Summary
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het verzamelen van bloed uit de subclavia-ader bij ratten. Het maakt snelle, tijdige en gemakkelijk identificeerbare bemonstering zonder anesthesie mogelijk en verkrijgt bloed van hoge kwaliteit door herhaalde monsterverzameling.
Abstract
Ratten worden veel gebruikt in farmacokinetiek (PK) en toxicokinetische (TK) studies die een bepaalde hoeveelheid bloed op specifieke tijdstippen moeten verzamelen om blootstelling aan geneesmiddelen te detecteren. De rattenbloedafnamemethode bepaalt de kwaliteit van het plasma en beïnvloedt verder de precisie van de testresultaten. De subclavia-aderbloedafnamemethode die in dit protocol wordt beschreven, verzamelt bloedmonsters herhaaldelijk in de bewuste toestand van dieren om te voldoen aan de behoeften van PK- en TK-tests. De vaardigheden van terughoudendheid en de juiste procedure van naaldincisie zorgen voor het succespercentage van bloedafname. Het is eenvoudig te bedienen terwijl de kwaliteit van plasma wordt gewaarborgd en tegelijkertijd rekening wordt gehouden met dierenwelzijn. Deze methode vereist echter een bekwame bediening en een onjuiste methode kan dierlijke zwakte, pijn, kreupelheid en zelfs sterfte veroorzaken. De huidige methode is gebruikt in de testfaciliteit voor een orale toxiciteitsstudie van 4 weken bij Sprague Dawley (SD) ratten met TK. De maximale hoeveelheid bloed die binnen 24 uur werd verzameld, bedroeg niet meer dan 20% van het totale bloed van het dier. Het lichaamsgewicht van de dieren was meer dan 200 g voor mannetjes en vrouwtjes. De gegevens toonden aan dat het lichaamsgewicht van de dieren elke week gestaag toenam en de klinische observatie normaal was na herhaalde monsterverzameling.
Introduction
Volgens de Richtlijnen1 van de International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) en de richtlijnen van de National Medical Products Administration (NMPA)2, moet het aantal bloedafnametijdpunten van ratten in de toxicokinetische (TK) studie voldoen aan de vereisten van de dynamische beoordeling van de blootstelling aan geneesmiddelen. Het geschatte totale bloedvolume van een rat is 55-70 ml / kg lichaamsgewicht3. De verzameltijdpunten zijn over het algemeen intensief binnen 30 minuten na toediening en nemen daarna af, en meer dan tien bloedmonsters moeten binnen 48 uur worden verzameld bij routinetests4. Bloedmonsters worden bijvoorbeeld verzameld op 12-tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h en 12 h) in TK-onderzoek van oraal toegediende geneesmiddelen. Onderzoekers moeten herhaaldelijk 200-250 μL bloed bij ratten verzamelen om plasma van hoge kwaliteit te verkrijgen voor de TK-test5.
De bloedafnameplaatsen bij ratten omvatten staartbloedvaten, retro-orbitale plexusader, submandibulaire ader, hart, abdominale aorta6, enzovoort. Onder hen is bloedafname uit de caudale ader van ratten een veelgebruikte methode, waarvoor ervaren en bekwame operators nodig zijn 7,8. Het verzamelen van bloed uit de retro-orbitale plexusader is minder ingewikkeld; deze methode wordt echter niet aanbevolen omdat het het gezichtsvermogen van de ratten kan beschadigen9, en bloed uit het hart en de abdominale aorta is alleen geschikt voor de uiteindelijke bloedafname10. Een andere methode voor het verzamelen van bloed uit de submandibulaire ader bij een bewuste rat heeft aangetoond dat dit tot meer complicaties leidt en onvoldoende bloedmonsterkwaliteitaan het licht brengt 11. Daarom kunnen onderzoekers het dier verdoven om de moeilijkheid van bemonstering te verminderen. Toch verhoogt de anesthesie ook de kosten van het experiment, en ernstiger, het zal de metabole toestand van ratten beïnvloeden12. Het huidige protocol maakt gebruik van een snelle en eenvoudige methode voor het verzamelen van bloed in de subclavia-aderen van ratten zonder anesthesie, waardoor nauwkeurige positionering en bilaterale afwisselende bloedafname mogelijk is om tijdig en herhaald monsters van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley (SD) ratten, ~ 6-11 weken werden gebruikt voor de experimenten. De ratten werden gefokt volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren13.
1. Voorbereiding van dieren
OPMERKING: Alle SD-ratten die in deze studie werden gebruikt, waren wakker en werden niet verdoofd / geëuthanaseerd. De vaardigheid van terughoudendheid door de huid op de rug van het dier te grijpen, is nodig.
- Zoek het laagste punt van de subclavia driehoekige fossa tussen de nek en de voorpoot bij een rat. Beweeg ~ 2-3 mm naar het hoofd en bereik de naaldpunt op de bloedafnameplaats (figuur 1). Verwijder het haar met een elektrisch scheerapparaat.
OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele behoeften kan serum of plasma nodig zijn. Plasma wordt als voorbeeld genomen in dit protocol en heeft geen invloed op de werking van bloedafname. - Bereid wattenstaafjes gekleurd met 75% alcohol voor het afvegen en desinfecteren en droge wattenstaafjes voor het afvegen.
2. Bloedafname
OPMERKING: Ten minste 2 mensen, die beide ervaring moeten hebben met bloedafname en rattenbestrijdingstechnieken, moeten deze stappen uitvoeren.
- Pak de huid op de achterkant van de nek met één hand vast om het hoofd, de nek en de borst van de rat rechtop te houden en de injectieplaats bloot te leggen (video 1). Maak de voorpoot aan de zijkant van de injectieplaats recht om het niveau te behouden.
- Houd de spuit met de andere hand evenwijdig aan de kop van de rat en kantel de spuit 5°-10° naar buiten zodat de punt in de ventrale richting wordt gekanteld.
- Steek de naald volledig in de voorste holte. Trek de spuit terug om de negatieve druk in de buis te behouden.
- Beweeg de naald langzaam van diep naar ondiep en terug naar hetzelfde pad. Wanneer er bloed in de naald van de spuit is gekomen, stelt u de positie van de naald vast (video 2).
OPMERKING: Het bloed wordt dan met een constante snelheid in de spuit gevuld, zoals weergegeven in figuur 2A (vooraanzicht) en figuur 2B (zijaanzicht). - Controleer de maximale bloedhoeveelheid in overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de instelling. Dit is afhankelijk van het gewicht en de gezondheid van het dier. Bij afwezigheid van andere vereisten, verwijder niet meer dan 20% van het totale bloedvolume van het dier binnen 24 uur, wat ~ 3 weken herstel vereist14.
- Wanneer voldoende bloedmonster is verzameld, trekt u de spuit onmiddellijk op en bereidt u zich voor op de bloedbehandeling (stap 3).
- Zet de injectieplaats van de rat gedurende ~ 1-2 minuten onder druk om het bloeden te stoppen. Aangezien de verzamelplaats zich in het onderste deel van de nek bevindt, knijpt u in de huid van de subclavia-ader om het bloeden te stoppen door erop te drukken (figuur 3).
OPMERKING: Bloed kan afwisselend worden verzameld uit de bilaterale subclavia-ader wanneer herhaalde bloedafname nodig is. - Breng de rat terug naar de kooi en observeer de toestand ervan.
3. Verwerking van het bloedmonster
- Verwijder de naald uit de spuit en gooi deze weg in de scherpe gereedschapscontainer. Breng het bloed langzaam over van de spuit naar een buis van 1,5 ml. Druk de spuit tegen de wand om eventuele bubbelvorming te voorkomen.
OPMERKING: Omdat druk ervoor kan zorgen dat rode bloedcellen scheuren, verwijdert u de naald om hemolyse te voorkomen14. - Dek de microcentrifugebuis af, veeg er voorzichtig mee en draai hem minstens vijf keer ondersteboven om het bloed grondig te mengen met het antistollingsmiddel.
- Centrifugeer het volbloedmonster bij 2000 x g gedurende ~10-15 min bij kamertemperatuur binnen 120 minuten na het verzamelen van het plasma.
- Gebruik een pipetpistool (zie Materiaaltabel) om het bovenste plasma over te brengen in een lege microcentrifugebuis. Raak de pipetkop niet aan met het onderste volbloed. Verwijder of centrifugeer het plasma dat besmet is met de rode bloedcellen.
- Gebruik de monsters onmiddellijk of bewaar ze bij -30 °C.
OPMERKING: De kenmerken van het medicijn bepalen de opslagtijd. De plasmamonsters verkregen uit de ader van de subclavia zijn doorschijnend en lichtgeel. Hemolyse kan het plasma rood kleuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Goede plasmamonsters uit de ader van de subclavia waren doorschijnend lichtgeel (figuur 4, de linkerbuis). Onjuiste bloedafname of manipulatie resulteerde in hemolyse (figuur 4, de rechterbuis).
De gegevens van de testfaciliteit toonden aan dat in een orale toxiciteitsstudie van 4 weken van een oogdruppel bij SD-ratten met TK, bloedmonsters tweemaal werden verzameld op 9-tijdstippen (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h en 24 h) tussen de eerste (dag 1) en de laatste doseringsdag (dag 28). De dosering voor de TKB-, TKC- en TKD-ratten was respectievelijk 10 mg / kg, 30 mg / kg en 100 mg / kg en het doseringsvolume was 10 ml / kg. Het bloedafnamevolume van de eerste bemonstering was ~ 0,2 ml, de leeftijd van het dier was ~ 6-7 weken, het lichaamsgewicht van het mannelijke dier was ~ 268-297 g en dat van het vrouwtje was ~ 214-239 g. Het bloedvolume van de laatste bemonstering was ~ 0,3 ml, de leeftijd van het dier was ~ 10-11 weken, het lichaamsgewicht van het mannelijke dier was ~ 376-462 g en dat van het vrouwelijke dier was ~ 254-300 g. Er zat een interval van 28 dagen tussen de twee keren TK-bloedafname. Het lichaamsgewicht van de dieren nam elke week gestaag toe en de klinische observatie was normaal. De totale hoeveelheid bloed van een rat van 250 g is ongeveer 16 ml15 en de maximale hoeveelheid bloed die binnen 24 uur werd verzameld, bedroeg niet meer dan 20% van het totale bloed van het dier. De gegevens over het lichaamsgewicht van vrouwelijke dieren zijn weergegeven in tabel 1 en die van mannelijke dieren zijn weergegeven in tabel 2.
Figuur 1: Afbeelding van de naaldpunt van de bloedafnamesite. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bloedextractieproces. Het bloed werd soepel verkregen. (A) Vooraanzicht. (B) Zijaanzicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Weergave van de hemostatische methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Uiterlijk van het specimen na centrifugatie. De linkerbuis toonde een gekwalificeerd plasmabeeld. De rechterbuis toonde een hemolysemonster. Het plasma zag er roze of rood uit. Hoe donkerder de kleur, hoe hoger de hemolysesnelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De anatomie van de ader van de subclavia. Deze ader bevindt zich onder het sleutelbeen en de naald kan het bereiken net door de subclavia driehoekige fossa niet meer dan 0,5 cm. Het verbindt de interne halsader, wervelader en externe halsader om de craniale venader te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Gegevens over het lichaamsgewicht van vrouwelijke dieren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Gegevens over het lichaamsgewicht van mannelijke dieren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Video 1: Top-down weergave van het bloedafnameproces van ratten. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Zijaanzicht van het bloedafnameproces van ratten. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn bepaalde voordelen van het verzamelen van bloed uit de aderen van de subclavia. (1) Omdat de plaats van de bloedafname gemakkelijk wordt gedissocieerd en de veneuze plexus niet regelmatig is vanwege de verschillende houdingen van de ratten, kan de beschreven methode gemakkelijk de positie van de veneuze plexus lokaliseren met behoud van de stabiele en comfortabele houdingen van de ratten. (2) De bediening is eenvoudig en gunstig voor de snelle ontwikkeling van de vaardigheden van technici en minder pijn voor dieren. (3) Een bedrijfsmodus om het dier comfortabel te maken, vermindert rusteloos gedrag aanzienlijk en voorkomt bloedspatten. (4) Het is een bloedafnamemethode met hoge snelheid (20 s), hoge efficiëntie, lage kosten en zonder anesthesie, die het risico op dierlijke anesthesie en de tijd van terughoudendheid in termen van dierenwelzijn vermindert.
In dit protocol worden de ratten comfortabel gehouden in het proces van terughoudendheid, ontspannen ze matig bij het hanteren en vermijden ze een langdurige aanraking. Losse hantering zorgt ervoor dat ratten snel kunnen bewegen en kunnen per ongeluk letsel aan dieren of mensen veroorzaken; integendeel, het kan hypoxie bij ratten veroorzaken. Het is essentieel om het bloeden te stoppen tijdens het drukken op de bemonsteringsplaats. De operators houden het dier in hun armen om ze glad te strijken in de duisternis. Bovendien mag de onderdruk niet te hoog zijn tijdens de bloedafname; anders zal het leiden tot slechte bloedafname. Aangezien de PK- en TK-onderzoeken herhaalde bloedafname vereisen, moet het bloedvolume worden geregeld op basis van verschillende diergewichten en gezondheidsvoorschriften; ondertussen zal een alternatieve bloedafnamesite het dierenwelzijn ten goede komen. Als de dieren klein of zwak zijn, worden ze op passende wijze voorzien van glucose en andere supplementen onder de door de test toegestane omstandigheden. De naaldinlaat moet glad en vrij van weerstand zijn, en wanneer er geen bloed te verzamelen is, of er is geen weerstand, moet de naald opnieuw worden ingebracht in een enigszins aangepaste richting of van kant worden veranderd. In het bloedafnameproces is het noodzakelijk om te voorkomen dat bloed wordt gemengd dat tweemaal is afgenomen van het inbrengen. Wanneer het bloedmonstervolume voor de eerste injectie onvoldoende is, is de tweede injectie vereist, moet de spuit worden vervangen en wordt de vervangende buis opnieuw ingenomen voor het bloed dat wordt verzameld in geval van hemolyse. Het wordt aanbevolen om in één keer klaar te zijn met het verzamelen van bloed. Het bloed in de spuit wordt aan de wand bevestigd en in de bloedafnamebuis geïnjecteerd om bubbels tijdens het proces te voorkomen. Om tijdig bloed te verzamelen, moet de operator 2 minuten voor de verzameling volledig voorbereid zijn en 1 minuut daarvoor injecteren. Wanneer het dier minder coöperatief of uitdagend is om te bedienen, moet het van tevoren worden gekalmeerd. Daarom moet er een groep gekwalificeerde technici zijn.
De brachiale plexus staat loodrecht op en achter de ader van de subclavia, dus onjuiste bediening kan leiden tot brachiale plexusbeschadiging, voorpootpijn, kreupelheid, terugdeinzen en andere nadelige symptomen16. Deze techniek kan ook worden toegepast op cavia's en voldoen aan de bloedafnamebehoeften in cavia-experimenten, maar verder onderzoek is nodig om bloed van cavia's te trekken met deze methode.
De anatomie van een ader van een subclavia is weergegeven in figuur 5. De ader van de subclavia bevindt zich onder het sleutelbeen en de naald kan deze bereiken door de subclavia driehoekige fossa, niet groter dan 0,5 cm. De methode is daarom riskant en vraagt om een gekwalificeerde professional. Een ongekwalificeerde professional zal resulteren in dierlijke hyperactiviteit, moeite om te controleren, slechte bloedcirculatie, dierlijke zwakte of zelfs mortaliteit na een seriële bloedafname. Onjuiste chirurgie zal ook de borst of slagader beschadigen. Als gevolg hiervan is het cruciaal om een gekwalificeerde professional in te schakelen om een succesvol experiment te bereiken.
Kortom, dit protocol presenteert een alternatieve methode voor het verzamelen van bloed uit de subclavia-ader van ratten, die technische ondersteuning biedt voor PK- en TK-studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song en Wei Yang hebben een financieel belang in Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, dat dit werk echter niet ondersteunde. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) en Key Program "New Drug Creation" van Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 en No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
