Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63448
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים שני שינויים של בדיקת סיבי הדנ"א כדי לחקור פערי דנ"א חד-גדיליים בשכפול דנ"א לאחר אינדוקציה של נגע. בדיקת הסיבים S1 מאפשרת זיהוי של פערים לאחר שכפול באמצעות אנדונוקלאז S1 ספציפי ל-SSDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפער מאפשרת הדמיה וכימות של תיקון פערים.

Abstract

בדיקת סיבי הדנ"א היא שיטה פשוטה וחזקה לניתוח דינמיקה של מזלג שכפול, המבוססת על אימונו-דטקציה של אנלוגים נוקלאוטידים המשולבים במהלך סינתזת דנ"א בתאים אנושיים. עם זאת, טכניקה זו יש רזולוציה מוגבלת של כמה אלפי קילובסיסים. כתוצאה מכך, פערי דנ"א חד-גדילי (ssDNA) לאחר שכפול, קטנים עד כמה מאות בסיסים, אינם ניתנים לזיהוי על ידי הבדיקה הסטנדרטית. כאן אנו מתארים גרסה שונה של בדיקת סיבי הדנ"א המשתמשת בנוקלאז S1, אנזים שמבקע באופן ספציפי את ה-ssDNA. בנוכחות פערי ssDNA לאחר שכפול, הנוקלאז S1 יתמקד במרווחים ויבקע אותם, ויצר דרכים קצרות יותר שיכולות לשמש כקריאה לרווחי ssDNA על מזלגות מתמשכים. פערי ssDNA אלה לאחר שכפול נוצרים כאשר דנ"א פגום משוכפל ללא הרף. ניתן לתקן אותם באמצעות מנגנונים שאינם מחוברים לשכפול הגנום, בתהליך המכונה מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול. מאחר שמנגנוני מילוי פערים כוללים סינתזת דנ"א שאינה תלויה בשלב S, ניתן להשתמש בשינויים בסכמת תיוג סיבי הדנ"א גם כדי לעקוב אחר אירועים של מילוי פערים. בסך הכל, שינויים אלה של בדיקת סיבי הדנ"א הם אסטרטגיות רבות עוצמה כדי להבין כיצד נוצרים פערים לאחר שכפול וממלאים את הגנום של התאים האנושיים.

Introduction

עבודות סמינל סיפקו עדויות להצטברות של פערים חד-גדיליים (ssDNA) לאחר שכפול בעת טיפול בחומרים מזיקים לדנ"א בחיידקים1 ובתאים אנושיים 2,3. במהלך שכפול של תבניות דנ"א פגומות, מנגנוני סינתזת הדנ"א עשויים לעקוף את הנגעים על ידי שימוש בפולימראזות DNA ספציפיות של סינתזת טרנסלציה או באמצעות מנגנוני החלפת תבניות. לחלופין, ה-replisome עשוי גם פשוט לדלג על הנגע ולהשאיר מאחור מרווח ssDNA, שיתוקן מאוחר יותר. לאחרונה, מחקר הראה בבירור כי טיפול בחומרים גנוטוקסיים מוביל לפערי ssDNA באאוקריוטים על ידי שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לדמיין את המבנה הספציפי של מתווכי שכפול4. היווצרותם של אזורים אלה של פערים לאחר שכפול הוצעה בתחילה להיות תוצאה פשוטה של המצב הבלתי רציף למחצה של שכפול DNA2. במקרה זה, נגע על הגדיל המפגר יכול לחסום את התארכותו של שבר אוקזאקי, אך התקדמות המזלג ניצלת באופן טבעי על ידי שבר אוקזאקי הבא, ומשאירה מאחור פער ssDNA. עם זאת, מחקרים נוספים הראו כי היווצרות פערים על הגדיל המוביל אפשרית גם כן, כפי שהוכח לראשונה בחיידק5. באאוקריוטים, PRIMPOL, פולימראז דנ"א ייחודי עם פעילות פרימאז, הוכח כמי שמסוגל להפעיל מחדש את סינתזת הדנ"א במורד הזרם של נגע חוסם שכפול באמצעות פעילות הנזיפה שלו 6,7,8,9,10,11. לפיכך, פעילות הפרימט PRIMPOL עשויה להסביר את היווצרותם של פערי ssDNA לאחר שכפול בגדיל המוביל עם טיפול בחומר מזיק לדנ"א בתאים אנושיים12. עם זאת, זיהוי פערים אלה, כמו גם תיקון פערים, עד לאחרונה, דרשו גישות עקיפות או גוזלות זמן כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים4 או בדיקות מבוססות פלסמיד13. השימוש בנוקלאז S1 הספציפי ל-SsDNA כדי לזהות פערים בתאים אנושיים היה חלוץ במחקרים מוקדמים לפני יותר מארבעים שנה, תוך שימוש בטכניקות גרדיאנט סוכרוז 2,3. לאחרונה, הקבוצה שלנו יישמה את השימוש בנוקלאז זה כדי לזהות ssDNA בשכפול דנ"א (פערים לאחר שכפול) בשיטות אחרות כגון סיבי דנ"א ומבחני שביט14. גישות חדשות אלה סללו את הדרך לגל הנוכחי של מחקרים על פערים שלאחר שכפול. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה של שימוש בנוקלאז S1 כדי לזהות פערי ssDNA לאחר שכפול על ידי בדיקת סיבי DNA ומסבירים כיצד ערכת תיוג דיפרנציאלית בפרוטוקול סיבי הדנ"א יכולה לאפשר מחקר של תיקון פערים אלה.

בדיקת סיבי הדנ"א היא טכניקה רבת עוצמה ששימשה מספר גדל והולך של מעבדות וסיפקה תובנות חשובות על דינמיקת מזלג שכפול ומנגנוני תגובת עקה לשכפול. בקצרה, טכניקה זו מבוססת על שילוב רציף של אנלוגים נוקלאוטידים (כגון CldU -5-chloro-2'-deoxyuridine-, ו- IdU -5-iodo-2'-deoxyuridine) בדנ"א המשכפל. לאחר הקציר, התאים נשחקים, ומולקולות דנ"א מתפשטות על מגלשת זכוכית מצופה באופן חיובי. לאחר מכן, CldU ו-IdU מזוהים על ידי נוגדנים ספציפיים, שאותם ניתן לדמיין במיקרוסקופ פלואורסצנטי כסיבים דו-גוניים. לבסוף, אורכי דרכי IdU ו-CldU נמדדים כדי לזהות שינויים כלשהם בדינמיקה של שכפול הדנ"א כתוצאה מאינדוקציה של נזק לדנ"א. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור תופעות שונות, כגון תקיעת מזלג, האטת מזלג, השפלת דנ"א מתהווה ושינויים בתדירות הירי במקור15,16.

מגבלה אחת של בדיקת סיבי הדנ"א היא הרזולוציה של כמה קילו-בסיסים. מכיוון שפערי ssDNA לאחר שכפול יכולים להיות בטווח של מאות בסיסים, אי אפשר לדמיין את הפערים האלה ישירות על ידי פרוטוקול סיבי הדנ"א הסטנדרטי. נוכחותם של פערי ssDNA על שכפול דנ"א בתאים אנושיים שטופלו בחומרים גנוטוקסיים הייתה מעורבת בעבר בעקיפין. לדוגמה, תצפית של ssDNA כפי שהוערך על ידי גיוס של החלבון הקושר ssDNA, חלבון שכפול A (RPA), בתאים מחוץ לשלב S, או היווצרות של ssDNA כפי שזוהה על ידי הרפיית DNA אלקליין בשילוב עם היעדר עיכוב מזלג ממושך על ידי בדיקת סיבי DNA 12,17,18,19,20,21 יוחסה להצטברות של פערי ssDNA. בנוסף, פערי ssDNA לאחר שכפול גורמים למחסום פאזה G2/M תלוי ATR ותאי מעצר שטופלו ברעלי שכפול 18,19,20,21,22.

הנוקלאז S1 מפרק חומצות גרעין חד-גדיליות המשחררות 5'-פוספוריל מונו- או אוליגונוקלאוטידים ויש לו זיקה גבוהה פי 5 ל-ssDNA בהשוואה לרנ"א. חומצות גרעין דו-גדיליות (DNA:DNA, DNA:RNA, או RNA:RNA) עמידות בפני נוקלאז S1 למעט כאשר משתמשים בהן בריכוזים גבוהים במיוחד. הנוקלאז S1 גם מבקע דנ"א דו-גדילי באזור החד-גדילי הנגרם על-ידי ניק, פער, חוסר התאמה או לולאה. הנוקלאז S1 הוא אפוא אנדונוקלאז ספציפי ל-ssDNA המסוגל לבקוע פערי ssDNA, ובסופו של דבר לייצר שברים דו-גדילייםשל 23,24. לפיכך, הוספת שלבים לעיכול נוקלאז S1 לפרוטוקול סיבי הדנ"א מאפשרת בעקיפין זיהוי של פערי ssDNA לאחר שכפול. בנוכחות פערים, טיפול בגרעינים חשופים עם נוקלאז S1 לפני התפשטות הדנ"א ייצור דרכים קצרות יותר כתוצאה מביקת S1 של ssDNA הנמצאת מטבעה בפערים14. לפיכך, קיצור דרכי הוא הקריאה לפערי ssDNA באמצעות גישה זו. בהשוואה לפרוטוקול סיבי הדנ"א הסטנדרטי, סיבי הדנ"א עם הנוקלאז S1 דורשים רק שני שלבים נוספים: חשיפה גרעינים (חדירת תאים) וטיפול בנוקלאז S1. חשוב לציין כי בקרות מתאימות הן חובה, כגון דגימות המטופלות בחומר הגנוטוקסי אך ללא נוקלאז S1 ודגימות שטופלו בנוקלאז S1 ללא הסוכן הגנוטוקסי. הפרוטוקול עצמו, כולל שילוב אנלוגים, טיפול S1 והתפשטות, יכול להתבצע ביום אחד ואינו דורש חומר יוצא דופן. זה דורש רק את אנלוגי התימידין, את נוקלאז S1 המטוהר, את הנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. באופן כללי, סיבי הדנ"א המשתמשים בנוקלאז S1 מזהים פערי ssDNA על מזלגות שכפול מתמשכים באמצעות גישה פשוטה יחסית.

ניתן לתקן (או למלא) את פערי ה-ssDNA שלאחר השכפול שנוצרו כתוצאה ממנגנוני תגובת מתח שכפול על ידי מנגנונים שונים, כולל סינתזת DNA של טרנסלציה או החלפת תבניות, בתהליך שנקרא מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול (PRR)25. תהליכים אלה מתרחשים מאחורי הפיצולים המתקדמים, הכוללים סינתזת דנ"א בלתי תלויה בשכפול 14,26,27. בהתבסס על ממצאים אלה, ניתן לבצע ערכת תיוג שונה מבדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטית כדי לדמיין אירועים ממלאי פערים בשלב G2 ישירות 14,16,26,28. באופן ספציפי, ניתן להשתמש באנלוגיית תימידין אחת כדי לתייג את מזלג השכפול בזמן הטיפול הגנוטוקסי והיווצרות פערי ssDNA לאחר שכפול, בעוד שניתן להשתמש באנלוגיה אחרת של תימידין כדי לתייג אירועים של מילוי פערים. בפרוטוקול זה, התאים מסומנים באנלוגיה תימידין ראשונה (IdU, למשל) מיד לאחר או במקביל לטיפול גנוטוקסי במשך שעה אחת, כך שהדנ"א המתהווה מסומן בזמן היווצרות הפער. Nocodazole מתווסף עם הטיפול בכל מקום בין 12-24 שעות כדי לעצור תאים ב-G2/M, ובכך למנוע את שלב ה-S הבא. עבור 4 השעות האחרונות של טיפול בנוקודזול, אנלוגי תימידין שני (CldU, למשל) מתווסף למדיה כדי שישולבו במהלך מילוי הפער. חשוב לציין, ניתן להשתמש בבדיקה זו רק כדי לזהות אירועים של מילוי פערים ב-G2 מכיוון שלא ניתן להבחין בין האות הממלא את הפער מ-CldU לבין אות עקב שילוב CldU בשכפול דנ"א בשלב ה-S. לכן, כדי למזער את אות הרקע, התזמון של שילוב CldU לאחר אינדוקציה של נזק צריך לחפוף עם כאשר רוב אוכלוסיית התאים נכנסת לשלבG2 14. לכן, תזמון זה ישתנה בהתאם לקו התא ולמצבי הטיפול. מומלץ למטב את התקדמות מחזור התאים לפני השימוש בבדיקה זו. צביעה משותפת של אנלוגים תימידין אלה מאפשרת הדמיה של דרכי מילוי פערים (PRR) (טלאי CldU) על גבי דנ"א מתהווה (דרכי IdU) המסונתזות במהלך הטיפול הגנוטוקסי כאשר נוצרו פערי ssDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מכיוון שהמחקר משתמש בתאים אנושיים, העבודה אושרה על ידי ועדת האתיקה של המכון למדע ביו-רפואי באוניברסיטת סאו פאולו (ICB-USP, מספר אישור #48347515.3.00005467) למחקר עם דגימות אנושיות.

הערה: הפרוטוקולים המתוארים כאן שימשו בפרסומים קודמים עם שינויים קלים 14,16,28. כאן ההתמקדות היא בשימוש באור אולטרה סגול C (UVC) כחומר מזיק לדנ"א. עם זאת, גם חומרים מזיקים אחרים לדנ"א כמו ציספלטין והידרוקסיאוריה הועסקו בהצלחהב-28. פרוטוקול זה יכול להתבצע במערך של קווי תאים, כולל U2OS, HEK293T, פיברובלסטים אנושיים ואחרים 14,28,29. חיוני לקבוע את שאלת הניסוי לפני ביצוע פרוטוקול זה. בדיקת סיבי הדנ"א עם נוקלאז S1 (הנקראת להלן סיבי S1) משמשת לזיהוי נוכחותם של פערי ssDNA לאחר שכפול, בעוד שבדיקת מילוי הפער (או PRR) מתבצעת כדי לכמת אירועים של מילוי פערים בשלב G2. לפיכך, אם מנתחים את נוכחותם של פערי ssDNA לאחר שכפול, על החוקר לבצע את סעיף 2 (מערך הניסוי של סיבי S1) ולהמשיך ישירות לסעיף 4 (הכנת סיבי DNA על ידי התפשטות) של הפרוטוקול. אם מנתחים אירועים של מילוי פערים, על החוקר להמשיך ישירות לסעיף 3 (מערך ניסויי של מילוי פערים (PRR).

1. ריאגנטים והתקנה

  1. אנלוגים תימידינים: Resuspend 5-Iodo-2'-deoxyuridine (IdU) ו-5-Chloro-2'-deoxyuridine (CldU) ב-1 N NH4OH לריכוז סופי של 100 mM. מסננים את האנלוגיות דרך מסנן מזרקים סטרילי (0.2 מיקרומטר), aliquot, ומאחסנים אותם ב-20 מעלות צלזיוס- .
  2. נוגדנים: ראשונים - עכבר אנטי-ברדיו (ביוראד) ועכבר אנטי-ברדיו (BD); משניות - אלכסה פלואור 488 ואנטי עכבר אלכסה פלואור 594.
  3. חיץ חדירה סלולרי CSK100 עבור סיבי S1: הוסף 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7.2], 300 mM סוכרוז ו 0.5% טריטון X-100 ב- Hמזוקק 2O.
  4. חיץ נוקלאז S1 [pH 4.6]: הוסף 30 mM נתרן אצטט [pH 4.6], 10 mM אבץ אצטט, 50 mM NaCl ו-5% גליצרול ב-H2O.
    הערה: מאגר הנוקלאז S1 חייב להיות בעל pH סופי של 4.6, מכיוון שפעילות S1 יורדת ב-50% ב-pH >-4.9.
  5. Aliquot ולאחסן ב -20 °C את הנוקלאז S1 מטוהר מ - A. oryzae מדולל מראש במאגר דילול נוקלאז S1 המסופק על ידי היצרן.
  6. בנה מחדש את הנוקודזול ב- DMSO לריכוז סופי של 2 mM למילוי פערים. בדיקת מעבדה.
  7. מאגר ליזיס: הוסף 200 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM EDTA ו- 0.5 % SDS ב- H2O.
  8. מכינים מלוחים עם מאגר פוספט (PBS).
  9. הכן PBS-T על ידי הוספת 0.1% Tween-20 ב- PBS.
  10. הכינו 5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS.
  11. הכן 0.1% BSA ב- PBS.
  12. הכן PBS-T-BSA על ידי הוספת BSA של 1% ב- PBS-T.
    הערה: השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מנורת כספית או קסנון עם אורך גל של 510 ננומטר ורוחב פס של 42 ננומטר GFP (FITC, Alexa Fluor 488) ומסנן פליטה של אורך גל של 624 ננומטר ורוחב פס של 40 ננומטר טקסס אדום (Alexa Fluor 594) או מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזר קו 488 ננומטר (כחול) כדי לזהות פלואורסצנציה ירוקה (זוהתה בין 510 ל-560 ננומטר) ולייזר בקו 561 ננומטר (צהוב) כדי לזהות פלואורסצנציה אדומה ( זוהו בין 575 ל-680 ננומטר). מטרת טבילה (40x, 63x או 100x).

2. מערך ניסיוני של סיבי S1 (2 ימים)

  1. יום 1: צלחת 4 בארות לכל קו תאים: ± UVC ו- ± S1 nuclease עם תאים במפגש של 70-90%.
    הערה: הניסוי יכול להיעשות בפורמט קטן כמו צלחת של 12 בארות. במקרה זה, כל הפתרונות משמשים ב 0.5 מ"ל / באר.
  2. יום 2: הכינו IdU טרי ב-20 μM ו-CldU ב-200 μM במדיה של תרביות תאים שחוממו מראש (37 מעלות צלזיוס).
  3. לשאוף את מדיית התרבית ומיד להוסיף את המדיה עם 20 μM IdU ולדגום את התאים ב 37 °C, 5% CO2 (חממת תאים) במשך 20 דקות בדיוק.
  4. שטפו במהירות את התאים עם PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) פעמיים.
  5. להקרין את התאים עם 20 J/m2 UVC. השתמש בתאים לא מטופלים כבקרות.
  6. מיד להוסיף את המדיה עם 200 μM CldU ולדגום את התאים ב 37 °C, 5% CO2 (חממת תאים) במשך 60 דקות בדיוק.
    הערה: ניתן להחליף תוויות IdU ו- CldU, אך הריכוז של האנלוגיה השנייה צריך להיות גבוה פי 5-10 מהאנלוגיה הראשונה. תזמון הדגירה האנלוגית יכול להיות מותאם לסוכן הגנוטוקסי שבו נעשה שימוש, אך הזמן של הדגירה האנלוגית השנייה צריך להיות ארוך מספיק כדי להבטיח מספיק זמן להיווצרות פער14,16. אם אתם משתמשים בתרופה המזיקה לדנ"א, הוסיפו את התרופה יחד עם CldU 28,29,30.
  7. שטפו את התאים עם PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) פעמיים.
  8. חלחל לתאים עם מאגר CSK100 למשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: ניתן לבדוק חדירה מוצלחת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר שבו רק גרעינים צריכים להיות ניתנים לצפייה
  9. בזהירות לשטוף את הגרעינים עם PBS (לשפוך 0.5 מ"ל על הצד של כל באר, רק למשך כמה שניות).
  10. יש לשטוף בזהירות את הגרעינים עם חיץ S1 (יוצקים 0.5 מ"ל בצד של כל באר, רק לכמה שניות).
  11. דגירה של הגרעינים עם חיץ S1 עם נוקלאז S1 (20 U/mL) או ללא (כבקרה) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (חממת תאים).
  12. שאפו למאגר S1 והוסיפו 0.1% BSA ב-PBS.
  13. לגרד את הגרעינים ולהעביר אותם לצינור 1.5 מ"ל מבואר כראוי. שמור צינורות על קרח כל הזמן.
    הערה: ניתן לבדוק ניתוק מוצלח של גרעינים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
  14. גלולה את הגרעינים: צנטריפוגה ב ~ 4600 x g במשך 5 דקות, ב 4 ° C.
    הערה: בשונה מבדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטית, לא ניתן לספור את הגרעינים, לכן שקול את המספר ההתחלתי של תאים מצופים. לחלופין, ניתן להשתמש בבאר נוספת שלא הייתה נתונה לחדירה כדי להעריך את ספירת התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
  15. בצעו החייאה של הכדורים היטב ב-PBS בריכוז של כ-1500 תאים/μL, הניחו את הצינורות על קרח והמשיכו להכנת סיבי DNA על ידי התפשטות (סעיף 4) פרוטוקול באופן מיידי

3. מערך ניסויי למילוי פערים (PRR) (3 ימים)

  1. יום 1: צלחת 2 בארות לכל שורת תאים: ± UVC עם תאים במפגש של כ-70%.
  2. יום 2: הכינו IdU טרי בטמפרטורה של 20 מיקרומטר במדיה של תרביות תאים מחוממות מראש (37 מעלות צלזיוס).
  3. להקרין את התאים עם 20 J/m2 UVC.
  4. מיד להוסיף את המדיה עם 20 μM IdU ולדגום את התאים ב 37 °C, 5% CO2 (חממת תאים) במשך 60 דקות בדיוק.
  5. שטפו את התאים עם PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) פעמיים.
  6. מיד להוסיף את המדיה עם 200 ng/mL nocodazole ולדגום את התאים ב 37 °C, 5% CO2 (חממת תאים) במשך 12-24 שעות (תזמון של שלב זה חייב להישמר עקבי בין הניסויים).
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הנוקודזול בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש. אם אתה משתמש בתרופה גנוטוקסית, הדגירה של התאים עם IdU ± תרופה28.
  7. יום 3: שאפו למדיית התרבות, הוסיפו את המדיה עם 20 μM CldU + nocodazole, ודגרו למשך 4 השעות האחרונות של טיפול בנוקודזול, ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (חממת תאים).
  8. שטפו את התאים ב-PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
  9. מוסיפים טריפסין ואינקובציה למשך 1-2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (חממת תאים) כדי לנתק תאים.
  10. הוסיפו את אותו נפח של מדיה של תרביות תאים ואספו תאים (מדיה + טריפסין) בצינור 1.5 מ"ל מבואר כראוי. שמור את הצינורות על קרח כל הזמן.
  11. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
  12. גלול את התאים: צנטריפוגה ב ~ 350 x g במשך 5 דקות, ב 4 ° C.
  13. הסירו את הסופרנאטנט והחזירו את התאים ב-PBS ב-1,500 תאים/μL. שמרו את התאים על הקרח והתחילו בהכנת סיבי הדנ"א על ידי הפצת פרוטוקול באופן מיידי (יום 3 או 4).

4. הכנת סיבי דנ"א על ידי התפשטות (כשעה אחת ל-12 שקופיות)

  1. הביאו את שקופיות המיקרוסקופ בעיפרון פחמן והניחו אותן שטוחות על מגש.
  2. הקש על החלק התחתון של הצינור כדי להבטיח הומוגניזציה.
  3. הוסף 2 μL של תאים בחלק העליון של השקופית המתאימה.
    הערה: ניתן להוסיף שתי טיפות, אחת בחלק העליון של השקופית ואחת באמצע השקופית.
  4. מוסיפים 6 μL של מאגר הליזיס ומזיזים את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה בערך 5 פעמים (הימנעו מיצירת בועות).
  5. משכו מעט את הטיפה לכיוון תחתית המגלשה עם קצה הפיפטה (כדי להנחות את נתיב התפשטות הטיפה).
  6. דגירה במשך 5 דקות ב- RT כדי לטשטש את הגרעינים.
    הערה: ניתן להתאים את נפח מאגר הליזיס ואת זמן הליזיס אם הליזאט מתייבש מהר מדי או, לחלופין, אינו מתייבש מספיק. נפח מאגר Lysis יכול לנוע בין 5-7 μL והתזמון יכול לרדת בין 4-10 דקות.
  7. הטה את השקופית סביב 20-40° ואפשר לירידה להתפשט לתחתית השקופית במהירות קבועה ונמוכה.
  8. אפשרו לשקופית להתייבש ב-RT בחושך (10-15 דקות).
  9. מכינים מחדש את תמיסת התיקון: מערבבים מתנול: חומצה אצטית קרחונית ביחס של 3:1.
  10. טבלו את השקופיות בצנצנת המכילה את תמיסת התיקון ודגרו במשך 5 דקות ב-RT כדי לתקן דנ"א על השקופיות.
    אזהרה: מתנול הוא רעיל מאוד ויש לשמור אותו מתחת למכסה המנוע הכימי. יש להשליך במיכל המתאים.
  11. יבשו את המגלשות ב-RT בחושך ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנות מאור עד צביעה.

5. חיסון של סיבי דנ"א (כ-6 שעות)

  1. שטפו את השקופיות עם PBS פעמיים במשך 5 דקות.
  2. דנטורציה של הדנ"א עם 2.5 M HCl שהוכן טרי במשך 40-60 דקות ב- RT.
    אזהרה: כדי להכין 2.5 M HCl, לשפוך חומצה במים ולעולם לא להיפך. זוהי תגובה אקסותרמית ולכן היא תתחמם מעט.
  3. שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
  4. בלוק עם 5% BSA (ניתן לאחסן ב 20 °C עבור עד שלושה שימושים) מחומם בעבר ב 37 ° C במשך 30-60 דקות ב 37 ° C.
  5. הסר את הנוזל העודף מהשקופיות על ידי הקשה עדינה על נייר.
  6. הוסיפו 30 μL של נוגדנים ראשוניים (עכבר אנטי-BrdU 1/20 (עבור IdU) ו-rat anti-BrdU 1/100 (עבור CldU) המדוללים ב-PBS-T-BSA) לשקופיות באופן טיפתי והניחו כיסוי על גביה. דגירה למשך 1-1.5 שעות ב- RT בתא חשוך ולח.
  7. מניחים את השקופיות בצנצנת עם PBS למשך 1-2 דקות, ואז מסירים בזהירות את הכיסויים.
  8. יש לשטוף עם PBS-T בצנצנת שלוש פעמים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להניח את השקופיות ב-PBS.
  9. הסר את הנוזל העודף על ידי הקשה עדינה על נייר.
  10. הוסיפו 30 μL של נוגדנים משניים (אלקסה פלואור 594 נגד עכברים ואנטי-חולדה אלקסה פלואור 488 מדוללת ב-1/75 ב-PBS-T-BSA.) לשקופיות בצורה טיפה והניחו כיסוי על גביה. דגירה למשך 45-60 דקות ב- RT בתא חשוך ולח.
  11. מניחים את השקופיות בצנצנת עם PBS למשך 1-2 דקות, ואז מסירים בזהירות את הכיסויים.
  12. יש לשטוף עם PBS-T בצנצנת שלוש פעמים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להניח את השקופיות ב-PBS.
  13. הסר את הנוזל העודף על ידי הקשה עדינה על נייר.
  14. הוסיפו 20 μL של ריאגנט ההרכבה באופן טיפתי לשקופיות והניחו מעליהן כיסוי. הימנעו מבועות.
  15. תנו לשקופיות להתייבש ב-RT בחושך, ואז אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (או -20 מעלות צלזיוס לשימור ארוך יותר).

6. רכישת תמונה וניתוחה (כשעה אחת לכל מדגם)

הערה: ניתן להשתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עבור שני הפרוטוקולים. עם זאת, עבור בדיקת מילוי הפער (PRR), מומלץ מאוד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לרזולוציה מוגברת של התמונות.

  1. מניחים טיפה של שמן טבילה (ספציפי למיקרוסקופ) ליד החלק העליון של השקופית שבה התאים היו שוכבים ומוצאים את המיקוד באמצעות הערוץ הירוק על ידי חיפוש נקודות ירוקות ברקע (ניתן להשתמש במטרות 40x, 63x ו-100x).
  2. מצא את הריכוז העיקרי של סיבים ועבור לקצוות כדי למצוא סיבים בודדים שאינם חופפים היטב באמצעות ערוץ אחד בלבד כדי לבחור את האזורים לתמונות ולמנוע הטיה פוטנציאלית.
  3. צלם כ-15-20 תמונות בכל שקופית לצד השקופית כולה בערוצים הירוקים והאדומים ומזג את שני הערוצים כדי להשיג סיבי DNA דו-צבעיים.
    הערה: אם אתה משתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, צלם תמונות ברזולוציה גבוהה (1024 x 1024 פיקסלים) והשתמש בערכי חור סיכה הקרובים ל- 1 עבור פלואורסצנציה אדומה וירוקה כאחד.
  4. השתמש ב- ImageJ (תוכנה חופשית המסופקת על ידי NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) למדידות אורך דרכי IdU ו- CldU.
    1. פתח תמונה על-ידי גרירתה לתוך התיבה ImageJ.
    2. השתמש בסרגל קנה המידה שנוצר על ידי תוכנת המיקרוסקופ (מכויל כראוי) כדי להמיר את האורך למיקרומטרים. השתמש בכלי הקו הישר על-ידי בחירת הסמל החמישי משמאל לימין בתיבה ImageJ כדי למדוד את סרגל קנה המידה בתמונה המסופקת מיקרומטרים ולקבל מדידה בפיקסלים. לחץ על ניתוח > הגדר קנה מידה והחלף את "המרחק בפיקסלים" במספר המתאים ואת "יחידת האורך" ל- μm.
    3. בתיבה ImageJ, בחר בכלי קו מפולח על-ידי לחיצה שמאלהעל הסמל החמישי משמאל לימין ולאחר מכן בחירה באפשרות השנייה מלמעלה למטה.
    4. צייר את הנתיב המדויק של המערכת האדומה (IdU) או הירוקה (CldU) על-ידי לחיצה שמאלית ועצור את הציור על-ידי לחיצה ימנית. לחץ על לחצן M במקלדת כדי למדוד את האורך.
    5. עבור סיבי S1, נתחו רק אדום-ירוק (סיבים דו-צבעיים)16. מדוד את אורכי דרכי האדמה האדומים והירוקים מלפחות 150 סיבים מתמונות שונות על-ידי מעקב אחר מדידות הדרכים האדומות והירוקות עבור כל סיב בנפרד.
    6. לצורך בדיקת מילוי הפער, מדוד רק את אורך דרכי ה-IdU (האדומות) המכילות לפחות 1 כתם CldU (ירוק) אך ללא צביעת CldU רציפה. ציון לפחות 10-15 קטעי IdU מתמונות שונות עם לפחות תיקון CldU אחד.
      הערה: ניתן להשתמש בתוכנות אחרות לניתוחים, כגון דפדפן התמונות Zeiss LSM.
  5. עבור סיבי S1, התווה את אורך דרכי ה- IdU, אורך דרכי CldU והיחסים (CldU / IdU או להיפך) בגרפיקה נפרדת כעלילות נקודות פיזור עם חציונים.
  6. מדוד אירועי מילוי פערים כיחידות של "צפיפות לכל קילו-בסיס", חלק את המספר הכולל של טלאי CldU (PRR, ירוק) באורך נתון של מערכת IdU (אדומה) באורך הכולל של המערכת האדומה בקילו-בסיסים (בהתחשב ב-1 μm = 2.59 קילו-בייסים31). לאחר מכן התווה את הנתונים כעלילות נקודות פיזור עם חציונים.
  7. בשני הניסויים, בצע ניתוח סטטיסטי בין שתי דגימות באמצעות מאן-וויטני (מבחן לא-פאראמטרי) ובין יותר משתי דגימות באמצעות Kruskal-Wallis ולאחר מכן מבחן ההשוואות המרובות של דאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בבדיקת סיבי S1, אם טיפול בחומר גנוטוקסי מוביל לפערים של ssDNA לאחר שכפול, האורך הכולל של סיבי הדנ"א מגרעינים שטופלו ב-S1 יהיה קצר יותר עם הטיפול בנזק לדנ"א בהשוואה לדגימות שלא טופלו, כמו גם לדגימות שטופלו בחומר הגנוטוקסי אך לא הוגשו לביקוע S1 (איור 1).

לחלופין, אם הטיפול בנוקלאז S1 אינו משפיע באופן משמעותי על אורך סיבי הדנ"א בהשוואה לתאים שאינם מטופלים, פרשנויות שונות אפשריות: (1) אין היווצרות של פערי ssDNA לאחר שכפול עם הטיפול בחומר הגנוטוקסי שבו נעשה שימוש, ו/או ברקע הגנטי הספציפי שנחקר. ואכן, הראינו בעבר כי 6-4 פוטו-תוצרים המושרים על-ידי UV (6-4PP) אך לא דימרים של פירימידין (CPD) המושרים על-ידי UV מובילים להיווצרות פערי ssDNA בתאים החסרים לתיקון כריתת נוקלאוטידים (תאי NER, XP-C)14. (2) פערי ה-ssDNA תוקנו ולא ניתן עוד לזהותם. (3) הקיצור הנגרם על ידי טיפול בחומר הגנוטוקסי בלבד בולט מכדי לאפשר זיהוי של קיצור נוסף באמצעות מחשוף S1.

יש לציין כי חוסר ההשפעה של ה-S1 עשוי לשקף גם בעיות טכניות כגון תנאים לקויים לפעילות S1, כולל pH לא הולם של מאגר S1 או כמות מוגבלת של אבץ.

Figure 1
איור 1: זיהוי של פערי ssDNA לאחר שכפול על מזלגות מתמשכים על ידי בדיקת S1 Fiber. (A) ייצוג סכמטי של מבחני סיבי DNA עם ssDNA ספציפי S1 nuclease (סיבי S1). מזלגות שכפול מתקדמים מסומנים באנלוגי תימידין (IdU, CldU) וניתן למדוד אותם לאחר התפשטות דנ"א ושמירה חיסונית. משמאל, מזלגות מתקדמים סטנדרטיים ללא רווחים אינם רגישים לביקוע על ידי נוקלאז S1. נכון, פערים בדנ"א המתהווה שאינם ניתנים לגילוי באופן קונבנציונלי יכוונו על ידי נוקלאז S1 ויודגמו כדקים קצרים יותר של CldU. (B) סכימה של פרוטוקול סיבי S1. (C) תמונות מייצגות של סיבי S1. למעלה, לשלוט במערכת הדנ"א המתהווה ללא רווחים, אטומים לביקוע על ידי נוקלאז S1. תחתית, מערכת הדנ"א חיובית לפערים שנבקעו על ידי הנוקלאז S1 וכתוצאה מכך אורך קצר יותר של מערכת CldU (ירוקה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

במבחן מילוי הפערים (PRR), עלייה משמעותית בצפיפות של טלאי CldU קצרים על דרכי IdU מעידה על עלייה באירועי מילוי פערים (איור 2). צפיפות גבוהה של אירועי PRR יכולה לבוא לידי ביטוי על-ידי אירוע PRR אחד (תיקון ירוק/CldU) במערכת IdU קצרה, כמו גם על-ידי אירועי PRR מרובים במערכת ארוכה (ראו תמונות מייצגות איור 2C). הניתוח חייב להתבצע בקפדנות על ידי ניקוד רק של טלאי CldU שנמצאים על גבי קטעי IdU בהתחשב בכך שמדבקות ה-CldU קטנות וניתן בקלות לטעות בהן כרקע מכתים (ראו תמונות מייצגות איור 2C).

Figure 2
איור 2: זיהוי של תיקון לאחר שכפול על-ידי מילוי פערים. (B) סכמת הפרוטוקול המשמשת לאיתור מילוי פערים. (C) תמונות מייצגות מבדיקת מילוי פערים (PRR). משטחי IdU שמאליים וארוכים יותר עם לפחות תיקון CldU אחד ו/או פחות תיקוני CldU מתאימים בסך הכל לצפיפות מילוי פערים נמוכה (פחות אירועי מילוי פערים). נכון, דרכי IdU קצרות יותר עם לפחות תיקון CldU אחד ושטחי IdU ארוכים יותר עם יותר תיקוני CldU בסך הכל תואמים לצפיפות מילוי פער גבוהה (יותר אירועים למילוי פערים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים של פרוטוקול בדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטי נדונו בפרסום קודם32. כאן אנו מתארים גרסאות מותאמות של בדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטית כדי לחקור את נוכחותם של פערי ssDNA לאחר שכפול, כמו גם את תיקונם על ידי מילוי פערים, המתוארים לראשונהב-14. בהקשר של נוכחות פער ssDNA לאחר שכפול, השימוש בנוקלאז S1 בפרוטוקול S1 Fiber יהיה ככל הנראה מתאים לאחר חשיפה של סוכן גנוטוקסי למשך שעה לפחות כדי לאפשר זמן להיווצרות פערים ולזיהוי לאחר מכן. עם זאת, חשוב לציין כי בחלק מקווי התאים או הרקע הגנטי, השימוש בנוקלאז S1 עשוי ליצור דרכים קצרות יותר גם ללא טיפול נוסף בחומרים גנוטוקסיים33,34. לכן, חשוב לכלול את כל הבקרות כדי להבטיח מסקנה נכונה האם טיפול עם סוכן גנוטוקסי מוביל להצטברות פערים. בנוסף, חשוב לאמת עוד יותר את תוצאת סיבי S1 על ידי חזרה על הבדיקה בתנאים שבהם פערי ssDNA אינם נוצרים עוד או מתוקנים.

לגבי בדיקת מילוי הפערים (PRR), חשוב לייעל את המינון/ריכוז התרופתי של UVC שאינו משפיע על האורך הכולל של סיבי הדנ"א, שכן התוצאות מחושבות כצפיפות לפי קילו-בייס. אם משתמשים בריכוז שגורם לקיצור דרכי הנשימה, התוצאות עשויות להיות מוטות באופן מלאכותי לכיוון צפיפות מילוי פערים מוגברת, מה שמקשה על פענוח נתונים. כדי לנטרל מגבלה זו, ניתן לדמיין אירועים של מילוי פערים על גבי דנ"א שאינו מסומן על ידי צביעת סך הדנ"א באמצעות נוגדן נגד ssDNA, כפי שתואר קודם לכן14,16. יתר על כן, ניתן לבצע ניסוי קינטי כדי להבטיח זיהוי מרבי של אירועים ממלאי פערים.

שים לב שניתן גם לנטר אירועים של מילוי פערים באמצעות בדיקת סיבי S1 כאשר מאפשרים לתאים להתאושש לפני הטיפול בנוקלאז S1. באופן ספציפי, כאשר מרווחים לאחר שכפול מתמלאים, סיבי דנ"א הופכים להיות חסרי רגישות לביקוע על ידי נוקלאז S1, ולכן אורך סיבי הדנ"א יכול לשמש כקריאה למילוי פערים בהקשר זה28. לפיכך, ניתן להשתמש בגישה זו כדי לחקור מילוי פערים לאורך מחזור התא, בשונה מבדיקת PRR המוגבלת לחקירת מילוי פערים ב-G2/M.

לבסוף, נתונים שהתקבלו עם בדיקת ה- PRR אומתו באמצעות סיבי S128, מה שמרמז על כך שנוקודזול וחסימה מלאכותית של תאים ב- G2/M במהלך בדיקת PRR אינם משפיעים על מילוי הפער. סוכנים אחרים הגורמים לחסימת פאזה G2/M יכולים לשמש באופן פוטנציאלי בבדיקה זו

סיבי S1 נמצאים בשימוש הולך וגובר במעבדות ברחבי העולם, ומספקים תובנות חדשות על המנגנונים של היווצרות פערי ssDNA וחושפים תנאים שלא הוערכו בעבר, שבהם ניתן ליצור פערים אלה 14,29,34,35,36. לצורך חקירות עתידיות, יהיה מעניין לשלב את הפרוטוקולים המתוקנים הללו עם גישת הנקודות הקוונטיות המאפשרת הדמיה ישירה של נגע הדנ"א37 כדי להבהיר את השיחה ההדדית בין היווצרות פער ssDNA לאחר שכפול לבין תיקון DNA, כמו גם כיצד אופי הנזק מגדיר את המנגנון של תגובת הלחץ של השכפול. כחלופה למבחן סיבי S1, ניתן להשתמש בנוקלאז S1 גם כדי לחקור את תהליך מילוי הפערים בבדיקת שביט נייטרלי שונה. בקצרה, אם קיימים פערים, טיפול בשביטים עם נוקלאז S1 מוביל להיווצרות של שברים דו-גדיליים, הניתנים לזיהוי על ידי בדיקת שביט ניטרלית. פרוטוקולים לבדיקת שביט נייטרלי וכן לבדיקת שביט שעבר שינוי אנזים פורסמו בעבר38,39. בפרט, גישה זו מאפשרת זיהוי פער ssDNA בכל שלבי מחזור התא, ללא צורך לעצור תאים בשלב G2. באמצעות גישה זו, בשילוב עם פרוטוקולי S1 Fiber ומילוי פערים (PRR) שתוארו כאן, מצאנו כי REV3L (יחידת קטליטית DNA פולימראז זטה) אחראית למילוי פערים שנוצרו כאשר 6-4PPs המושרים על-ידי UV נמצאים בגנום האנושי14.

עם הגישה הטכנית הזמינה המוגבלת, היווצרות פערי ssDNA לאחר שכפול, ובמיוחד אירועים של מילוי פערים, נותרו במידה רבה בלתי נחקרים בתאים אנושיים. בסך הכל, הטכניקות המתוקנות הללו (סיבי S1, בדיקת מילוי פערים (PRR) ו-S1 Comet) מספקות אסטרטגיות חדשניות לחקר נוכחותם של פערי ssDNA וכיצד פערים אלה מתמלאים בסופו של דבר בגנום האנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

העבודה במעבדת C.F.M.M. נתמכת על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, סאו פאולו, ברזיל, מענקים #2019/19435-3, #2013/08028-1 ו-2017/05680-0) במסגרת מחקר שיתוף הפעולה הבינלאומי של FAPESP והארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO, הולנד); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, Glacial Synth 64-19-7 Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxide Synth 1336-21-6 Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005 -
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 Invitrogen A21470 -
Antibody Mouse anti-BrdU Becton Disckson 347580 -
Antibody Rat anti-BrdU Abcam  Ab6326 -
Biological security hood Pachane PA 410 Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294 Or similar
Cell scraper Thermo Scientific 179693 Or similar
CldU Millipore-Sigma C6891 -
Cloridric acid Synth 7647-01-0 Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) Zeiss - Or similar
Cover glass (or coverslips) Thermo Scientific 152460 Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose LGC/Gibco BR30211-05/12100046 Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich E5314 Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200 Zeiss - Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco 12657-029 Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 3110 13-998-074 Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jar Sigma-Aldrich S5516 Or similar
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5 Or similar
Idu Millipore-Sigma I7125 -
Magnesium Chloride Synth 7791-18-6 Or similar
Methanol Merck 67-56-1 Or similar
Microscope slides Denville M1021 Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) Synth 1132-61-2 Or similar
Nocodazole Sigma-Aldrich 31430-18-9 -
PBS (Phosphate Buffer Saline) Life Thechnologies 3002 Or similar
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Or similar
ProLong Gold AntiFade Mountant Invitrogen P36930 Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae Invitrogen 18001-016 Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) BioRad 161-0302 Or similar
Sodium Acetate Trihydrate Sigma-Aldrich 6131-90-4 Or similar
Sodium Chloride Synth  7647-14-5 Or similar
Sucrose Sigma-Aldrich 57-50-1 Or similar
Tris Base West Lab Research BP152-1 Or similar
Triton X-100 Synth 9002-93-1 Or similar
Trypsin Gibco 25200072 Or similar
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Or similar
UVC Lamp Non Specific - Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV Radiometer Vilber Loumart - Or similar
Zinc Acetate Sigma-Aldrich 557-34-6 Or similar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).

Tags

גנטיקה גיליון 180 פער דנ"א חד-גדילי לאחר שכפול מילוי פערים תיקון לאחר שכפול שכפול DNA בדיקת סיבי DNA בדיקת סיבי DNA נוקלאז S1 נזיפה
זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet,… More

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. M. Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay. J. Vis. Exp. (180), e63448, doi:10.3791/63448 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter