Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में, फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (फेस) तकनीक का उपयोग श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) और ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
Abstract
ग्लाइकोजन कण शाखित पॉलीसेकेराइड होते हैं जो ग्लूकोसिल इकाइयों की रैखिक श्रृंखलाओं से बने होते हैं जो α-1,4 ग्लूकोसाइड बांड से जुड़े होते हैं। उत्तरार्द्ध α-1,6 ग्लूकोसाइड लिंकेज द्वारा एक-दूसरे से जुड़े होते हैं, जिन्हें शाखा बिंदुओं के रूप में संदर्भित किया जाता है। कार्बन भंडारण के विभिन्न रूपों (यानी, स्टार्च, β-ग्लूकन) के बीच, ग्लाइकोजन शायद जीवित दुनिया भर में पाए जाने वाले सबसे पुराने और सबसे सफल भंडारण पॉलीसेकेराइड में से एक है। ग्लूकन चेन को व्यवस्थित किया जाता है ताकि आवश्यकता पड़ने पर बड़ी मात्रा में ग्लूकोज को जल्दी से सेल में संग्रहीत या ईंधन दिया जा सके। ग्लाइकोजन कणों की ठीक संरचना को हल करने के लिए पिछले दशकों में कई पूरक तकनीकों को विकसित किया गया है। यह आलेख फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (FACE) का वर्णन करता है। यह विधि ग्लूकन चेन की आबादी को निर्धारित करती है जो ग्लाइकोजन कण की रचना करती है। श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) के रूप में भी जाना जाता है, यह पैरामीटर कण आकार और ब्रांचिंग के प्रतिशत को प्रतिबिंबित करता है। यह ग्लाइकोजन जैवसंश्लेषण के गणितीय मॉडलिंग के लिए भी एक आवश्यक आवश्यकता है।
Introduction
ग्लाइकोजन, कार्बन और ऊर्जा भंडारण के रूप में उपयोग किया जाता है, ग्लूकोज का एक होमोपॉलिमर है जिसमें ग्लूकोसिल इकाइयों की रैखिक श्रृंखलाएं शामिल हैं जो (1 → 4) से जुड़ी होती हैं - α बांड और (1 → 6) के माध्यम से जुड़ी होती हैं - α ग्लाइकोसिडिक बांड या ब्रांचिंग पॉइंट्स। वे जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के साइटोसोल में β- और α-कणों के रूप में दिखाई देते हैं। β कण छोटे पानी में घुलनशील कण होते हैं जो मुख्य रूप से प्रोकैरियोट्स में देखे जाते हैं। उनका व्यास 20-40 एनएम से होता है, संभवतः ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमों और स्टेरिक बाधा 1,2 द्वारा निर्धारित किया जाता है।
सबसे पहले पशु कोशिकाओं में वर्णित, बड़े α-कण एक फूलगोभी जैसे आकार के साथ व्यास में 300 एनएम तक प्रदर्शित होते हैं। यह विशेष संगठन कई β-कणों के एकत्रीकरण से उत्पन्न हो सकता है या एक एकल β-कण 3 से बाहर निकलने से उत्पन्न हो सकताहै। दिलचस्प बात यह है कि हाल ही के एक अध्ययन ने एस्चेरिचिया कोलाई4 में α-कणों की उपस्थिति की सूचना दी है। हालांकि, पशु कोशिकाओं से α-कणों के विपरीत, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान उत्तरार्द्ध जल्दी से अलग हो जाता है, जो साहित्य 4 में डेटा की कमी की व्याख्या कर सकताहै। यूकेरियोट्स और प्रोकैरियोट्स में α-कणों की उपस्थिति में फाइलोजेनेटिक रूप से असंबंधित ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमशामिल हैं 5। यह ऐसे कणों के कार्य और β-कणों के बीच संभावित क्रॉस-लिंकर एजेंटों की प्रकृति के बारे में सवाल उठाताहै।
यद्यपि ग्लाइकोजन अणु गठन 6,7,8,9 के लिए दो विरोधी गणितीय मॉडल प्रस्तावित किए गए थे, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि β-कण बड़ी मात्रा में ग्लूकोज की तेजी से रिहाई के लिए एक अत्यधिक कुशल ईंधन भंडार के रूप में अपने चयापचय समारोह के जवाब में विकसित हुए हैं। साक्ष्य का एक बड़ा शरीर इंगित करता है कि ग्लाइकोजन गुण जैसे कि पानी में पाचन और घुलनशीलता औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) के साथ सहसंबद्ध हैं, जो तब ब्रांचिंग बिंदुओं के प्रतिशत और कण आकार 2,6,7,8,10,11 को निर्देशित करेगा। . एसीएल को ग्लूकोज अवशेषों की कुल संख्या और ब्रांचिंग बिंदुओं की संख्या के बीच के अनुपात से परिभाषित किया गया है। आमतौर पर, एसीएलमान यूकेरियोट्स और प्रोकैरियोट्स में क्रमशः 11-14 और 7-23 ग्लूकोज अवशेषों से भिन्न होते हैं। मनुष्यों में, कई ग्लाइकोजन विकार रोग असामान्य ग्लाइकोजन संचय के कारण होते हैं। उदाहरण के लिए, एंडरसन की बीमारी ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम की कमी गतिविधि से जुड़ी हुई है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य ग्लाइकोजन11 का संचय होता है। प्रोकैरियोट्स में, संचयी अध्ययनों से पता चलता है कि एसीएल एक महत्वपूर्ण कारक है जो ग्लाइकोजन और बैक्टीरियल जीवित रहने की क्षमता12,13 की गिरावट दर को प्रभावित करता है। यह बताया गया है कि कम एसीएल मूल्य के साथ β-कणों को संश्लेषित करने वाले बैक्टीरिया अधिक धीरे-धीरे कम हो जाते हैं और इसलिए भुखमरी की स्थिति का सामना करते हैं। इस प्रकार, मानव ग्लाइकोजन भंडारण रोगों में असामान्य ग्लाइकोजन कणों के गठन को समझने के लिए β-कणों की वास्तुकला का ज्ञान आवश्यक है और पोषक तत्वों की कमी वाले वातावरण में प्रोकैरियोट्स जीवित रहते हैं।
उन्नीसवीं शताब्दी के अंत में फ्रांसीसी फिजियोलॉजिस्ट क्लाउड बर्नार्ड द्वारा कुत्ते के जिगर से ग्लाइकोजन के पहले अलगाव के बाद से,ग्लाइकोजन कणों को विस्तार से चिह्नित करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया था। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोजन आकृति विज्ञान (α- या β-कणों) के लिए संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 15, α-1,6 लिंकेज16 के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए प्रोटॉन-एनएमआर स्पेक्ट्रोमेट्री, आणविक वजन का अनुमान लगाने के लिए बहु-डिटेक्टरों के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (फेस) 17 या चेन लंबाई वितरण (सीएलडी) दोनों के लिए स्पंदित एम्पेरोमेट्रिक डिटेक्शन (एचपीएईसी-पैड) के साथ उच्च-प्रदर्शन अनियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी दोनों श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) और एसीएल के लिए स्पंदित एम्पेरोमेट्रिक डिटेक्शन (एचपीएईसी-पीएडी) के साथ उच्च प्रदर्शन अनियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी निर्धारण18.
यह काम फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन विधि पर केंद्रित है, जो प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन द्वारा हेमीएसिटल समूह के रिडक्टिव एमिनेशन पर निर्भर करता है। ऐतिहासिक रूप से, 8-एमिनो-1,3,6-नेप्थलीन ट्राइसल्फोनिक एसिड (एएनटी) का उपयोग पहली बार लेबलिंग के लिए किया गया था। बाद में, इसे अधिक संवेदनशील फ्लोरोफोर, 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) 19 द्वारा बदल दिया गया था।
चित्रा 1: 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) के साथ रिडक्टिव एमिनेशन प्रतिक्रिया। 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) के प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन द्वारा हेमिसीटल समूह की रिडक्टिव एमिनेशन प्रतिक्रिया कम करने वाली स्थितियों के तहत कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जैसा कि चित्रा 1 में दर्शाया गया है, एक ग्लूकन श्रृंखला के कम करने वाले अंत का हेमीसेटल फ़ंक्शन कम करने की स्थिति में एपीटीएस के प्राथमिक अमाइन के साथ बातचीत करता है। एपीटीएस के सल्फोनिक समूह नकारात्मक आवेश लेते हैं जो पोलीमराइजेशन (डीपी) की अपनी डिग्री के अनुसार ग्लूकन चेन के अलगाव को सक्षम करते हैं। रिडक्टिव अमाइन प्रतिक्रिया अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य और कुशल है। DP3 से DP135 के लिए 80% की औसत दक्षता लेबलिंग प्राप्त की जाती है और माल्टोज (DP2) और ग्लूकोज के लिए क्रमशः88% और 97% तक प्राप्त की जाती है, क्रमशः 17,20। क्योंकि एपीटीएस का एक अणु प्रत्येक ग्लूकन श्रृंखला के कम करने के अंत के साथ प्रतिक्रिया करता है, व्यक्तिगत श्रृंखलाओं को एक दाढ़ के आधार पर एक दूसरे की तुलना में परिमाणित और तुलना की जा सकती है।
Protocol
1. debranching एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन
- एसीटेट बफर (पीएच 4.8) के 100 mM के 200 μL के 200 μL के साथ 0.5-2 mg/mL पर शुद्ध ग्लाइकोजन के 200 μL को मिलाएं। isoamylase के 2 μL जोड़ें (प्रोटीन के 180 U / mg) और pullulanase के 1.5 μL (प्रोटीन के 30 U / mg) ( सामग्री की तालिका देखें), ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण, और एक 1.5 mL ट्यूब में 16 घंटे के लिए 42 °C पर incubate।
नोट: ग्लाइकोजन शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान गिरावट या एमाइलेज संदूषण हो सकता है। मुक्त माल्टो-ओलिगोसेकेराइड्स की उपस्थिति की सराहना करने के लिए, नमूनों को समानांतर में डिब्रांचिंग एंजाइम कॉकटेल के बिना ऊष्मायन किया जा सकता है। एक मानक (उदाहरण के लिए, माल्टोहेप्टोज़) को विश्लेषण में शामिल किया गया है ताकि क्षालन समय और पोलीमराइजेशन की डिग्री के बीच संबंध निर्धारित किया जा सके। - 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्रतिक्रियाओं को रोकें।
- गोली और किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 16,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
- एक पिपेट का उपयोग करके supernatants निकालें और उन्हें नए एनोटेट ट्यूबों के लिए स्थानांतरित करें। अनियन / धनायन विनिमय राल मोतियों (एजी -501-X8, सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL के बराबर जोड़कर supernatants desalt और आंदोलन।
- नियमित रूप से 5 मिनट के लिए मोतियों को उत्तेजित करें। pipetting द्वारा नमूने ले लीजिए और उन्हें नए एनोटेटेड ट्यूबों में जगह.
- फ्रीज-सूखा या नमूनों को सुखाने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम वाष्पीकरणकर्ता सेट अप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
- सूखे नमूनों को कमरे के तापमान पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: नमूने 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
2. रिडक्टिव एमिनेशन
- टेट्राहाइड्रोफुरान (THF) में 1 M सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड के 2 μL और APTS के 2 μL (15% एसिटिक एसिड के 48 μL में पुन: निलंबित APTS के 5 मिलीग्राम) के साथ सूखे नमूनों को मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
- अंधेरे में 16 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
सावधानी: सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड को अनुकूलित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण ों के साथ और रासायनिक हुड के तहत संभाला जाता है। साँस लेना और त्वचा के साथ संपर्क अत्यधिक विषाक्त हैं और घातक हो सकते हैं, जिससे गंभीर त्वचा जलती है और आंखों को नुकसान होता है। एसिटिक एसिड के साथ सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड को मिलाते समय अत्यधिक जहरीली गैसें उत्पन्न की जा सकती हैं। पानी के संपर्क में, सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड ज्वलनशील गैसों को छोड़ता है, जो अनायास प्रज्वलित हो सकता है। केंद्रित नमूनों को एक रासायनिक हुड के तहत संभाला जाता है और इस चरण से शुरू होने वाले अनुकूलित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणका उपयोग किया जाता है।
3. चेहरा विश्लेषण
- प्रत्येक नमूने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के 46 μL जोड़ें।
- 100 μL की सूक्ष्म शीशियों में 1/50 के लिए सीधे नमूनों को पतला करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के 49 μL करने के लिए नमूने के 1 μL जोड़ने के द्वारा. चेहरे (5-10 मिनट) को सेट करते समय नमूनों को अंधेरे में रखें।
- एक लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति (LIF) डिटेक्टर के साथ एक केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण के साथ रिवर्स polarity वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन ( सामग्री की तालिका देखें)। पृथक्करण के लिए ध्रुवीयता को "रिवर्स मोड" पर सेट करें, 488 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर LIF और 512 एनएम पर डिटेक्टर सेट करें।
- 10 s और 0.5 साई पर इंजेक्शन दबाव के लिए इंजेक्शन समय सेट करें।
- 50 μm (375 μm बाहरी व्यास) के आंतरिक व्यास के साथ लंबाई में 60.2 सेमी की एक नंगे फ्यूज्ड सिलिका केशिका में 30 kV पर APTS-लेबल-ग्लूकन पृथक्करण पृथक्करण को पूरा करें, एन-लिंक्ड कार्बोहाइड्रेट पृथक्करण बफर में अल्ट्राप्योर पानी में 1/3 तक पतला ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट:: एन-लिंक्ड कार्बोहाइड्रेट पृथक्करण बफ़र हर 20 रन बदल दिया है।
4. डेटा प्रसंस्करण
- निर्यात करें ". एएससी "और"। CDF "इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रोफ़ाइल और एकीकरण डेटा युक्त फ़ाइलें, क्रमशः।
- खोलें । ASC फ़ाइल और समय चार्ट के अनुसार सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाई आरेखित करें।
- खोलें । CDF फ़ाइल, एक पहले स्वचालित एकीकरण के साथ आगे बढ़ें और निम्न पैरामीटर समायोजित करें: चौड़ाई; घाटी से घाटी एकीकरण; न्यूनतम क्षेत्र।
- किसी भी अनुचित एकीकरण ईवेंट को मैन्युअल रूप से जाँचें और सही करें.
Representative Results
ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला की लंबाई का निर्धारण
चित्र 2 श्रृंखला की लंबाई वितरण और ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक वर्कफ़्लो का प्रतिनिधित्व करता है।
चित्र 2: श्रृंखला लंबाई वितरण (CLD) और औसत श्रृंखला लंबाई निर्धारित करने के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 3 वाणिज्यिक माल्टोहेक्साओज़ और डीब्रांच्ड बोवाइन लिवर ग्लाइकोजन के इलेक्ट्रोफेरोग्राम को प्रदर्शित करता है। सभी प्रयोगों में 4.13-4.67 मिनट के बीच देखे गए प्रतिदीप्ति संकेत ों की उत्पत्ति अप्रभावित एपीटीएस से हुई थी। लेबल माल्टोहेक्साओज़ (DP6) के क्षालन समय का अनुमान 8.49 मिनट (चित्रा 3A) पर लगाया गया था। गोजातीय ग्लाइकोजन के एपीटीएस-लेबल वाले ग्लूकन की पहचान DP6 (चित्रा 3B) के क्षालन समय के आधार पर की गई थी। नियंत्रण नमूने में मुक्त माल्टो-ओलिगोसेकेराइड का कोई निशान नहीं पाया गया था (ग्लाइकोजन डिब्रांचिंग एंजाइमों के साथ इनक्यूबेट नहीं किया गया था) (चित्रा 3 सी)।
चित्र 3: एक मानक और गोजातीय जिगर ग्लाइकोजन के इलेक्ट्रोफेरोग्राम। (A) एक ग्लूकन मानक, माल्टोहेक्साओज़ (DP6) के समय क्षालन (8.49 मिनट) का उपयोग एंजाइम गतिविधियों (B) को डिब्रांचिंग एंजाइम गतिविधियों (B) की कार्रवाई के बाद गोजातीय यकृत ग्लाइकोजन से जारी किए गए एपीटीएस-लेबल वाले ग्लूकेन के पोलीमराइजेशन (DP) की डिग्री निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में किया गया था। ). इनसेट पैनल 44 डीपी तक ग्लूकन चेन का पृथक्करण दिखाता है। समानांतर में, अनुपचारित गोजातीय ग्लाइकोजन को नमूना (सी) में मुक्त माल्टो-ओलिगोसेकेराइड्स के संभावित निशान का पता लगाने के लिए एपीटीएस के साथ लेबल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि एपीटीएस-लेबल वाले ग्लूकन की रिहाई आइसोमाइलेज और पुलुलानेस दोनों गतिविधियों द्वारा ब्रांचिंग बिंदुओं की दरार के कारण होती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल को कई प्रोफाइल वाले मोज़ेक आंकड़े बनाने के लिए अधिक उपयुक्त प्रारूप में फिर से तैयार किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, प्रतिदीप्ति मानों वाली डेटा फ़ाइलें "asc" एक्सटेंशन के साथ उत्पन्न होती हैं और CSV (अल्पविराम-अलग मान) प्रारूप का चयन करके स्प्रेडशीट प्रोग्राम में खोली जाती हैं। दुर्भाग्य से, निर्यात किए गए प्रतिदीप्ति मान संबंधित क्षालन समय से जुड़े नहीं हैं। नतीजतन, उन्हें फेस उपकरण पर अधिग्रहण आवृत्ति सेटअप के अनुसार मैन्युअल रूप से जोड़ा जाना चाहिए (4 हर्ट्ज का मतलब है कि हर 0.25 सेकंड में एक मूल्य अधिग्रहण)।
पीक क्षेत्रों को तब फेस इंस्ट्रूमेंट के मूल अनुप्रयोग का उपयोग करके अनुमान लगाया गया था या किसी अन्य एप्लिकेशन का उपयोग करने के लिए "सीडीएफ" एक्सटेंशन के साथ डेटा फ़ाइल के रूप में निर्यात किया गया था। क्षेत्र मानों को एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में निर्यात किया जाता है और कुल सतह क्षेत्र (चित्रा 4) के प्रतिशत के रूप में डीपी को व्यक्त करके सामान्यीकृत किया जाता है।
चित्रा 4: डेटा सामान्यीकरण, श्रृंखला लंबाई वितरण, और औसत श्रृंखला लंबाई मान। प्रतिदीप्ति शिखर क्षेत्रों को एक स्प्रेडशीट में आयात और सामान्यीकृत किया गया था। श्रृंखला लंबाई वितरण प्रत्येक डीपी के लिए डीपी के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है। औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) की गणना प्रत्येक प्रतिशत श्रृंखला बार पोलीमराइजेशन की इसी डिग्री को संक्षेप में करके की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अंत में, औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) पोलीमराइजेशन की इसी डिग्री के प्रत्येक प्रतिशत श्रृंखला बार के योग की गणना करके अनुमान लगाया जाता है। इसी तरह के प्रयोगों को खरगोश जिगर ग्लाइकोजन (चित्रा 5 ए), गोजातीय यकृत ग्लाइकोजन (चित्रा 5 बी), और सीप ग्लाइकोजन (चित्रा 5 सी) पर तीन प्रतियों में किया गया था।
चित्रा 5: वाणिज्यिक ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण। खरगोश जिगर (ए), गोजातीय जिगर (बी), और सीप ग्लाइकोजन (सी) को डिब्रांचिंग एंजाइमों (आइसोमाइलेज और पुलुलानेस) की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया गया था। APTS-लेबल glucans तो चेहरे विश्लेषण का उपयोग कर polymerization (DP) की उनकी डिग्री के अनुसार अलग कर दिया गया था। Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) क्रमशः खरगोश जिगर, सीप, और गोजातीय जिगर ग्लाइकोजन में सबसे प्रचुर मात्रा में glucans का प्रतिनिधित्व करते हैं। माध्य की मानक त्रुटि (SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से अनुमान लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
खरगोश जिगर ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण स्पष्ट रूप से गोजातीय जिगर ग्लाइकोजन (डीपी 7) या सीप ग्लाइकोजन (DP6) की तुलना में छोटे माल्टो-ओलिगोसेकेराइड (DP2) की एक उच्च सामग्री से पता चला। नतीजतन, खरगोश जिगर ग्लाइकोजन में गोजातीय यकृत ग्लाइकोजन (एसीएल = 11.9) और सीप ग्लाइकोजन (एसीएल = 12.6) की तुलना में सबसे कम औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल = 9.8) होती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उन वाणिज्यिक ग्लाइकोजन का उपयोग आमतौर पर ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज या ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि के लिए किया जाता है। इससे पता चलता है कि ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइम गतिविधियों के गतिज मापदंडों (वीमैक्स और केएम) का निर्धारण ग्लाइकोजन के स्रोत के अनुसार भिन्न होगा।
Subtractive विश्लेषण
subtractive विश्लेषण दो नमूनों के glucan श्रृंखला वितरण की तुलना करने के लिए एक सरल विधि है। उदाहरण के लिए, वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) Synechocystis PCC6803 तनाव और एकल आइसोजेनिक glgA1 और glga2 उत्परिवर्ती उपभेदों द्वारा उत्पादित ग्लाइकोजन के CLDs निर्धारित किए गए थे (चित्रा 6A)।
चित्र 6: subtractive विश्लेषण का उपयोग करके श्रृंखला लंबाई वितरण की तुलना. (A) साइनोबैक्टीरिया उपभेदों से शुद्ध ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण: wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 और एकल isogenic glgA1 और glga2 उत्परिवर्ती उपभेदों चेहरा विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। माध्य की मानक त्रुटि (SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से अनुमान लगाया गया था। (B) WT के प्रत् येक DP के % को WT के प्रत् येक DP के % को घटाकर और WT के प्रत् येक DP के % को घटाकर घटाकर घटाकर घटाया गया था। यह सीधा गणितीय हेरफेर उत्परिवर्ती उपभेदों (काली रेखाओं) में ग्लूकन श्रृंखलाओं के परिवर्तन को प्रदर्शित करता है। (सी) वाइल्डटाइप से ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई वितरण और सिनेकोसिस्टिस के उत्परिवर्ती प्रत्येक सीएलडी (सभी नमूनों के लिए डीपी 6) के लिए देखे गए अधिकतम शिखर के अनुसार सामान्यीकृत किए गए थे। दो घटकों को लॉगरिदमिक पैमाने (एनडी (डीपी)) पर सामान्यीकृत सीएलडी की साजिश रचने से स्पष्ट किया जाता है। प्रत्येक घटक विकास ठहराव के एक अलग तंत्र को इंगित करता है (अधिक जानकारी के लिए, संदर्भ2 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
याद करने के लिए, अधिकांश साइनोबैक्टीरिया उपभेदों में ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधियों को एन्कोडिंग करने वाले दो जीन होते हैं: GlgA1 और GlgA221। दोनों एंजाइम एडीपी-ग्लूकोज के अवशेष ग्लूकोज को रैखिक ग्लूकन चेन के गैर-कम करने वाले सिरों पर स्थानांतरित करते हैं। जैसा कि चित्रा 6ए में दर्शाया गया है, केवल श्रृंखला की लंबाई वितरण प्रोफाइल को देखकर नमूनों की तुलना करना चुनौतीपूर्ण है। subtractive विश्लेषण नमूनों के बीच प्रत्येक DP के प्रतिशत घटाने के होते हैं (चित्रा 6B). DP के WT के %DP के subtractive analysis minus % of DP ΠglgA1 उत्परिवर्ती DP3, 4, and 5 (ऋणात्मक मान) की अधिकता और DP 10-20 की घटती हुई सामग्री को प्रकट करता है। इसके विपरीत, WT के %DP और DP के % glgA2 उत्परिवर्ती के बीच subtractive विश्लेषण एक विपरीत प्रभाव को इंगित करता है। क्योंकि subtractive विश्लेषण प्रोफाइल GlgA1 और GlgA2 के बीच अलग हैं, यह ग्लाइकोजन जैवसंश्लेषण21 में प्रत्येक ग्लाइकोजन सिंथेज़ आइसोफोर्म के एक विशिष्ट कार्य का सुझाव देता है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि subtractive विश्लेषण केवल उन प्रयोगों पर लागू होता है जिनमें नमूनों के समानांतर प्रदर्शन किया गया संदर्भ नमूना शामिल होता है। अन्यथा, subtractive विश्लेषण अनुभवजन्य हो सकता है क्योंकि यह संदर्भ के सामान्यीकृत CLD पर स्थित है। 2015 में, डेंग और सहयोगियों, जिन्होंने चूहों और मनुष्यों में ग्लाइकोजन विकास के तंत्र को रोकने की जांच की, ने इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए ग्लाइकोजन सीएलडी की व्याख्या करने और एक वैकल्पिक साजिश का प्रस्ताव दिया। यह प्लॉट प्रत्येक CLD को सामान्य करने के लिए अधिकतम पीक क्षेत्र का उपयोग करता है। डेटा को तब दो घटकों को हाइलाइट करते हुए लॉगरिदमिक पैमाने पर प्लॉट किया जाता है। उत्तरार्द्ध श्रृंखला बढ़ाव रोकने के लिए दो अलग-अलगतंत्रों को चित्रित करता है 2। उच्च डीपी घटक के लिए फिटिंग लाइनों ड्राइंग द्वारा, निरपेक्ष पैरामीटर (यानी, ढलानों और लाइनों के अवरोधन) एक संदर्भ प्रोफ़ाइल के लिए सामान्यीकरण के बिना सीएलडी तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) Synechocystis PCC6803 तनाव और एकल आइसोजेनिक glgA1 और glga2 उत्परिवर्ती के CLDs को लॉग पैमाने पर प्लॉट किया गया था, और प्रत्येक प्रोफ़ाइल (चित्रा 6 C) के लिए फिटिंग लाइनों को निर्धारित किया गया था। पहला घटक नमूनों के बीच अत्यधिक समान था, जो डीपी 6 पर अधिकतम के साथ चरम पर था। यह दर्शाता है कि ब्रांचिंग एंजाइम स्पष्ट रूप से ऐसी श्रृंखलाओं की अधिकतम उत्पादन करता है। दूसरा घटक एक व्यापक कंधे के रूप में दिखाई दिया, जिसे पहले से ही चूहों और मानव ग्लाइकोजन2 के लिए वर्णित किया गया था। दूसरे घटक का झुकाव एक उच्च DP पर उत्पन्न हुआ , जो किglgA1 में एक उच्च DP पर उत्पन्न हुआ और संबंधित फिटिंग लाइन (लाल रेखा) की ढलान wildtype प्रोफ़ाइल की तुलना में कम थी। इस प्रकार, GlgA1 की कमी जैवसंश्लेषण के दौरान श्रृंखला बढ़ाव की गिरफ्तारी को धीमा कर देती है जिसे चूहों और मानव ग्लाइकोजन2 के लिए स्टेरिक बाधा द्वारा होने का प्रस्ताव दिया गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि शेष लंबा एंजाइम (यानी, GlgA2) श्रृंखला भीड़ से पहले लंबी श्रृंखलाओं का उत्पादन करता है। ΠglgA2 में, विपरीत प्रभाव फिटिंग लाइन की एक अधिक नाटकीय बूंद के साथ देखा गया था, इस बात की पुष्टि करता है कि शेष GlgA1 द्वारा उत्पादित श्रृंखलाएं स्टेरिक बाधा से पहले अकेले GlgA2 द्वारा संश्लेषित श्रृंखलाओं की तुलना में समग्र रूप से छोटी हैं। इस विश्लेषण से पता चलता है कि दोनों आइसोफॉर्मों के पास अलग-अलग कैनेटीक्स हैं और / या ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि के साथ उनके संबंधित संगीत कार्यक्रम अलग-अलग हैं।
Discussion
ग्लाइकोजन कणों के भौतिक-रासायनिक गुण (जैसे, आकार, आकृति विज्ञान, घुलनशीलता) सीधे कणों की रचना करने वाले ग्लूकन की लंबाई से जुड़े होते हैं। बायोसिंथेटिक और कैटाबोलिक एंजाइमों के बीच किसी भी असंतुलन के परिणामस्वरूप श्रृंखला की लंबाई वितरण में परिवर्तन होता है और, प्रति से, असामान्य ग्लाइकोजन का संचय जो सेल11 के लिए खतरनाक हो सकता है। फेस विश्लेषण ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) को निर्धारित करने के लिए पसंद की एक विधि है। जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है, सीएलडी का निर्धारण ग्लाइकोजन (एसीएल) के औसत श्रृंखला लंबाई मूल्य के अनुमान की अनुमति देता है, जो ग्लाइकोजन कणों की संरचना को प्रतिबिंबित करता है। उच्च एसीएल मूल्यों के साथ पशु ग्लाइकोजन असामान्य कणों की उपस्थिति से जुड़े होते हैं। subtractive विश्लेषण विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि (उत्परिवर्ती बनाम wildtype) से दो ग्लाइकोजन नमूनों की तुलना करने के लिए एक सहायक विधि है। दूसरी ओर, अधिकतम शिखर पर सामान्यीकृत लॉगरिदमिक पैमाने पर सीएलडी की साजिश रचकर, एक संदर्भ से स्वतंत्र रूप से सीएलडी की तुलना करने का लाभ है और हमें बढ़ते ग्लाइकोजन तंत्र के बारे में जानकारी दी है।
इसके अलावा, फेस विश्लेषण ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमों के उत्प्रेरक गुणों की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। उदाहरण के लिए, सभी ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम (1 → 4) - लिंकेज α और ओलिगोमाल्टोसिल समूहों को (1 → 6) पर स्थानांतरित करते हैं - α स्थिति या ब्रांचिंग बिंदु। ब्रांचिंग एंजाइम पॉलीसेकेराइड (जैसे, एमाइलोपेक्टिन, ग्लाइकोजन) के लिए उनकी आत्मीयता और समान उत्प्रेरक तंत्र22 के बावजूद स्थानांतरित ग्लूकन की लंबाई के कारण अलग-अलग होते हैं। इस प्रकार, ब्रांचिंग एंजाइमों (मानव, पौधे, बैक्टीरिया) के विभिन्न स्रोतों को फेस विश्लेषण23 का उपयोग करके इनक्यूबेशन प्रयोगों और सीएलडी तुलनाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से विशेषता और वर्गीकृत किया जा सकता है।
जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, HPAEC-PAD भी श्रृंखला लंबाई वितरण18 को निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि है। दोनों तकनीकों के पूर्ण हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता होती है (1 → 6) - α लिंकेज या ब्रांचिंग बिंदुओं को आइसोएमाइलेज-प्रकार के डिब्रांचिंग एंजाइमों द्वारा उनके पोलीमराइजेशन (डीपी) की डिग्री के अनुसार रैखिक ग्लूकन के पूल को अलग करने से पहले। हालांकि, HPAEC-PAD विधि चेहरे की तुलना में दो नुकसान ों को आश्रय देती है: (1) amperometric पल्स प्रतिक्रिया कम हो जाती है क्योंकि ग्लूकन श्रृंखलाएं बढ़ जाती हैं, जो मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इस बड़े पैमाने पर पूर्वाग्रह के मुद्दे को HPAEC-ENZ-PAD का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है जिसमें अनियन एक्सचेंज कॉलम और पीएडी24 के बीच एक पोस्ट-कॉलम एंजाइम रिएक्टर शामिल है। स्तंभ एंजाइम रिएक्टर ग्लूकोज अवशेषों में माल्टो-ओलिगोसेकेराइड्स को हाइड्रोलाइज़ करता है जिससे एक निरंतर नाड़ी एम्पेरोमेट्रिक प्रतिक्रिया की अनुमति मिलती है। (2) एचपीएईसी-पीएडी 70 तक पोलीमराइजेशन की डिग्री के साथ ग्लूकन चेन के अलगाव की अनुमति देता है। यद्यपि संकल्प ग्लाइकोजन नमूनों के सीएलडी को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है, फेस 150 तक डीपी के साथ श्रृंखलाओं को अलग करता है, जो स्टार्च के नमूनों के लिए उपयुक्तहै। यह ध्यान में रखना आवश्यक है कि एचपीएईसी-पीएडी और फेस विश्लेषण दोनों में पेशेवरों और विपक्ष हैं। उदाहरण के लिए, एमिनेशन प्रतिक्रिया को एपीटीएस के प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक मुक्त हेमीएसिटल समूह की आवश्यकता होती है। इसका तात्पर्य यह है कि एपीटीएस लेबलिंग का उपयोग ग्लूकन चेन के लिए नहीं किया जा सकता है, जिसमें कम करने वाले सिरों की कमी होती है (उदाहरण के लिए, इनुलिन)। HPAEC-PAD विधि को सिरों को कम करने की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है। HPAEC-PAD विधि का एक दूसरा दिलचस्प पहलू यह है कि अनियन एक्सचेंज कॉलम को रैखिक ग्लूकन के कुछ मिलीग्राम के साथ लोड किया जा सकता है, जिससे एक विशिष्ट डीपी या 14सी-रेडियोलेबल माल्टो-ओलिगोसेकेराइड के साथ माल्टो-ओलिगोसेकेराइड के शुद्धिकरण की अनुमति मिलती है एंजाइमेटिक परख18,25 के लिए। अंत में, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जैसे, MALDI-TOF) श्रृंखला की लंबाई वितरण को निर्धारित करने के लिए एक तेज और संवेदनशील तकनीक है, यह तकनीक कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतीत होती है। यह लंबी ग्लूकन चेन26 की मात्रा को अतिरंजित करता है। फिर भी, उत्तरार्द्ध का उपयोग सेलुलर ऊतक27 में ग्लाइकोजन की उपस्थिति को मैप करने के लिए MALDI इमेजिंग जैसे एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास इस काम से जुड़े हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को CNRS, Université de Lille CNRS, और ANR अनुदान "MathTest" (ANR-18-CE13-0027) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
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