Summary
Dans le présent protocole, la technique d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE) est utilisée pour déterminer la distribution de la longueur de la chaîne (CLD) et la longueur moyenne de la chaîne (ACL) du glycogène.
Abstract
Les particules de glycogène sont des polysaccharides ramifiés composés de chaînes linéaires d’unités glucosyliques liées par des liaisons glucosides α-1,4. Ces derniers sont attachés les uns aux autres par α-1,6 liaisons glucosides, appelées points de branchement. Parmi les différentes formes de stockage du carbone (c’est-à-dire l’amidon, le β-glucane), le glycogène est probablement l’un des polysaccharides de stockage les plus anciens et les plus réussis que l’on trouve dans le monde vivant. Les chaînes de glucane sont organisées de manière à ce qu’une grande quantité de glucose puisse être rapidement stockée ou alimentée dans une cellule en cas de besoin. De nombreuses techniques complémentaires ont été développées au cours des dernières décennies pour résoudre la structure fine des particules de glycogène. Cet article décrit l’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE). Cette méthode quantifie la population de chaînes de glucanes qui composent une particule de glycogène. Également connu sous le nom de distribution de longueur de chaîne (CLD), ce paramètre reflète la taille des particules et le pourcentage de ramification. C’est également une exigence essentielle pour la modélisation mathématique de la biosynthèse du glycogène.
Introduction
Le glycogène, utilisé comme stockage de carbone et d’énergie, est un homopolymère du glucose constitué de chaînes linéaires d’unités glucosyliques liées par des liaisons (1 → 4)-α et attachées par (1 → 6)-α des liaisons glycosidiques ou des points de ramification. Ils apparaissent sous forme de particules β et α dans le cytosol d’un large éventail d’organismes. β-particules sont de minuscules particules solubles dans l’eau principalement observées chez les procaryotes. Leur diamètre varie de 20 à 40 nm, probablement dicté par les enzymes métabolisant le glycogène et l’obstacle stérique 1,2.
D’abord décrites dans des cellules animales, les plus grandes particules de α présentent jusqu’à 300 nm de diamètre avec une forme de chou-fleur. Cette organisation particulière peut provenir de l’agrégation de plusieurs particules de β ou peut survenir en bourgeonnant à partir d’une seule particule β3. Fait intéressant, une étude récente a rapporté la présence de particules de α dans Escherichia coli4. Cependant, contrairement aux particules α provenant de cellules animales, ces dernières s’effondrent rapidement au cours du processus d’extraction, ce qui peut expliquer le manque de données dans la littérature4. L’apparition de particules de α chez les eucaryotes et les procaryotes implique des enzymes métabolisant le glycogène phylogénétiquement non apparentées5. Cela soulève des questions concernant la fonction de ces particules et la nature des agents de réticulation potentiels entre β-particules5.
Bien que deux modèles mathématiques opposés aient été proposés pour la formation de molécules de glycogène 6,7,8,9, il est généralement admis que les particules de β ont évolué en réponse à leur fonction métabolique en tant que réserve de carburant très efficace pour la libération rapide de grandes quantités de glucose. Un grand nombre de preuves indiquent que les propriétés du glycogène telles que la digestibilité et la solubilité dans l’eau sont corrélées à la longueur moyenne de la chaîne (LCA), qui dictera ensuite le pourcentage de points de ramification et la taille des particules 2,6,7,8,10,11 . L’ACL est définie par le rapport entre le nombre total de résidus de glucose et le nombre de points de ramification. En règle générale, les valeurs du LCA varient de 11 à 14 et de 7 à 23 résidus de glucose chez les eucaryotes et les procaryotes, respectivement10. Chez l’homme, plusieurs maladies du trouble du glycogène sont dues à une accumulation anormale de glycogène. Par exemple, la maladie d’Andersen est associée à l’activité déficiente d’une enzyme de ramification du glycogène, entraînant l’accumulation de glycogène11 anormal. Chez les procaryotes, des études cumulatives suggèrent que le LCA est un facteur critique ayant un impact sur le taux de dégradation du glycogène et la capacité de survie bactérienne12,13. Il a été rapporté que les bactéries synthétisant des particules de β avec une faible valeur ACL se dégradent plus lentement et résistent donc plus longtemps aux conditions de famine. Ainsi, la connaissance de l’architecture des particules de β est essentielle pour comprendre la formation de particules de glycogène anormales dans les maladies de stockage du glycogène humain et la survie des procaryotes dans un environnement déficient en nutriments.
Depuis le premier isolement du glycogène du foie de chien par le physiologiste Français Claude Bernard à la fin du XIXe siècle14, de nombreuses techniques ont été développées pour caractériser en détail les particules de glycogène. Par exemple, la microscopie électronique à transmission pour la morphologie du glycogène (particules α ou β)15, la spectrométrie proton-RMN pour déterminer le pourcentage de liaisons α-1,616, la chromatographie d’exclusion de taille avec multi-détecteurs pour déduire le poids moléculaire, l’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE)17 ou la chromatographie par échange d’anions à haute performance avec détection ampérométrique pulsée (HPAEC-PAD) pour la distribution de longueur de chaîne (CLD) et le LCA détermination18.
Ce travail se concentre sur la méthode d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore, qui repose sur l’amination réductrice du groupe hémiacétal par fonction amine primaire. Historiquement, l’acide 8-amino-1,3,6-naphtalène trisulfonique (ANTS) a d’abord été utilisé pour le marquage. Plus tard, il a été remplacé par le fluorophore plus sensible, l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS)19.
Figure 1 : La réaction d’amination réductrice avec l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS). Réaction d’amination réductrice du groupe hémiacétal par fonction amine primaire de l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS) dans des conditions réductrices Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Comme illustré à la figure 1, la fonction hémiacétal de l’extrémité réductrice d’une chaîne glucane interagit avec l’amine primaire de l’APTS dans des conditions réductrices. Les groupes sulfoniques d’APTS portent des charges négatives qui permettent la séparation des chaînes de glucanes en fonction de leur degré de polymérisation (DP). La réaction réductrice de l’amine est hautement reproductible et efficace. Un étiquetage d’efficacité moyen de 80% est obtenu pour DP3 à DP135 et jusqu’à 88% et 97% pour le maltose (DP2) et le glucose, respectivement17,20. Parce qu’une molécule d’APTS réagit avec l’extrémité réductrice de chaque chaîne glucane, les chaînes individuelles pourraient être quantifiées et comparées les unes aux autres sur une base molaire.
Protocol
1. Incubation avec des enzymes débranchantes
- Mélanger 200 μL de glycogène purifié à 0,5-2 mg/mL avec 200 μL de 100 mM de tampon acétate (pH 4,8). Ajouter 2 μL d’isoamylase (180 U/mg de protéines) et 1,5 μL de pullulanase (30 U/mg de protéines) (voir tableau des matériaux), mélanger doucement par pipetage de haut en bas, et incuber à 42 °C pendant 16 h dans un tube de 1,5 mL.
REMARQUE: La dégradation ou la contamination par l’amylase peut se produire pendant le processus de purification du glycogène. Pour apprécier la présence de malto-oligosaccharides libres, les échantillons peuvent être incubés sans le cocktail d’enzymes débranchantes en parallèle. Une norme (p. ex. maltoheptaose) est incluse dans l’analyse pour déterminer la relation entre le temps d’élution et le degré de polymérisation. - Arrêtez les réactions en incubant à 95 °C pendant 5 min.
- Centrifuger à 16 100 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler et enlever tout matériau insoluble.
- Retirez les surnageants à l’aide d’une pipette et transférez-les dans de nouveaux tubes annotés. Dessaler les surnageants en ajoutant l’équivalent de 100 μL de billes de résine échangeuse anion/cation (AG-501-X8, voir Tableau des matériaux) et agiter.
- Agiter régulièrement les perles pendant 5 min. Prélever les échantillons par pipetage et les placer dans de nouveaux tubes annotés.
- Lyophiliser ou utiliser un évaporateur sous vide installé (voir tableau des matériaux) à 30 °C pour sécher les échantillons.
- Conserver les échantillons séchés à température ambiante ou à -20 °C.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés pendant 1 mois.
2. Amination réductrice
- Mélanger les échantillons séchés avec 2 μL de cyanoborohydrure de sodium 1 M dans du tétrahydrofurane (THF) et 2 μL d’APTS (5 mg d’APTS remis en suspension dans 48 μL d’acide acétique à 15 %) (voir tableau des matériaux).
- Incuber à 42 °C pendant 16 h dans l’obscurité.
ATTENTION : Le cyanoborohydrure de sodium est manipulé avec un équipement de protection individuelle adapté et sous une hotte chimique. L’inhalation et le contact avec la peau sont très toxiques et peuvent être mortels, causant de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Des gaz hautement toxiques peuvent être générés lors du mélange de cyanoborohydrure de sodium avec de l’acide acétique. Au contact de l’eau, le cyanoborohydrure de sodium libère des gaz inflammables, qui peuvent s’enflammer spontanément. Les échantillons concentrés sont manipulés sous une hotte chimique et à l’aide d’un équipement de protection individuelle adapté à partir de cette étape.
3. Analyse FACE
- Ajouter 46 μL d’eau ultrapure à chaque échantillon.
- Diluer les échantillons directement à 1/50 dans des micro-flacons de 100 μL en ajoutant 1 μL de l’échantillon à 49 μL d’eau ultrapure. Gardez les échantillons dans l’obscurité tout en réglant le FACE (5-10 min).
- Effectuer une électrophorèse à polarité inverse avec un instrument d’électrophorèse capillaire avec un détecteur à fluorescence induite par laser (LIF) (voir tableau des matériaux). Réglez la polarité sur « mode inverse » pour la séparation, réglez le LIF à 488 nm de longueur d’onde d’émission et le détecteur à 512 nm.
- Réglez le temps d’injection sur 10 s et la pression d’injection à 0,5 psi.
- Effectuer la séparation des glucanes marqués APTS à 30 kV dans un capillaire de silice fondue nue de 60,2 cm de longueur avec un diamètre intérieur de 50 μm (375 μm de diamètre extérieur) dans le tampon de séparation des glucides lié à l’azote dilué à 1/3 dans de l’eau ultrapure (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Le tampon de séparation des glucides lié à l’azote est remplacé toutes les 20 exécutions.
4. Traitement des DONNÉES
- Exportez le fichier « . ASC « et « . CDF « fichiers contenant respectivement le profil de l’électrophérogramme et les données d’intégration.
- Ouvrez le fichier . ASC et dessinez l’unité de fluorescence relative en fonction du graphique temporel.
- Ouvrez le fichier . CDF , procédez à une première intégration automatique et ajustez les paramètres suivants: largeur; l’intégration de vallée à vallée; superficie minimale.
- Vérifiez et corrigez manuellement tout événement d’intégration incorrect.
Representative Results
Détermination de la longueur moyenne de la chaîne du glycogène
La figure 2 représente le flux de travail nécessaire pour déduire la distribution de la longueur de la chaîne et la longueur moyenne de la chaîne (LCA) du glycogène.
Figure 2 : Flux de travail pour déterminer la distribution de la longueur de chaîne (CLD) et la longueur moyenne de la chaîne. Cliquez ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
La figure 3 montre les électrophérogrammes du maltohexaose commercial et du glycogène hépatique bovin débranché. Les signaux de fluorescence observés entre 4,13 et 4,67 minutes dans toutes les expériences provenaient de l’APTS non réagi. Le temps d’élution du maltohexaose marqué (DP6) a été estimé à 8,49 min (Figure 3A). Les glucanes de glycogène bovin marqués APTS ont été identifiés en fonction du temps d’élution de DP6 (figure 3B). Aucune trace de malto-oligosaccharide libre n’a été détectée dans l’échantillon témoin (glycogène non incubé avec des enzymes débranchantes) (figure 3C).
Figure 3 : Électrophérogrammes d’un glycogène hépatique standard et bovin. (A) L’élution temporelle (8,49 min) d’un étalon glucane, le maltohexaose (DP6), a été utilisée comme référence pour déterminer le degré de polymérisation (DP) des glucanes marqués APTS libérés par le glycogène hépatique bovin après l’action des activités enzymatiques débranchantes (B ). Le panneau en médaillon montre une séparation des chaînes de glucane jusqu’à 44 DP. En parallèle, le glycogène bovin non traité a été marqué avec APTS pour détecter d’éventuelles traces de malto-oligosaccharides libres dans l’échantillon (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
On peut conclure que la libération de glucane marqué APTS est due au clivage des points de ramification par les activités de l’isoamylase et de la pullulanase. Il convient de noter que le profil d’électrophorèse capillaire peut être redessiné dans un format plus approprié pour créer une figure en mosaïque contenant plusieurs profils. Pour ce faire, les fichiers DATA contenant des valeurs de fluorescence sont générés avec l’extension « asc » et ouverts dans le tableur en choisissant le format CSV (valeurs séparées par des virgules). Malheureusement, les valeurs de fluorescence exportées ne sont pas associées au temps d’élution correspondant. Par conséquent, ils doivent être ajoutés manuellement en fonction de la configuration de la fréquence d’acquisition sur l’appareil FACE (4 Hz signifie une acquisition de valeur toutes les 0,25 s).
Les zones de crête ont ensuite été déduites à l’aide de l’application native de l’instrument FACE ou exportées sous forme de fichier DATA avec une extension « cdf » pour utiliser une autre application. Les valeurs de surface sont exportées dans un tableur et normalisées en exprimant le PDD en pourcentage de la surface totale (Figure 4).
Figure 4 : Normalisation des données, distribution de la longueur de la chaîne et valeur moyenne de la longueur de la chaîne. Les zones de pic de fluorescence ont été importées et normalisées dans une feuille de calcul. La distribution de la longueur de la chaîne est indiquée sous la forme du pourcentage de DP pour chaque DP. La longueur moyenne de la chaîne (ACL) est calculée en additionnant chaque chaîne en pourcentage multipliée par le degré de polymérisation correspondant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Enfin, la longueur moyenne de la chaîne (ACL) est déduite en calculant la somme de chaque chaîne en pourcentage multipliée par le degré de polymérisation correspondant. Des expériences similaires ont été réalisées en triplicate sur le glycogène hépatique de lapin (figure 5A), sur le glycogène hépatique bovin (figure 5B) et le glycogène d’huître (figure 5C).
Figure 5 : Distribution de la longueur de la chaîne du glycogène commercial. Le foie de lapin (A), le foie de bovin (B) et le glycogène d’huître (C) ont été incubés en présence d’enzymes débranchantes (isoamylase et pullulanase). Les glucanes marqués APTS ont ensuite été séparés en fonction de leur degré de polymérisation (DP) à l’aide de l’analyse FACE. Le maltose (DP2), le maltohexaose (DP6) et le maltoheptaose (DP7) représentent respectivement les glucanes les plus abondants dans le foie de lapin, l’huître et le glycogène du foie bovin. L’erreur-type de la moyenne (MEB) a été déduite de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La distribution en longueur de chaîne du glycogène hépatique de lapin a clairement montré une teneur plus élevée en malto-oligosaccharide court (DP2) que le glycogène hépatique bovin (DP 7) ou le glycogène d’huître (DP6). En conséquence, le glycogène hépatique de lapin possède la longueur moyenne de chaîne la plus faible (LCA = 9,8) par rapport au glycogène hépatique bovin (LCA = 11,9) et au glycogène d’huître (LCA = 12,6). Il est à noter que ces glycogènes commerciaux sont généralement utilisés pour doser l’activité de la glycogène phosphorylase ou de la glycogène synthase. Cela suggère que la détermination des paramètres cinétiques (Vmax et Km) des activités enzymatiques métabolisant le glycogène variera en fonction de la source de glycogène.
Analyses soustractives
L’analyse soustractive est une méthode simple pour comparer la distribution des chaînes de glucane de deux échantillons. Par exemple, des CLD de glycogène produits par la souche de type sauvage (WT) Synechocystis PCC6803 et des souches mutantes isogéniques uniques glgA1 et glgA2 ont été déterminés (figure 6A).
Figure 6 : Comparaison des distributions de longueur de chaîne à l’aide de l’analyse soustractive. (A) Les distributions de longueur de chaîne du glycogène purifié à partir de souches cyanobactériennes : Synechocystis PCC6803 de type sauvage (WT) et souches mutantes isogéniques uniques glgA1 et glgA2 ont été déterminées à l’aide de l’analyse FACE. L’erreur-type de la moyenne (MEB) a été déduite de trois expériences indépendantes. (B) Des analyses soustractives ont été effectuées en soustrayant le % de chaque PDD de WT au % de chaque PDD de ΔglgA1 et en soustrayant le % de chaque PDD de WT au % de chaque PDD de DP ΔglgA2. Cette manipulation mathématique simple montre l’altération des chaînes de glucanes dans des souches mutantes (lignes noires). (C) Les distributions moyennes de longueur de chaîne du glycogène de type sauvage et des mutants de Synechocystis ont été normalisées en fonction du pic maximal observé pour chaque CLD (DP6 pour tous les échantillons). Deux composantes sont mises en évidence en traçant le CLD normalisé sur une échelle logarithmique (Nde (DP)). Chaque composante indique un mécanisme différent d’arrêt de la croissance (pour plus d’informations, voir la référence2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour rappel, la plupart des souches de cyanobactéries possèdent deux gènes codant pour les activités de la glycogène synthase : GlgA1 et GlgA221. Les deux enzymes transfèrent le glucose résiduel d’ADP-glucose aux extrémités non réductrices des chaînes linéaires de glucanes. Comme le montre la figure 6A, il est difficile de comparer les échantillons en ne regardant que les profils de distribution de la longueur de la chaîne. L’analyse soustractive consiste à soustraire le pourcentage de chaque PDD entre les échantillons (figure 6B). L’analyse soustractive de %DP de WT moins % de DP ΔglgA1 mutant révèle un excès de DP3, 4 et 5 (valeurs négatives) et une diminution de la teneur en DP 10-20. En revanche, l’analyse soustractive entre %DP de WT et % de DP ΔglgA2 mutant indique un effet inverse. Étant donné que les profils d’analyse soustractive sont différents entre GlgA1 et GlgA2, cela suggère une fonction spécifique de chaque isoforme de glycogène synthase dans la biosynthèse du glycogène21.
Il est important de noter que l’analyse soustractive ne s’applique qu’aux expériences impliquant un échantillon de référence effectué en parallèle avec les échantillons. Sinon, l’analyse soustractive peut être empirique puisqu’elle repose sur le CLD normalisé de la référence. En 2015, Deng et ses collaborateurs, qui ont étudié les mécanismes d’arrêt de la croissance du glycogène chez la souris et l’homme, ont proposé une autre solution de traçage et d’interprétation des CLD de glycogène pour résoudre ce problème. Ce graphique utilise la zone de crête maximale pour normaliser chaque CLD. Les données sont ensuite tracées sur une échelle logarithmique mettant en évidence deux composantes. Ces derniers illustrent deux mécanismes différents d’arrêt de l’allongement de la chaîne2. En traçant des lignes adaptées à la composante DP supérieure, les paramètres absolus (c’est-à-dire les pentes et les interceptions des lignes) peuvent être utilisés pour la comparaison CLD sans normalisation à un profil de référence. Les CLD de la souche synechocystis PCC6803 de type sauvage (WT) et des mutants isogéniques uniques glgA1 et glgA2 ont été tracés sur une échelle logarithmique et des lignes d’ajustement ont été déterminées pour chaque profil (figure 6C). La première composante était très similaire entre les échantillons, culminant avec un maximum à DP 6. Cela montre que l’enzyme ramifiée produit explicitement un maximum de telles chaînes. Le deuxième composant est apparu comme une épaule large, qui a déjà été décrite pour les souris et les glycogènes humains2. L’inclinaison du deuxième composant est apparue à un DP plus élevé dans ΔglgA1 et la pente de la ligne d’ajustement correspondante (ligne rouge) était inférieure au profil de type sauvage. Ainsi, l’absence de GlgA1 ralentit l’arrêt de l’allongement de la chaîne lors de la biosynthèse qui a été proposé par entrave stérique chez la souris et le glycogènehumain 2. Ces données suggèrent que l’enzyme d’allongement restante (c.-à-d. GlgA2) produit des chaînes plus longues avant l’encombrement de la chaîne. Dans ΔglgA2, l’effet inverse a été observé avec une chute plus spectaculaire de la ligne d’ajustement, corroborant que les chaînes produites par le GlgA1 restant sont globalement plus courtes que celles synthétisées par GlgA2 seul avant l’entrave stérique. Cette analyse suggère que les deux isoformes possèdent une cinétique distincte et/ou que leur concertation respective avec l’activité enzymatique ramifiée diffère.
Discussion
Les propriétés physico-chimiques des particules de glycogène (p. ex. taille, morphologie, solubilité) sont directement associées à la longueur des glucanes composant les particules. Tout déséquilibre entre les enzymes biosynthétiques et cataboliques entraîne l’altération de la distribution de la longueur de la chaîne et, en soi, l’accumulation de glycogène anormal qui peut être dangereux pour la cellule11. L’analyse FACE est une méthode de choix pour déterminer la distribution de la longueur de chaîne (CLD) du glycogène. Comme le montre la figure 2, la détermination de la CLD permet d’inférer la valeur moyenne de la longueur de chaîne du glycogène (LCA), qui reflète la structure des particules de glycogène. Les glycogènes animaux avec des valeurs élevées de LCA sont associés à l’apparition de particules anormales. L’analyse soustractive est une méthode utile pour comparer deux échantillons de glycogène de différents milieux génétiques (mutant ou type sauvage). En traçant sur une échelle logarithmique les CLD normalisés au pic maximal, en revanche, ont l’avantage de comparer les CLD indépendamment d’une référence et nous donnent des informations sur le mécanisme croissant du glycogène.
De plus, l’analyse FACE est une technique puissante pour caractériser les propriétés catalytiques des enzymes métabolisant le glycogène. Par exemple, toutes les enzymes de ramification du glycogène clivent (1 → 4) les liaisons α et transfèrent des groupes oligomaltosyles sur une position (1 → 6) -α ou des points de ramification. Les enzymes ramifiées se distinguent par leur affinité pour les polysaccharides (par exemple, l’amylopectine, le glycogène) et la longueur des glucanes transférés malgré le mécanisme catalytique similaire22. Ainsi, diverses sources d’enzymes ramifiées (humaines, végétales, bactériennes) peuvent être caractérisées et classées grâce à une série d’expériences d’incubation et de comparaisons CLD à l’aide de l’analyse FACE23.
Comme mentionné dans l’introduction, HPAEC-PAD est également une méthode alternative pour déterminer la distribution de longueur de chaîne18. Les deux techniques nécessitent l’hydrolyse complète des liaisons (1 → 6)-α ou des points de ramification par des enzymes de débranchement de type isoamylase avant de séparer le pool de glucanes linéaires en fonction de leur degré de polymérisation (DP). Cependant, la méthode HPAEC-PAD présente deux inconvénients par rapport à FACE: (1) la réponse ampérométrique de l’impulsion diminue à mesure que les chaînes de glucanes augmentent, ce qui ne fournit pas d’informations quantitatives. Ce problème de biais de masse peut être contourné en utilisant HPAEC-ENZ-PAD qui implique un réacteur enzymatique post-colonne entre la colonne d’échange d’anions et PAD24. Le réacteur enzymatique de colonne hydrolyse les malto-oligosaccharides en résidus de glucose permettant une réponse ampérométrique d’impulsion constante. (2) Le HPAEC-PAD permet la séparation des chaînes de glucanes avec un degré de polymérisation allant jusqu’à 70. Bien que la résolution soit suffisante pour déterminer le CLD des échantillons de glycogène, FACE sépare les chaînes avec des DP jusqu’à 150, ce qui convient aux échantillons d’amidon17. Il est essentiel de garder à l’esprit que l’analyse HPAEC-PAD et FACE a des avantages et des inconvénients. Par exemple, la réaction d’amination nécessite un groupe hémiacétal libre pour réagir avec la fonction amine primaire de l’APTS. Cela implique que l’étiquetage APTS ne peut pas être utilisé pour les chaînes de glucane dépourvues d’extrémités réductrices (par exemple, l’inuline). La méthode HPAEC-PAD ne nécessite pas la présence d’extrémités réductrices. Un deuxième aspect intéressant de la méthode HPAEC-PAD est que la colonne d’échange d’anions peut être chargée de quelques milligrammes de glucanes linéaires, permettant la purification du malto-oligosaccharide avec un DP spécifique ou 14C-radiomarqué malto-oligosaccharide pour le dosage enzymatique 18,25. Enfin, bien que la spectrométrie de masse (p. ex. MALDI-TOF) soit une technique rapide et sensible pour déterminer la distribution de la longueur de la chaîne, cette technique semble être moins reproductible. Il surestime la quantité de longues chaînes de glucane26. Néanmoins, ce dernier peut être utilisé pour une application spécifique telle que l’imagerie MALDI pour cartographier la présence de glycogène à travers le tissu cellulaire27.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le CNRS, l’Université de Lille CNRS, et les bourses ANR « MathTest » (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
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