Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av dyrkbar gjær og mugg fra jord for å undersøke sopppopulasjonsstruktur

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Denne protokollen er en effektiv, rask metode for dyrking av gjær og formen Aspergillus fumigatus fra store sett med jordprøver på så lite som 7 dager. Metodene kan enkelt modifiseres for å imøtekomme en rekke inkubasjonsmedier og temperaturer etter behov for eksperimenter.

Abstract

Jord er vert for en utrolig mengde mikrobielt liv, med hvert gram som inneholder opptil milliarder bakterielle, arkeale og soppceller. Multicellulære sopp som mugg og encellede sopp, bredt definert som gjær, oppfyller viktige roller i jordøkosystemer som nedbrytere av organisk materiale og som matkilder for andre jordboere. Svampeartenes mangfold i jord er avhengig av en rekke klimatiske faktorer som nedbør og temperatur, samt jordegenskaper, inkludert organisk materiale, pH og fuktighet. Mangel på tilstrekkelig miljøprøvetaking, spesielt i regioner i Asia, Afrika, Sør-Amerika og Mellom-Amerika, hindrer karakterisering av jordsoppsamfunn og oppdagelsen av nye arter.

Vi karakteriserte jordsoppsamfunn i ni land på seks kontinenter ved hjelp av ~ 4000 jordprøver og en protokoll utviklet i laboratoriet for isolering av gjær og mugg. Denne protokollen begynner med separat selektiv anrikning for gjær og den medisinsk relevante formen Aspergillus fumigatus, i flytende medier mens den hemmer bakterievekst. Resulterende kolonier overføres deretter til faste medier og viderebehandles for å oppnå rene kulturer, etterfulgt av nedstrøms genetisk karakterisering. Gjærartens identitet etableres via sekvensering av deres interne transkriberte spacer (ITS) -region av den nukleære ribosomale RNA-genklyngen, mens den globale populasjonsstrukturen til A. fumigatus utforskes via mikrosatellittmarkøranalyse.

Protokollen ble vellykket brukt til å isolere og karakterisere jordgjær og A. fumigatuspopulasjoner i Kamerun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabia. Disse funnene avslørte sårt tiltrengt innsikt i globale mønstre i jordgjærdiversitet, samt global befolkningsstruktur og antifungale motstandsprofiler av A. fumigatus. Denne artikkelen presenterer metoden for å isolere både gjær og A. fumigatus fra internasjonale jordprøver.

Introduction

Sopp i jordøkosystemer spiller viktige roller i nedbrytning av organisk materiale, næringssyklus og jordgjødsel1. Både kulturuavhengige (dvs. høykapasitetssekvensering) og kulturavhengige tilnærminger er mye brukt i studiet av jordsvamp 2,3. Mens den store mengden data som genereres av metabarkodesekvensering med høy gjennomstrømning er nyttig for å belyse brede mønstre i samfunnsstruktur og mangfold, kan den kulturavhengige tilnærmingen gi svært komplementær informasjon om de taksonomiske og funksjonelle strukturer i soppsamfunn, samt mer spesifikke profiler av individuelle organismer gjennom nedstrøms mangfold og funksjonelle analyser på grunn av tilgjengeligheten av rene soppkulturer.

Til tross for sjelden overskridelse av tusenvis av celler per gram jord, er gjær, bredt definert som encellede sopp, essensielle nedbrytere og matkilder for andre jordboere 4,5. Faktisk kan gjær være den dominerende jordsoppen i kalde biosfærer som kontinental Antarktis 6,7. Jord er også et primært reservoar av medisinsk relevante gjær som forårsaker alvorlige opportunistiske infeksjoner hos mennesker og andre pattedyr8. Til tross for morfologiske likheter er gjærarter fylogenetisk mangfoldige og forekommer blant filamentøse sopp i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, innenfor soppriket9. Gjær mangler en definerende DNA-signatur ved soppstrekkodingsgenet, den interne transkriberte avstandsstykket (ITS) -regionen i den nukleære ribosomale RNA-genklyngen10, noe som gjør dem umulige å skille fra andre sopp i metagenomikkundersøkelser og dermed nødvendiggjør bruk av kulturavhengige metoder for å isolere gjærarter.

Protokollen nedenfor ble implementert for å karakterisere jordgjærsamfunn i ni land og identifisere globale trender og mønstre i jordgjærdiversitet 9,11,12. Metagenomikk tilnærminger er av begrenset bruk når man studerer målrettede grupper av organismer som gjær 2,3. På grunn av deres fylogenetiske mangfold kan gjær ikke skilles fra andre sopp basert på DNA-sekvens alene. Dermed krever studier av gjærpopulasjoner fortsatt bruk av kulturavhengig isolasjon. Dyrking er imidlertid ofte betydelig mer tidkrevende og krever mer personell til å utføre forsøkene. Derfor har protokollen blitt optimalisert og strømlinjeformet for raskere behandling med begrenset personell. Den største fordelen med dyrking er at de identifiserte gjærartene er levende gjær og ikke døde, og dermed er det mer sannsynlig at de er sanne jordboere i stedet for forbigående celler som er tilstede i jordene. Det har blitt anslått at omtrent 40% av sopp-DNA i jord enten er forurensninger fra andre miljøer, ekstracellulære, eller kommer fra celler som ikke lenger er intakte, noe som forårsaker sekvenseringsmetoder med høy gjennomstrømning for å overvurdere sopprikdom med så mye som 55% 13. Kulturavhengig isolasjon kan lett bekrefte gjærartens identitet med den ekstra fordelen av å sikre ren kultur som skal brukes i nedstrømsanalyser. Faktisk ble rene kulturer av 44 antatte nye gjærarter identifisert ved hjelp av denne jordisolasjonsprotokollen som tillot bruk av en rekke metoder for å studere deres taksonomiske og funksjonelle egenskaper i detalj14.

Protokollen nedenfor kan også brukes til å isolere muggsopp som finnes i jord, for eksempel A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk form med en bred, global fordeling i jord15. Det har blitt isolert fra mange kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøvetaking inkluderer vanligvis luft, organisk avfall (kompost, sagstøv, tulipanpæreavfall) og jord (landbruks-, hage- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen som forårsaker en rekke infeksjoner som samlet kalles aspergillose, som påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden16,20. Omtrent 300 000 mennesker over hele verden lider av invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige formen for aspergillose16. Avhengig av faktorer som pasientpopulasjonen, infeksjonsstedet og effekten av antifungal terapi, kan dødeligheten være så høy som 90%. I løpet av de siste tiårene har motstanden mot antifungal terapi økt, noe som krever global overvåkingsinnsats i både kliniske og miljømessige populasjoner for å spore disse resistensgenotypene 21,22,23. Gitt sin evne til å vokse ved temperaturer over 50 ° C, kan denne temperaturen utnyttes til å velge for A. fumigatus isolater fra jord ved hjelp av kulturavhengige metoder. Aspergillus fumigatus isolater genotypes vanligvis ved ni svært polymorfe korte tandem repeterende (STR) loci, vist å ha høy diskriminerende kraft mellom stammer24. Disse STR-genotypene kan sammenlignes med andre tidligere undersøkte populasjoner for å spore spredningen av A. fumigatus-genotyper, inkludert stoffresistensgener, rundt om i verden.

Nedenfor beskriver vi en protokoll for rask isolering av gjær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturavhengig måte. Avhengig av mengden jord oppnådd per prøve, kan jordprøvene deles mellom de to protokollene. Sammenlignet med lignende metoder som isolerer gjær og A. fumigatus fra jord, bruker denne protokollen 10 ganger mindre jord per oppnådd isolat. Studier som forsøker å isolere A. fumigatus fra jord krever mellom 1 og 2 g jord per isolat, mens denne protokollen krever bare 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokollen benytter mindre plast og beholdere som letter den høye gjennomstrømningsdesignen. Derfor kan et større antall prøver behandles med mindre plass til utstyr som inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fullt ut for å oppnå isolater på så lite som 7 dager. Denne protokollen er optimalisert for å tillate behandling av opptil 150-200 prøver per dag per person.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Eventuelle trinn ved bruk av internasjonale jordprøver og / eller A. fumigatussporer og mycelia krever arbeid i et biosikkerhetsskap for nivå 2 organismer (BSCII).

1. Isolering av gjær fra jord

  1. Fremstilling av antibakterielle og antifungale løsninger
    1. Suspend kloramfenikolpulver i 70% etanol for å fremstille en 50 g / L stamløsning. Steriliser ved sprøytefiltrering og oppbevar ved 4 °C.
      MERK: Dette antibiotikumet vil forhindre vekst av de fleste bakterier under jordgjærisolasjon. Siden kloramfenikolresistente bakterier fortsatt kan vokse, må kolonimorfologi tas nøye i betraktning når gjær skilles fra bakterier. Ytterligere antibiotika kan tilsettes media ved arbeid med jord som mistenkes å inneholde antibiotikaresistente bakteriestammer. Bakteriell forurensning i kloramfenikol-supplerte medier var ikke et problem som oppstod ved isolering av gjær fra miljøjord.
    2. Suspender benomylpulver i DMSO for å tilberede en 5 g/l stamløsning. Steriliser ved sprøytefiltrering og oppbevar ved 4 °C.
      MERK: Dette selektive antifungale stoffet forhindrer veksten av de fleste filamentøse sopp uten å påvirke gjærveksten under jordgjærisolasjon26,27.
  2. Forberedelse av kulturmedier og sterilt utstyr
    1. For å forberede YEPD (Gjærekstrakt-Peptone-Dextrose) kjøttkraft, tilsett 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton og 20 g dekstrose til 1 liter dobbeltdestillert vann. Rør til godt blandet og autoklav i 40 min ved 121 °C. Oppbevares i romtemperatur til bruk.
    2. YEPD fast agarmedium
      1. Bland 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 20 g dekstrose og 20 g agar i 1 liter vann. Rør godt for å blande og autoklav i 40 min ved 121 °C.
      2. Når det er tilstrekkelig avkjølt, tilsett 1 ml kloramfenikol og benomyl fra stamløsninger for å bringe de endelige konsentrasjonene av de to antimikrobielle stoffene til henholdsvis 50 mg / l og 5 mg / l.
      3. Bland godt ved omrøring og hell i 10 cm diameter Petri retter. La stå i romtemperatur over natten for å stille inn og oppbevare ved 4 °C til bruk.
        MERK: Fra 1 L YEPD kan ca. 40 plater helles.
    3. Steriliser tre plain-tipped applikatorpinner og gjenbrukbare cellespredere ved autoklavering og lagre ved romtemperatur.
  3. Inkubasjon av jord i flytende kjøttkraft
    1. Forbered et sett med sterile 13 ml kulturrør ved å merke dem med jordprøve-ID.
    2. Bruk en serologisk pipette til å tilsette 5 ml YEPD-buljong supplert med kloramfenikol og benomyl i hvert rør.
    3. Arbeid i en BSCII, overfør ~ 0,1 g jord til riktig kulturrør ved hjelp av en steril, tre vanlig tippet applikator.
      MERK: Bruk en ny applikator for hver jordprøve og kast umiddelbart etter bruk for å unngå krysskontaminering mellom prøvene.
    4. Cap røret sikkert til første stopp for å forhindre søl, men fortsatt tillate luftutveksling under inkubasjon. Inkuber kulturrørene i en rulletrommel i 24 timer ved en temperatur som anses optimal for å maksimere gjærveksten.
      MERK: Inkubasjonstemperaturen bør bestemmes basert på den gjennomsnittlige årlige temperaturen i jordprøvenes opprinnelsesland. Ved isolering av jordgjær fra Island ble for eksempel kulturrørene inkubert ved 14 °C, mens jordsmonn fra Saudi-Arabia ble ruget ved 30 °C. På grunn av langsommere gjærvekst ved lavere temperaturer, kan inkubasjonstiden måtte forlenges i opptil 72 timer.
  4. Overfør supernatanten til det faste mediet.
    1. Bruk settet med YEPD + kloramfenikol + benomylagarplater fremstilt i trinn 1.2, og merk dem med jordprøve-ID.
    2. Fjern kulturrørene som ble tilberedt i trinn 1.3 fra rulletrommelen. Arbeide i en BSCII, kort virvel røret for å trekke jordpartikler og celler som kan ha avgjort på bunnen tilbake i suspensjon.
    3. Bruk en mikropipette til å overføre 100 μL av supernatanten til en plate. Bruk en steril, gjenbrukbar cellespreder for å spre væsken grundig og jevnt over agaroverflaten.
      MERK: Arbeid i sett med 10 prøver kan øke hastigheten på denne prosessen betydelig. Pipetter supernatanten på 10 plater først og utfør deretter spredning. Bruk en fersk spreder for hver prøve for å unngå krysskontaminering mellom prøvene.
    4. Stable platene i plastposer, forsegle og ruge opp ned i 2-3 dager ved samme temperatur som tidligere ble brukt til flytende buljonginkubasjon til mikrobiell vekst er synlig.
  5. Påvisning av gjær og striper for enkeltkolonier
    1. Etter å ha gitt tilstrekkelig inkubasjonstid (vanligvis 2-3 dager, men kan ta lengre tid ved lavere temperaturer), inspiser platene i en BSCII for gjærvekst. Se etter kremete, runde, matte gjær som lett skiller seg fra bakterie- og muggkolonier.
      MERK: Noen gjær produserer fargede pigmenter og kan virke svart / brun, gul eller rød, men deres generelle kolonitekstur og form vil være lik ikke-pigmenterte gjær.
    2. Velg en gjærlignende koloni fra hver plate for videre behandling.
      MERK: Hvis mer enn én type morfologi observeres på en enkelt plate, velg en representativ koloni for hver morfologiske type.
    3. Ved hjelp av sterile applikatorpinner i tre overføres hver utvalgte koloni til en fersk YEPD + kloramfenikol + benomylplate og strek for enkeltkolonier. Utfør tre separate striper.
      1. Strekk frem og tilbake over en tredjedel av platen ved hjelp av en applikatorpinne. Begynn den andre og tredje streken ved å strekke applikatoren over den foregående streken en gang. Bruk en ny applikatorpinne for hver strek.
        MERK: Bruk en plate per isolat. Kast applikatorer umiddelbart etter bruk for å unngå krysskontaminering mellom prøvene.
    4. Stable platene i plastposer, forsegle og ruge opp ned i 2-3 dager ved samme temperatur som tidligere til enkeltkolonier blir synlige.
  6. Identifisering av gjærarter via ITS-sekvensering
    1. Velg en godt separert, enkeltkoloni per jordisolat og subkultur på en fersk YEPD + kloramfenikol + benomylplate for å få flere celler. Inkuber i 2-3 dager ved samme temperatur som tidligere.
    2. Høst de nydyrkede cellene og suspender dem i -80 ° C fryserrør som inneholder 1 ml sterilisert 30% glyserol i dobbeltdestillert vann for å lage cellesuspensjoner. Vedlikehold disse hjulopphengene ved -80 °C som lagerløsninger.
    3. Bruk ferske celler til å utføre koloni-PCR (polymerasekjedereaksjon) med primere ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') og ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') for å forsterke soppstrekkodingsgenet, ITS9. Bruk følgende termocyklide forhold: et innledende denatureringstrinn ved 95 °C i 10 minutter etterfulgt av 35 sykluser på (i) 95 °C i 30 s, (ii) 55 °C i 30 s og (iii) 72 °C i 1 min.
      MERK: Colony PCR har en høy suksessrate og en raskere behandlingstid enn DNA-ekstraksjon etterfulgt av PCR.
    4. Hvis koloni-PCR gjentatte ganger mislykkes for en stamme, ekstraher DNA ved hjelp av den valgte protokollen og utfør ITS PCR ved hjelp av ekstrahert genomisk DNA som mal (bruk samme termocyklide forhold som ovenfor).
      MERK: En relativt billig kloroformbasert DNA-ekstraksjon anbefales28.
    5. Utfør Sanger-sekvensering for å bestemme DNA-sekvensen til det forsterkede ITS-området for hver stamme.
    6. Sammenlign den oppnådde ITS-sekvensen av gjærstammene med sekvenser deponert i offentlige databaser som NCBI GenBank og UNITE for å etablere artsidentitet.

2. Isolering av Aspergillus fumigatus fra jord

  1. Forbered 1 ml steril Sabouraud dextrose buljong (SDB) supplert med antibiotika kloramfenikol per jordprøve.
    1. Tilsett 10 g pepton og 20 g dekstrose til 1 liter destillert vann. Autoklav ved 121 °C i 40 min.
    2. La SDB avkjøles til ~50 °C, tilsett 1 ml 50 g/L kloramfenikol for å bringe konsentrasjonen til 50 mg/l.
      MERK: Kloramfenikol fremstilles på samme måte som beskrevet ovenfor for gjærisolering. Bortsett fra å hemme bakterievekst, forhindrer kloramfenikol også produksjon av gass fra bakterier som vil føre til at rørene åpnes under inkubasjonstrinnet beskrevet i trinn 2.2.
    3. Aseptisk aliquot 1 ml SDB i et 1,5 ml mikrosentrifugerør per jordprøve ved hjelp av en mekanisk pipette.
  2. Tilsett jord til 1,5 ml mikrosentrifugerrør.
    1. Legg benkbelegg eller absorberende polstring inne i en BSCII for å hjelpe til med avhending av sølt jord.
    2. Bruk autoklaverte applikatorpinner til å overføre ca. 0,1 g jord til et mikrosentrifugerrør på 1,5 ml som inneholder 1 ml SBD. Lukk røret og virvelen. Inkuber den suspenderte jorda ved 50 °C i 3 dager.
      MERK: Risting under inkubasjon er ikke nødvendig.
  3. Mycelial høsting av jord-inokulert kjøttkraft
    1. Forbered malt ekstrakt agar (MEA) plater.
      1. Per liter MEA: Tilsett 20 g maltekstrakt, 20 g dekstrose, 6 g pepton og 15 g agar til 1 liter destillert vann. Autoklav ved 121 °C i 40 min.
      2. La MEA avkjøles til ~ 50 ° C, tilsett deretter 1 ml 50 g / L kloramfenikol for å bringe til en endelig konsentrasjon på 50 mg / L.
    2. Overfør mycelia fra jordinokulert kjøttkraft på MEA-plater.
      1. Identifiser jordinokulum som har synlig mycelvekst ved SDB til luftgrensen.
      2. Bruk steriliserte tre plain-tipped applikatorpinner for å overføre mycelia til midten av en MEA-plate. Inkuber MEA-platene ved 37 °C i 3 dager.
  4. Utvalg av mycelia med A. fumigatus morfologiske egenskaper.
    1. Identifiser muggkolonier som har karakteristiske A. fumigatus morfologiske egenskaper (grønn semsket skinn som vekst).
    2. Arbeid i en BSCII, bruk steriliserte tre plain-tipped applikatorpinner eller en inokulasjonssløyfe for å høste conidia / mycelia ved å skrape overflaten en gang. Overfør sporene/mycelia til midten av en MEA-plate ved å strekke seg på agaren for enkeltkolonier. Rug ved 37 °C i 2 dager.
      MERK: Siden flere A. fumigatus-stammer og/eller andre sopper kan være tilstede på platen, er det viktig å strekke seg for enkeltkolonier. Enkeltkolonistripeprotokollen i trinn 1.5.3 i gjærisolasjonsprotokollen kan brukes.
    3. Ved hjelp av en steril applikatorpinne eller inokulasjonssløyfe, subkultur en enkelt koloni generert i trinn 2.4.1.2 på MEA ved å strekke kolonien en gang. Spred de høstede sporene inn i midten av platen. Rug ved 37 °C i 2 dager.
  5. Høsting av A. fumigatus sporer/mycelia for lagring av kultur
    1. Forbered en steril 30% glyseroloppløsning (for en 100 ml løsning, tilsett 30 ml 100% glyserol blandet med 70 ml dobbeltdestillert vann, sterilisert ved 121 ° C i 40 minutter).
    2. Arbeid i en BSCII, bruk en p1000 pipette til å aspirere 1 ml av 30% glyseroloppløsningen. Dispenser 1 ml glyseroloppløsning på A. fumigatus-kolonien for å høste sporer/mycelia.
      1. På grunn av hydrofobisiteten til A. fumigatus sporer/mycelia, bruk pipettespissen til å skrape et tett sporulert område av platen.
        MERK: Når glyserol dispenseres i riper, vil glyserol holde seg til ripeområdet i stedet for å rulle over agaren.
      2. Dispenser glyserol sakte på riperområdet for å løsne sporene og suspendere dem i glyseroloppløsningen.
      3. Når den er helt dispensert, tipper du platen lett og aspirerer glyserolspore/mycelia-suspensjonen.
        MERK: Omtrent 750 til 800 μL vil bli aspirert.
      4. Overfør aspiratet til et sterilt fryserør og oppbevar ved -80 °C. Opprett om nødvendig arbeidslager ved å gjenta trinn 2.5.2.1 til 2.5.2.4.
  6. Fenotypisk identifikasjon av A. fumigatus stammer
    1. Bruk sporelageret opprettet fra trinn 2.5.2, og lag en 100x fortynning i vann.
      1. Aspirer 10 μL av mycel- og sporebestandene og dispenser i 990 μL vann. Vortex suspensjonen.
    2. Dispenser 10 μL av den fortynnede spore suspensjonen på en standard mikroskop lysbilde.
    3. VALGFRITT: Beis mycel- og sporesuspensjonen med metylenblått.
      1. For å flekke med metylenblått, fest konidiene og konidioforene til lysbildet ved å føre lysbildet over en Bunsen-brenner til det er tørt.
      2. Påfør metylenblå i 1-2 minutter og vask av med vann.
      3. Tørk lysbildet med blottingpapir.
    4. Ved hjelp av et sammensatt mikroskop ved 400x forstørrelse, se suspensjonen og finn konidioforer. Sammenlign den observerte konidioformorfologien med A. fumigatus conidiophore morfologi.
  7. Molekylær identifikasjon av A. fumigatus stammer
    1. Ekstraher DNA fra hvert isolat etter vanlige sopp-DNA-ekstraksjonsprotokoller.
    2. Ved å bruke primere som er spesifikke for Aspergillus-β-tubulin-gener (β-tub1 og β-tub4), kjør PCR og oppnå sekvensen for de forsterkede produktene, etter protokoller beskrevet av Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Sammenlign de oppnådde sekvensene med sekvenser deponert i offentlige databaser som NCBI GenBank ved hjelp av BLAST.
      2. Bekreft at belastningssekvensene samsvarer best med A. fumigatus-sekvenser i databasen.
    3. Alternativt til trinn 2.7.2, kjør en multipleks PCR-reaksjon rettet mot A. fumigatus parringstypene MAT1-1 og MAT1-229.
      1. Bruk følgende tre primersekvenser i multipleks PCR-reaksjonen: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5'-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3'; AFM3: 5'-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3'.
      2. Bruk følgende termosyklerparametere: 5 min ved 95 °C, 35 sykluser på 30 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 1 min ved 72 °C før en siste 5 min ved 72 °C.
      3. Kjør gelelektroforese for å identifisere produktene; se etter 834 bp MAT-1 eller 438 bp MAT1-2. Bruk A. fumigatus stammer som har bekreftet parring type forsterkning som positive og negative kontroller.
  8. Mikrosatellitt-genotyping av A. fumigatus-stammer gjennom fragmentanalyse
    MERK: Selv om trinnene nedenfor bredt dekker genotyping A. fumigatus ved ni mikrosatellitt (STR) loci, har bare noen få viktige hensyn blitt fremhevet. For detaljer om A. fumigatus STR genotyping, se De Valk et al.24,30.
    1. Forbered tre PCR multiplex master blandinger ved hjelp av STRAf primere tidligere beskrevet av De Valk et al.24.
      1. Fluorescerende etikett fremoverprimere for å bestemme fragmentstørrelsen gjennom kapillærelektroforese. Forsikre deg om at konsentrasjonen av fremoverprimerne er halvparten (0,5 μM) av de omvendte primerne (1 μM) i masterblandingen.
        NOTAT: For best resultat, bruk fluorescerende etiketter som har absorbansbølgelengder som samsvarer med de av den valgte fargestandarden som brukes under kapillærelektroforese
      2. Bruk varmstartpolymerase for best resultat.
      3. Bruk en DNA-konsentrasjon på 0,1 ng per reaksjon.
    2. Kjør multipleks-PCR for hver belastning ved hjelp av følgende PCR-program: 95 °C i 10 minutter, 40 sykluser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 60 s, etterfulgt av 72 °C i 10 minutter og et hold ved 4 °C.
    3. Se etter forsterkede produkter gjennom gelelektroforese.
    4. Fortynn produktene til ønsket nivå (vanligvis ~ 50x) som anbefalt av spesialister på fragmentanalyser og kjør kapillærelektroforese. Utfør tre løp for hver belastning, hvor hver kjøring dekker tre multipleksede reaksjoner med tre forskjellige fluorescerende sonder.
    5. For å bestemme riktig fragmentstørrelse for hver av de ni STR-lociene, bruk programvare som er i stand til fragmentanalyse.
      1. Hent rådata hentet fra kapillærelektroforese. Score fragmentstørrelsene basert på den største toppen ved hjelp av fragmentanalyseprogramvaren (f.eks. Osiris).
      2. Konverter fragmentstørrelsene til gjentatte tall for hver av de ni stedene. Bruk fragmentstørrelsene til repetisjonstallene til referansestammen Af293 som tidligere beskrevet av De Valk et al.24.
        MERK: Små variasjoner i fragmentstørrelser kan forekomme mellom forskjellige kapillære elektroforeseplattformer. Det er derfor viktig å inkludere en felles referansestamme (og en intern stige) med kjent fragmentstørrelse for hver av de ni stedene for genotypingsstammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjærisolasjon fra jord
Ovennevnte gjærisolasjonsprotokoll ble implementert for å dyrke gjær fra jordprøver som stammer fra 53 steder i ni land 9,12. Totalt ble 1.473 gjærstammer isolert fra 3.826 jordprøver. Gitt de forskjellige klimatiske forholdene i de ni opprinnelseslandene, ble den beste inkubasjonstemperaturen for hvert land bestemt basert på den gjennomsnittlige årlige temperaturen (tabell 1). Gitt den langsommere gjærveksten ved 14 ° C, ble jordprøver fra Island inkubert på en rulletrommel i ytterligere 48 timer (totalt 96-120 timer). Etter 2-3 dagers inkubasjon på fast medium var mikrobiell vekst synlig på plater for alle prøver (figur 1A). En tilfeldig utvalgt koloni for hver gjærmorfologi som var tilstede på en tallerken ble stripet for enkeltkolonier på ferske plater (figur 1B).

Graden av vellykket gjærisolering varierte mellom landene (tabell 1). For eksempel ble 97 gjærstammer dyrket fra 562 saudiarabiske jordprøver (17,3%), mens 261 gjær ble dyrket fra 300 kanadiske jordprøver (87%). En sjeldenhetsanalyse bør utføres for å avgjøre om tilstrekkelig jordprøvetaking er utført for å oppnå nøyaktige estimater av det sanne gjærdiversiteten i samplede steder. Et eksempel på sjeldenhetsanalyse for hvert land ble preformert der Shannon diversity index ble brukt som et mål på jordgjærdiversitet (figur 2). De resulterende sjeldenhetskurvene nærmet seg metningsasymptoten, noe som indikerer at ytterligere prøvetaking sannsynligvis ikke hadde gitt mer gjærdiversitet.

Sekvensering av ITS-regionen viste at de 1,473 gjærisolatene kan kategoriseres i 134 forskjellige arter. Dette inkluderte 90 kjente arter og 44 potensielt nye arter. Vi brukte en blandet effektmodell for å identifisere prediktorer for globalt dyrkbart jordgjærdiversitet, som kvantifisert av Shannon mangfoldsindeks31. I denne modellen ble gjennomsnittlig årlig nedbør, gjennomsnittlig årstemperatur, høyde og avstand til ekvator av prøvetakingslokalitetene montert som faste effekter, mens prøvetakingsland ble satt som en tilfeldig effekt9. Denne modellen identifiserte gjennomsnittlig årlig nedbør for å være signifikant korrelert med Shannon diversity index (p = 0,012), mens det ikke ble funnet signifikante korrelasjoner mellom andre prediktorvariabler og Shannons mangfoldsindeks9.

For å sammenligne denne kulturbaserte protokollen med kulturuavhengige metoder, sammenlignet vi disse funnene med en tidligere studie av Tedersoo og kolleger som undersøkte globalt mangfold av jordsvampe ved hjelp av metagenomikk2. Tedersoo og kolleger utførte høy gjennomstrømningssekvensering av ITS-regionen på DNA direkte ekstrahert fra jordprøver fra 39 land, hvorav fire, nemlig Kamerun, Canada, Kina og New Zealand, også ble samplet i denne studien. Vi utførte BLAST-søk for å identifisere ITS-sekvenser tilstede i begge datasettene32, og fant at 26% av ITS-sekvensene hadde et signifikant treff (>98,41% nukleotididentitet) i metagenomikk-datasettet. Imidlertid matchet <3% en soppsekvens fra samme land, mens de resterende 23% matchet en soppsekvens funnet i et annet land9. Vi var mer vellykkede enn metagenomics-studien i å kommentere ITS-sekvensene med gjærartidentitet. Tedersoo og kolleger rapporterte totalt 50.589 soppoperative taksonomiske enheter (OTUer), med antall gjær-OTUer ikke kjent. Av disse sopp-OTUene ble 33 % bare kommentert som environmental_sequence (724, 1,4 %), uncultured_soil_fungus (2 405, 4,8 %), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1 407, 2,8 %) eller uncultured_fungus (11 898, 23,5 %).

Aspergillus fumigatus isolasjon fra jord
Etter 3 dagers jordinkubasjon ved 50 °C i 1 ml SDB i et mikrosentrifugerør, kan mycelia bli funnet voksende innenfor SDB, på SDB til luftgrensen og/eller på innsiden av veggene. Aspergillus fumigatus mycelia er vanligvis funnet voksende på SDB til luftgrensen, men kan også høstes fra like under SDB-overflaten. Etter dette trinnet overføres mycelia til MEA og dyrkes i 3 dager ved 37 °C. Mycelvekst på plater kan bare danne den grønne semskede morfologien som er typisk for A. fumigatus (figur 3A). Mer vanlig kan andre termotolerante former være tilstede i samme jord og vokse med A. fumigatus på samme plate eller av seg selv (figur3B-D). Aspergillus fumigatus isolasjonshastigheter kan variere mellom geografiske steder, i likhet med det som er funnet for jordgjær. For eksempel, i Vancouver, Canada, ble 251 isolater oppnådd gjennom denne metoden fra 540 jordprøver (46,5%) (upubliserte resultater). I Kamerun ble det derimot høstet 51 A. fumigatus-isolater fra 495 jordprøver (10,3 %)33.

A. fumigatus conidiophore struktur kan ses og identifiseres ved hjelp av lysmikroskopi. Konidioforer har en ball på pinnemorfologi (figur 4). I tillegg er A. fumigatus conidiophores uniseriate, hvor phialides, festet til conidia-kjedene, er festet direkte til den sfæriske vesiklet. I andre Aspergillus-arter er konidioforer biseriate, hvor phialidene er forbundet med metulae festet til vesiklet.

Flere programmer er tilgjengelige for å utføre fragmentanalyse av rådata fra kapillærelektroforese, og konvertere kapillærelektroforesespekteret til fragmentstørrelser. Figur 5 er et kromatogram generert av programmet Osiris. De tre kanalene som visualiserer fragmentlengdene til A. fumigatus dinukleotid (2A, 2B og 2C), trinukleotid (3A, 3B og 3C) og tetranukleotid (4A, 4B og 4C) STR loci er vist. I tillegg vises også PCR-artefakter som oppstår hvis prøve-DNA-konsentrasjonen under PCR er for høy. De høyeste toppene i hver farge representerer fragmentstørrelsene til de tre STR-lociene i dette plottet.

Den genetiske variasjonen som er tilstede mellom A. fumigatus STR-genotyper kan visualiseres ved hjelp av R-pakken poppr. R-skriptet bruvo.msn skaper en parvis Bruvos genetiske avstandsmatrise mellom hvert par genotyper. Denne matrisen brukes deretter til å generere et minimum spennende nettverk (MSN). En MSN av høy kvalitet kan deretter genereres ved hjelp av R-skriptet plot_poppr_msn eller imsn (figur 6). En diskriminerende analyse av hovedkomponenter (DAPC) er en annen metode for å visualisere de genetiske forholdene mellom stammer (figur 7). R-skriptet dapc i R-pakken adegenet brukes til å utføre DAPC og kan brukes med kjente eller ukjente gruppe priors. Med ukjente gruppe priors bruker den K-means clustering for å identifisere det sannsynlige antall grupper av individer.

Figure 1
Figur 1: Gjærisolering fra jordprøver. (A) Mikrobiell vekst er synlig på fast agar etter 2-3 dagers inkubasjon. Gjærkolonier kan sees ispedd andre sopp-/bakteriekolonier. En representativ gjærkoloni for hver morfologisk type på en tallerken er valgt for å strekke seg for enkeltkolonier. (B) Tre striper utføres for å oppnå enkeltkolonier av gjærisolater. En plate ble brukt til å skaffe hvert jordisolat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sjeldenhetsanalyse av jordprøvetaking. I hvert av de ni samplede landene nærmer jordgjærdiversiteten, som kvantifisert av Shannon diversity index, metning etter hvert som antall jordprøver øker. Dette tallet ble tilpasset fra 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Aspergillus fumigatus morfologi på Sabouraud dextroseagar. (A) Grønn semsket skinnlignende A. fumigatus vekstmorfologi. (B-D) A. fumigatus vekst med andre termofile former tilstede i jordprøven. A. fumigatus conidiation er synlig redusert i B og D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Foto av en Aspergillus fumigatus conidiophore under et lysmikroskop. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Osiris utgang av ni mikrosatelitt loci fra en Aspergillus fumigatus stamme. Utgangene tilsvarer (A) dinukleotid (2A, 2B og 2C), (B) trinukleotid (3A, 3B og 3C) og (C) tetranukleotid (4A, 4B og 4C) STR loci. Forward primer 5 ' fluorescerende etiketter er: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Multipleksreaksjonsprodukter ble fortynnet 30 ganger før kapillærelektroforese. Fargestandarden LIZ600 ble brukt under kapillærelektroforese. Rådata ble analysert ved hjelp av toppanalyseprogramvaren Osiris som identifiserte potensielle topper mellom 60 og 400 bp. Flere PCR-artefakter er off-scale topper som forårsaker fluorescensblødning, hakkete topper og N-1 topper (C). Forkortelser: 6-FAM = 6-carboxyfluorescein; HEX = heksaklorfluorescein; STR = korte tandem repetisjoner; RFU = relative fluorescensenheter; BPS = basepar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Minimumsspennende nettverk som viser den genetiske sammenhengen mellom MLGs av A. fumigatus fra Island og Northwest Territories i Canada. Hver node representerer en MLG, hvor nodestørrelsen tilsvarer antall stammer for hver MLG. Noder som er mer genetisk like har mørkere og tykkere kanter, mens noder genetisk fjernt har lysere og tynnere kanter. Dette tallet ble tilpasset fra 34. Forkortelser: ISL = Island; NWT = Nordvestterritoriene i Canada; MLG = multilocus genotype. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Genetisk clustering ved hjelp av diskriminant analyse av hovedkomponenter (DAPC) på Island, NWT, Eurasisk, Nord-Amerika og Oceanian A. fumigatus populasjoner. Isolatene ble genotypet ved ni mikrosatellittlokier og klonkorrigert, totalt 1 703 unike multilokusgenotyper. Genotyper ble farget i henhold til geografisk opprinnelse. Dette tallet ble tilpasset fra 34. Forkortelser: DAPC = diskriminerende analyse av hovedkomponenter; NWT = Nordvestterritoriene; ISL = Island; CMR = Kamerun; CAN = Hamilton, Ontario, Canada; BEL = Belgia; FRA = Frankrike; DEU = Tyskland; IND = India; NLD = Nederland; NOR = Norge; NZL = Norge; ESP = Spania; CHE = Sveits; USA = Usa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Land Inkubasjon temperatur (° C) Jordprøver Gjær isolater Kjente arter/ Nye arter
Kamerun 30 493 110 10/9
Canada 23 300 261 34/12
Kina 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Frankrike 23 327 175 12/2
Island 14 316 211 11/0
New Zealand 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Saudi-Arabia 30 562 97 8/1
Total 3826 1473 90/44

Tabell 1: Jordgjærisolasjon fra ni land på seks kontinenter. Inkubasjonstemperaturen for jordprøver fra hvert land ble bestemt ut fra den gjennomsnittlige årstemperaturen. Resultatene som presenteres her er tilpasset fra 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen utviklet for isolering av gjær og A. fumigatus fra jord er en rask og effektiv metode for jordbehandling og soppisolering med høy gjennomstrømning. Protokollen krever bare en liten mengde jord (0,1-0,2 g) per prøve, slik at flere steder kan prøves med lignende innsats. Den raske behandlingstiden sikrer at resultatene kan oppnås innen en kort tidsramme og gir tid til feilsøking og gjentatte eksperimenter om nødvendig. Denne protokollen kan enkelt replikeres på tvers av mange laboratorieinnstillinger ved hjelp av standard mikrobiologi og celledyrkingsutstyr. Men når du isolerer gjær eller mugg fra internasjonal jord, er det nødvendig med ekstra forholdsregler. Alt ikke-engangs plastutstyr, som plastbrett og cellespredere, skal steriliseres ved nedsenking i 10% blekemiddel, etterfulgt av autoklavering. Den brukte benkefrakken skal forsegles i en plastpose og steriliseres i en autoklav før den kastes.

For å merke seg, kan antallet og identiteten til gjær isolert ved hjelp av protokollen ovenfor begrenses av inkuberingsforholdene og mediene som brukes. For eksempel kan 24 timers inkubasjon i rulletrommelen favorisere isoleringen av raskt voksende aerobe gjær over sakte voksende arter. I tillegg kan bruk av næringsrikt YEPD-medium for gjærisolering ha utelukket gjærarter med ulike næringsbehov og preferanser. Videre opplever de fleste steder som er samplet her sesongvariasjoner i temperatur og andre klimatiske forhold gjennom året. Hvis tid og ressurser tillater det, kan de samme jordprøvene behandles under en rekke forskjellige temperaturer for å tillate isolering av et bredere spekter av gjær som bor i disse jordene.

Mens kulturuavhengige metoder er avgjørende for å belyse store mønstre i miljømessig soppdiversitet, klarer de ikke å være tilstrekkelig informative for målrettede grupper av sopp som gjær. Bruken av kulturavhengig isolasjon tillot en omfattende undersøkelse av det globale jordgjærdiversiteten og dets prediktorer9. Mens metagenomikkstudien utført av Tedersoo og kolleger identifiserte globale prediktorer og mønstre i jordens soppdiversitet, kunne ikke i hvilken grad disse funnene gjelder spesielt for gjærdiversitet, belyses2. Tedersoo og kolleger identifiserte gjennomsnittlig årlig nedbør som en viktig klimatisk driver for jordens soppdiversitet over hele verden2. Denne studien fant en lignende sammenheng mellom gjennomsnittlig årlig nedbør og dyrkbar gjærdiversitet i globale jordarter, og fremhevet at kulturavhengige metoder kan utfylle og utvide funn av høy gjennomstrømningssekvenseringsmetoder9.

Tilsetningen av kloramfenikol er et viktig skritt i fremstillingen av både faste og flytende medier for å forhindre soppvekstinterferens av bakterier. Tilsetningen av kloramfenikol til flytende medier er avgjørende, da mangelen på antibiotika vil tillate bakteriene som er tilstede i jorda å gjære. Dette vil føre til produksjon av gasser som med makt vil åpne mikrosentrifugerør eller 13 ml kulturrør som brukes under jordinkubasjon i protokollen. Hvis bakteriell forurensning i kloramfenikol som inneholder agar / buljong er et problem, kan kloramfenikol erstattes eller suppleres med sterkere antibiotika. Ved isolering av A. fumigatus fra jord, kan SD-buljong erstattes med en Tween 20-løsning (0,2 M NaCl med 1% Tween 20) for å bidra til å suspendere den hydrofobe A. fumigatus conidia35,36. Etter suspensjon kan 100 μL belagt på SD-agar og inkuberes ved 50 °C.

Aspergillus fumigatus vokser raskt og sporulerer rikelig når den inkuberes alene på både SD-agar- og MEA-medier mellom 22 °C og 50 °C. Avhengig av hvilke andre termotolerante arter som finnes i jordprøven, kan imidlertid A. fumigatus vekst og sporulering hindres (figur 3A,D). I en slik situasjon kan det være nødvendig med en til flere subkultureringstrinn for å oppnå en ren koloni for etterfølgende høsting og karakterisering.

Fragmentanalysen av A. fumigatus-stammer i figur 5 ble utført ved hjelp av programmet Osiris. Flere PCR-artefakter har blitt fremhevet i figur 5C og er diskutert i detalj av De Valk et al.30. B-1 stammingstopper som har kortere repetisjonsverdier er forårsaket av strengglidning under syntesen av antisensestrengen av DNA-polymerasen. N-1 topper oppstår hvis DNA-konsentrasjonen er for høy under PCR. Den anbefalte DNA-konsentrasjonen er 0,1 ng som angitt i protokollen ovenfor. En annen artefakt er fargestoffblødning som kan avhjelpes ved hjelp av fluorescerende etiketter med ikke-overlappende absorpsjonsbølgelengder. For eksempel genererer fluorescerende etiketter 6-FAM, HEX og ATTO550, samt LIZ600-fargestandarden, forskjellige fragmenttopper (figur 5). Til slutt, for å forhindre off-scale topper, fortynn hver PCR-reaksjon (i dette tilfellet var det ~ 50x fortynning) før kapillærelektroforese. For ytterligere å redusere fluorescensen til de ubrukte fremoverprimerne i reaksjonsblandingen, halverer du fremoverprimeringskonsentrasjonene i forhold til omvendt primere når du lager masterblandingen.

Den høye gjennomstrømningen og konservative naturen til denne protokollen gir en relativt rask og enkel oppkjøp av mange gjær og mugg fra jord. Det er imidlertid to hovedbegrensninger knyttet til prøvetakingsmetoden. For det første ble de morfologiske egenskapene til gjærkolonier dyrket fra jord brukt til å velge for unike arter. Disse ble deretter subkulturert og brukt til artsidentifikasjon via ITS-sekvensering. Dette ble gjort for å maksimere representasjonen av gjærarter tilstede. Imidlertid kan gjærarter som delte lignende eller identiske morfologier til de valgte koloniene, mislykkes i å bli subkulturert. For det andre, under A. fumigatus isolasjon, da bare en individuell koloni er valgt per jordprøve, vil tilstedeværelsen av flere individer i jordprøven bli savnet. Dette kan føre til en underrepresentasjon av det sanne genetiske mangfoldet som finnes i prøvepopulasjonen, da unike genotyper som finnes i samme jordprøve ikke vil bli samlet inn. For å redusere dette problemet, i løpet av streken for enkeltkolonitrinn etter den første dyrkingen på faste medier, kan flere enkeltkolonier samles for å oppnå ytterligere genotyper. Det lille jordvolumet som brukes per prøve, bidrar til å minimere denne prøvetakingsbegrensningen sammenlignet med metoder som brukte større mengder jord per prøve.

Bruken av denne høye gjennomstrømningen og arbeidseffektive protokollen for isolering av gjær og mugg vil øke antall individer i jordpopulasjonen mens du bruker mindre innsats per prøve. Økningen i statistisk styrke vil gi et bedre bilde av dyrkbare gjærsamfunn i jorda og bidra til å karakterisere jordpopulasjoner av A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant nr. ALLRP 570780-2021) og McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

Biologi Gjær mangfold Aspergillus fumigatus ren kultur morphotyping DNA strekkoding mikrosatellitt genotyping
Isolering av dyrkbar gjær og mugg fra jord for å undersøke sopppopulasjonsstruktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter