Summary
このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。
Abstract
土壌は信じられないほどの量の微生物の生命をホストしており、各グラムには数十億の細菌、古細菌、真菌細胞が含まれています。カビや単細胞菌などの多細胞菌類は、広く酵母として定義され、有機物の分解者として、また他の土壌住民の食料源として、土壌生態系において不可欠な役割を果たしています。土壌中の真菌種の多様性は、降雨量や気温などの多数の気候要因、ならびに有機物、pH、水分などの土壌特性に依存する。特にアジア、アフリカ、南米、中央アメリカの地域では、適切な環境サンプリングの欠如は、土壌真菌群集の特徴付けと新種の発見を妨げている。
我々は、約4,000の土壌サンプルと、酵母とカビの単離のために実験室で開発されたプロトコルを使用して、6大陸の9カ国の土壌真菌群集を特徴付けた。このプロトコルは、細菌の増殖を抑制しながら、酵母および医学的に関連するカビ であるアスペルギルス フミガーツスを液体培地中で別々に選択的に濃縮することから始まります。次いで、得られたコロニーを固体培地に移し、さらに処理して純粋な培養物を得、続いて下流の遺伝子特性評価を行う。酵母種の同一性は、核リボソームRNA遺伝子クラスターの内部転写スペーサー(ITS)領域のシーケンシング によって 確立され、 A. fumigatus の全球集団構造はマイクロサテライトマーカー分析 によって 探索される。
このプロトコルは、カメルーン、カナダ、中国、コスタリカ、アイスランド、ペルー、ニュージーランド、サウジアラビアの土壌酵母および A. fumigagatus 集団を単離し、特徴付けるために首尾よく適用されました。これらの知見は、土壌酵母の多様性における地球規模のパターン、ならびに A. fumigatusの世界的な集団構造および抗真菌性プロファイルに関する非常に必要な洞察を明らかにした。本稿では、国際的な土壌サンプルから酵母と A. fumigatus の両方を単離する方法を提示する。
Introduction
土壌生態系の菌類は、有機物の分解、栄養循環、土壌施肥に重要な役割を果たしています1.培養非依存性(すなわち、ハイスループットシーケンシング)および培養依存性アプローチの両方が、土壌真菌の研究において広く使用されている2,3。ハイスループットメタバーコードシーケンシングによって生成される大量のデータは、群集構造と多様性の広範なパターンを解明するのに有用であるが、培養依存的アプローチは、真菌群集の分類学的および機能的構造に関する高度に補完的な情報、ならびに純粋な真菌培養物の利用可能性による下流の多様性および機能解析を通じて個々の生物のより具体的なプロファイルを提供することができる。
土壌1グラムあたり数千の細胞を超えることはめったにないにもかかわらず、単細胞菌類として広く定義される酵母は、他の土壌居住者にとって不可欠な分解剤および食物源である4,5。実際、酵母は、大陸南極大陸などの寒い生物圏における優勢な土壌真菌であり得る6,7。土壌はまた、ヒトおよび他の哺乳動物において重篤な日和見感染を引き起こす医学的に関連する酵母の主要な貯蔵庫である8。形態学的類似性にもかかわらず、酵母種は系統学的に多様であり、真菌界内の2つの主要な門、子嚢菌と担子菌の糸状菌の間で発生する9。酵母は、核リボソームRNA遺伝子クラスター10の内部転写スペーサー(ITS)領域である真菌バーコード遺伝子に明確なDNAシグネチャを欠いているため、メタゲノミクス調査において他の真菌と区別がつかないため、酵母種を単離するために培養依存的な方法を使用する必要があります。
以下のプロトコルは、9カ国の土壌酵母コミュニティを特徴付け、土壌酵母の多様性における世界的な傾向とパターンを特定するために実施されました9,11,12。メタゲノミクスアプローチは、酵母2,3などの生物の標的群を研究する際には、限られた用途しかない。その系統学的多様性のために、酵母はDNA配列のみに基づいて他の真菌と区別することができない。したがって、酵母集団を研究するには、培養依存的単離の継続的な使用が必要である。しかし、培養はしばしば著しく時間がかかり、実験を行うためにより多くの人員を必要とする。したがって、プロトコルは最適化および合理化されており、限られた人員でより高速に処理できます。培養の主な利点は、同定された酵母種が生きた酵母であり、死んだ酵母ではないことであり、したがって、土壌中に存在する一過性の細胞ではなく、真の土壌居住者である可能性が高いことである。土壌中の真菌DNAの約40%は、他の環境、細胞外からの汚染物質、またはもはや無傷の細胞からの汚染物質であると推定されており、真菌の豊かさを55%も過大評価するハイスループットシーケンシングアプローチを引き起こしています13。培養依存性の単離は、酵母種の同一性を容易に確認することができ、下流の分析に使用する純粋な培養物を確保するという追加の利点がある。実際、44種の推定される新しい酵母種の純粋な培養物が、分類学的および機能的特性を詳細に研究するためのさまざまな方法の使用を可能にしたこの土壌単離プロトコルを使用して同定された14。
以下のプロトコールは、A. fumigatusなどの土壌内に存在するカビを単離するためにも使用することができる。アスペルギルス フミガーツスは、土壌15に広く全球的に分布する好熱性および腐生性のカビです。それは多数の臨床的および非臨床的環境から単離されている。非臨床サンプリングには、一般に、空気、有機破片(堆肥、のこぎり粉、チューリップ球根廃棄物)、土壌(農業、庭園、天然土壌)が含まれます16,17,18,19。アスペルギルス フミガーツスは、アスペルギルス症と総称される一連の感染症を引き起こすヒト日和見病原体であり、世界中で800万人以上に影響を与えています16,20。世界中の約300,000人が侵襲性アスペルギルス症に罹患しており、これは最も重篤な形態のアスペルギルス症である16。患者集団、感染部位、抗真菌療法の有効性などの要因に応じて、死亡率は90%にもなる可能性があります。過去数十年にわたり、抗真菌療法に対する耐性が増大しており、これらの耐性遺伝子型を追跡するために、臨床的および環境的集団の両方における世界的なサーベイランス努力が必要である21,22,23。50°C以上の温度で増殖する能力を考えると、この温度を利用して、培養依存的な方法を使用して土壌からA. fumigatus分離株を選択することができます。アスペルギルス フミガーツス分離株は、一般に、9つの高度に多型的な短いタンデムリピート(STR)遺伝子座で遺伝子型決定され、株24間で高い識別力を有することが示される。これらのSTR遺伝子型は、以前に調査された他の集団と比較して、薬剤耐性遺伝子を含むA. fumigatus遺伝子型の世界的な広がりを追跡することができる。
以下に、培養依存的な方法で土壌サンプルから酵母およびA. fumigatusを迅速に単離するためのプロトコルを記載する。サンプルごとに得られる土壌の量に応じて、土壌サンプルを2つのプロトコル間で共有することができます。酵母およびA.フミガーツスを土壌から単離する同様の方法と比較して、このプロトコルは、得られた単離物当たり10倍少ない土壌を使用する。土壌からA. fumigatusを単離しようとする研究は、単離物あたり1〜2gの土壌を必要とするが、このプロトコルは0.1〜0.2gの土壌18,19,25しか必要としない。このプロトコルは、ハイスループット設計を容易にする小型のプラスチックと容器を利用しています。したがって、インキュベーターやローラードラムなどの機器用のスペースを少なくして、より多くのサンプルを処理できます。土壌サンプルは、わずか7日で分離株を得るために完全に処理することができます。このプロトコルは、1人あたり1日あたり最大150〜200サンプルの処理を可能にするように最適化されています。
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Protocol
注:国際的な土壌サンプルおよび/または A. fumigatus 胞子および菌糸体を利用するステップでは、レベル2生物(BSCII)のバイオセーフティキャビネット内で作業する必要があります。
1. 土壌からの酵母の単離
- 抗菌および抗真菌溶液の調製
- クロラムフェニコール粉末を70%エタノールに懸濁し、50g/Lの原液を調製した。シリンジ濾過により滅菌し、4°Cで保存する。
注:この抗生物質は、土壌酵母の単離中にほとんどの細菌の増殖を防ぎます。クロラムフェニコール耐性菌は依然として増殖する可能性があるため、酵母と細菌を区別する際にはコロニー形態を慎重に考慮する必要があります。追加の抗生物質は、抗生物質耐性細菌株を含む疑いのある土壌で作業する場合、培地に添加することができる。クロラムフェニコール添加培地中の細菌汚染は、環境土壌から酵母を単離する際に遭遇する問題ではなかった。 - ベノミル粉末をDMSOに懸濁し、5g/Lの原液を調製する。シリンジ濾過により滅菌し、4°Cで保存する。
注:この選択的抗真菌薬は、土壌酵母単離中の酵母増殖に影響を与えることなく、ほとんどの糸状菌の増殖を防止する26,27。
- クロラムフェニコール粉末を70%エタノールに懸濁し、50g/Lの原液を調製した。シリンジ濾過により滅菌し、4°Cで保存する。
- 培地および滅菌装置の調製
- YEPD(酵母エキス - ペプトン - デキストロース)ブロスを調製するために、酵母エキス10g、ペプトン20g、およびデキストロース20gを1Lの二重蒸留水に加える。よく混合しオートクレーブまで121°Cで40分間攪拌する。 使用時まで室温で保存してください。
- YEPD固体寒天培地
- 酵母エキス10g、ペプトン20g、デキストロース20g、寒天20gを水1Lに混ぜる。よくかき混ぜてオートクレーブを121°Cで40分間混合する。
- 十分に冷却したら、原液からクロラムフェニコールとベノミルを1mL加え、2つの抗菌剤の最終濃度をそれぞれ50mg/Lおよび5mg/Lにする。
- かき混ぜてよく混ぜ、直径10cmのペトリ皿に注ぎます。使用時まで4°Cに設定して一晩室温で放置する。
注:1LのYEPDから、約40枚のプレートを流し込むことができます。
- 木製の平らな先端のアプリケータースティックと再利用可能なセルスプレッダーをオートクレーブで滅菌し、室温で保管します。
- 液体ブロス中の土壌のインキュベーション
- 滅菌13 mL培養チューブのセットを土壌サンプルIDで標識することによって調製する。
- 血清学的ピペットを用いて、クロラムフェニコールおよびベノミルを添加した5mLのYEPDブロスを各チューブに加える。
- BSCIIで作業し、滅菌された木製の平らな先端のアプリケーターを使用して、〜0.1gの土壌を適切な培養管に移します。
注:サンプル間の交差汚染を避けるために、土壌サンプルごとに新鮮なアプリケーターを使用し、使用後はすぐに廃棄してください。 - チューブを最初のストップにしっかりとキャップしてこぼれを防ぎますが、インキュベーション中の空気交換は可能です。培養チューブをローラードラムで24時間インキュベートし、酵母増殖を最大化するのに最適と考えられる温度で培養する。
注:インキュベーション温度は、土壌サンプルの原産国の年間平均温度に基づいて決定する必要があります。例えば、アイスランドから土壌酵母を単離する場合、培養管を14°Cでインキュベートし、一方サウジアラビアの土壌は30°Cでインキュベートした。 より低い温度での酵母増殖が遅いため、インキュベーション時間を最大72時間延長しなければならない場合があります。
- 上清を固体培地に移す。
- ステップ1.2で調製したYEPD+クロラムフェニコール+ベノミル寒天プレートのセットを使用して、それらを土壌サンプルIDで標識する。
- ステップ1.3で調製した培養チューブをローラードラムから取り出します。BSCIIで作業し、チューブを短時間渦巻きにして、底に沈んだ可能性のある土壌粒子と細胞を懸濁液に戻します。
- マイクロピペットを用いて、100 μLの上清をプレート上に移す。滅菌された再利用可能なセルスプレッダーを使用して、液体を寒天表面に完全かつ均等に広げます。
注: 10 個のサンプルのセットで作業すると、このプロセスが大幅に高速化されます。まず上清を10枚のプレートにピペットでつないで、次いで展延を行う。サンプル間の交差汚染を避けるために、サンプルごとに新鮮なスプレッダーを使用してください。 - プレートをビニール袋に積み重ね、密封し、微生物の増殖が見えるまで、液体ブロスインキュベーションに以前に使用したのと同じ温度で2〜3日間逆さまにインキュベートします。
- 単一コロニーの酵母およびストリーキングの検出
- 十分なインキュベーション時間(通常は2〜3日ですが、より低い温度ではもっと時間がかかることがあります)を許容した後、BSCIIでプレートに酵母の増殖がないか検査します。クリーミーで丸みを帯びたマット状の酵母で、細菌やカビのコロニーと簡単に区別できます。
注:一部の酵母は着色された色素を産生し、黒/茶色、黄色、または赤に見えることがありますが、その全体的なコロニーの質感と形状は非色素性酵母に似ています。 - さらなる処理のために、各プレートから酵母様コロニーを1つ選択する。
注: 1 つのプレートで複数のタイプの形態が観察される場合は、形態学的タイプごとに 1 つの代表的なコロニーを選択します。 - 滅菌された木製の平らな先端のアプリケータースティックを使用して、選択した各コロニーを新鮮なYEPD + クロラムフェニコール + ベノミルプレートと単一コロニー用のストリークに移します。3 つの別々のストリークを実行します。
- アプリケータースティックを使用してプレートの3分の1以上を前後に縞。2 番目と 3 番目のストリークを開始するには、前のストリークにアプリケーターを 1 回横切ってストリークします。すべてのスジに新しいアプリケータースティックを使用してください。
メモ: アイソレートごとに 1 枚のプレートを使用してください。サンプル間の交差汚染を避けるために、使用後すぐにアプリケータを廃棄してください。
- アプリケータースティックを使用してプレートの3分の1以上を前後に縞。2 番目と 3 番目のストリークを開始するには、前のストリークにアプリケーターを 1 回横切ってストリークします。すべてのスジに新しいアプリケータースティックを使用してください。
- プレートをビニール袋に積み重ね、密封し、シングルコロニーが見えるまで、以前に使用したのと同じ温度で2〜3日間逆さまにインキュベートします。
- 十分なインキュベーション時間(通常は2〜3日ですが、より低い温度ではもっと時間がかかることがあります)を許容した後、BSCIIでプレートに酵母の増殖がないか検査します。クリーミーで丸みを帯びたマット状の酵母で、細菌やカビのコロニーと簡単に区別できます。
- ITSシーケンシング による 酵母種の同定
- 土壌ごとによく分離された単一コロニーを選択し、新鮮なYEPD + クロラムフェニコール + ベノミルプレートに継代培養して、より多くの細胞を取得します。以前に使用したのと同じ温度で2〜3日間インキュベートする。
- 新たに増殖した細胞を回収し、滅菌した30%グリセロール1mLを二重蒸留水中に含む-80°Cの冷凍チューブに懸濁して細胞懸濁液を作成した。これらの懸濁液を-80°Cに維持し、原液とする。
- 新鮮な細胞を使用して、プライマーITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')およびITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGCC 3')を用いてコロニーPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行い、真菌バーコード遺伝子であるITS9を増幅する。95 °C で 10 分間の初期変性ステップを行い、その後、(i) 95 °C で 30 秒間、(ii) 55 °C で 30 秒間、および (iii) 72 °C で 1 分間を 35 サイクル繰り返します。
注:コロニーPCRは、PCRに続くDNA抽出よりも成功率が高く、ターンアラウンドタイムが速いです。 - 株のコロニーPCRが繰り返し失敗する場合は、選択したプロトコルを使用してDNAを抽出し、抽出したゲノムDNAを鋳型としてITSPCRを実行します(上記と同じ熱サイクル条件を使用)。
注:比較的安価なクロロホルムベースのDNA抽出が推奨されます28。 - サンガーシーケンシングを実行して、各株について増幅されたITS領域のDNA配列を決定する。
- 得られた酵母株のITS配列を、NCBI GenBankやUNITEなどの公的データベースに寄託された配列と比較して、種の同一性を確立します。
2. 土壌からのアスペルギルス フミガーツスの 単離
- 土壌サンプルあたり抗生物質クロラムフェニコールを添加した滅菌サブローデキストロースブロス(SDB)1mLを調製する。
- 10gのペプトンと20gのデキストロースを1Lの蒸留水に加える。オートクレーブを121°Cで40分間処理する。
- SDBを〜50°Cに冷却し、1mLの50g / Lクロラムフェニコールを加えて濃度を50mg / Lにします。
注:クロラムフェニコールは、酵母単離のために上記と同じ方法で調製される。クロラムフェニコールは、細菌の増殖を抑制するだけでなく、ステップ2.2で詳述されているインキュベーションステップ中にチューブを開く原因となる細菌からのガスの生成も防止します。 - メカニカルピペットを用いて土壌試料あたり1.5mLの微量遠心管にSDBを1mLずつ無菌的にアリコートする。
- 1.5mLの微量遠心チューブに土壌を加える。
- BSCIIの内部にベンチコートまたは吸収性パディングを敷いて、こぼれた土壌の処分に役立てます。
- オートクレーブ処理されたアプリケータースティックを使用して、約 0.1 g の土壌を 1 mL の SBD を含む 1.5 mL の微量遠心チューブに移します。チューブとボルテックスを閉じます。懸濁土壌を50°Cで3日間インキュベートする。
注:インキュベーション中の振盪は必要ありません。
- 土壌接種ブロスの菌糸収穫
- 麦芽エキス寒天(MEA)プレートを調製する。
- MEA1リットルあたり:蒸留水1Lに麦芽エキス20g、デキストロース20g、ペプトン6g、寒天15gを加える。オートクレーブを121°Cで40分間処理する。
- MEAを〜50°Cまで冷却してから、1mLの50g / Lクロラムフェニコールを加えて、最終濃度を50mg / Lにします。
- 土壌接種したブロスから菌糸体をMEAプレートに移す。
- SDBから空気の境界まで目に見える菌糸成長を持つ土壌接種剤を特定します。
- 滅菌された木製の平らな先端のアプリケータースティックを使用して、菌糸体をMEAプレートの中心に移します。MEAプレートを37°Cで3日間インキュベートする。
- 麦芽エキス寒天(MEA)プレートを調製する。
- A.フミガーツスの形態学的特性を有する菌糸体の選択。
- 特徴的な A.フミガーツスの 形態学的特性(緑色のスエード様の成長)を有するカビコロニーを特定する。
- BSCIIでの作業では、滅菌された木製の平らな先端のアプリケータースティックまたは接種ループを使用して、表面を一度こすって分生子/菌糸体を収穫します。胞子/菌糸体をMEAプレートの中心に移し、寒天上に縞模様を付けて単一コロニーとする。37°Cで2日間インキュベートする。
注:複数の A. fumigatus 株および/または他の真菌がプレート上に存在する可能性があるため、単一コロニーのストリークが重要である。酵母単離プロトコルにおけるステップ1.5.3における単一コロニーストリーキングプロトコルを使用することができる。 - 滅菌アプリケータースティックまたは接種ループを用いて、ステップ2.4.1.2で生成した単一コロニーをコロニーを1回ストリークしてMEA上に継代培養する。収穫した胞子をプレートの中央に広げる。37°Cで2日間インキュベートする。
- 培養保存のための A.フミガトゥス 胞子/菌糸体の収穫
- 滅菌30%グリセロール溶液を調製する(100mL溶液の場合、70mLの二重蒸留水と混合した100%グリセロール30mLを加え、121°Cで40分間滅菌する)。
- BSCIIで作業するには、p1000ピペットを使用して1mLの30%グリセロール溶液を吸引します。 A. fumigagatus コロニーに1mLのグリセロール溶液を分注し、胞子/菌糸体を採取する。
- A. fumigatus胞子/菌糸体の疎水性のため、ピペットチップを使用してプレートの密集した胞子形成領域を傷つけます。
注:グリセロールがスクラッチに分配されると、グリセロールは寒天の上を転がるのではなく、スクラッチ領域に付着します。 - グリセロールをスクラッチ領域にゆっくりと分注して胞子を取り除き、グリセロール溶液に懸濁させます。
- 完全に分注したら、プレートを軽く傾け、グリセロール胞子/菌糸体懸濁液を吸引する。
注: 約 750 ~ 800 μL が吸引されます。 - 吸引液を滅菌冷凍管に移し、-80°Cで保存する。 必要に応じて、手順 2.5.2.1 ~ 2.5.2.4 を繰り返して作業在庫を登録します。
- A. fumigatus胞子/菌糸体の疎水性のため、ピペットチップを使用してプレートの密集した胞子形成領域を傷つけます。
- A. fumigatus株の表現型同定
- ステップ2.5.2から作成した胞子ストックを使用して、水中で100倍希釈液を作成します。
- 菌糸体および胞子ストックの10 μLを吸引し、990 μLの水に分配する。懸濁液をボルテックスする。
- 希釈胞子懸濁液10 μLを標準的な顕微鏡スライドに分注する。
- オプション:菌糸体および胞子懸濁液をメチレンブルーで染色する。
- メチレンブルーで染色するには、乾くまでスライドをブンゼンバーナーに通して、分生子と分生子をスライドに固定します。
- メチレンブルーを1〜2分間塗布し、水で洗い流します。
- 吸い取り紙でスライドを乾かします。
- 倍率400倍の化合物顕微鏡を使用して、懸濁液を表示し、分生子腫を見つけます。観察された分生子葉類の形態を A. fumigatus conidiophore morphologyと比較する。
- ステップ2.5.2から作成した胞子ストックを使用して、水中で100倍希釈液を作成します。
- A.フミガーツス株の分子同定
- 一般的な真菌DNA抽出プロトコルに従って各単離物からDNAを抽出します。
- アスペルギルス β-チューブリン遺伝子(β-tub1およびβ-tub4)に特異的なプライマーを用いて、PCRを実行し、Alcazar-Fuoliらによって記載されたプロトコールに従って増幅産物の配列を取得する17。
- 得られた配列を、BLASTを使用してNCBI GenBankなどの公開データベースに寄託された配列と比較します。
- 菌株配列がデータベース内の A.フミガーツス 配列にトップマッチであることを確認する。
- ステップ2.7.2の代わりに、 A.フミガーツス 交配型MAT1-1およびMAT1-2を標的とするマルチプレックスPCR反応を実行する29。
- マルチプレックスPCR反応において以下の3つのプライマー配列を使用する: AFM1:5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5'-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3'; AFM3: 5'-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3'.
- 次のサーモサイクラーパラメータを使用します:95°Cで5分、95°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで1分、72°Cで最後の5分の前に35サイクル。
- ゲル電気泳動を実行して生成物を同定する。834 bp MAT-1 または 438 bp MAT1-2 を探します。交配型増幅が確認された A.フミガーツス 株を陽性対照および陰性対照として用いる。
- 断片解析による A. fumigatus 株のマイクロサテライトジェノタイピング
注:以下にリストされている手順は、9つの超小型衛星(STR)遺伝子座でのA. fumigatusのジェノタイピングを広くカバーしていますが、いくつかの重要な考慮事項のみが強調されています。A. fumigatus STRジェノタイピングの詳細については、De Valk et al.24,30を参照されたい。- De Valkらによって以前に記載されたSTRAfプライマーを用いて3つのPCRマルチプレックスマスターミックスを調製する。
- フォワードプライマーを蛍光標識し、キャピラリー電気泳動により断片サイズを決定します。フォワードプライマーの濃度がマスターミックス内のリバースプライマー(1 μM)の半分(0.5 μM)であることを確認します。
注:最良の結果を得るには、キャピラリー電気泳動時に使用した選択した色素標準の吸光度波長と一致する吸光度波長を有する蛍光標識を使用してください。 - 最良の結果を得るためには、ホットスタートポリメラーゼを使用してください。
- 1反応あたり0.1ngのDNA濃度を使用してください。
- フォワードプライマーを蛍光標識し、キャピラリー電気泳動により断片サイズを決定します。フォワードプライマーの濃度がマスターミックス内のリバースプライマー(1 μM)の半分(0.5 μM)であることを確認します。
- 95 °C で 10 分間、95 °C で 30 秒間、60 °C で 30 秒間、72 °C で 60 秒間、続いて 72 °C で 10 分間、4 °C でホールドする PCR プログラムを使用して、各株のマルチプレックス PCR を実行します。
- ゲル電気泳動で増幅生成物を確認します。
- フラグメント分析の専門家が推奨するとおりに製品を所望のレベル(通常は〜50倍)に希釈し、キャピラリー電気泳動を実行します。各株に対して3回のランを実行し、各ランは3つの異なる蛍光プローブで3つの多重化反応をカバーします。
- 9つのSTR遺伝子座のそれぞれについて正しい断片サイズを決定するには、断片解析が可能なソフトウェアを使用する。
- キャピラリー電気泳動から得られた生データを取得します。フラグメント解析ソフトウェア(例えば、Osiris)を使用して、最大のピークに基づいてフラグメントサイズをスコアリングする。
- フラグメント サイズを変換して、9 つの遺伝子座のそれぞれについて数値を繰り返します。De Valkらによって以前に記載された参照株Af293の繰り返し番号の断片サイズを使用する。
メモ: 異なるキャピラリー電気泳動プラットフォーム間でフラグメントサイズのわずかな変動が発生する場合があります。したがって、ジェノタイピング株のための9つの遺伝子座のそれぞれについて既知の断片サイズを有する共通の基準株(および内部はしご)を含むことが重要である。
- De Valkらによって以前に記載されたSTRAfプライマーを用いて3つのPCRマルチプレックスマスターミックスを調製する。
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Representative Results
土壌からの酵母の単離
上記の酵母単離プロトコルは、9、12の9カ国の53カ所を起源とする土壌サンプルから酵母を培養するために実施された。合計で、1,473の酵母株が3,826の土壌サンプルから単離された。9つの出発国の異なる気候条件を考えると、各国の最良の孵卵温度は、その年間平均気温に基づいて決定された(表1)。14°Cでの酵母増殖が遅いことを考えると、アイスランドからの土壌サンプルをローラードラム上でさらに48時間(合計96〜120時間)インキュベートした。固体培地上での2〜3日間のインキュベーションに続いて、微生物増殖がすべてのサンプルについてプレート上で見えた(図1A)。プレート上に存在する酵母形態ごとに無作為に選択されたコロニーを、新鮮なプレート上の単一コロニーについて筋状にした(図1B)。
酵母単離の成功率は国によって異なっていた(表1)。例えば、97の酵母株が562のサウジアラビアの土壌サンプル(17.3%)から培養されたのに対し、261の酵母は300のカナダの土壌サンプル(87%)から培養された。希少化分析を実行して、サンプリングされた場所における真の酵母多様性の正確な推定値を得るために十分な土壌サンプリングが実施されているかどうかを判断する必要があります。各国の希少化分析の例を事前に作成し、シャノン多様性指数を土壌酵母多様性の尺度として使用しました(図2)。得られた希薄化曲線は飽和漸近線に近づき、追加のサンプリングがより多くの酵母多様性をもたらした可能性は低いことを示している。
ITS領域のシーケンシングにより、1,473の酵母分離株を134の異なる種に分類できることが明らかになった。これには、90の既知の種と44の潜在的に新しい種が含まれていました。我々は混合効果モデルを適用して、シャノン多様性指数31によって定量化された、全球的な培養可能な土壌酵母多様性の予測因子を同定した。このモデルでは、サンプリング場所の平均年間降水量、年間平均気温、標高、赤道までの距離を固定効果として当てはめ、サンプリング国をランダム効果として設定しました9。このモデルでは、平均年間降水量がシャノン多様性指数(p = 0.012)と有意に相関していることが特定されましたが、他の予測変数とシャノン多様性指数9との間に有意な相関は見られませんでした。
この培養ベースのプロトコルを培養に依存しない方法と比較するために、我々はこれらの知見を、メタゲノミクス2を用いて土壌真菌の全球的多様性を調査したTedersooらによる以前の研究と比較した。今回、Tedersoたちの研究グループは、39カ国の土壌サンプルから直接抽出したDNAについてITS領域のハイスループットシーケンシングを行い、そのうち4カ国(カメルーン、カナダ、中国、ニュージーランド)も本研究でサンプリングした。我々は、両方のデータセット32に存在するITS配列を同定するためにBLAST検索を実施し、ITS配列の26%がメタゲノミクスデータセットにおいて有意な一致(>98.41%のヌクレオチド同一性)を有することを見出した。しかし、<3%が同じ国の真菌配列と一致し、残りの23%が別の国の真菌配列と一致しました9。我々は、酵母種の同一性を有するITS配列に注釈を付けることにおいて、メタゲノミクス研究よりも成功した。今回、Tedersooたちの研究グループは、合計50,589の真菌操作分類単位(OTU)を報告したが、酵母OTUの数は不明である。これらの真菌OTUのうち、33%は単にenvironmental_sequence(724、1.4%)、uncultured_soil_fungus(2,405、4.8%)、uncultured_ectomycorrhizal_fungus(1,407、2.8%)、またはuncultured_fungus(11,898、23.5%)として注釈が付けられていた。
土壌からのアスペルギルス フミガーツス隔離
微量遠心管内の1mLのSDB中で50°Cで3日間の土壌インキュベーションの後、菌糸体はSDB内、SDBと空気境界上、および/または内壁に生育しているのが見つかることがあります。アスペルギルス フミガーツス菌糸体は、典型的には、SDBから空気境界までに生育しているが、SDB表面の直下から採取することもできる。この工程の後、菌糸体をMEAに移し、37°Cで3日間増殖させた。 プレート上の菌糸生育は、A. fumigatusに典型的な緑色のスエード形態を形成するだけであり得る(図3A)。 より一般的には、他の耐熱性カビが同じ土壌内に存在し、同じプレート上または単独でA. fumigatusとともに成長することができる(図3B-D)。アスペルギルス フミガーツスの分離率は、土壌酵母について見出されたものと同様に、地理的な場所によって異なる可能性がある。例えば、カナダのバンクーバーでは、540の土壌サンプル(46.5%)から251の分離株がこの方法で得られた(未発表の結果)。対照的に、カメルーン内では、495の土壌サンプル(10.3%)から51のA. fumigatus分離株が採取された33。
A. フミガーツス ・コニディオフォア構造は、光学顕微鏡を用いて観察および同定することができる。分生子植物はスティックの形態にボールを持っています(図4)。さらに、 A. fumigatus conidiophoresはユニセリエートであり、そこでは分生子鎖に結合したフィアライドが球状の小胞に直接付着している。他のア スペルギルス 種では、分生子は二分腸であり、フィアライドは小胞に付着したメチュラエに接続される。
キャピラリー電気泳動からの生データのフラグメント分析を実行し、キャピラリー電気泳動スペクトルをフラグメントサイズに変換するためのソフトウェアプログラムがいくつか用意されています。 図5は 、プログラムOsirisによって生成されたクロマトグラムである。 A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B, and 2C), trinucleotide (3A, 3B, and 3C), and tetranucleotide (4A, 4B, and 4C) の断片長を可視化した 3 つのチャネルに STR 遺伝子座が示されている。また、PCR時の試料DNA濃度が高すぎる場合に発生するPCRアーチファクトも示されている。各色の最高ピークは、このプロットにおける3つのSTR遺伝子座の断片サイズを表す。
A. fumigatus STR遺伝子型間に存在する遺伝的変異は、Rパッケージpopprを用いて可視化することができる。R スクリプト bruvo.msn は、遺伝子型の各ペア間にペアワイズ Bruvo の遺伝的距離行列を作成します。この行列は、最小スパニング ネットワーク (MSN) を生成するために使用されます。高品質の MSN は、plot_poppr_msn または imsn の R スクリプトを使用して生成できます (図 6)。主成分の判別分析(DAPC)は、株間の遺伝的関係を視覚化するもう1つの方法です(図7)。R パッケージ adegenet の R スクリプト dapc は、DAPC の実行に使用され、既知または未知のグループ事前確率で使用できます。未知のグループ事前確率では、K-means クラスタリングを使用して、個人のグループの可能性が高い数を識別します。
図1:土壌サンプルからの酵母単離(A)微生物の増殖は、2〜3日間のインキュベーション後に固体寒天上で見られる。酵母コロニーは、他の真菌/細菌コロニーの中に点在しているのを見ることができます。プレート上の形態学的タイプごとに1つの代表的な酵母コロニーが選択され、単一コロニーについてスジする。(b)酵母分離株の単一コロニーを得るために3本のストリークが行われる。1枚のプレートを用いて、各土壌単離物を得た。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:土壌サンプリングの希薄化分析 サンプリングされた9カ国のそれぞれにおいて、シャノン多様性指数によって定量化されたように、土壌酵母の多様性は、土壌サンプルの数が増加するにつれて飽和に近づく。この図は 9から翻案した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サブローデキストロガー上のアスペルギルス・フミガーツス・モルフォロジー (A)グリーンスエード様A.フミガーツス 増殖形態学。 (B-D)A. 土壌試料内に存在する他の好熱性鋳型によるフミガーツス増殖。A.フミガーツス調味料は、BおよびDにおいて目に見えて減少する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:光学顕微鏡下での アスペルギルス フミガーツス・ コニディオフォアの写真。 スケール バー = 10 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5: アスペルギルス フミガーツス 株からの9つのマイクロサテライト遺伝子座のオシリス出力。 出力は、(A)ジヌクレオチド(2A、2B、および2C)、(B)トリヌクレオチド(3A、3B、および3C)、および(C)テトラヌクレオチド(4A、4B、および4C)STR遺伝子座に対応する。フォワードプライマー5'蛍光標識は、A=6-FAM;B = 16 進数;C = ATTO550。マルチプレックス反応生成物を、キャピラリー電気泳動の前に30倍に希釈した。LIZ600色素標準物質をキャピラリー電気泳動時に使用した。生データは、ピーク分析ソフトウェアOsirisを使用して分析し、60〜400bpの間の潜在的なピークを特定した。いくつかのPCRアーティファクトは、蛍光出血を引き起こすオフスケールピーク、吃音ピーク、およびN-1ピーク(C)である。略語:6-FAM=6-カルボキシフルオレセイン;HEX = ヘキサクロロフルオレセイン;STR = 短いタンデムリピート;RFU = 相対蛍光単位;BPS = 塩基対。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:アイスランド産の A. fumigatus のMLGとカナダのノースウェスト準州との間の遺伝的関係を示す最小スパンネットワーク。 各ノードは 1 つの MLG を表し、ノード サイズは各 MLG のひずみの数に対応します。遺伝的に類似しているノードは、より暗く、より太いエッジを有するが、遺伝的に遠いノードは、より明るく、より薄いエッジを有する。この数字は 34から翻案された。略語: ISL = アイスランド;NWT = カナダのノースウェスト準州。MLG = 多遺伝子座遺伝子型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:アイスランド、NWT、ユーラシア、北米、オセアニアの A.フミガーツス 集団の主成分判別分析(DAPC)を用いた遺伝的クラスタリング。 単離物は、9つのマイクロサテライト遺伝子座で遺伝子型決定され、クローン補正され、合計1,703のユニークな多遺伝子座遺伝子型となった。遺伝子型は地理的起源に従って着色された。この数字は 34から翻案された。略語: DAPC = 主成分の判別分析;NWT = ノースウェスト準州;ISL = アイスランド;CMR = カメルーン;CAN = カナダ、オンタリオ州ハミルトン;BEL = ベルギー;FRA = フランス;DEU = ドイツ;IND = インド;NLD = オランダ;NOR=ノルウェー;NZL = ニュージーランド;ESP = スペイン;CHE = スイス;米国 = 米国。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 国 | インキュベーション温度(°C) | 土壌サンプル | 酵母分離株 | 既知種・新種 |
| カメルーン | 30 | 493 | 110 | 10/9 |
| カナダ | 23 | 300 | 261 | 34/12 |
| 中国 | 23 | 340 | 230 | 23/5 |
| コスタリカ | 30 | 388 | 95 | 20/2 |
| フランス | 23 | 327 | 175 | 12/2 |
| アイスランド | 14 | 316 | 211 | 11/0 |
| ニュージーランド | 23 | 610 | 155 | 14/4 |
| ペルー | 23 | 490 | 139 | 30/9 |
| サウジアラビア | 30 | 562 | 97 | 8/1 |
| トータル | 3826 | 1473 | 90/44 |
表1:6大陸9カ国からの土壌酵母単離。各国の土壌サンプルのインキュベーション温度は、その年間平均温度に基づいて決定した。ここに提示された結果は、9,12から適応されています。
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Discussion
土壌から酵母および A.フミガーツス を単離するために開発されたプロトコルは、ハイスループット土壌処理および真菌単離のための迅速かつ効率的な方法である。このプロトコルは、サンプルあたり少量の土壌(0.1〜0.2g)しか必要としないため、同様の努力でより多くのサイトをサンプリングすることができます。迅速なターンアラウンドタイムにより、短い時間枠内で結果が得られ、必要に応じてトラブルシューティングや実験の繰り返しに時間をかけることができます。このプロトコルは、標準的な微生物学および細胞培養装置を使用して、多くの実験室環境で簡単に複製できます。ただし、酵母やカビを国際土壌から隔離する場合は、特別な予防措置が必要です。プラスチックトレイやセルスプレッダーなどの使い捨てでないプラスチック機器はすべて、10%漂白剤に浸してからオートクレーブ処理することで滅菌する必要があります。使用済みのベンチコートは、廃棄する前にビニール袋に密封し、オートクレーブで滅菌する必要があります。
なお、上記のプロトコールを用いて単離された酵母の数および同一性は、使用するインキュベート条件および培地によって制限され得る。例えば、ローラードラム内での24時間のインキュベーションは、成長の遅い種よりも成長の速い好気性酵母の単離に有利に働くことができる。加えて、酵母単離のための栄養豊富なYEPD培地の使用は、異なる栄養要件および嗜好を有する酵母種を除外し得る。さらに、ここでサンプリングされたほとんどの場所では、年間を通じて気温やその他の気候条件の季節変動を経験しています。時間と資源が許せば、同じ土壌サンプルを異なる温度範囲で処理して、これらの土壌に生息するより広い範囲の酵母の単離を可能にすることができる。
培養に依存しない方法は、環境真菌の多様性における大規模なパターンを解明するために不可欠であるが、酵母などの真菌の標的群にとっては十分に有益ではない。培養依存的単離の使用により、地球規模の土壌酵母の多様性とその予測因子の包括的な調査が可能になった9。今回、Tedersooたちの研究グループが実施したメタゲノミクス研究では、土壌真菌の多様性に関する世界的な予測因子とパターンが同定されたが、これらの知見が酵母の多様性に具体的にどの程度当てはまるかは解明できなかった2。今回、Tedersooたちの研究グループは、年間平均降水量が、世界中の土壌真菌の多様性の主要な気候要因であることを明らかにした2。この研究は、世界の土壌における平均年間降水量と培養可能な酵母の多様性との間に同様の相関関係があることを発見し、培養に依存する方法がハイスループットシーケンシングアプローチの知見を補完し、拡張できることを強調した9。
クロラムフェニコールの添加は、細菌による真菌の増殖干渉を防止するために、固体培地および液体培地の両方の調製における重要なステップである。クロラムフェニコールを液体培地に添加することは、抗生物質の不足が土壌中に存在する細菌を発酵させることを可能にするので、極めて重要である。これは、プロトコルの土壌インキュベーション中に使用される微量遠心チューブまたは13mL培養チューブを強制的に開くガスの生産につながります。寒天/スープを含むクロラムフェニコールの細菌汚染が問題となる場合、クロラムフェニコールはより強力な抗生物質で置換または補充することができる。土壌からA.フミガーツスを単離する場合、疎水性A.フミガーツス・コニディア35,36を懸濁させるために、SDブロスをTween 20溶液(1%Tween 20を含む0.2M NaCl)で置換することができる。懸濁液に続いて、100μLをSD寒天上に播種し、50°Cでインキュベートすることができる。
アスペルギルス フミガーツスは 、SD寒天培地とMEA培地の両方を22°C〜50°Cの間で単独でインキュベートすると、急速に成長し、豊富に胞子形成します。 しかし、土壌サンプル中に存在する他の耐熱性種によっては、 A.フミガーツス の成長および胞子形成が妨げられる可能性がある (図3A、D)。このような状況下では、その後の収穫および特性評価のために純粋なコロニーを得るために、1〜数回の継代培養工程が必要となり得る。
図5のA.フミガーツス株の断片解析は、プログラムOsirisを用いて行った。いくつかのPCRアーティファクトが図5Cで強調されており、De Valkらによって詳細に議論されている30。より短い反復値を有するB−1吃音ピークは、DNAポリメラーゼによるアンチセンス鎖の合成中の鎖の滑りによって引き起こされる。N-1ピークは、PCR中にDNA濃度が高すぎる場合に生じる。推奨されるDNA濃度は、上記のプロトコルに記載されているように0.1ngです。もう1つのアーチファクトは、重複しない吸光波長を有する蛍光標識を使用して修復することができる色素出血である。例えば、蛍光標識6-FAM、HEX、およびATTO550、ならびにLIZ600色素標準は、明確なフラグメントピークを生成します(図5)。最後に、オフスケールピークを防ぐために、キャピラリー電気泳動の前に各PCR反応を希釈する(この場合、〜50倍希釈した)。反応混合物中の未使用のフォワードプライマーの蛍光をさらに低減するために、マスターミックスを作成するときにリバースプライマーに対するフォワードプライマー濃度を半分にする。
このプロトコルの高スループットと保守的な性質により、土壌から多くの酵母やカビを比較的迅速かつ容易に取得できます。ただし、サンプリング方法には 2 つの主な制限があります。まず、土壌から成長させた酵母コロニーの形態学的特徴を用いて、固有の種を選別した。次いで、これらを継代培養し、ITSシーケンシング による 種同定に使用した。これは、存在する酵母種の表現を最大化するために行われた。しかしながら、選択されたコロニーに類似または同一の形態を共有した酵母種は、継代培養されない可能性がある。第2に、 A. fumigatus 単離の間、土壌サンプルごとに1つの個体コロニーのみが選択されるので、土壌サンプル内の複数の個体の存在は見逃されるであろう。これは、同じ土壌サンプル内に存在するユニークな遺伝子型が収集されないため、サンプル集団内に存在する真の遺伝的多様性の過小評価につながる可能性があります。この問題を緩和するために、固体培地上での最初の培養に続く単一コロニーのためのストリークステップの間に、いくつかの単一コロニーを収集して、追加の遺伝子型を得ることができる。サンプルごとに使用される土壌の量が少ないため、サンプルあたり大量の土壌を使用する方法と比較して、このサンプリングの制限を最小限に抑えることができます。
酵母とカビの単離にこのハイスループットで労働効率の高いプロトコルを使用すると、サンプルあたりの労力を減らしながら、土壌集団内の個体数が増加します。統計的検出力の増加は、土壌中の培養可能な酵母群集のより良い画像を提供し、 A. fumigatusの土壌集団を特徴付けるのに役立つ。
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Disclosures
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会からの助成金(Grant No.ALLRP 570780-2021)およびマクマスター大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
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