Summary
I den nuværende protokol anvendes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) teknikken til at bestemme kædelængdefordelingen (CLD) og den gennemsnitlige kædelængde (ACL) af glykogen.
Abstract
Glykogenpartikler er forgrenede polysaccharider sammensat af lineære kæder af glucosylenheder bundet af α-1,4 glucosidbindinger. Sidstnævnte er fastgjort til hinanden ved hjælp af α-1,6 glucosidforbindelser, kaldet grenpunkter. Blandt de forskellige former for kulstoflagring (dvs. stivelse, β-glucan) er glykogen sandsynligvis et af de ældste og mest succesrige opbevaringspolysaccharider, der findes i hele den levende verden. Glucankæder er organiseret, så en stor mængde glukose hurtigt kan opbevares eller brændes i en celle, når det er nødvendigt. Talrige komplementære teknikker er blevet udviklet i løbet af de sidste årtier for at løse den fine struktur af glykogenpartikler. Denne artikel beskriver fluorofor-assisteret kulhydratelektroforese (FACE). Denne metode kvantificerer populationen af glucankæder, der komponerer en glykogenpartikel. Også kendt som kædelængdefordeling (CLD), afspejler denne parameter partikelstørrelsen og procentdelen af forgrening. Det er også et væsentligt krav til matematisk modellering af glykogenbiosyntese.
Introduction
Glykogen, der anvendes som kulstof- og energilagring, er en homopolymer af glucose bestående af lineære kæder af glucosylenheder bundet af (1 → 4)-α bindinger og bundet gennem (1 → 6)-α glycosidbindinger eller forgreningspunkter. De fremstår som β- og α-partikler i cytosolen hos en lang række organismer. β er små vandopløselige partikler, der hovedsageligt observeres i prokaryoter. Deres diameter varierer fra 20-40 nm, sandsynligvis dikteret af glykogenmetaboliserende enzymer og sterisk hindring 1,2.
Først beskrevet i dyreceller viser de større α-partikler op til 300 nm i diameter med en blomkållignende form. Denne særlige organisation kan stamme fra aggregering af flere β-partikler eller kan opstå ved at spire ud af en enkelt β-partikel3. Interessant nok har en nylig undersøgelse rapporteret tilstedeværelsen af α-partikler i Escherichia coli4. I modsætning til α fra dyreceller falder sidstnævnte imidlertid hurtigt fra hinanden under ekstraktionsprocessen, hvilket kan forklare manglen på data i litteraturen4. Udseendet af α-partikler i eukaryoter og prokaryoter involverer fylogenetisk uafhængige glykogenmetaboliserende enzymer5. Dette rejser spørgsmål vedrørende sådanne partiklers funktion og arten af potentielle tværbindingsmidler mellem β-partikler5.
Selvom to modsatte matematiske modeller blev foreslået til dannelse af glykogenmolekyle 6,7,8,9, er det generelt accepteret, at β-partikler har udviklet sig som reaktion på deres metaboliske funktion som en yderst effektiv brændstofreserve til hurtig frigivelse af store mængder glukose. En stor mængde beviser tyder på, at glykogenegenskaber såsom fordøjelighed og opløselighed i vand er korreleret med den gennemsnitlige kædelængde (ACL), som derefter vil diktere procentdelen af forgreningspunkter og partikelstørrelsen 2,6,7,8,10,11 . ACL defineres ved forholdet mellem det samlede antal glucoserester og antallet af forgreningspunkter. ACL-værdierne varierer typisk fra 11-14 og 7-23 glucoserester i henholdsvis eukaryoter og prokaryoter10. Hos mennesker skyldes flere glykogenforstyrrelsessygdomme unormal glykogenakkumulering. For eksempel er Andersens sygdom forbundet med den mangelfulde aktivitet af et glykogenforgreningsenzym, hvilket resulterer i akkumulering af unormalt glykogen11. I prokaryoter tyder kumulative undersøgelser på, at ACL er en kritisk faktor, der påvirker nedbrydningshastigheden af glykogen og bakteriel overlevelsesevne12,13. Det er blevet rapporteret, at bakterier, der syntetiserer β-partikler med en lav ACL-værdi, nedbrydes langsommere og derfor modstår sulteforhold længere. Således er viden om arkitekturen af β-partikler afgørende for at forstå dannelsen af unormale glykogenpartikler i humane glykogenlagringssygdomme og prokaryoters overlevelse i et næringsstofmangelfuldt miljø.
Siden den første isolering af glykogen fra hundelever af den franske fysiolog Claude Bernard i slutningen af det nittende århundrede14 blev der udviklet mange teknikker til at karakterisere glykogenpartikler i detaljer. For eksempel transmissionselektronmikroskopi til glykogenmorfologi (α- eller β-partikler)15, proton-NMR-spektrometri til bestemmelse af procentdelen af α-1,6-forbindelser16, størrelsesudelukkelseskromatografi med multidetektorer til udledning af molekylvægten, fluoroforeseksuel elektroforese (FACE)17 eller højtydende anionbytterkromatografi med pulserende amperometrisk detektion (HPAEC-PAD) for både kædelængdefordeling (CLD) og ACL bestemmelse18.
Dette arbejde fokuserer på den fluoroforeassisterede kulhydratelektroforesemetode, som er afhængig af den reduktive aminering af hemiacetalgruppen ved primær aminfunktion. Historisk set blev 8-amino-1,3,6-naphthalen trisulfonsyre (ANTS) først brugt til mærkning. Senere blev den erstattet af den mere følsomme fluorofor, 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS)19.
Figur 1: Den reduktive amineringsreaktion med 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS). Reduktiv amineringsreaktion af hemiacetalgruppen ved primær aminfunktion af 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS) under reduktive betingelser Klik her for at se en større version af dette tal.
Som afbildet i figur 1 interagerer den hemiacetale funktion af den reducerende ende af en glucankæde med den primære amin af APTS under reducerende betingelser. De sulfoniske grupper af APTS bærer negative ladninger, der muliggør adskillelse af glucankæder i henhold til deres polymerisationsgrad (DP). Den reduktive aminreaktion er yderst reproducerbar og effektiv. En gennemsnitlig effektivitetsmærkning på 80% opnås for DP3 til DP135 og op til 88% og 97% for henholdsvis maltose (DP2) og glucose17,20. Fordi et molekyle APTS reagerer med den reducerende ende af hver glucankæde, kunne individuelle kæder kvantificeres og sammenlignes med hinanden på molær basis.
Protocol
1. Inkubation med afgreningsenzymer
- 200 μL oprenset glykogen blandes ved 0,5-2 mg/ml med 200 μL 100 mM acetatbuffer (pH 4,8). Der tilsættes 2 μL isoamylase (180 U/mg protein) og 1,5 μL pullulanase (30 U/mg protein) (se materialetabel), blandes forsigtigt ved pipettering op og ned og inkuberes ved 42 °C i 16 timer i et rør på 1,5 ml.
BEMÆRK: Nedbrydning eller amylasekontaminering kan forekomme under glykogenrensningsprocessen. For at værdsætte tilstedeværelsen af frie malto-oligosaccharider kan prøver inkuberes uden den afgrenende enzymcocktail parallelt. En standard (f.eks. Maltoheptaose) er inkluderet i analysen for at bestemme forholdet mellem elueringstiden og graden af polymerisation. - Stop reaktionerne ved at inkubere ved 95 °C i 5 min.
- Centrifugering ved 16.100 x g i 5 minutter ved stuetemperatur til pellet og fjern eventuelt uopløseligt materiale.
- Fjern supernatanterne ved hjælp af en pipette og overfør dem til nye kommenterede rør. Afsalt supernatanterne ved at tilsætte, hvad der svarer til 100 μL anion/kationbytterharpiksperler (AG-501-X8, se materialetabellen) og omrøre.
- Omrør regelmæssigt perlerne i 5 minutter. Saml prøverne ved pipettering og læg dem i nye kommenterede rør.
- Frysetørre eller anvende en vakuumfordamper, der er opstillet (se materialetabellen) ved 30 °C, til at tørre prøverne.
- Opbevar tørrede prøver ved stuetemperatur eller ved -20 °C.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares i 1 måned.
2. Reduktiv aminering
- De tørrede prøver blandes med 2 μL 1 M natriumcyanoborohydrid i tetrahydrofuran (THF) og 2 μL APTS (5 mg APTS resuspenderet i 48 μL 15 % eddikesyre) (se materialetabellen).
- Inkuber ved 42 °C i 16 timer i mørke.
FORSIGTIG: Natriumcyanoborohydrid håndteres med tilpasset personligt beskyttelsesudstyr og under en kemisk hætte. Indånding og kontakt med huden er meget giftig og kan være dødelig og forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Meget giftige gasser kan genereres ved blanding af natriumcyanoborohydrid med eddikesyre. I kontakt med vand frigiver natriumcyanoborohydrid brandfarlige gasser, som kan antændes spontant. Koncentrerede prøver håndteres under en kemisk hætte og ved hjælp af tilpasset personligt beskyttelsesudstyr fra dette trin.
3. ANSIGTSANALYSE
- Der tilsættes 46 μL ultrarent vand til hver prøve.
- Prøverne fortyndes direkte til 1/50 i mikrohætteglas på 100 μL ved at tilsætte 1 μL af prøven til 49 μL ultrarent vand. Opbevar prøverne i mørke, mens du indstiller FACE (5-10 min).
- Udfør omvendt polaritetselektroforese med et kapillærelektroforeseinstrument med en laserinduceret fluorescensdetektor (LIF) (se materialetabel). Indstil polariteten til "omvendt tilstand" for adskillelse, indstil LIF til 488 nm emissionsbølgelængde og detektoren til 512 nm.
- Indstil injektionstiden til 10 s og injektionstrykket til 0,5 psi.
- Udfør APTS-mærket-glucans adskillelse ved 30 kV i en bar smeltet silicakapillær på 60,2 cm i længden med en indvendig diameter på 50 μm (375 μm ydre diameter) i den N-bundne kulhydratseparationsbuffer fortyndet til 1/3 i ultrarent vand (se materialetabel).
BEMÆRK: Den N-bundne kulhydratseparationsbuffer udskiftes hver 20. kørsel.
4. DATABEHANDLING
- Eksporter ". ASC "og ". CDF "filer, der indeholder henholdsvis elektroferogramprofilen og integrationsdata.
- Åbn . ASC-fil og tegne den relative fluorescensenhed i henhold til tidsdiagrammet.
- Åbn . CDF-fil , fortsæt med en første automatisk integration og juster følgende parametre: bredde; dal til dal integration; mindste areal.
- Kontroller og ret enhver forkert integrationshændelse manuelt.
Representative Results
Bestemmelse af den gennemsnitlige kædelængde af glykogen
Figur 2 repræsenterer den arbejdsgang, der kræves for at udlede kædelængdefordelingen og den gennemsnitlige kædelængde (ACL) af glykogen.
Figur 2: Arbejdsgang til bestemmelse af kædelængdefordelingen (CLD) og den gennemsnitlige kædelængde.
Figur 3 viser elektroferogrammerne af kommerciel maltohexaose og afbranchet kvægleverglykogen. Fluorescenssignalerne observeret mellem 4,13-4,67 minutter i alle eksperimenter stammer fra de ureagerede APTS. Elueringstiden for mærket maltohexaose (DP6) blev anslået til 8,49 min (figur 3A). De APTS-mærkede glucaner af kvægglykogen blev identificeret ud fra elueringstiden for DP6 (figur 3B). Der blev ikke påvist spor af frit maltoolisaccharid i kontrolprøven (glykogen ikke inkuberet med afgreningsenzymer) (figur 3C).
Figur 3: Elektroferogrammer af en standard og kvægleverglykogen. (A) Tidselueringen (8,49 min) af en glucanstandard, maltohexaose (DP6), blev anvendt som reference til bestemmelse af polymerisationsgraden (DP) af APTS-mærkede glucaner frigivet fra kvægleverglykogen efter virkningen af afgrening af enzymaktiviteter (B ). Det indbyggede panel viser en adskillelse af glucankæder op til 44 DP. Parallelt hermed blev ubehandlet kvægglykogen mærket med APTS for at påvise mulige spor af frie malto-oligosaccharider i prøve (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Det kan konkluderes, at frigivelsen af APTS-mærket glucan skyldes spaltning af forgreningspunkter ved både isoamylase- og pullulanaseaktiviteter. Det skal bemærkes, at kapillærelektroforeseprofilen kan tegnes om i et mere passende format for at skabe en mosaikfigur, der indeholder flere profiler. For at gøre dette genereres DATA-filer, der indeholder fluorescensværdier, med "asc" -udvidelsen og åbnes i regnearksprogrammet ved at vælge CSV-format (kommasepareret værdi). Desværre er de eksporterede fluorescensværdier ikke forbundet med den tilsvarende elueringstid. Derfor skal de tilføjes manuelt i henhold til anskaffelsesfrekvensopsætningen på FACE-apparatet (4 Hz betyder en værdiopsamling hver 0,25 s).
Spidsbelastningsområder blev derefter udledt ved hjælp af FACE-instrumentets oprindelige applikation eller eksporteret som en DATA-fil med en "cdf" -udvidelse for at bruge et andet program. Arealværdierne eksporteres i et regnearksprogram og normaliseres ved at udtrykke DP som en procentdel af det samlede overfladeareal (figur 4).
Figur 4: Datanormalisering, kædelængdefordeling og gennemsnitlig kædelængdeværdi. Fluorescenstopområder blev importeret og normaliseret i et regneark. Kædelængdefordelingen vises som procentdelen af DP for hver DP. Den gennemsnitlige kædelængde (ACL) beregnes ved at opsummere hver procentkæde gange den tilsvarende polymerisationsgrad. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig udledes den gennemsnitlige kædelængde (ACL) ved at beregne summen af hver procentkæde gange den tilsvarende polymerisationsgrad. Lignende forsøg blev udført i tre eksemplarer på kaninleverglykogen (figur 5A), på kvægleverglykogen (figur 5B) og østersglykogen (figur 5C).
Figur 5: Kædelængdefordeling af kommercielt glykogen. Kaninleveren (A), kvægleveren (B) og østersglykogen (C) blev inkuberet i nærvær af afgreningsenzymer (isoamylase og pullulanase). De APTS-mærkede glucaner blev derefter adskilt i henhold til deres polymerisationsgrad (DP) ved hjælp af FACE-analyse. Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) repræsenterer de mest rigelige glucaner i henholdsvis kaninlever, østers og kvægleverglykogen. Standard Error of Mean (SEM) blev udledt af tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kædelængdefordelingen af kaninleverglykogen viste tydeligt et højere indhold af kort maltoolikosaccharid (DP2) end kvægleverglykogen (DP 7) eller østersglykogen (DP6). Som følge heraf har kaninleverglykogen den laveste gennemsnitlige kædelængde (ACL = 9,8) sammenlignet med kvægleverglykogen (ACL = 11,9) og østersglykogen (ACL = 12,6). Det skal bemærkes, at disse kommercielle glykogener normalt anvendes til analyse af glykogenphosphorylase- eller glykogensyntaseaktiviteten. Dette tyder på, at bestemmelsen af kinetiske parametre (Vmax og Km) af glykogenmetaboliserende enzymaktiviteter vil variere afhængigt af glykogenkilden.
Subtraktive analyser
Den subtraktive analyse er en simpel metode til at sammenligne glucankædernes fordeling af to prøver. For eksempel blev CLD'er af glykogen produceret af vildtype (WT) Synechocystis PCC6803 stamme og enkelte isogene glgA1 og glgA2 mutantstammer bestemt (figur 6A).
Figur 6: Sammenligning af kædelængdefordelinger ved hjælp af subtraktiv analyse. (A) Kædelængdefordelingerne af glykogen renset fra cyanobakterielle stammer: vildtype (WT) Synechocystis PCC6803 og enkelte isogene glgA1- og glgA2-mutantstammer blev bestemt ved hjælp af FACE-analyse. Standard Error of Mean (SEM) blev udledt af tre uafhængige eksperimenter. B) Subtraktive analyser blev udført ved at trække % af hver DP af WT til % af hver DP af ΔglgA1 og trække % af hver DP af WT til % af hver DP af DP ΔglgA2. Denne ligefremme matematiske manipulation viser ændringen af glucankæder i mutante stammer (sorte linjer). (C) Den gennemsnitlige kædelængdefordeling af glykogen fra vildtype og mutanter af Synechocystis blev normaliseret i henhold til den maksimale top, der blev observeret for hver CLD (DP6 for alle prøver). To komponenter fremgår ved at plotte den normaliserede CLD på en logaritmisk skala (Nde (DP)). Hver komponent angiver en anden mekanisme for vækststop (for yderligere oplysninger, se reference2). Klik her for at se en større version af denne figur.
For at huske har de fleste cyanobakteriestammer to gener, der koder for glykogensyntaseaktiviteter: GlgA1 og GlgA221. Begge enzymer overfører restglukosen af ADP-glucose til de ikke-reducerende ender af lineære glucankæder. Som vist i figur 6A er det en udfordring at sammenligne prøver ved kun at se på fordelingsprofilerne for kædelængden. Den subtraktive analyse består i at trække procentdelen af hver DP mellem prøverne (figur 6B). Den subtraktive analyse af %DP af WT minus % af DP ΔglgA1-mutanten afslører et overskud af DP3, 4 og 5 (negative værdier) og et nedsat indhold af DP 10-20. I modsætning hertil indikerer den subtraktive analyse mellem %DP for WT og % for DP ΔglgA2-mutant en modsat virkning. Fordi de subtraktive analyseprofiler er forskellige mellem GlgA1 og GlgA2, antyder dette en specifik funktion af hver glykogensyntaseisoform i glykogenbiosyntese21.
Det er vigtigt at bemærke, at subtraktiv analyse kun gælder for eksperimenter, der involverer en referenceprøve udført parallelt med prøverne. Ellers kan subtraktiv analyse være empirisk, da den ligger på referencens normaliserede CLD. I 2015 foreslog Deng og samarbejdspartnere, der undersøgte stopmekanismer for glykogenvækst hos mus og mennesker, en alternativ planlægning og fortolkning af glykogen-CLD'er for at løse dette problem. Dette plot bruger det maksimale topområde til at normalisere hver CLD. Dataene afbildes derefter på en logaritmisk skala, der fremhæver to komponenter. Sidstnævnte illustrerer to forskellige mekanismer til kædeforlængelse, der stopper2. Ved at tegne linjer, der passer til den højere DP-komponent, kan absolutte parametre (dvs. skråninger og aflytninger af linjerne) bruges til CLD-sammenligning uden normalisering til en referenceprofil. CLD'er af vildtype (WT) Synechocystis PCC6803-stammen og de enkelte isogene glgA1 - og glgA2-mutanter blev afbildet på en logskala, og tilpasningslinjer blev bestemt for hver profil (figur 6C). Den første komponent var meget ens mellem prøverne og toppede med et maksimum ved DP 6. Dette illustrerer, at forgreningsenzymet eksplicit producerer maksimalt sådanne kæder. Den anden komponent optrådte som en bred skulder, som allerede var beskrevet for mus og humane glykogener2. Hældningen af den anden komponent opstod ved en højere DP i ΔglgA1 , og hældningen af den tilsvarende tilpasningslinje (rød linje) var lavere end vildtypeprofilen. Således bremser manglen på GlgA1 arrestationen af kædeforlængelse under biosyntese, der blev foreslået at forekomme ved sterisk hindring for mus og humant glykogen2. Disse data tyder på, at det resterende forlængende enzym (dvs. GlgA2) producerer længere kæder før kædetrængning. I ΔglgA2 blev den modsatte effekt observeret med et mere dramatisk fald i tilpasningslinjen, hvilket bekræfter, at kæderne produceret af den resterende GlgA1 generelt er kortere end dem, der syntetiseres af GlgA2 alene før sterisk hindring. Denne analyse tyder på, at begge isoformer besidder forskellig kinetik og/eller at deres respektive samspilning med forgreningsenzymaktivitet er forskellig.
Discussion
De fysisk-kemiske egenskaber af glykogenpartikler (f.eks. Størrelse, morfologi, opløselighed) er direkte forbundet med længden af glucaner, der komponerer partiklerne. Enhver ubalance mellem biosyntetiske og katabolske enzymer resulterer i ændring af kædelængdefordelingen og i sig selv akkumulering af unormalt glykogen, der kan være farligt for cellen11. FACE-analysen er en metode til valg til bestemmelse af glykogens kædelængdefordeling (CLD). Som afbildet i figur 2 tillader bestemmelsen af CLD konklusionen af den gennemsnitlige kædelængdeværdi af glykogen (ACL), som afspejler strukturen af glykogenpartikler. Animalglykogener med høje ACL-værdier er forbundet med udseendet af unormale partikler. Den subtraktive analyse er en nyttig metode til at sammenligne to glykogenprøver fra forskellige genetiske baggrunde (mutant versus vildtype). Ved at plotte på en logaritmisk skala har CLD'er normaliseret til den maksimale top derimod fordelen ved at sammenligne CLD uafhængigt af en reference og gav os information om den voksende glykogenmekanisme.
Derudover er FACE-analyse en kraftfuld teknik til at karakterisere de katalytiske egenskaber af glykogenmetaboliserende enzymer. For eksempel spalter alle glykogenforgreningsenzymer (1 → 4)-α forbindelser og overfører oligomaltosylgrupper til en (1 → 6)-α position eller forgreningspunkter. Forgreningsenzymer kan skelnes på grund af deres affinitet for polysaccharider (f.eks. Amylopectin, glykogen) og længden af overførte glucaner på trods af den lignende katalytiske mekanisme22. Således kan forskellige kilder til forgreningsenzymer (mennesker, planter, bakterier) karakteriseres og klassificeres gennem en række inkubationseksperimenter og CLD-sammenligninger ved hjælp af FACE-analyse23.
Som nævnt i indledningen er HPAEC-PAD også en alternativ metode til bestemmelse af kædelængdefordelingen18. Begge teknikker kræver fuldstændig hydrolyse af (1 → 6)-α forbindelser eller forgreningspunkter ved hjælp af afgreningsenzymer af isoamylase-typen, før puljen af lineære glucaner adskilles i henhold til deres polymerisationsgrad (DP). HPAEC-PAD-metoden har imidlertid to ulemper sammenlignet med FACE: (1) Det amperometriske pulsrespons falder, når glucankæderne øges, hvilket ikke giver kvantitativ information. Dette massebias-problem kan omgås ved hjælp af HPAEC-ENZ-PAD, der involverer en enzymreaktor efter kolonnen mellem anionbytterkolonnen og PAD24. Kolonneenzymreaktoren hydrolyserer malto-oligosaccharider i glucoserester, hvilket muliggør en konstant puls amperometrisk respons. (2) HPAEC-PAD tillader adskillelse af glucankæder med en polymerisationsgrad på op til 70. Selvom opløsningen er tilstrækkelig til at bestemme CLD for glykogenprøver, adskiller FACE kæder med DPs op til 150, egnet til stivelsesprøver17. Det er vigtigt at huske på, at både HPAEC-PAD og FACE-analyse har fordele og ulemper. For eksempel kræver amineringsreaktionen en fri hemiacetal gruppe til at reagere med APTS's primære aminfunktion. Dette indebærer, at APTS-mærkning ikke kan anvendes til glucankæder, der mangler reducerende ender (f.eks. Inulin). HPAEC-PAD-metoden kræver ikke tilstedeværelse af reducerende ender. Et andet interessant aspekt af HPAEC-PAD-metoden er, at anionbytterkolonnen kan fyldes med et par milligram lineære glucaner, hvilket muliggør rensning af malto-oligosaccharid med en specifik DP eller 14C-radioaktivt mærket malto-oligosaccharid til enzymatisk assay18,25. Endelig, selvom massespektrometri (f.eks. MALDI-TOF) er en hurtig og følsom teknik til bestemmelse af kædelængdefordeling, synes denne teknik at være mindre reproducerbar. Det overvurderer mængden af lange glucankæder26. Ikke desto mindre kan sidstnævnte bruges til en specifik anvendelse såsom MALDI-billeddannelse for at kortlægge tilstedeværelsen af glykogen på tværs afcellulært væv 27.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter forbundet med dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CNRS, Université de Lille CNRS og ANR-tilskuddene "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
