synthetiseren, langzamer afbreken en daarom langer bestand zijn tegen uithongeringsomstandigheden. Kennis van de architectuur van β-deeltjes is dus essentieel voor het begrijpen van de vorming van abnormale glycogeendeeltjes in menselijke glycogeenstapelingsziekten en prokaryotenoverleving in een voedingsarme omgeving.
Sinds de eerste isolatie van glycogeen uit hondenlever door de Franse fysioloog Claude Bernard in de late negentiende eeuw14, werden veel technieken ontwikkeld om glycogeendeeltjes in detail te karakteriseren. Bijvoorbeeld transmissie-elektronenmicroscopie voor glycogeenmorfologie (α- of β-deeltjes)15, proton-NMR-spectrometrie voor het bepalen van het percentage α-1,6-koppelingen16, maatuitsluitingschromatografie met multidetectoren voor het afleiden van het molecuulgewicht, Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE)17 of high-performance anionenuitwisselingschromatografie met Pulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD) voor zowel ketenlengteverdeling (CLD) als ACL bepaling18.
Dit werk richt zich op de fluorofoor-geassisteerde koolhydraat-elektroforesemethode, die afhankelijk is van de reductieve aminatie van de hemiacetale groep door primaire aminefunctie. Historisch gezien werd 8-amino-1,3,6-naftaleen trisulfonzuur (ANTS) voor het eerst gebruikt voor etikettering. Later werd het vervangen door het meer gevoelige fluorofoor, 8-amino 1,3,6 pyreen trisulfonzuur (APTS)19.
Figuur 1: De reductieve aminatiereactie met 8-amino 1,3,6 pyreentrisulfonzuur (APTS). Reductieve aminatiereactie van de hemiacetale groep door primaire aminefunctie van 8-amino 1,3,6 pyreentrisulfonzuur (APTS) onder reductieve omstandigheden Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals afgebeeld in figuur 1, interageert de hemiacetale functie van het reducerende uiteinde van een glucaanketen met het primaire amine van APTS onder reducerende omstandigheden. De sulfonische groepen van APTS dragen negatieve ladingen die de scheiding van glucaanketens mogelijk maken op basis van hun mate van polymerisatie (DP). De reductieve aminereactie is zeer reproduceerbaar en efficiënt. Een gemiddelde efficiëntie-etikettering van 80% wordt verkregen voor DP3 tot DP135 en tot 88% en 97% voor maltose (DP2) en glucose, respectievelijk17,20. Omdat één molecuul APTS reageert met het reducerende uiteinde van elke glucaanketen, kunnen individuele ketens worden gekwantificeerd en op molaire basis met elkaar worden vergeleken.
Protocol
1. Incubatie met ontbraakenzymen
- Meng 200 μL gezuiverd glycogeen bij 0,5-2 mg/ml met 200 μL 100 mM acetaatbuffer (pH 4,8). Voeg 2 μl isoamylase (180 E/mg eiwit) en 1,5 μL pullulanase (30 E/mg eiwit) toe (zie Tabel met materialen), meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en incubeer bij 42 °C gedurende 16 uur in een buis van 1,5 ml.
OPMERKING: Afbraak of amylasebesmetting kan optreden tijdens het glycogeenzuiveringsproces. Om de aanwezigheid van vrije malto-oligosacchariden te waarderen, kunnen monsters parallel worden geïncubeerd zonder de debranching enzymcocktail. Een standaard (bijvoorbeeld maltoheptaose) is opgenomen in de analyse om de relatie tussen de elutietijd en de mate van polymerisatie te bepalen. - Stop de reacties door gedurende 5 minuten te broeden bij 95 °C.
- Centrifugeer bij 16.100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om te pelleteren en verwijder onoplosbaar materiaal.
- Verwijder de bovennatuurlijke stoffen met een pipet en breng ze over in nieuwe geannoteerde buizen. Ontzout de supernatanten door het equivalent van 100 μL anion/kationenwisselingsharsparels (AG-501-X8, zie Materialentabel) toe te voegen en te roeren.
- Roer de kralen regelmatig gedurende 5 min. Verzamel de monsters door te pipetteren en plaats ze in nieuwe geannoteerde buizen.
- Vriesdroog of gebruik een vacuümverdamper die is ingesteld (zie Materiaaltabel) bij 30 °C om de monsters te drogen.
- Bewaar gedroogde monsters bij kamertemperatuur of bij -20 °C.
OPMERKING: De monsters kunnen 1 maand worden bewaard.
2. Reductieve aminatie
- Meng de gedroogde monsters met 2 μL 1 M natriumcyanoboorhydride in tetrahydrofuraan (THF) en 2 μL APTS (5 mg APTS geresuspendeerd in 48 μL 15% azijnzuur) (zie Materiaaltabel).
- Incubeer bij 42 °C gedurende 16 uur in het donker.
LET OP: Natriumcyanoborohydride wordt behandeld met aangepaste persoonlijke beschermingsmiddelen en onder een chemische kap. Inademing en contact met de huid zijn zeer giftig en kunnen fataal zijn, waardoor ernstige brandwonden en oogbeschadiging ontstaan. Zeer giftige gassen kunnen worden gegenereerd bij het mengen van natriumcyanoboorhydride met azijnzuur. In contact met water geeft natriumcyanoboorhydride brandbare gassen af, die spontaan kunnen ontbranden. Geconcentreerde monsters worden behandeld onder een chemische kap en met behulp van aangepaste persoonlijke beschermingsmiddelen vanaf deze stap.
3. FACE-analyse
- Voeg 46 μL ultrapuur water toe aan elk monster.
- Verdun de monsters rechtstreeks tot 1/50 in microflacons van 100 μL door 1 μL van het monster toe te voegen aan 49 μL ultrapuur water. Bewaar de monsters in het donker tijdens het instellen van de FACE (5-10 min).
- Voer omgekeerde polariteit elektroforese uit met een capillair elektroforese-instrument met een lasergeïnduceerde fluorescentie (LIF) detector (zie Tabel met materialen). Stel de polariteit in op "omgekeerde modus" voor scheiding, stel de LIF in op 488 nm emissiegolflengte en de detector op 512 nm.
- Stel de injectietijd in op 10 s en de injectiedruk op 0,5 psi.
- Voer de APTS-gelabelde glucanenscheiding uit bij 30 kV in een kaal gesmolten silicacapillair van 60,2 cm lang met een binnendiameter van 50 μm (375 μm buitendiameter) in de N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer verdund tot 1/3 in ultrapuur water (zie Materialentabel).
OPMERKING: De N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer wordt elke 20 runs vervangen.
4. GEGEVENSVERWERKING
- Exporteer de ". ASC "en ". CDF "bestanden met respectievelijk het elektroferogramprofiel en integratiegegevens.
- Open het . ASC-bestand en teken de relatieve fluorescentie-eenheid volgens de tijdgrafiek.
- Open het . CDF-bestand , ga verder met een eerste automatische integratie en pas de volgende parameters aan: breedte; vallei tot dal integratie; minimale oppervlakte.
- Controleer en corrigeer eventuele onjuiste integratiegebeurtenissen handmatig.
Representative Results
Bepaling van de gemiddelde ketenlengte van glycogeen
Figuur 2 geeft de workflow weer die nodig is om de ketenlengteverdeling en de gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen af te leiden.
Figuur 2: Workflow om de ketenlengteverdeling (CLD) en gemiddelde ketenlengte te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 toont de elektroferogrammen van commerciële maltohexaose en onttakt runderleverglycogeen. De fluorescentiesignalen waargenomen tussen 4,13-4,67 min in alle experimenten waren afkomstig van de niet-gereageerde APTS. De elutietijd van gelabeld maltohexaose (DP6) werd geschat op 8,49 min (figuur 3A). De met APTS gelabelde glucanen van runderglycogeen werden geïdentificeerd op basis van de elutietijd van DP6 (figuur 3B). In het controlemonster werd geen spoor van vrije malto-oligosacharide aangetroffen (glycogeen niet geïncubeerd met debranching-enzymen) (figuur 3C).
Figuur 3: Elektroferogrammen van een standaard en runderleverglycogeen. (A) De tijdselutie (8,49 min) van een glucaanstandaard, maltohexaose (DP6), werd als referentie gebruikt om de mate van polymerisatie (DP) te bepalen van apts-gelabelde glucanen die vrijkomen uit runderleverglycogeen na de werking van debranching-enzymactiviteiten (B ). Het inzetpaneel toont een scheiding van glucaanketens tot 44 DP. Tegelijkertijd werd onbehandeld runderglycogeen gelabeld met APTS om mogelijke sporen van vrije malto-oligosacchariden in monster (C) te detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er kan worden geconcludeerd dat het vrijkomen van APTS-gelabeld glucaan te wijten is aan de splitsing van vertakkingspunten door zowel isoamylase- als pullulanase-activiteiten. Opgemerkt moet worden dat het capillaire elektroforeseprofiel kan worden hertekend in een geschikter formaat om een mozaïekfiguur met verschillende profielen te creëren. Om dit te doen, worden DATA-bestanden met fluorescentiewaarden gegenereerd met de extensie "asc" en geopend in het spreadsheetprogramma door csv-indeling (door komma's gescheiden waarde) te kiezen. Helaas zijn de geëxporteerde fluorescentiewaarden niet gekoppeld aan de overeenkomstige elutietijd. Daarom moeten ze handmatig worden toegevoegd volgens de opstelling van de acquisitiefrequentie op het FACE-apparaat (4 Hz betekent één waardeverwerving per 0,25 s).
Piekgebieden werden vervolgens afgeleid met behulp van de native applicatie van het FACE-instrument of geëxporteerd als een DATA-bestand met een "cdf" -extensie om een andere applicatie te gebruiken. De oppervlaktewaarden worden geëxporteerd in een spreadsheetprogramma en genormaliseerd door de DP uit te drukken als een percentage van de totale oppervlakte (figuur 4).
Figuur 4: Gegevensnormalisatie, ketenlengteverdeling en gemiddelde ketenlengtewaarde. Fluorescentiepiekgebieden werden geïmporteerd en genormaliseerd in een spreadsheet. De ketenlengteverdeling wordt weergegeven als het percentage DP voor elke DP. De gemiddelde ketenlengte (ACL) wordt berekend door elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie op te tellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten slotte wordt de gemiddelde ketenlengte (ACL) afgeleid door de som van elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie te berekenen. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd in drievoud op konijnenleverglycogeen (figuur 5A), op runderleverglycogeen (figuur 5B) en oesterglycogeen (figuur 5C).
Figuur 5: Ketenlengteverdeling van commercieel glycogeen. De konijnenlever (A), runderlever (B) en oesterglycogeen (C) werden geïncubeerd in aanwezigheid van debranching enzymen (isoamylase en pullulanase). De APTS-gelabelde glucanen werden vervolgens gescheiden op basis van hun mate van polymerisatie (DP) met behulp van FACE-analyse. Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) vertegenwoordigen de meest voorkomende glucanen in respectievelijk konijnenlever, oester en runderleverglycogeen. De Standard Error of Mean (SEM) werd afgeleid uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De ketenlengteverdeling van konijnenleverglycogeen toonde duidelijk een hoger gehalte aan korte malto-oligosacharide (DP2) dan runderleverglycogeen (DP 7) of oesterglycogeen (DP6). Hierdoor bezit het konijnenleverglycogeen de laagste gemiddelde ketenlengte (ACL = 9,8) in vergelijking met runderleverglycogeen (ACL = 11,9) en oesterglycogeen (ACL = 12,6). Opgemerkt moet worden dat die commerciële glycogenen meestal worden gebruikt voor het testen van de glycogeenfosforylase- of glycogeensynthase-activiteit. Dit suggereert dat de bepaling van kinetische parameters (Vmax en Km) van glycogeen metaboliserende enzymactiviteiten zal variëren afhankelijk van de bron van glycogeen.
Subtractieve analyses
De subtractieve analyse is een eenvoudige methode om de verdeling van de glucaanketens van twee monsters te vergelijken. Bijvoorbeeld, CLD's van glycogeen geproduceerd door de wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 stam en enkele isogene glgA1 en glgA2 mutante stammen werden bepaald (figuur 6A).
Figuur 6: Vergelijking van ketenlengteverdelingen met behulp van subtractieve analyse. (A) De ketenlengteverdelingen van glycogeen gezuiverd uit cyanobacteriële stammen: wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 en enkelvoudige isogene glgA1 - en glgA2-mutante stammen werden bepaald met behulp van FACE-analyse. De Standard Error of Mean (SEM) werd afgeleid uit drie onafhankelijke experimenten. B) Subtractieve analyses werden uitgevoerd door het % van elk DP WT af te trekken van het % van elk DP van ΔglgA1 en het % van elk DP van WT af te trekken tot het % van elk DP van DP ΔglgA2. Deze eenvoudige wiskundige manipulatie toont de verandering van glucaanketens in mutante stammen (zwarte lijnen). (C) De gemiddelde ketenlengteverdelingen van glycogeen van wildtype en mutanten van Synechocystis werden genormaliseerd volgens de maximale piek die voor elke CLD (DP6 voor alle monsters) werd waargenomen. Twee componenten worden aangetoond door de genormaliseerde CLD op een logaritmische schaal (Nde (DP)) uit te zetten. Elke component duidt op een ander mechanisme van groeistop (voor meer informatie, zie referentie2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ter herinnering, de meeste cyanobacteriënstammen bezitten twee genen die coderen voor glycogeensynthase-activiteiten: GlgA1 en GlgA221. Beide enzymen brengen het residu glucose van ADP-glucose over op de niet-reducerende uiteinden van lineaire glucaanketens. Zoals weergegeven in figuur 6A, is het een uitdaging om monsters te vergelijken door alleen naar de distributieprofielen van de ketenlengte te kijken. De subtractieve analyse bestaat uit het aftrekken van het percentage van elke DP tussen de monsters (figuur 6B). De subtractieve analyse van %DP van WT minus % DP ΔglgA1-mutant onthult een overmaat aan DP3, 4 en 5 (negatieve waarden) en een verlaagd gehalte aan DP 10-20. De subtractieve analyse tussen %DP van WT en % van DP ΔglgA2-mutant wijst daarentegen op een tegengesteld effect. Omdat de subtractieve analyseprofielen verschillen tussen GlgA1 en GlgA2, suggereert dit een specifieke functie van elke glycogeensynthase-isovorm in glycogeenbiosynthese21.
Het is belangrijk op te merken dat subtractieve analyse alleen van toepassing is op experimenten waarbij een referentiemonster wordt uitgevoerd dat parallel met de monsters wordt uitgevoerd. Anders kan subtractieve analyse empirisch zijn, omdat het op de genormaliseerde CLD van de referentie ligt. In 2015 stelden Deng en medewerkers, die de stopmechanismen van glycogeengroei bij muizen en mensen onderzochten, een alternatieve plotting en interpretatie van glycogeen-CLD's voor om dit probleem aan te pakken. Deze plot gebruikt het maximale piekgebied om elke CLD te normaliseren. De gegevens worden vervolgens uitgezet op een logaritmische schaal die twee componenten benadrukt. Deze laatste illustreren twee verschillende mechanismen voor kettingverlenging diestoppen 2. Door lijnen te tekenen die passen bij de hogere DP-component, kunnen absolute parameters (d.w.z. hellingen en onderscheppingen van de lijnen) worden gebruikt voor CLD-vergelijking zonder normalisatie naar een referentieprofiel. CLD's van de wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 stam en de enkele isogene glgA1 en glgA2 mutanten werden uitgezet op een logschaal, en passende lijnen werden bepaald voor elk profiel (Figuur 6C). De eerste component was zeer vergelijkbaar tussen de monsters, met een piek met een maximum bij DP 6. Dit illustreert dat het vertakkende enzym expliciet een maximum aan dergelijke ketens produceert. De tweede component verscheen als een brede schouder, die al werd beschreven voor muizen en menselijke glycogenen2. De helling van de tweede component ontstond bij een hogere DP in ΔglgA1 en de helling van de overeenkomstige fittinglijn (rode lijn) was lager dan het wildtypeprofiel. Het ontbreken van GlgA1 vertraagt dus de arrestatie van ketenverlenging tijdens biosynthese die werd voorgesteld om op te treden door sterische belemmering voor muizen en menselijk glycogeen2. Deze gegevens suggereren dat het resterende langwerpige enzym (d.w.z. GlgA2) langere ketens produceert voordat de keten wordt verdrongen. In ΔglgA2 werd het tegenovergestelde effect waargenomen met een meer dramatische daling van de fittinglijn, wat bevestigt dat de ketens geproduceerd door de resterende GlgA1 over het algemeen korter zijn dan die gesynthetiseerd door GlgA2 alleen vóór sterische belemmering. Deze analyse suggereert dat beide isovormen een verschillende kinetiek bezitten en/of dat hun respectieve afstemming met vertakkende enzymactiviteit verschilt.
Discussion
De fysisch-chemische eigenschappen van glycogeendeeltjes (bijv. Grootte, morfologie, oplosbaarheid) zijn direct geassocieerd met de lengte van glucanen waaruit de deeltjes bestaan. Elke onbalans tussen biosynthetische en katabole enzymen resulteert in de verandering van de ketenlengteverdeling en, per se, de accumulatie van abnormaal glycogeen dat gevaarlijk kan zijn voor de cel11. De FACE-analyse is een methode bij uitstek om de ketenlengteverdeling (CLD) van glycogeen te bepalen. Zoals afgebeeld in figuur 2, maakt de bepaling van CLD de gevolgtrekking mogelijk van de gemiddelde ketenlengtewaarde van glycogeen (ACL), die de structuur van glycogeendeeltjes weerspiegelt. Dierlijke glycogenen met hoge ACL-waarden worden geassocieerd met het verschijnen van abnormale deeltjes. De subtractieve analyse is een nuttige methode voor het vergelijken van twee glycogeenmonsters met verschillende genetische achtergronden (mutant versus wildtype). Door op een logaritmische schaal te plotten, heeft CLDs genormaliseerd tot de maximale piek daarentegen het voordeel dat CLD onafhankelijk van een referentie wordt vergeleken en ons informatie geeft over het groeiende glycogeenmechanisme.
Bovendien is FACE-analyse een krachtige techniek voor het karakteriseren van de katalytische eigenschappen van glycogeen metaboliserende enzymen. Alle glycogeenvertakkende enzymen splitsen bijvoorbeeld (1 → 4)-α verbanden en brengen oligomaltosylgroepen over op een (1 → 6)-α positie of vertakkingspunten. Vertakkende enzymen zijn te onderscheiden door hun affiniteit voor polysacchariden (bijv. Amylopectine, glycogeen) en de lengte van overgedragen glucanen ondanks het vergelijkbare katalytische mechanisme22. Zo kunnen verschillende bronnen van vertakkende enzymen (mens, plant, bacterie) worden gekarakteriseerd en geclassificeerd door middel van een reeks incubatie-experimenten en CLD-vergelijkingen met behulp van FACE-analyse23.
Zoals vermeld in de inleiding, is HPAEC-PAD ook een alternatieve methode voor het bepalen van de ketenlengteverdeling18. Beide technieken vereisen de volledige hydrolyse van (1 → 6)-α koppelingen of vertakkingspunten door isoamylase-type debranching enzymen voordat de pool van lineaire glucanen wordt gescheiden op basis van hun mate van polymerisatie (DP). De HPAEC-PAD-methode heeft echter twee nadelen ten opzichte van FACE: (1) de amperometrische pulsrespons neemt af naarmate de glucaanketens toenemen, wat geen kwantitatieve informatie oplevert. Dit probleem van massabias kan worden omzeild met behulp van HPAEC-ENZ-PAD waarbij een postkolomenzymreactor tussen de anionenuitwisselingskolom en PAD24 betrokken is. De kolomenzymreactor hydrolyseert malto-oligosacchariden tot glucoseresiduen waardoor een constante pulsamperometrische respons mogelijk is. (2) De HPAEC-PAD maakt de scheiding van glucaanketens mogelijk met een mate van polymerisatie tot 70. Hoewel de resolutie voldoende is voor het bepalen van de CLD van glycogeenmonsters, scheidt FACE ketens met DP's tot 150, geschikt voor zetmeelmonsters17. Het is essentieel om in gedachten te houden dat zowel HPAEC-PAD als FACE-analyse voor- en nadelen hebben. De aminatiereactie vereist bijvoorbeeld een vrije hemiacetale groep om te reageren met de primaire aminefunctie van de APTS. Dit impliceert dat APTS-etikettering niet kan worden gebruikt voor glucaanketens zonder reducerende uiteinden (bijv. Inuline). De HPAEC-PAD-methode vereist geen reducerende uiteinden. Een tweede interessant aspect van de HPAEC-PAD-methode is dat de anionenuitwisselingskolom kan worden geladen met enkele milligram lineaire glucanen, waardoor malto-oligosaccharide kan worden gezuiverd met een specifiek DP of 14C-radioactief gelabelde malto-oligosaccharide voor enzymatische assay18,25. Ten slotte, hoewel massaspectrometrie (bijv. MALDI-TOF) een snelle en gevoelige techniek is om de verdeling van de ketenlengte te bepalen, lijkt deze techniek minder reproduceerbaar te zijn. Het overschat de hoeveelheid lange glucaanketens26. Niettemin kan de laatste worden gebruikt voor een specifieke toepassing zoals MALDI-beeldvorming om de aanwezigheid van glycogeen in cellulair weefsel in kaart tebrengen 27.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten in verband met dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de CNRS, de Université de Lille CNRS en de ANR-beurzen "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
