Summary
Här beskriver vi en in vivo-avbildningsteknik med optisk koherenstomografi för att underlätta diagnos och kvantitativ mätning av retinopati hos möss.
Abstract
Optisk koherenstomografi (OCT) erbjuder en icke-invasiv metod för diagnos av retinopati. OCT-maskinen kan fånga retinala tvärsnittsbilder från vilka näthinnans tjocklek kan beräknas. Även om OCT används i stor utsträckning i klinisk praxis är dess tillämpning i grundforskning inte lika utbredd, särskilt hos små djur som möss. På grund av den lilla storleken på deras ögonbollar är det utmanande att genomföra fundus-avbildningsundersökningar hos möss. Därför krävs ett specialiserat retinalt bildsystem för att rymma OCT-avbildning på små djur. Denna artikel visar ett litet djurspecifikt system för ULT-undersökningsförfaranden och en detaljerad metod för bildanalys. Resultaten av retinal OCT-undersökning av knockoutmöss med mycket låg densitet lipoproteinreceptor (Vldlr) och C57BL / 6J-möss presenteras. OCT-bilderna av C57BL/6J-möss visade näthinnelager, medan de av Vldlr-knockoutmöss visade subretinal neovaskularisering och retinal gallring. Sammanfattningsvis skulle OCT-undersökning kunna underlätta icke-invasiv detektion och mätning av retinopati i musmodeller.
Introduction
Optisk koherenstomografi (OCT) är en avbildningsteknik som kan ge in vivo högupplöst och tvärsnittsavbildning för vävnad 1,2,3,4,5,6,7,8, särskilt för icke-invasiv undersökning i näthinnan 9,10,11,12 . Det kan också användas för att kvantifiera några viktiga biomarkörer, såsom retinal tjocklek och retinal nervfiberskikttjocklek. Principen för OCT är optisk koherensreflektometri, som erhåller tvärsnittsvävnadsinformation från koherensen av ljus som reflekteras från ett prov och omvandlar det till en grafisk eller digital form genom ett datorsystem7. OCT används ofta i oftalmologiska kliniker som ett viktigt verktyg för diagnos, uppföljning och hantering för patienter med näthinnesjukdomar. Det kan också ge insikt i patogenesen av näthinnesjukdomar.
Förutom kliniska tillämpningar har OCT också använts i djurstudier. Även om patologi är guldstandarden för morfologisk karakterisering, har OCT fördelen med icke-invasiv in vivo-avbildning och longitudinell uppföljning. Dessutom har det visat sig att OCT är väl korrelerat med histopatologi i retinopati djurmodeller 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Musen är det vanligaste djuret i biomedicinska studier. Men dess små ögonbollar utgör en teknisk utmaning för att genomföra OCT-avbildning hos möss.
Jämfört med den OCT som först användes för retinal avbildning hos möss21,22, har OCT hos små djur nu optimerats med avseende på hårdvaru- och mjukvarusystem. Till exempel minskar OCT, i kombination med trackern, signifikant signal-brusförhållandet; OCT-programvarusystemuppgraderingar gör att fler retinala lager kan detekteras automatiskt; och den integrerade DLP-beamern hjälper till att minska rörelseartefakterna.
Lipoproteinreceptor med mycket låg densitet (Vldlr) är ett transmembranprotein i endotelceller. Det uttrycks på retinala vaskulära endotelceller, retinala pigmentepitelceller och runt det yttre begränsande membranet23,24. Subretinal neovaskularisering är fenotypen för Vldlr knockout-möss23. Därför används Vldlr knockoutmöss för att undersöka patogenesen och potentiell behandling av subretinal neovaskularisering. Denna artikel visar tillämpningen av OCT-avbildning för att upptäcka retinala lesioner hos Vldlr knockout-möss, i hopp om att ge någon teknisk referens för retinopatiforskning i smådjursmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verksamheten utfördes efter uttalandet om användning av djur i oftalmisk och synforskning från Association for Research in Vision and Ophthalmology. Den experimentella designen godkändes av den institutionella djuretiska kommittén (medicinsk etikkommitté för JSIEC, EC 20171213(4) -P01). Två månader gamla C57BL/6J-möss och Vldlr-knockoutmöss användes i denna studie. Det fanns 7 möss i varje grupp, som alla var kvinnliga och vägde 20 g till 24 g.
1. Experimentella förhållanden
- Tilldela mössen till två grupper: en experimentell grupp bestående av Vldlr knockout-möss och en kontrollgrupp bestående av C57BL/6J-möss.
- Mata mössen med mat och vatten konventionellt.
- Höj mössen i djurlaboratoriet under stabila förhållanden med rumstemperatur (22 °C), luftfuktighet (50-60%), ljus-mörk cykel (12 h-12 h) och rumsljusintensitet (350-400 lux).
- Förbered experimentutrustningen: optisk koherenstomografi med konfokal skanningslaseroftalmoskop (cSLO) för små djur (figur 1A).
- Bered allt material som krävs för experimentet (figur 1B) och väg mössen (figur 1C).
2. Informationsregister
- Registrera informationen: grupp, kod, födelsedatum, ålder, kön, vikt och bedövningsdosering.
3. Instrumentstart och testning
- Slå på datorn och starta programvaran.
- Klicka på knappen Testprogram för att slutföra testprogrammet.
- Slå på termostaten och förvärm den till en temperatur på 37 °C.
- Starta OCT-modulproceduren efter programtestningen.
- Skapa ett nytt ämne och fyll i musinformationen.
- Förvärm den elektriska filten och täck den med kirurgiska handdukar.
4. Anestesi
- Använd frystorkat bedövningspulver innehållande Tiletamin och Zolazepam för att framställa bedövningsblandningen.
OBS: Följ lokala djuretiska kommittés rekommendationer för val, dosering och administreringsväg för anestesi. Bedöva djuret med ett bedövningsmedel som ger oändlighet och förlust av smärtuppfattning i minst 1 timme, varefter djuret återhämtar sig snabbt. Doseringen bör baseras på längden på experimenttiden, djurvikt och andra faktorer. - Bedöva djuret med hjälp av den beredda bedövningsblandningen. Se till att hålla djuret varmt under hela proceduren tills återhämtning.
5. Applicering av mydriatiska droppar
- Uppnå manuell fasthållning av musen genom scruff, låt ögongloben skjuta ut något och rotera mushuvudet med ett öga uppåt.
- Applicera de mydriatiska dropparna för att vidga pupillerna (figur 2A).
- Kontrollera om pupillutvidgningen har skett efter 10 min.
6. Placering av musen
- Placera en mus på en elektrisk filtplattform.
- Täck båda ögonen med medicinsk natriumhyaluronatgel (figur 2B).
- Skruva fast en 60 D dubbel sfärisk lins (förinställd lins) på cSLO-enheten (figur 1A-5, 6).
- Placera en 100 D-kontaktlins på mushornhinnan med den konkava sidan vidrörande natriumhyaluronatgelén på hornhinnans yta (figur 2C, D och figur 3A-II).
- Placera musen på den lilla djurplattformen med konstant temperatur och håll ögat 1-2 mm från linsen på cSLO-enheten (bild 3A).
- Justera kontaktlinsens vinkel med pincett för att hålla pupillen i mitten av linsen.
- Finjustera justeringarna av huvudet så att ögat vetter rakt fram.
7. Konfokal skanningslaseroftalmoskop (cSLO)
- Klicka på OCT-knappen , välj musmodulen och starta cSLO-programmet (bild 4B).
- Välj IR-läge (ljuskälla: rött ljus) och justera parametern (intervall: 2047, figur 4D).
- Välj det öga som ska undersökas (höger öga: figur 4C-1; vänster öga: figur 4C-2).
- Kontrollera spaken och flytta den förinställda linsen långsamt mot kontaktlinsen.
- Justera diopterns värde tills den bakre polavbildningen är klar (figur 4E).
- Gör ytterligare justeringar för att justera bilden av den retinala bakre polen och centrera den vid det optiska nervhuvudet.
8. Optisk koherenstomografi (ULT)
- Starta OCT-programmet (figur 4G).
- Klicka på förloppsindikatorn uppåt och nedåt tills OCT-bilden visas (bild 4H).
- Justera parametrar: Intervall Min (Figur 4I) = 0-20, Intervall Max (Figur 4J) = 40-60.
- Justera det förinställda linsavståndet och positionsriktningen tills en idealisk OCT-bild erhålls.
- Välj skanningsposition genom att flytta standardlinjen i cSLO (bild 4M).
- Börja skanna från synnervhuvudet.
- Samla bilder i samma ordning för varje öga: horisontell linje: optiskt nervhuvud → överlägset → sämre; vertikal linje: optisk nervhuvud → nasal → temporal.
- Samla bilder från fyra håll.
- Klicka på Medelvärde för att lägga över cSLO- och OCT-bildsignalerna (bild 4F och figur 4O).
- Klicka på skottknappen för att hämta SLO-OCT-bilden (bild 4P).
- Spara och exportera alla bilder (bild 4Q, R).
9. Experimentets slut (efter ULT-undersökningen)
- Placera musen på den elektriska filten för att hålla den varm tills den vaknar.
OBS: Musen bör övervakas tills den återfår tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Postoperativ exponering för starkt ljus bör minimeras. - Ta bort 100 D-kontaktlinsen.
- Applicera levofloxacin ögongel för att skydda hornhinnan.
- Placera tillbaka musen i buret när den vaknar.
OBS: Se till att den undersökta musen inte returneras till sällskap med andra möss förrän den är helt återställd. - Stäng av programvaran och stäng av datorn.
- Rengör 100 D-kontaktlinsen med vatten; torka linsen.
- Rengör och desinficera miljön.
10. Bildanalys
- Jämför OCT-bilderna av Vldlr knockout-möss med C57BL/6J-möss.
- Observera flera positioner: vertikala och horisontella skanningar som passerar genom den optiska papillen; överlägsna, underlägsna, nasala och tidsmässiga skanningar; och onormala reflektionsplatsskanningar.
- Observera tjockleken, formen, skiktningen och onormala reflektionsskador på näthinnan i varje bild, liksom glasögongränssnittet i näthinnan och glaskroppen.
- Registrera platser, egenskaper och antal skador.
11. Retinal stratifiering korrigering
- Klicka på Ladda undersökning i OCT-gränssnittet (bild 5A).
- Ropa ut OCT-bilderna av en mus från ett popup-fönster.
- Välj bilder: OCT-bild som skannar genom den optiska papillen, horisontellt eller vertikalt.
- Dubbelklicka på bilden i mediebehållaren för att visa den på skärmen (bild 5C).
- Klicka på Lagerdetektering för att slutföra automatisk skiktning på näthinnan (figur 5D).
- Välj skiljelinjerna på båda sidor av lagret som är förberett för analys (figur 6D-10).
- Välj en separat skiljelinje (bild 6B-6) och klicka på Redigera lager (bild 6A-1) för att aktivera linjen när en röd cirkel visas (bild 6B-7).
- Justera avståndet (figur 6A-4, t.ex. 50) och gränsområdet (figur 6A-5, t.ex. 50).
- Ändra skiljelinjen genom att flytta den röda cirkeln (jämför den gröna skiljelinjen i figur 6B och figur 6C; Figur 6C visar det modifierade resultatet).
12. Retinal lamineringstjocklek
- Klicka på knappen Mätmarkör (bild 6D-9).
- Välj skiljelinjen för det lager som ska analyseras (t.ex. i det yttre kärnskiktet, välj den 4: e och 5:e skiljelinjen i listan) för att visa gränsen för lagret på OCT-bilden (figur 6D-10).
- Välj Anslut med lager (bild 6D-11) och Håll kontakten när du är på språng (bild 6D-12).
- Välj det område som ska visa resultaten (den valda kolumnen är färgad, figur 6D-13).
- Klicka på den position som ska analyseras på OCT-bilden för att få mätlinjen att visas (vinkelrätt mot den horisontella axeln och överensstämmer med färgen på det resulterande området) (figur 6D-14).
- Klicka på nästa kolumn för nästa mätning och visa tidigare data (figur 6E-15).
- Läs av Vert-värdet (tjockleken på den uppmätta positionen) i raden Längd i μm (vävnad) (figur 6E, röd rektangel).
- Klicka på Ta bort markör (bild 6E-16) och Ny markör (bild 6E-17) för att testa igen så att resultaten täcker originaldata (om ommätning är nödvändig).
- Tryck på Skriv ut Scr på tangentbordet för att spara skärmbilder, eller klicka på Spara undersökning för att spara direkt (bild 5H).
- Mata in data i ett kalkylblad eller statistisk programvara för statistisk analys.
13. Mätning av full retinal tjocklek
- Välj linje 1 (ILM, inre begränsande membran, figur 7B) och linje 7 (OS-RPE, OS: yttre fotoreceptorsegment; RPE: retinal pigmentepitelskikt, figur 7C) i listan i det övre högra hörnet.
OBS: Den fulla retinala tjockleken betyder tjockleken på retinal neurepitheliumskiktet, vilket är näthinnan mellan ILM och OS-RPE på OCT). - Mät näthinnans tjocklek på båda sidor av den optiska papillen med ett visst intervall.
- Till exempel: från utseendet på retinalstrukturen vid kanten av den optiska papillen, mät 4 värden med 200 μm avstånd mellan den horisontella linjalen (Figur 7G, H).
- Registrera alla uppmätta värden i ett kalkylblad.
- Använd flera t-tester (en per rad) för att jämföra de uppmätta värdena för varje motsvarande position i båda grupperna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tack vare de högupplösta skanningarna av OCT kan lagren i musens näthinna observeras och onormala reflektioner och deras exakta platser kan identifieras. De retinala OCT-bilderna av Vldlr knockout-möss och C57BL/6J-möss jämfördes i denna studie. OCT-bilderna av alla C57BL/6J-möss visade olika näthinneskikt med olika reflektivitet, och avgränsningen var tydlig (figur 8D). Däremot visade alla Vldlr knockout-möss onormala, hyperreflekterande lesioner på OCT-bilderna (figur 8B).
Ofullständig glaskroppsavlossning (PVD) hos Vldlr knockoutmöss
OCT-resultaten visade några mellersta reflekterande band på näthinneytorna hos Vldlr-knockoutmöss (figur 8B, röda pilar). Dessa mellersta reflekterande band fäst vid näthinnekärlet (figur 8B, grön pil), motsvarande cSLO-bilden (figur 8A, grön pil). Dessa egenskaper överensstämmer med ULT-egenskaperna hos ofullständig glaskroppsavlossning.
Subretinal neovaskularisering hos Vldlr knockout-möss
Resultaten visade att subretinal neovaskularisering hade två utvecklingslägen hos Vldlr-knockoutmössen .
Med involvering av det yttre kärnskiktet
En hyperreflekterande lesion, med en bottom-down triangulär form på OCT-bilden, uppträdde på subretinalutrymmet och spred sig till det yttre kärnskiktet. Lesionen bröt inte igenom det yttre plexiformskiktet (figur 8B, vit pil).
ULT-utseendet för denna typ av subretinal neovaskularisering överensstämde med de patologiska fynden som visas i figur 9A. Den patologiska sektionen visade att neovaskularisering (figur 9A, tjock grön pil) bröt igenom RPE, fotoreceptorns inre / yttre segment (IS / OS) och det yttre begränsande membranet (ELM). Det invaderade det yttre kärnskiktet (ONL) men bröt inte igenom det yttre plexiformskiktet (OPL).
Utan involvering av det yttre kärnskiktet
Ett band av hyperreflekterande lesion uppträdde på OCT-bilden, som var belägen vid det subretinala utrymmet (figur 8B, gul pil). cSLO-bilden visade motsvarande plats (figur 8A, gul pil). De ytterligare skanningarna av näthinnan runt denna plats (figur 8A, gul pil) visade samma resultat.
I överensstämmelse med lesionen (figur 10A, tjock blå pil) i den patologiska sektionen bröt denna subretinala neovaskularisering inte igenom ELM (figur 10A, tunn gul pil) utan involverade delvis fotoreceptorn IS / OS.
Retinal tjocklek resultat
Näthinnetjockleken hos alla mösss högra öga erhölls genom att använda den automatiska stratifierings- och tjockleksmätningsfunktionen hos OCT. Näthinnetjockleken hos Vldlr knockoutmöss (200,94 ± 14,64 μm) var signifikant lägre än för C57BL/6J-möss (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-test, 7 högra ögon/grupp). Jämförelsen av retinal tjocklek i de fyra riktningarna (temporal, nasal, överlägsen och underlägsen) av den bakre polären mellan de två grupperna visas i figur 11.
Figur 1: Beredning av försöksmaterial och djur. (A) Utrustning: 1. cSLO / ULT-enhet för näthinneavbildning av små djur, 2. dator och bildskärm, 3. Liten djurplattform med konstant temperatur, 4. termostat, 5. Förinställd lins, 6. installation av den förinställda linsen. B) Läkemedel och små föremål: I. povidon-jod, II. mikrospruta, III. bedövningsblandningslösning, IV. timer, V. mydriatiska ögondroppar, VI. pincett, VII. medicinsk natriumhyaluronatgel, VIII. medicinsk bomullspinne, IX. antibiotisk ögonsalva, X. 100 D kontaktlins (två). (C) Viktmätning på en digital balans. Förkortningar: cSLO = konfokal skanningslaser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förberedelse före undersökning av möss från ULT . (A) Mydriasis ögondroppsapplikation, (B) natriumhyaluronatgelbeläggning på hornhinnan, (C, D) placering av en 100 D-kontaktlins, med konkav yta som kommer i kontakt med hornhinnan. Förkortning: OCT = optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förfaranden för undersökning av ULT . (A) Placering av musens position, I. förinställd lins, II. kontaktlins, III. Liten djurplattform med konstant temperatur. B) Drift av cSLO/ULT-maskinen, IV. manöverspak, V. tiltspaken, VI. cSLO-enhet. Förkortningar: cSLO = konfokal skanningslaser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: OCT-avbildningsprocess. Svar: Mätläge , B. Startlassr för IR-lasern, C. ögonval (C-1-OD; C-2-OS), D. intervall av IR-laser, E. dioptern, F. överlagring av cSLO-bilden, G. OCT scanning start/stopp laserknapp H. referens till OCT-bild, I. Intervall Min: 0-20, J. Räckvidd Max: 50-60, K. bildens signalintensitet, L. skanningsriktning (t.ex. vertikal skanning), M. skanningsposition vald genom att flytta den gröna referenslinjen (t.ex. vertikal skanning genom optisk papill), N. realtidsvisning av OCT-bilden, O. överlägg av OCT-bilden, P. Skott: bildförvärv, Q. SLO-OKT-bilder som har förvärvats, R. Spara undersökning: spara undersökningsresultatet. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: cSLO = konfokal skanningslaser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi; IR = infraröd; OD = höger öga; OS = vänster öga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Automatiskt retinaltamineringsgränssnitt på OCT-systemet . A. Knappen Ladda undersökning, B. Mediebehållare, som visar alla OCT-bilder, C. OCT-bild som väljs för analys, D. Lagerdetekteringsknapp för automatisk retinal skiktning, E. delningslinjelista, F. automatisk delaminering på näthinnan, G. Knappen Redigera lager för skiktad korrigering, H. Spara undersökning för att spara resultaten. Skalstänger = 200 μm. Förkortning: OCT = optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Skiktad korrigering (A-C) och tjockleksmätning (D-E). (A) Redigeringsaktiveringsgränssnitt i lager: 1. Knappen Redigera lager, 2. delningslinjelista (t.ex. att markera alla rader), 3. aktiverade skiljelinjer, 4. Justering av avstånd, 5. Justering av gränsintervall. (B) Aktivering av en skiljelinje (t.ex. rad 3 i A), 6. linje 3, linjen mellan det inre plexiformskiktet och det inre kärnskiktet, 7. ett exempel på skiktningsfel. (C) Ändring av skiktningsfel, 8. den röda cirkeln för modifiering. (D) Ett exempel på mätning av retinal lamellär tjocklek, 9. Knappen Mät markör, 10. skiljelinjer för det yttre kärnskiktet, 11. Anslut med lager (mätningen kommer att ansluta till skiktet enligt skiljelinjerna), 12. Håll kontakten när du flyttar (mätpositionen är där det manuella klicket stannar), 13. platsen för resultatvisningen, 14. Mätlinjen (vinkelrätt mot den horisontella axeln). (E) Förvärv av mätresultat, 15. mätresultaten (röd rektangel: Vertvärdet är tjockleksresultatet), 16. Knappen Ta bort markör för borttagning av mätposter, 17. Ny Marker-knapp för ommätning (det nya resultatet skriver över den ursprungliga posten). Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Mätning av full retinal tjocklek. A. Mät markörknapp, B. rad 1 (ILM) och C. linje 7 (OS-RPE) val för att visa gränserna för näthinnan med full tjocklek, D. Anslut med lagerval, E. Håll kontakten vid flyttmarkering, F. linjalstång (vertikala och horisontella linjalstaplar, båda 200 μm långa), G. Mätlinjer på näthinnan (4 linjer med 200 μm vågrät linjallängd som avstånd på varje sida av den optiska papillen), H. mätresultaten (resultaten differentieras av olika färger och motsvarar färgen på mätlinjerna på näthinnan), I. Datautvinning från Vert-värdet i raden Längd i μm (vävnad). Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: ILM = inre begränsande membran; OS-RPE = fotoreceptor yttre segment av retinal pigmentepitel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Jämförelse av cSLO- och OCT-bilder av Vldlr knockout och C57BL/6J-möss. cSLO (A) och OCT (B) bilder av Vldlr knockout-möss jämfört med cSLO (C) och OCT (D) -bilder av C57BL / 6J-möss. Egenskaper hos OCT hos Vldlr knockoutmöss (B): 1) Mittreflekterande linje (B, röda pilar) på näthinnans inre yta med vidhäftning till näthinnekärlet (B, grön pil). 2) Hyperreflekterande lesioner, belägna vid subretinalutrymmet, med (B, vit pil) eller utan (B, gul pil) involvering av yttre kärnskikt. Pilarna på cSLO-bilden (A) representerar platserna för motsvarande färgpilar på OCT-bilden (B). Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: cSLO = konfokal skanningslaser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi; Vldlr = lipoproteinreceptor med mycket låg densitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Läge 1: retinala paraffinsektioner med hematoxylin-eosinfärgning i Vldlr knockout och C57BL/6J-mus. (A) Ett exempel på subretinal neovaskularisering som invaderar det yttre kärnskiktet (tjock grön pil), som ligger i mitten av näthinnan på en Vldlr-knockoutmus. (B) Normal kontroll, den mellersta delen av näthinnan på en C57BL/6J-mus. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: Vldlr = lipoproteinreceptor med mycket låg densitet; ILM = inre begränsande membran; NFL = retinalt nervfiberskikt; GCL = retinal ganglioncellskikt; IPL = inre plexiformskikt; INL = inre kärnskikt; OPL = yttre plexiformskikt; ONL = yttre kärnskikt; ELM = externt begränsande membran; IS = fotoreceptor inre segment; OS = fotoreceptor yttre segment; RPE = retinalt pigmentepitelskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Läge 2: retinala paraffinsektioner med hematoxylin-eosinfärgning i Vldlr knockout och C57BL / 6J-mus. (A) Ett exempel på subretinal neovaskularisering utan inblandning av yttre kärnskikt (tjock blå pil) och med intakt ELM (tunn gul pil), belägen i den mellersta periferin näthinnan i en Vldlr knockout-mus. (B) Normal kontroll, näthinnan i mellersta periferin hos en C57BL/6J-mus. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: VLDR = lipoproteinreceptor med mycket låg densitet; ILM = inre begränsande membran; NFL = retinalt nervfiberskikt; GCL = retinal ganglioncellskikt; IPL = inre plexiformskikt; INL = inre kärnskikt; OPL = yttre plexiformskikt; ONL = yttre kärnskikt; ELM = externt begränsande membran; IS = fotoreceptor inre segment; OS = yttre fotoreceptorsegment; RPE = retinalt pigmentepitelskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: Jämförelse av näthinnetjocklek mellan C57BL/6J-möss och Vldlr-knockoutmöss (alla data från höger öga). (A) Retinal tjocklek (μm) genom optisk nervpapill genom OCT horisontell skanning. (B) Retinal tjocklek (μm) genom optisk nervpapill genom OCT vertikal skanning. Den horisontella koordinaten representerar mätpositionerna med ett avstånd på 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Förkortningar: T = Temporal; P = Optisk papill; N = Nasal; S = Överlägsen; I = Underlägsen; OCT = optisk koherenstomografi; VLDR = lipoproteinreceptor med mycket låg densitet; OD = höger öga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie tillämpades OCT-avbildning med hjälp av ett näthinnebildsystem för små djur för att utvärdera retinala förändringar hos Vldlr-knockoutmöss , som visar ofullständig bakre glaskroppsavskiljning, subretinal neovaskularisering och retinal tjockleksförtunning. OCT är en icke-invasiv avbildningsmetod för att undersöka näthinnans tillstånd in vivo. De flesta ULT-enheter är utformade för mänsklig ögonundersökning. Storleken på hårdvaruutrustningen, inställningen av brännvidden, inställningen av systemparametrarna och positioneringskraven för undersökaren är alla baserade på det mänskliga ögat. Ändringar av linsen och systeminställningarna krävs för att undersöka små djur med människospecifik ULT-utrustning. I detta dokument presenteras förfaranden för undersökning av små och medelstora ULT.
Brännvidden är olika under bildskanning av olika små djur med olika storlekar av ögonbollar. Denna skillnad i brännvidd är kritisk och måste lösas för att få tydliga och korrekta fundusbilder. En effektiv metod är att ersätta objektivlinsen med linser med olika krökningar. På grund av sin lilla ögonglob behöver musen en kontaktlins på 100 D framför hornhinnan utöver den dubbla sfäriska 60 D-förinställda linsen på ULT-utrustningen.
OCT kan endast tillhandahålla linjeskanningar som endast täcker en begränsad region av näthinnan. Därför är det viktigt att standardisera protokollet för ULT-skanningar för kvalitativ och kvantitativ jämförelse av ULT-resultat i olika grupper. Tre horisontella skanningar och tre vertikala skanningar utfördes här. Denna maskin ger en cSLO-bild i realtid för att övervaka platsen för OCT-skanningen så att skanningens position kan justeras exakt och bekvämt. Ytterligare skanningar kan läggas till när en onormal reflektion hittas.
Parametrarna för bildförvärv måste justeras noggrant. Här rekommenderas att Range Min är 0-20 och Range Max är 50-60 (Figur 4I, J). När parametrarna är överjusterade skulle bildens signalkontrast förbättras, och den reflekterade signalen i näthinnan med låg reflektion blir lägre eller till och med svart, och viss morfologisk information kommer att gå förlorad.
Följande är några tips för att undvika försämring av bildkvaliteten: 1. Placera en kontaktlins framför ögonen omedelbart efter anestesi för att undvika grå starr; 2. Se till att den förinställda linsen och kontaktlinsen är rena; 3. Undvik att hår kommer in mellan hornhinnan och kontaktlinsen; 4. Se till att dopplern, kontrasten och ljusstyrkan i ULT-parametrarna är korrekt inställda.
OCT-bilderna kan användas för att kvalitativt upptäcka lesioner och kvantitativt mäta mätvärden som retinal tjocklek. Här föreslås en metod för att mäta näthinnans tjocklek på flera platser, och medelvärdet kan beräknas som den genomsnittliga näthinnetjockleken. Detta uppnås genom ULT-systemets automatiska stratifieringsfunktion. Därför kan tjockleken på retinalamineringarna också mätas. Mätmetoden är enkel och exakt (figur 6 och figur 7). Resultaten visade att näthinnans tjocklek var lägre hos Vldlr knockout-möss än C57BL/6J-möss, i överensstämmelse med litteraturen25. Skillnaden i näthinnetjocklek mellan de två grupperna kan tydligt visas av en graf som genereras från mätningarna på flera platser (figur 11). Liknande retinopatianalys och mätmetoder för näthinnetjocklek har också rapporterats i Stargardts sjukdomsmusmodell26. Det är dock värt att notera att de hyperreflekterande banden vid näthinnans glasögongränssnitt inte hör till näthinnevävnaden och bör avlägsnas under stratifiering. Dessutom, om subretinala lesioner invaderar näthinnan, bör tjockleksmätningen inkludera den invaderade delen.
Detta smådjurs retinala bildsystem har vissa begränsningar. Till exempel, även om det kan ge tydliga bilder av den bakre polen inom 35 °, är bildförvärv av den perifera näthinnan fortfarande utmanande. Dessutom bildar cSLO en gråskalebild, som inte är lika bra som en färgfundusbild för att upptäcka fundusskador (pigmentering, blödning, utsöndring). Därför behövs ytterligare förbättringar. Sammanfattningsvis kan OCT-undersökning av cSLO-maskinen underlätta icke-invasiv detektion och mätning av retinopati i musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Projektkälla: Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2018A0303130306). Författarna vill tacka Ophthalmic Research Laboratory, Joint Shantou International Eye Center vid Shantou University och Chinese University of Hong Kong för finansiering och material.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
