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Genetics

डीएनए फाइबर परख का उपयोग कर मानव कोशिकाओं में पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल संचय और मरम्मत का पता लगाना

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63448
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम घाव प्रेरण के बाद डीएनए की प्रतिकृति में एकल-फंसे डीएनए अंतराल की जांच करने के लिए डीएनए फाइबर परख के दो संशोधनों का वर्णन करते हैं। एस 1 फाइबर परख एसएसडीएनए-विशिष्ट एस 1 एंडोन्यूक्लाइज का उपयोग करके पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जबकि अंतर-भरने वाली परख अंतराल की मरम्मत के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देती है।

Abstract

डीएनए फाइबर परख मानव कोशिकाओं में डीएनए संश्लेषण के दौरान शामिल न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स के इम्यूनोडिटेक्शन के आधार पर प्रतिकृति कांटा गतिशीलता के विश्लेषण के लिए एक सरल और मजबूत तरीका है। हालांकि, इस तकनीक में कुछ हजार किलोबेस का सीमित रिज़ॉल्यूशन है। नतीजतन, पोस्ट-प्रतिकृति एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) अंतराल के रूप में कुछ सौ ठिकानों के रूप में छोटे मानक परख द्वारा पता लगाने योग्य नहीं हैं। यहां, हम डीएनए फाइबर परख के एक संशोधित संस्करण का वर्णन करते हैं जो एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग करता है, एक एंजाइम जो विशेष रूप से एसएसडीएनए को क्लीव करता है। पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति में, एस 1 न्यूक्लियस अंतराल को लक्षित और क्लीव करेगा, जिससे छोटे ट्रैक्ट उत्पन्न होंगे जिन्हें चल रहे कांटे पर एसएसडीएनए अंतराल के लिए रीड-आउट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल तब बनते हैं जब क्षतिग्रस्त डीएनए को असंतत रूप से दोहराया जाता है। उन्हें जीनोम प्रतिकृति से असंबद्ध तंत्र के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, एक प्रक्रिया में जिसे गैप-फिलिंग या पोस्ट-रेप्लिकेटिव मरम्मत के रूप में जाना जाता है। क्योंकि गैप-फिलिंग तंत्र में एस चरण से स्वतंत्र डीएनए संश्लेषण शामिल है, डीएनए फाइबर लेबलिंग योजना में परिवर्तन को गैप-फिलिंग घटनाओं की निगरानी के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, डीएनए फाइबर परख के ये संशोधन यह समझने के लिए शक्तिशाली रणनीतियां हैं कि मानव कोशिकाओं के जीनोम में पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल कैसे बनते हैं और भरे जाते हैं।

Introduction

मौलिक कार्यों ने बैक्टीरिया1 और मानव कोशिकाओं 2,3 में डीएनए हानिकारक एजेंटों के साथ उपचार पर पोस्ट-प्रतिकृति एकल-फंसे (एसएसडीएनए) अंतरालके संचय का सबूत प्रदान किया है। क्षतिग्रस्त डीएनए टेम्पलेट्स की प्रतिकृति के दौरान, डीएनए संश्लेषण मशीनरी विशिष्ट ट्रांसलेशन संश्लेषण डीएनए पोलीमरेज़ को नियोजित करके या टेम्पलेट स्विचिंग तंत्र के माध्यम से घावों को बाईपास कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, रेप्लिसोम बाद में मरम्मत के लिए एसएसडीएनए गैप को पीछे छोड़कर घाव को भी छोड़ सकता है। हाल ही में, एक अध्ययन से स्पष्ट रूप से पता चला है कि जीनोटॉक्सिक एजेंटों के साथ उपचार प्रतिकृति मध्यवर्ती4 की विशिष्ट संरचना की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यूकेरियोट्स में एसएसडीएनए अंतराल की ओर जाता है। पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल के इन क्षेत्रों का गठन शुरू में डीएनए प्रतिकृति2 के अर्ध-असंतत मोड का एक सरल परिणाम होने का प्रस्ताव किया गया था। इस मामले में, लैगिंग स्ट्रैंड पर एक घाव ओकाज़ाकी टुकड़े के बढ़ाव को अवरुद्ध कर सकता है, लेकिन कांटा प्रगति स्वाभाविक रूप से निम्नलिखित ओकाज़ाकी टुकड़े द्वारा बचाया जाता है, जिससे एसएसडीएनए अंतर पीछे छूट जाता है। हालांकि, आगे के अध्ययनों से पता चला है कि अग्रणी स्ट्रैंड पर अंतराल का गठन भी संभव है, जैसा कि पहले बैक्टीरिया5 में दिखाया गया है। यूकेरियोट्स में, प्राइमेस गतिविधि के साथ एक अद्वितीय डीएनए पोलीमरेज़, प्रिमपोल को डीएनए संश्लेषण को पुनरारंभ करने में सक्षम दिखाया गया था, जो इसकी रीप्रिमिंग गतिविधि 6,7,8,9,10,11 के माध्यम से एक प्रतिकृति अवरुद्ध घाव है। इस प्रकार, प्रिमपोल प्राइमेज़ गतिविधि मानव कोशिकाओं में डीएनए हानिकारक एजेंट के साथ उपचार पर अग्रणी स्ट्रैंड में पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल के गठन की व्याख्या कर सकती है12. बहरहाल, इन अंतरालों का पता लगाने के साथ-साथ अंतराल की मरम्मत, हाल ही में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी4 या प्लास्मिड-आधारित परख13 जैसे अप्रत्यक्ष या समय लेने वाले दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। मानव कोशिकाओं में अंतराल का पता लगाने के लिए एसएसडीएनए-विशिष्ट एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग चालीस साल पहले शुरुआती अध्ययनों द्वारा सुक्रोज ढाल तकनीक 2,3 का उपयोग करके किया गया था। हाल ही में, हमारे समूह ने डीएनए फाइबर और धूमकेतु परख14 जैसे अन्य तरीकों का उपयोग करके डीएनए (पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल) को दोहराने में एसएसडीएनए का पता लगाने के लिए इस न्यूक्लियस के उपयोग को लागू किया। इन नए दृष्टिकोणों ने पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल पर अध्ययन के वर्तमान उछाल का मार्ग प्रशस्त किया। यहां, हम डीएनए फाइबर परख द्वारा पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल का पता लगाने के लिए एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग करने की रणनीति का वर्णन करते हैं और बताते हैं कि डीएनए फाइबर प्रोटोकॉल में एक अंतर लेबलिंग योजना इन अंतरालों की मरम्मत के अध्ययन की अनुमति कैसे दे सकती है।

डीएनए फाइबर परख एक शक्तिशाली तकनीक है जिसका उपयोग प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या द्वारा किया गया है और प्रतिकृति कांटा गतिशीलता और प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रिया तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। संक्षेप में, यह तकनीक प्रतिकृति डीएनए में न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स (जैसे सीएलडीयू -5-क्लोरो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन-, और आईडीयू -5-आयोडो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन) के अनुक्रमिक समावेश पर आधारित है। कटाई के बाद, कोशिकाओं को लाइज़ किया जाता है, और डीएनए अणु सकारात्मक रूप से लेपित ग्लास स्लाइड पर फैलते हैं। सीएलडीयू और आईडीयू को तब विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है, जिसे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में द्विरंगी फाइबर के रूप में देखा जा सकता है। अंत में, डीएनए क्षति प्रेरण के परिणामस्वरूप डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता के किसी भी परिवर्तन की पहचान करने के लिए आईडीयू और सीएलडीयू ट्रैक्ट की लंबाई को मापा जाता है। इस तकनीक का उपयोग विभिन्न घटनाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि कांटा स्टालिंग, कांटा धीमा, नवजात डीएनए गिरावट, और मूल फायरिंग15,16 की आवृत्ति में भिन्नता।

डीएनए फाइबर परख की एक सीमा कुछ किलोबेस का संकल्प है। क्योंकि पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल सैकड़ों ठिकानों की सीमा में हो सकते हैं, इसलिए मानक डीएनए फाइबर प्रोटोकॉल द्वारा सीधे इन अंतरालों की कल्पना करना असंभव है। जीनोटॉक्सिक एजेंटों के साथ इलाज किए गए मानव कोशिकाओं में डीएनए की प्रतिकृति पर एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति को अप्रत्यक्ष रूप से पहले फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, एसएसडीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन, प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) की भर्ती द्वारा मूल्यांकन के रूप में एसएसडीएनए का अवलोकन, एस चरण के बाहर कोशिकाओं में, या एसएसडीएनए के गठन के रूप में क्षारीय डीएनए अनवाइंडिंग द्वारा डीएनए फाइबर परख 12,17,18,19,20,21 द्वारा लंबे समय तक कांटा स्टालिंग की अनुपस्थिति के साथ संयुक्त रूप से पता चला है एसएसडीएनए अंतराल के संचय के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। इसके अलावा, पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल एक एटीआर-निर्भर जी 2 / एम चरण चेकपॉइंट को प्रेरित करते हैं और प्रतिकृति जहर18,19,20,21,22 के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं को गिरफ्तार करते हैं।

एस 1 न्यूक्लियस एकल-फंसे हुए न्यूक्लिक एसिड को नीचा दिखाता है जो 5'-फॉस्फोरिल मोनो- या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जारी करता है और आरएनए की तुलना में एसएसडीएनए के लिए 5 गुना अधिक आत्मीयता रखता है। डबल-फंसे न्यूक्लिक एसिड (डीएनए: डीएनए, डीएनए: आरएनए, या आरएनए: आरएनए) एस 1 न्यूक्लियस के प्रतिरोधी होते हैं, सिवाय इसके कि जब अत्यधिक उच्च सांद्रता में उपयोग किया जाता है। एस 1 न्यूक्लियस निक, गैप, बेमेल या लूप के कारण एकल-फंसे हुए क्षेत्र में डबल-फंसे डीएनए को भी क्लीव करता है। एस 1 न्यूक्लियस इस प्रकार एक एसएसडीएनए-विशिष्ट एंडोन्यूक्लाइज है जो एसएसडीएनए अंतराल को क्लीविंग करने में सक्षम है, अंततः डबल-फंसे हुए ब्रेक23,24 उत्पन्न करता है। इस प्रकार, डीएनए फाइबर प्रोटोकॉल में एस 1 न्यूक्लियस पाचन के लिए कदम जोड़ना अप्रत्यक्ष रूप से पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल का पता लगाने में सक्षम बनाता है। अंतराल की उपस्थिति में, डीएनए प्रसार से पहले एस 1 न्यूक्लियस के साथ उजागर नाभिक का उपचार एसएसडीएनए के एस 1 दरार के परिणामस्वरूप छोटे ट्रैक्ट उत्पन्न करेगा जो स्वाभाविक रूप से अंतराल14 पर मौजूद है। तदनुसार, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके एसएसडीएनए अंतराल के लिए ट्रैक्ट शॉर्टनिंग रीड-आउट है। मानक डीएनए फाइबर प्रोटोकॉल की तुलना में, एस 1 न्यूक्लियस के साथ डीएनए फाइबर को केवल दो अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है: नाभिक एक्सपोजर (सेल पारगम्यता) और एस 1 न्यूक्लियस के साथ उपचार। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि उचित नियंत्रण अनिवार्य हैं, जैसे कि जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ इलाज किए गए नमूने लेकिन एस 1 न्यूक्लियस के बिना और जीनोटॉक्सिक एजेंट के बिना एस 1 न्यूक्लियस के साथ इलाज किए गए नमूने। प्रोटोकॉल ही, एनालॉग्स, एस 1 उपचार, और प्रसार के समावेश सहित, एक दिन में किया जा सकता है और असाधारण सामग्री की आवश्यकता नहीं है। इसके लिए केवल थाइमिडीन एनालॉग्स, शुद्ध एस 1 न्यूक्लियस, उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, एस 1 न्यूक्लियस को नियोजित करने वाला डीएनए फाइबर अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण का उपयोग करके चल रहे प्रतिकृति कांटे पर एसएसडीएनए अंतराल का पता लगाता है।

प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रिया तंत्र के परिणामस्वरूप गठित पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल को विभिन्न तंत्रों द्वारा मरम्मत (या भरा) किया जा सकता है, जिसमें ट्रांसलेशन डीएनए संश्लेषण या टेम्पलेट स्विचिंग शामिल है, जिसे गैप-फिलिंग या पोस्ट-प्रतिकृति मरम्मत (पीआरआर) 25 कहा जाता है। ये प्रक्रियाएं अग्रिम कांटे के पीछे होती हैं, जिसमें प्रतिकृति-स्वतंत्र डीएनए संश्लेषण 14,26,27 शामिल है। इन निष्कर्षों के आधार पर, मानक डीएनए फाइबर परख से अलग एक लेबलिंग योजना सीधे जी 2 चरण में अंतर-भरने की घटनाओं की कल्पना करने के लिए की जा सकती है 14,16,26,28। विशेष रूप से, एक थाइमिडीन एनालॉग का उपयोग जीनोटॉक्सिक उपचार और पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए गैप गठन के समय प्रतिकृति कांटा को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, जबकि एक अन्य थाइमिडीन एनालॉग का उपयोग गैप-फिलिंग इवेंट्स को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को पहले थाइमिडीन एनालॉग (आईडीयू, उदाहरण के लिए) के साथ लेबल किया जाता है, तुरंत बाद या 1 घंटे के लिए जीनोटॉक्सिक उपचार के साथ सहवर्ती रूप से, ताकि नवजात डीएनए को अंतराल गठन के समय लेबल किया जा सके। एम में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए 12-24 घंटे के बीच कहीं भी उपचार पर नोकोडाज़ोल जोड़ा जाता है, निम्नलिखित एस चरण को रोकता है। नोकोडाज़ोल उपचार के अंतिम 4 घंटे के लिए, गैप भरने के दौरान शामिल करने के लिए मीडिया में एक दूसरा थाइमिडीन एनालॉग (सीएलडीयू, उदाहरण के लिए) जोड़ा जाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख का उपयोग केवल जी 2 में गैप-फिलिंग इवेंट्स का पता लगाने के लिए किया जा सकता है क्योंकि सीएलडीयू से गैप-फिलिंग सिग्नल को एस चरण में डीएनए की प्रतिकृति में सीएलडीयू निगमन के कारण सिग्नल से अलग नहीं किया जा सकता है। इसलिए, पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, क्षति प्रेरण के बाद सीएलडीयू निगमन का समय तब मेल खाना चाहिए जब अधिकांश सेल आबादी जी 2 चरण14 में प्रवेश कर रही हो। इसलिए, यह समय सेल लाइन और उपचार की स्थिति के आधार पर अलग-अलग होगा। इस परख को नियोजित करने से पहले सेल चक्र प्रगति का अनुकूलन करने की सलाह दी जाती है। इन थाइमिडीन एनालॉग्स का सह-धुंधला होना नवजात डीएनए (आईडीयू ट्रैक्ट) के शीर्ष पर गैप-फिलिंग (पीआरआर) ट्रैक्ट्स (सीएलडीयू पैच) के दृश्य की अनुमति देता है, जब एसएसडीएनए अंतराल उत्पन्न होने पर जीनोटॉक्सिक उपचार के दौरान संश्लेषित किया जाता है।

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Protocol

जैसा कि अध्ययन मानव कोशिकाओं का उपयोग करता है, मानव नमूनों के साथ अनुसंधान के लिए साओ पाउलो विश्वविद्यालय (आईसीबी-यूएसपी, अनुमोदन संख्या # 48347515.3.00005467) में बायोमेडिकल साइंस संस्थान की आचार समिति द्वारा काम को मंजूरी दी गई थी।

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पिछले प्रकाशनों में मामूलीसंशोधनों 14,16,28 के साथ किया गया था। यहां डीएनए हानिकारक एजेंट के रूप में पराबैंगनी प्रकाश सी (यूवीसी) के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है। हालांकि, अन्य डीएनए हानिकारक एजेंट जैसे सिस्प्लैटिन और हाइड्रॉक्सीयूरिया को भी सफलतापूर्वकनियोजित किया गया है। इस प्रोटोकॉल यू 2 ओएस, एचईके 2 9 3 टी, मानव फाइब्रोब्लास्ट और अन्य 14,28,29 सहित सेल लाइनों की एक सरणी में किया जा सकता है। यह इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन से पहले प्रयोगात्मक प्रश्न निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। एस 1 न्यूक्लियस (जिसे एस 1 फाइबर कहा जाता है) के साथ डीएनए फाइबर परख का उपयोग पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति का पता लगाने के लिए किया जाता है, जबकि गैप-फिलिंग (या पीआरआर) परख जी 2 चरण में अंतर-भरने की घटनाओं को मापने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, यदि पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति का विश्लेषण करते हैं, तो अन्वेषक को अनुभाग 2 (एस 1 फाइबर प्रयोगात्मक सेटअप) करना चाहिए और प्रोटोकॉल की धारा 4 (फैलाने से डीएनए फाइबर तैयारी) पर सीधे आगे बढ़ना चाहिए। यदि अंतर-भरने की घटनाओं का विश्लेषण करते हैं, तो अन्वेषक को सीधे धारा 3 (गैप-फिलिंग (पीआरआर) प्रयोगात्मक सेटअप) पर आगे बढ़ना चाहिए।

1. अभिकर्मकों और सेटअप

  1. थाइमिडीन एनालॉग्स: 1 एन एनएच4ओएच में 100 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 5-आयोडो -2 '-डीऑक्सीयूरिडीन (आईडीयू) और 5-क्लोरो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (सीएलडीयू) को फिर से निलंबित करें। एक बाँझ सिरिंज फिल्टर (0.2 μm), विभाज्य के माध्यम से एनालॉग्स फ़िल्टर, और उन्हें -20 सी पर स्टोर करें।
  2. एंटीबॉडी: प्राइमरी - एंटी-बीआरडीयू चूहा (बायोराड) और एंटी-बीआरडीयू माउस (बीडी); सेकेंडरी - एंटी-रैट एलेक्सा फ्लोर 488 और एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 594।
  3. एस 1 फाइबर के लिए सेलुलर पारगम्यता सीएसके 100 बफर: आसुत एच2ओ में 100 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम एमओपीएस [पीएच 7], 3 एमएम एमजीसीएल2 [पीएच 7.2], 300 एमएम सुक्रोज और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 जोड़ें।
  4. एस 1 न्यूक्लियस बफर [पीएच 4.6]: एच2ओ में 30 एमएम सोडियम एसीटेट [पीएच 4.6], 10 एमएम जिंक एसीटेट, 50 एमएम एनएसीएल और 5% ग्लिसरॉल जोड़ें।
    नोट: एस 1 न्यूक्लियस बफर में 4.6 का अंतिम पीएच होना चाहिए, क्योंकि एस 1 गतिविधि पीएच > 4.9 पर 50% गिरजाती है।
  5. विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें एस 1 न्यूक्लियस निर्माता द्वारा प्रदान किए गए एस 1 न्यूक्लियस कमजोर पड़ने वाले बफर में ए ओरिज़े से शुद्ध पूर्व-पतला है।
  6. अंतराल भरने के लिए 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमएसओ में नोकोडाजोल का पुनर्गठन करें। जाँच।
  7. लाइसिस बफर: एच 2ओ में 200 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 7.5], 50 एमएम ईडीटीए और 0.5% एसडीएस जोड़ें।
  8. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें।
  9. पीबीएस में 0.1% ट्वीन -20 जोड़कर पीबीएस-टी तैयार करें।
  10. पीबीएस में 5% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें।
  11. पीबीएस में 0.1% बीएसए तैयार करें।
  12. पीबीएस-टी में 1% बीएसए जोड़कर पीबीएस-टी-बीएसए तैयार करें।
    नोट: 510 एनएम तरंग दैर्ध्य और 42 एनएम बैंडविड्थ जीएफपी (एफआईटीसी, एलेक्सा फ्लोर 488) उत्सर्जन फिल्टर और 624 एनएम तरंग दैर्ध्य और 40 एनएम बैंडविड्थ टेक्सास रेड (एलेक्सा फ्लोर 594) उत्सर्जन फिल्टर या 488-एनएम लाइन (नीले) लेजर के साथ एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें 575 और 680 एनएम के बीच पाया गया)। विसर्जन उद्देश्य (40x, 63x या 100x)।

2. एस 1 फाइबर प्रयोगात्मक सेटअप (2 दिन)

  1. दिन 1: प्रत्येक सेल लाइन के लिए प्लेट 4 कुएं: 70-90% संगम पर कोशिकाओं के साथ यूवीसी और ± एस 1 न्यूक्लियस ±।
    नोट: प्रयोग एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के रूप में छोटे के रूप में एक प्रारूप में किया जा सकता है। इस मामले में, सभी समाधानों का उपयोग 0.5 एमएल /
  2. दिन 2: पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सेल संस्कृति मीडिया में 20 μM पर ताजा आईडीयू और 200 μM पर सीएलडीयू तैयार करें।
  3. संस्कृति मीडिया की आकांक्षा और तुरंत 20 μM आईडीयू के साथ मीडिया जोड़ने और ठीक20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 (सेल इनक्यूबेटर) पर कोशिकाओं सेते हैं।
  4. जल्दी से पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  5. एम2 यूवीसी के साथ कोशिकाओं को विकिरणित करें। अनुपचारित कक्षों को नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
  6. तुरंत 200 μM CldU के साथ मीडिया जोड़ें और ठीक 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (सेल इनक्यूबेटर) पर कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: आईडीयू और सीएलडीयू लेबलिंग को इंटरचेंज किया जा सकता है, लेकिन दूसरे एनालॉग की एकाग्रता पहले एनालॉग की तुलना में 5-10 गुना अधिक होनी चाहिए। एनालॉग इनक्यूबेशन का समय उपयोग किए जाने वाले जीनोटॉक्सिक एजेंट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन दूसरे एनालॉग इनक्यूबेशन का समय अंतराल गठन14,16 के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त लंबा होना चाहिए। यदि डीएनए हानिकारक दवा का उपयोग कर रहे हैं, तो सीएलडीयू 28,29,30 के साथ दवा जोड़ें।
  7. दो बार पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  8. कमरे के तापमान (आरटी) पर 8-10 मिनट के लिए सीएसके 100 बफर के साथ कोशिकाओं को पारगम्य करें।
    नोट: सफल पारगम्यता को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत जांचा जा सकता है जहां केवल नाभिक अवलोकन योग्य होना चाहिए
  9. ध्यान से नाभिक को पीबीएस के साथ धो लें (प्रत्येक कुएं के किनारे 0.5 एमएल डालें, बस कुछ सेकंड के लिए)।
  10. ध्यान से एस 1 बफर के साथ नाभिक धो लें (प्रत्येक कुएं के किनारे 0.5 एमएल डालें, बस कुछ सेकंड के लिए)।
  11. एमएल) के साथ एस 1 बफर के साथ नाभिक सेते हैं या 37 डिग्री सेल्सियस (सेल इनक्यूबेटर) पर 30 मिनट के लिए (नियंत्रण के रूप में) के बिना।
  12. एस 1 बफर की आकांक्षा करें और पीबीएस में 0.1% बीएसए जोड़ें।
  13. नाभिक को परिमार्जन करें और उन्हें उचित रूप से एनोटेट 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूबों को हर समय बर्फ पर रखें।
    नोट: नाभिक की सफल टुकड़ी को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत जांचा जा सकता है।
  14. नाभिक गोली: 5 मिनट के लिए ~ 4600 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: मानक डीएनए फाइबर परख से अलग, नाभिक की गिनती नहीं की जा सकती है, इसलिए चढ़ाया कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या पर विचार करें। वैकल्पिक रूप से, एक अतिरिक्त कुआं जो पारगम्यता के अधीन नहीं था, का उपयोग हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।
  15. ~ 1500 कोशिकाओं/μL की एकाग्रता पर पीबीएस में छर्रों को अच्छी तरह से निलंबित करें, बर्फ पर ट्यूबों को रखें और तुरंत (धारा 4) प्रोटोकॉल फैलाकर डीएनए फाइबर तैयारी के लिए आगे बढ़ें

3. गैप भरने (पीआरआर) प्रयोगात्मक सेटअप (3 दिन)

  1. दिन 1: प्रत्येक सेल लाइन के लिए प्लेट 2 कुएं: ~ 70% संगम पर कोशिकाओं के साथ यूवीसी ±।
  2. दिन 2: पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सेल संस्कृति मीडिया में 20 μM पर ताजा आईडीयू तैयार करें।
  3. एम2 यूवीसी के साथ कोशिकाओं को विकिरणित करें।
  4. तुरंत 20 μM आईडीयू के साथ मीडिया जोड़ें और ठीक 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 (सेल इनक्यूबेटर) पर कोशिकाओं सेते हैं।
  5. दो बार पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  6. एमएल नोकोडाज़ोल के साथ मीडिया जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं,12-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 (सेल इनक्यूबेटर) (इस चरण का समय प्रयोगों के बीच सुसंगत रखा जाना चाहिए)।
    नोट: नोकोडाज़ोल की एकाग्रता को उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि जीनोटॉक्सिक दवा का उपयोग कर रहे हैं, तो आईडीयू ± दवा28 के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. दिन 3: संस्कृति मीडिया की आकांक्षा करें, 20 μM CldU + नोकोडाज़ोल के साथ मीडिया जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (सेल इनक्यूबेटर) पर नोकोडाज़ोल उपचार के अंतिम 4 घंटे के लिए सेते हैं।
  8. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  9. ट्रिप्सिन जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 (सेल इनक्यूबेटर) पर1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. सेल संस्कृति मीडिया की एक ही मात्रा जोड़ें और एक उचित रूप से एनोटेट 1.5 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं (मीडिया + ट्रिप्सिन) एकत्र करें। ट्यूबों को हर समय बर्फ पर रखें।
  11. हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  12. कोशिकाओं गोली: 5 मिनट के लिए ~ 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  13. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ~ 1500 कोशिकाओं / μL पर पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और तुरंत प्रोटोकॉल फैलाकर डीएनए फाइबर तैयारी शुरू करें (दिन 3 या 4)।

4. फैलाने से डीएनए फाइबर तैयारी (~ 12 स्लाइड के लिए 1 घंटे)

  1. एक कार्बन पेंसिल के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड एनोटेट करें और उन्हें ट्रे पर फ्लैट रखें।
  2. होमोजेनाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब के नीचे टैप करें।
  3. इसी स्लाइड के शीर्ष पर कोशिकाओं के 2 μL जोड़ें।
    नोट: दो बूंदें जोड़ी जा सकती हैं, एक स्लाइड के शीर्ष पर और दूसरा स्लाइड के बीच में।
  4. लाइसिस बफर के 6 μL जोड़ें और लगभग 5 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कोशिकाओं को लाइज़ करें (बुलबुले बनाने से बचें)।
  5. पिपेट टिप के साथ स्लाइड के नीचे की ओर थोड़ा सा ड्रॉप खींचें (ड्रॉप फैलाने के पथ का मार्गदर्शन करने के लिए)।
  6. नाभिक लाइज़ करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: लाइसिस बफर की मात्रा और लाइसिस के समय को समायोजित किया जा सकता है यदि लाइसेट बहुत जल्दी सूख जाता है या वैकल्पिक रूप से, पर्याप्त सूखता नहीं है। लाइसिस बफर वॉल्यूम 5-7 μL से भिन्न हो सकता है और समय 4-10 मिनट के बीच गिर सकता है।
  7. लगभग 20-40 ° पर स्लाइड झुकाएं और ड्रॉप को निरंतर, कम गति पर स्लाइड के नीचे तक फैलने दें।
  8. स्लाइड को अंधेरे (10-15 मिनट) में आरटी पर सूखने दें।
  9. ताजा फिक्सिंग समाधान तैयार करें: मिश्रण मेथनॉल: 3: 1 अनुपात में ग्लेशियल एसिटिक एसिड।
  10. फिक्सिंग समाधान युक्त एक जार में स्लाइड विसर्जित और स्लाइड पर डीएनए को ठीक करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    सावधानी: मेथनॉल अत्यधिक विषाक्त है और इसे रासायनिक हुड के तहत रखा जाना चाहिए। एक उपयुक्त कंटेनर में त्यागें।
  11. अंधेरे में आरटी पर स्लाइड सूखी और धुंधला होने तक प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. डीएनए फाइबर के इम्यूनोस्टेनिंग (~ 6 घंटे)

  1. 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ स्लाइड धो लें।
  2. आरटी में 40-60 मिनट के लिए ताजा तैयार 2.5 एम एचसीएल के साथ डीएनए विकृत करें।
    सावधानी: 2.5 एम एचसीएल तैयार करने के लिए, पानी में एसिड डालें और कभी विपरीत न करें। यह एक एक्सोथर्मिक प्रतिक्रिया है इसलिए यह थोड़ा गर्म हो जाएगा।
  3. 5 मिनट के लिए तीन बार पीबीएस के साथ स्लाइड धो लें।
  4. 5% बीएसए के साथ ब्लॉक (तीन उपयोगों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है) पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया था।
  5. एक कागज पर धीरे से टैप करके स्लाइड से अतिरिक्त तरल निकालें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के 30 μL जोड़ें (माउस एंटी-बीआरडीयू 1/20 (आईडीयू के लिए) और चूहे एंटी-बीआरडीयू 1/100 (सीएलडीयू के लिए) पीबीएस-टी-बीएसए में पतला) ड्रॉपवाइज स्लाइड्स में और शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें। एक अंधेरे, आर्द्र कक्ष में आरटी पर 1-1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. 1-2 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक जार में स्लाइड रखें, फिर सावधानीपूर्वक कवरलिप्स को हटा दें।
  8. 5 मिनट के लिए तीन बार एक जार में पीबीएस-टी के साथ धोलें, फिर पीबीएस में स्लाइड रखें।
  9. एक कागज पर धीरे से टैप करके अतिरिक्त तरल निकालें।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 μL जोड़ें (एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 594 और एंटी-चूहा एलेक्सा फ्लोर 488 पीबीएस-टी-बीएसए में 1/75 पर पतला। एक अंधेरे, आर्द्र कक्ष में आरटी पर 45-60 मिनट के लिए सेते हैं।
  11. 1-2 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक जार में स्लाइड रखें, फिर सावधानीपूर्वक कवरलिप्स को हटा दें।
  12. 5 मिनट के लिए तीन बार एक जार में पीबीएस-टी के साथ धोलें, फिर पीबीएस में स्लाइड रखें।
  13. एक कागज पर धीरे से टैप करके अतिरिक्त तरल निकालें।
  14. स्लाइड में बढ़ते अभिकर्मक ड्रॉपवाइज के 20 μL जोड़ें और शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें। बुलबुले से बचें।
  15. स्लाइड्स को अंधेरे में आरटी पर सूखने दें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस (या लंबे संरक्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर करें।

6. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण (~ 1 घंटा प्रति नमूना)

नोट: एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप दोनों प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, गैप-फिलिंग (पीआरआर) परख के लिए, छवियों के बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

  1. स्लाइड के शीर्ष के पास विसर्जन तेल (माइक्रोस्कोप विशिष्ट) की एक बूंद रखें जहां कोशिकाओं को लाइसेड किया गया था और पृष्ठभूमि में हरे रंग के डॉट्स की खोज करके हरे रंग के चैनल का उपयोग करके फोकस ढूंढें (40x, 63x, और 100x उद्देश्यों का उपयोग किया जा सकता है)।
  2. तंतुओं की मुख्य एकाग्रता का पता लगाएं और चित्रों के लिए क्षेत्रों का चयन करने और संभावित पूर्वाग्रह से बचने के लिए केवल एक चैनल का उपयोग करके अच्छी तरह से फैले गैर-अतिव्यापी व्यक्तिगत फाइबर को खोजने के लिए किनारों पर जाएं।
  3. हरे और लाल चैनलों पर पूरी स्लाइड के साथ प्रति स्लाइड लगभग 15-20 चित्र लें और बाइकलर डीएनए फाइबर प्राप्त करने के लिए दो चैनलों को मर्ज करें।
    नोट: यदि एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो उच्च रिज़ॉल्यूशन (1024 x 1024 पिक्सेल) पर चित्र लें और लाल और हरे प्रतिदीप्ति दोनों के लिए 1 के करीब पिनहोल मूल्यों का उपयोग करें।
  4. आईडीयू और सीएलडीयू ट्रैक्ट लंबाई माप के लिए इमेजजे (एनआईएच, https://imagej.nih.gov/ij/ द्वारा प्रदान किए गए मुफ्त सॉफ़्टवेयर) का उपयोग करें।
    1. किसी चित्र को छविJ बॉक्स में खींचकर खोलें.
    2. लंबाई को माइक्रोमीटर में परिवर्तित करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर (उचित रूप से कैलिब्रेटेड) द्वारा उत्पन्न स्केल बार का उपयोग करें। माइक्रोमीटर प्रदान किए गए चित्र में स्केल बार को मापने और पिक्सेल में माप प्राप्त करने के लिए इमेजजे बॉक्स पर बाएं सेदाएं 5 आइकन का चयन करके सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें। विश्लेषण > सेट स्केल पर क्लिक करें और उपयुक्त संख्या और μm करने के लिए "लंबाई की इकाई" के साथ "पिक्सेल में दूरी" को प्रतिस्थापित करें।
    3. इमेजजे बॉक्स पर, बाएं से दाएं 5 आइकन पर बाएं-क्लिक करके और फिर ऊपर से नीचे तक दूसरे विकल्प का चयन करके खंडित रेखा उपकरण का चयन करें।
    4. बाएं-क्लिक करके लाल (आईडीयू) या हरे (सीएलडीयू) पथ का सटीक पथ खींचें और राइट-क्लिक करके ड्राइंग को रोकें। लंबाई मापने के लिए कीबोर्ड पर एम बटन दबाएं।
    5. एस 1 फाइबर के लिए, केवल लाल-हरे (बाइकलर फाइबर) 16 का विश्लेषण करें। प्रत्येक व्यक्तिगत फाइबर के लिए लाल और हरे रंग के ट्रैक्ट माप का ट्रैक रखकर विभिन्न चित्रों से कम से कम 150 फाइबर से लाल और हरे रंग की पथ की लंबाई को मापें।
    6. गैप-फिलिंग परख के लिए, केवल आईडीयू (लाल) ट्रैक्ट की लंबाई को मापें जिसमें कम से कम 1 सीएलडीयू (हरा) पैच होता है लेकिन कोई निरंतर सीएलडीयू धुंधला नहीं होता है। कम से कम 1 सीएलडीयू पैच के साथ विभिन्न चित्रों से कम से कम 10-15 आईडीयू ट्रैक्ट स्कोर करें।
      नोट: अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसे ज़ीस एलएसएम छवि ब्राउज़र।
  5. एस 1 फाइबर के लिए, आईडीयू ट्रैक्ट्स लंबाई, सीएलडीयू ट्रैक्ट लंबाई, और अनुपात (सीएलडीयू / आईडीयू या इसके विपरीत) को अलग-अलग ग्राफिक्स में माध्यिकाओं के साथ स्कैटर डॉट प्लॉट के रूप में प्लॉट करें।
  6. "प्रति किलोबेस घनत्व" की इकाइयों के रूप में गैप-फिलिंग घटनाओं को मापें, आईडीयू (लाल) पथ की दी गई लंबाई पर सीएलडीयू (पीआरआर, हरा) पैच की कुल संख्या को किलोबेस में लाल पथ की कुल लंबाई से विभाजित करें (1 μm = 2.59 किलोबेस31 पर विचार करते हुए)। फिर डेटा को माध्यिकाओं के साथ स्कैटर डॉट प्लॉट के रूप में प्लॉट करें।
  7. दोनों प्रयोगों में, मान-व्हिटनी (नॉनपैरामेट्रिक परीक्षण) का उपयोग करके दो नमूनों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण करें और क्रुस्कल-वालिस का उपयोग करके दो से अधिक नमूनों के बीच डन के कई तुलना परीक्षण के बाद।

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Representative Results

एस 1 फाइबर परख में, यदि जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ उपचार पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल की ओर जाता है, तो एस 1-उपचारित नाभिक से डीएनए फाइबर की समग्र लंबाई अनुपचारित नमूनों के साथ-साथ उन नमूनों की तुलना में डीएनए क्षति के साथ उपचार पर कम होगी जो जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ इलाज किए गए थे लेकिन एस 1 दरार (चित्रा 1) को प्रस्तुत नहीं किए गए थे।

वैकल्पिक रूप से, यदि अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में एस 1 न्यूक्लियस के साथ उपचार डीएनए फाइबर की लंबाई को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है, तो विभिन्न व्याख्याएं संभव हैं: (1) उपयोग किए गए जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ उपचार पर पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल का कोई गठन नहीं है, और / दरअसल, हमने पहले दिखाया है कि यूवी-प्रेरित 6-4 फोटोप्रोडक्ट्स (6-4 पीपी) लेकिन साइक्लोब्यूटेन पाइरीमिडीन डिमर्स (सीपीडी) न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत (एनईआर, एक्सपी-सी कोशिकाओं) 14 के लिए कमी वाली कोशिकाओं में एसएसडीएनए अंतराल के गठन का कारण बनता है। (2) एसएसडीएनए अंतराल की मरम्मत की गई थी और अब इसका पता नहीं लगाया जा सकता है। (3) अकेले जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ उपचार द्वारा प्रेरित शॉर्टनिंग एस 1 दरार के माध्यम से एक और शॉर्टनिंग का पता लगाने की अनुमति देने के लिए बहुत स्पष्ट है।

विशेष रूप से, एस 1 के प्रभाव की कमी एस 1 गतिविधि के लिए बिगड़ा हुआ स्थितियों जैसे तकनीकी मुद्दों को भी प्रतिबिंबित कर सकती है, जिसमें एस 1 बफर का अनुचित पीएच या जस्ता की सीमित मात्रा शामिल है।

Figure 1
चित्रा 1: एस 1 फाइबर परख द्वारा चल रहे कांटे पर पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल का पता लगाना (ए) एसएसडीएनए विशिष्ट एस 1 न्यूक्लियस (एस 1 फाइबर) के साथ डीएनए फाइबर परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रगतिशील प्रतिकृति कांटे को थाइमिडीन एनालॉग्स (आईडीयू, सीएलडीयू) के साथ लेबल किया जाता है और डीएनए प्रसार और इम्यूनोस्टेनिंग के बाद मापा जा सकता है। बाएं, अंतराल के बिना मानक प्रगतिशील कांटे एस 1 न्यूक्लियस द्वारा दरार के लिए अतिसंवेदनशील नहीं हैं। ठीक है, नवजात डीएनए में अंतराल जो पारंपरिक रूप से अज्ञात हैं, उन्हें एस 1 न्यूक्लियस द्वारा लक्षित किया जाएगा और छोटे सीएलडीयू ट्रैक्ट के रूप में कल्पना की जाएगी। (बी) एस 1 फाइबर प्रोटोकॉल की योजना। (सी) एस 1 फाइबर की प्रतिनिधि छवियां। शीर्ष, अंतराल के बिना नवजात डीएनए पथ को नियंत्रित करें, एस 1 न्यूक्लियस द्वारा दरार के लिए अभेद्य। नीचे, एस 1 न्यूक्लियस द्वारा क्लीव किए गए अंतराल के लिए डीएनए पथ सकारात्मक जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा सीएलडीयू (हरा) पथ लंबाई होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

गैप-फिलिंग (पीआरआर) परख में, आईडीयू ट्रैक्ट्स पर छोटे सीएलडीयू पैच के घनत्व में उल्लेखनीय वृद्धि अंतर-भरने की घटनाओं (चित्रा 2) में वृद्धि का संकेत है। पीआरआर घटनाओं का एक उच्च घनत्व एक छोटे आईडीयू पथ में 1 पीआरआर घटना (हरा / सीएलडीयू पैच) के साथ-साथ एक लंबे पथ में कई पीआरआर घटनाओं द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है (प्रतिनिधि छवियां चित्रा 2 सी देखें)। विश्लेषण केवल सीएलडीयू पैच को स्कोर करके कड़ाई से किया जाना चाहिए जो आईडीयू ट्रैक्ट के शीर्ष पर हैं, यह देखते हुए कि सीएलडीयू पैच छोटे हैं और आसानी से धुंधला पृष्ठभूमि के रूप में गलत किया जा सकता है (प्रतिनिधि छवियां चित्रा 2 सी देखें)।

Figure 2
चित्रा 2: गैप फिलिंग द्वारा पोस्ट-रेप्लिकेटिव मरम्मत का पता लगाना। (ए) हरे (सीएलडीयू) पैच के साथ लाल (आईडीयू) पथ की योजना एक गैप-फिलिंग इवेंट का संकेत देती है। (बी) अंतराल भरने का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल की योजना। (सी) अंतर-भरने (पीआरआर) परख से प्रतिनिधि छवियां। कम से कम एक सीएलडीयू पैच और / या कम सीएलडीयू पैच के साथ बाएं, लंबे आईडीयू ट्रैक्ट कुल कम अंतर-भरने वाले घनत्व (कम अंतर-भरने वाली घटनाओं) के अनुरूप हैं। दाएं, कम से कम एक सीएलडीयू पैच के साथ छोटे आईडीयू ट्रैक्ट और अधिक सीएलडीयू पैच के साथ लंबे आईडीयू ट्रैक्ट कुल उच्च अंतर-भरने वाले घनत्व (अधिक अंतर-भरने वाली घटनाओं) के अनुरूप हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानक डीएनए फाइबर परख प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों पर पिछले प्रकाशन32 में चर्चा की गई थी। यहां, हम मानक डीएनए फाइबर परख के संशोधित संस्करणों का वर्णन करते हैं ताकि पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति के साथ-साथ गैप-फिलिंग द्वारा उनकी मरम्मत की जांच की जा सके, शुरू में14 में वर्णित किया गया है। पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए गैप उपस्थिति के संदर्भ में, एस 1 फाइबर प्रोटोकॉल में एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग कम से कम 1 घंटे के लिए जीनोटॉक्सिक एजेंट के संपर्क के बाद उपयुक्त होगा ताकि अंतराल गठन और बाद में पता लगाने के लिए समय की अनुमति मिल सके। हालांकि, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि कुछ सेल लाइनों या आनुवंशिक पृष्ठभूमि में, एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग जीनोटॉक्सिक एजेंटों33,34 के साथ अतिरिक्त उपचार के बिना भी छोटे ट्रैक्ट उत्पन्न कर सकता है। इसलिए, जीनोटॉक्सिक एजेंट के साथ उपचार से अंतर संचय होता है या नहीं, इस पर उचित निष्कर्ष सुनिश्चित करने के लिए सभी नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, उन स्थितियों में परख को दोहराकर एस 1 फाइबर परिणाम को और मान्य करना महत्वपूर्ण है जिसमें एसएसडीएनए अंतराल अब नहीं बनते हैं या मरम्मत की जाती है।

गैप-फिलिंग (पीआरआर) परख के बारे में, एक यूवीसी खुराक / दवा एकाग्रता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है जो डीएनए फाइबर की समग्र लंबाई को प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि परिणामों की गणना प्रति-किलोबेस घनत्व के रूप में की जाती है। यदि एक एकाग्रता का उपयोग करना जो पथ को छोटा करने के लिए प्रेरित करता है, तो परिणाम कृत्रिम रूप से बढ़े हुए अंतर-भरने वाले घनत्व की ओर तिरछा हो सकते हैं, जिससे डेटा व्याख्या मुश्किल हो जाती है। इस सीमा का मुकाबला करने के लिए, एंटी-एसएसडीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके कुल डीएनए को धुंधला करके गैर-लेबल वाले डीएनए के शीर्ष पर गैप-फिलिंग घटनाओं की कल्पना की जा सकती है, जैसा कि पहले14,16 वर्णित है। इसके अलावा, अंतर-भरने की घटनाओं का अधिकतम पता लगाने के लिए एक गतिज प्रयोग किया जा सकता है।

ध्यान दें कि अंतराल भरने की घटनाओं को एस 1 फाइबर परख का उपयोग करके भी निगरानी की जा सकती है जब कोशिकाओं को एस 1 न्यूक्लियस के साथ उपचार से पहले ठीक होने की अनुमति दी जाती है। विशेष रूप से, जब पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल भर जाते हैं, तो डीएनए फाइबर एस 1 न्यूक्लियस द्वारा दरार के प्रति असंवेदनशील हो जाते हैं, और डीएनए फाइबर लंबाई इसलिए इस संदर्भ में अंतर भरने के लिए रीड-आउट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है28. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण का उपयोग पूरे सेल चक्र में अंतर-भरने का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, पीआरआर परख से अलग है जो जी 2 / एम में अंतर भरने की जांच तक सीमित है।

अंत में, पीआरआर परख के साथ प्राप्त डेटा को एस 1 फाइबर28 का उपयोग करके मान्य किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि पीआरआर परख के दौरान जी 2 / एम में कोशिकाओं के नोकोडाजोल और कृत्रिम रुकावट अंतर भरने को प्रभावित नहीं करते हैं। एम चरण रुकावट को प्रेरित करने वाले अन्य एजेंटों का उपयोग संभावित रूप से इस परख में किया जा सकता है

एस 1 फाइबर का उपयोग दुनिया भर में प्रयोगशालाओं द्वारा तेजी से किया गया है, एसएसडीएनए अंतराल गठन के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और पहले से अनुचित स्थितियों का खुलासा करता है जिसमें इन अंतरालों को 14,29,34,35,36 बनाया जा सकता है। भविष्य की जांच के लिए, क्वांटम डॉट दृष्टिकोण के साथ इन संशोधित प्रोटोकॉल को संयोजित करना दिलचस्प होगा जो डीएनए घाव37 के प्रत्यक्ष दृश्य को पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए अंतर गठन और डीएनए मरम्मत के बीच क्रॉस-टॉक को स्पष्ट करने की अनुमति देता है और साथ ही क्षति की प्रकृति प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रिया के तंत्र को कैसे परिभाषित करती है। एस 1 फाइबर परख के विकल्प के रूप में, एस 1 न्यूक्लियस का उपयोग संशोधित तटस्थ धूमकेतु परख में अंतर-भरने की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। संक्षेप में, यदि अंतराल मौजूद हैं, तो एस 1 न्यूक्लियस के साथ धूमकेतुओं का उपचार डबल-फंसे हुए ब्रेक के गठन की ओर जाता है, जो तटस्थ धूमकेतु परख द्वारा पता लगाने योग्य है। तटस्थ धूमकेतु परख के साथ-साथ एंजाइम-संशोधित धूमकेतु परख के लिए प्रोटोकॉल पहले38,39 प्रकाशित किए गए थे। विशेष रूप से, यह दृष्टिकोण सेल चक्र के सभी चरणों में एसएसडीएनए गैप डिटेक्शन की अनुमति देता है, जिसमें जी 2 चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने की आवश्यकता नहीं होती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, यहां वर्णित एस 1 फाइबर और गैप-फिलिंग (पीआरआर) प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त, हमने पाया कि आरईवी 3 एल (डीएनए पोलीमरेज़ जीटा उत्प्रेरक इकाई) मानव जीनोम14 में यूवी-प्रेरित 6-4 पीपी मौजूद होने पर अंतराल को भरने के लिए जिम्मेदार है।

सीमित उपलब्ध तकनीकी दृष्टिकोण के साथ, पोस्ट-प्रतिकृति एसएसडीएनए गैप गठन और, विशेष रूप से, अंतर-भरने की घटनाएं मानव कोशिकाओं में काफी हद तक अस्पष्टीकृत रही हैं। कुल मिलाकर, ये संशोधित तकनीकें (एस 1 फाइबर, गैप-फिलिंग (पीआरआर) परख, और एस 1 धूमकेतु) एसएसडीएनए अंतराल की उपस्थिति की जांच के लिए उपन्यास रणनीतियां प्रदान करती हैं और इन अंतरालों को अंततः मानव जीनोम में कैसे भरा जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

सीएफएमएम प्रयोगशाला में काम एफएपीईएसपी और नीदरलैंड संगठन से अंतर्राष्ट्रीय सहयोग अनुसंधान के तहत फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईएसपी, साओ पाउलो, ब्राजील, अनुदान # 2019 / 19435-3, # 2013 / 08028-1 और 2017 / 05680-0) द्वारा समर्थित है। कॉन्सेल्हो नैशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको ई टेक्नोलोगिको (सीएनपीक्यू, ब्रासीलिया, डीएफ, ब्राजील, अनुदान # 308868/2018-8] और कोर्डेनाकाओ डी एपरफेकोमेंटो डी पेसोसल डो एन्सिनो सुपीरियर (सीएपीएस, ब्रासीलिया, डीएफ, ब्राजील, वित्त कोड 001)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, Glacial Synth 64-19-7 Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxide Synth 1336-21-6 Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005 -
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 Invitrogen A21470 -
Antibody Mouse anti-BrdU Becton Disckson 347580 -
Antibody Rat anti-BrdU Abcam  Ab6326 -
Biological security hood Pachane PA 410 Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294 Or similar
Cell scraper Thermo Scientific 179693 Or similar
CldU Millipore-Sigma C6891 -
Cloridric acid Synth 7647-01-0 Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) Zeiss - Or similar
Cover glass (or coverslips) Thermo Scientific 152460 Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose LGC/Gibco BR30211-05/12100046 Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich E5314 Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200 Zeiss - Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco 12657-029 Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 3110 13-998-074 Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jar Sigma-Aldrich S5516 Or similar
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5 Or similar
Idu Millipore-Sigma I7125 -
Magnesium Chloride Synth 7791-18-6 Or similar
Methanol Merck 67-56-1 Or similar
Microscope slides Denville M1021 Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) Synth 1132-61-2 Or similar
Nocodazole Sigma-Aldrich 31430-18-9 -
PBS (Phosphate Buffer Saline) Life Thechnologies 3002 Or similar
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Or similar
ProLong Gold AntiFade Mountant Invitrogen P36930 Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae Invitrogen 18001-016 Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) BioRad 161-0302 Or similar
Sodium Acetate Trihydrate Sigma-Aldrich 6131-90-4 Or similar
Sodium Chloride Synth  7647-14-5 Or similar
Sucrose Sigma-Aldrich 57-50-1 Or similar
Tris Base West Lab Research BP152-1 Or similar
Triton X-100 Synth 9002-93-1 Or similar
Trypsin Gibco 25200072 Or similar
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Or similar
UVC Lamp Non Specific - Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV Radiometer Vilber Loumart - Or similar
Zinc Acetate Sigma-Aldrich 557-34-6 Or similar

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References

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आनुवंशिकी अंक 180 पोस्ट-प्रतिकृति एकल-फंसे डीएनए अंतर अंतर-भरने पोस्ट प्रतिकृति मरम्मत डीएनए प्रतिकृति डीएनए फाइबर परख एस 1 न्यूक्लियस रीप्राइमिंग
डीएनए फाइबर परख का उपयोग कर मानव कोशिकाओं में पोस्ट-प्रतिकृति अंतराल संचय और मरम्मत का पता लगाना
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Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. M. Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay. J. Vis. Exp. (180), e63448, doi:10.3791/63448 (2022).

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