Summary
Aquí describimos dos modificaciones del ensayo de fibra de ADN para investigar las brechas de ADN de cadena simple en la replicación del ADN después de la inducción de la lesión. El ensayo de fibra S1 permite la detección de huecos post-replicativos utilizando la endonucleasa S1 específica de ssDNA, mientras que el ensayo de llenado de huecos permite la visualización y cuantificación de la reparación de huecos.
Abstract
El ensayo de fibra de ADN es un método simple y robusto para el análisis de la dinámica de la bifurcación de replicación, basado en la inmunodetección de análogos de nucleótidos que se incorporan durante la síntesis de ADN en células humanas. Sin embargo, esta técnica tiene una resolución limitada de unos pocos miles de kilobases. En consecuencia, las brechas de ADN monocatenario post-replicativo (ssDNA) tan pequeñas como unos pocos cientos de bases no son detectables por el ensayo estándar. Aquí, describimos una versión modificada del ensayo de fibra de ADN que utiliza la nucleasa S1, una enzima que escinde específicamente el ssDNA. En presencia de brechas de ssDNA post-replicativas, la nucleasa S1 apuntará y cortará las brechas, generando tractos más cortos que se pueden usar como lectura para las brechas de ssDNA en bifurcaciones en curso. Estas brechas post-replicativas de ssDNA se forman cuando el ADN dañado se replica discontinuamente. Se pueden reparar a través de mecanismos desacoplados de la replicación del genoma, en un proceso conocido como llenado de huecos o reparación post-replicativa. Debido a que los mecanismos de llenado de brechas involucran la síntesis de ADN independientemente de la fase S, las alteraciones en el esquema de etiquetado de fibras de ADN también se pueden emplear para monitorear los eventos de llenado de brechas. En conjunto, estas modificaciones del ensayo de fibra de ADN son estrategias poderosas para comprender cómo se forman y llenan los vacíos post-replicativos en el genoma de las células humanas.
Introduction
Los trabajos seminales han proporcionado evidencia de la acumulación de brechas post-replicativas de cadena simple (ssDNA) tras el tratamiento con agentes dañinos para el ADN en bacterias1 y células humanas 2,3. Durante la replicación de plantillas de ADN dañadas, la maquinaria de síntesis de ADN puede eludir las lesiones mediante el empleo de ADN polimerasas de síntesis de translesión específicas o a través de mecanismos de cambio de plantilla. Alternativamente, el replisoma también puede simplemente omitir la lesión dejando un espacio de ssDNA detrás, para ser reparado más tarde. Más recientemente, un estudio mostró claramente que el tratamiento con agentes genotóxicos conduce a brechas de ssDNA en eucariotas mediante el uso de microscopía electrónica para visualizar la estructura específica de los intermedios de replicación4. La formación de estas regiones de brechas post-replicativas se propuso inicialmente como un resultado simple del modo semi-discontinuo de replicación del ADN2. En este caso, una lesión en la hebra rezagada puede bloquear el alargamiento de un fragmento de Okazaki, pero la progresión de la bifurcación es naturalmente rescatada por el siguiente fragmento de Okazaki, dejando atrás una brecha de ssDNA. Sin embargo, otros estudios demostraron que la formación de brechas en la hebra principal también es posible, como se mostró por primera vez en la bacteria5. En eucariotas, se demostró que PRIMPOL, una ADN polimerasa única con actividad de primasa, es capaz de reiniciar la síntesis de ADN aguas abajo de una lesión que bloquea la replicación a través de su actividad de reprimificación 6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, la actividad de la primasa PRIMPOL puede explicar la formación de brechas de ssDNA post-replicativas en la cadena principal tras el tratamiento con un agente dañino para el ADN en células humanas12. No obstante, la detección de estas brechas, así como la reparación de brechas, hasta hace poco, requerían enfoques indirectos o lentos, como la microscopía electrónica4 o los ensayos basados en plásmidos13. El uso de la nucleasa S1 específica de ssDNA para detectar brechas en las células humanas fue pionero en estudios tempranos hace más de cuarenta años, utilizando técnicas de gradiente de sacarosa 2,3. Más recientemente, nuestro grupo aplicó el uso de esta nucleasa para detectar ssDNA en la replicación de ADN (brechas post-replicativas) utilizando otros métodos como la fibra de ADN y los ensayos de cometas14. Estos nuevos enfoques allanaron el camino para el actual aumento de estudios sobre las brechas post-replicativas. Aquí, describimos una estrategia de uso de nucleasa S1 para detectar brechas de ssDNA post-replicativas mediante ensayo de fibra de ADN y explicamos cómo un esquema de etiquetado diferencial en el protocolo de fibra de ADN puede permitir el estudio de la reparación de estas brechas.
El ensayo de fibra de ADN es una técnica poderosa que ha sido utilizada por un número creciente de laboratorios y ha proporcionado información valiosa sobre la dinámica de la bifurcación de replicación y los mecanismos de respuesta al estrés de replicación. Brevemente, esta técnica se basa en la incorporación secuencial de análogos de nucleótidos (como CldU -5-cloro-2'-desoxiuridina-, e IdU -5-yodo-2'-desoxiuridina) en el ADN replicante. Después de la cosecha, las células se lisan y las moléculas de ADN se propagan en un portaobjetos de vidrio recubierto positivamente. CldU e IdU son detectados por anticuerpos específicos, que se pueden visualizar en un microscopio fluorescente como fibras bicolores. Finalmente, las longitudes de los tractos IdU y CldU se miden para identificar cualquier alteración de la dinámica de replicación del ADN como consecuencia de la inducción del daño del ADN. Esta técnica se puede utilizar para investigar diferentes fenómenos, como el estancamiento de la horquilla, la desaceleración de la bifurcación, la degradación del ADN naciente y las variaciones en la frecuencia de disparo de origen15,16.
Una limitación del ensayo de fibra de ADN es su resolución de unas pocas kilobases. Debido a que las brechas de ssDNA post-replicativas pueden estar en el rango de cientos de bases, es imposible visualizar estas brechas directamente mediante el protocolo estándar de fibra de ADN. La presencia de brechas de ssDNA en la replicación del ADN en células humanas tratadas con agentes genotóxicos se ha implicado indirectamente antes. Por ejemplo, la observación del ssDNA evaluado por el reclutamiento de la proteína de unión al ssDNA, la proteína de replicación A (RPA), en células fuera de la fase S, o la formación de ssDNA detectada por el desenrollamiento alcalino del ADN combinado con la ausencia de estancamiento prolongado de la horquilla por el ensayo de fibra de ADN 12,17,18,19,20,21 se atribuyó a la acumulación de brechas de ssDNA. Además, las brechas de ssDNA post-replicativas inducen un punto de control de fase G2/M dependiente de ATR y células de detención tratadas con venenos de replicación 18,19,20,21,22.
La nucleasa S1 degrada los ácidos nucleicos monocatenarios liberando mono u oligonucleótidos de 5'-fosforilo y tiene una afinidad 5 veces mayor con el ssDNA en comparación con el ARN. Los ácidos nucleicos de doble cadena (ADN: ADN, ADN: ARN o ARN: ARN) son resistentes a la nucleasa S1, excepto cuando se usan en concentraciones extremadamente altas. La nucleasa S1 también escinde ADN de doble cadena en la región de cadena simple causada por un corte, brecha, desajuste o bucle. La nucleasa S1 es, por lo tanto, una endonucleasa específica de ssDNA capaz de cortar los huecos de ssDNA, generando finalmente roturas de doble cadena23,24. Por lo tanto, agregar pasos para la digestión de la nucleasa S1 al protocolo de fibra de ADN indirectamente permite la detección de brechas de ssDNA post-replicativas. En presencia de huecos, el tratamiento de los núcleos expuestos con la nucleasa S1 antes de la propagación del ADN generará tractos más cortos como consecuencia de la escisión S1 del ssDNA inherentemente presente en los huecos14. En consecuencia, el acortamiento del tracto es la lectura de las brechas de ssDNA utilizando este enfoque. En comparación con el protocolo estándar de fibra de ADN, la fibra de ADN con la nucleasa S1 solo requiere dos pasos adicionales: exposición a los núcleos (permeabilización celular) y tratamiento con la nucleasa S1. Es importante tener en cuenta que los controles apropiados son obligatorios, como muestras tratadas con el agente genotóxico pero sin la nucleasa S1 y muestras tratadas con la nucleasa S1 sin el agente genotóxico. El protocolo en sí, incluida la incorporación de análogos, el tratamiento S1 y la propagación, se puede realizar en un día y no requiere material excepcional. Solo requiere los análogos de timidina, la nucleasa S1 purificada, los anticuerpos primarios y secundarios apropiados y un microscopio fluorescente. En general, la fibra de ADN que emplea la nucleasa S1 detecta las brechas de ssDNA en las bifurcaciones de replicación en curso utilizando un enfoque relativamente simple.
Las brechas post-replicativas de ssDNA formadas como consecuencia de los mecanismos de respuesta al estrés de replicación pueden ser reparadas (o llenadas) por diferentes mecanismos, incluida la síntesis de ADN translesivo o el cambio de plantilla, en un proceso llamado llenado de brechas o reparación posterior a la replicación (PRR)25. Estos procesos ocurren detrás de las bifurcaciones que avanzan, involucrando la síntesis de ADN independiente de la replicación 14,26,27. Sobre la base de estos hallazgos, se puede realizar un esquema de etiquetado distinto del ensayo estándar de fibra de ADN para visualizar eventos de llenado de brechas en la fase G2 directamente 14,16,26,28. Específicamente, un análogo de timidina se puede usar para etiquetar la bifurcación de replicación en el momento del tratamiento genotóxico y la formación de brechas de ssDNA post-replicativa, mientras que otro análogo de timidina se puede usar para etiquetar eventos de llenado de brechas. En este protocolo, las células se etiquetan con un primer análogo de timidina (IdU, por ejemplo) inmediatamente después o concomitantemente con el tratamiento genotóxico durante 1 h, de modo que el ADN naciente se marca en el momento de la formación de la brecha. El nocodazol se agrega tras el tratamiento durante entre 12-24 h para detener las células en G2 / M, previniendo la siguiente fase S. Durante las últimas 4 h de tratamiento con nocodazol, se agrega un segundo análogo de timidina (CldU, por ejemplo) al medio para incorporarlo durante el llenado de huecos. Es importante destacar que este ensayo solo se puede usar para detectar eventos de llenado de brechas en G2 porque la señal de llenado de brechas de CldU no se puede distinguir de una señal debido a la incorporación de CldU en la replicación de ADN en la fase S. Por lo tanto, para minimizar la señal de fondo, el momento de la incorporación de CldU después de la inducción del daño debe coincidir con el momento en que la mayoría de la población celular está entrando en la faseG2 14. Por lo tanto, este momento variará dependiendo de la línea celular y las condiciones de tratamiento. Se recomienda optimizar la progresión del ciclo celular antes de emplear este ensayo. La tinción conjunta de estos análogos de timidina permite la visualización de tractos de relleno de huecos (PRR) (parches CldU) sobre ADN naciente (tractos IdU) sintetizados durante el tratamiento genotóxico cuando se generaron huecos de ssDNA.
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Protocol
Como el estudio utiliza células humanas, el trabajo fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (ICB-USP, número de aprobación #48347515.3.00005467) para la investigación con muestras humanas.
NOTA: Los protocolos aquí descritos fueron utilizados en publicaciones anteriores con modificaciones menores 14,16,28. Aquí la atención se centra en el uso de la luz ultravioleta C (UVC) como un agente dañino para el ADN. Sin embargo, otros agentes dañinos para el ADN como el cisplatino y la hidroxiurea también se han empleado con éxito28. Este protocolo se puede realizar en una serie de líneas celulares, incluyendo U2OS, HEK293T, fibroblastos humanos y otros 14,28,29. Es esencial determinar la pregunta experimental antes de realizar este protocolo. El ensayo de fibra de ADN con la nucleasa S1 (llamada fibra S1 en adelante) se utiliza para detectar la presencia de huecos de ssDNA post-replicativos, mientras que el ensayo de llenado de huecos (o PRR) se realiza para cuantificar los eventos de llenado de huecos en la fase G2. Por lo tanto, si analiza la presencia de brechas de ssDNA post-replicativas, el investigador debe realizar la sección 2 (configuración experimental de la fibra S1) y proceder directamente a la sección 4 (preparación de la fibra de ADN por propagación) del protocolo. Si analiza los eventos de llenado de brechas, el investigador debe proceder directamente a la sección 3 (Configuración experimental de llenado de brechas (PRR)).
1. Reactivos y configuración
- Análogos de timidina: Resuspend 5-Iodo-2'-deoxyuridine (IdU) y 5-Chloro-2'-deoxyuridine (CldU) en 1 N NH4OH a una concentración final de 100 mM. Filtre los análogos a través de un filtro de jeringa estéril (0,2 μm), alícuota, y guárdelos a -20 C.
- Anticuerpos: Primarios - rata anti-BrdU (Biorad) y ratón anti-BrdU (BD); Secundarios: anti-rata Alexa Fluor 488 y anti-ratón Alexa Fluor 594.
- Tampón de permeabilización celular CSK100 para la fibra S1: Agregue 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7.2], 300 mM de sacarosa y 0.5% Triton X-100 en destilado H2O.
- Tampón de nucleasa S1 [pH 4.6]: Agregue 30 mM de acetato de sodio [pH 4.6], 10 mM de acetato de zinc, 50 mM de NaCl y 5% de glicerol en H2O.
NOTA: El tampón de nucleasa S1 debe tener un pH final de 4.6, ya que la actividad de S1 cae un 50% a pH > 4.9. - Alícuota y almacene a -20 °C la nucleasa S1 purificada a partir de A. oryzae prediluida en tampón de dilución de nucleasa S1 proporcionado por el fabricante.
- Reconstituir el nocodazol en DMSO a una concentración final de 2 mM para el llenado de huecos. Ensayo.
- Tampón de lisis: Añadir 200 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM EDTA y 0.5 % SDS en H2O.
- Prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Prepare PBS-T agregando 0.1% Tween-20 en PBS.
- Preparar albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en PBS.
- Preparar 0.1% BSA en PBS.
- Prepare PBS-T-BSA agregando 1% de BSA en PBS-T.
NOTA: Utilice un microscopio epifluorescente con una lámpara de mercurio o xenón con un filtro de emisión GFP (FITC, Alexa Fluor 488) de longitud de onda de 510 nm y ancho de banda de 42 nm y un filtro de emisión Texas Red (Alexa Fluor 594) de longitud de onda de 624 nm y un ancho de banda de 40 nm o un microscopio confocal con un láser de línea de 488 nm (azul) para detectar fluorescencia verde (detectada entre 510 y 560 nm) y un láser de línea de 561 nm (amarillo) para detectar fluorescencia roja ( detectado entre 575 y 680 nm). Objetivo de inmersión (40x, 63x o 100x).
2. Configuración experimental de S1 Fiber (2 días)
- Día 1: Placa 4 pocillos para cada línea celular: ± UVC y nucleasa S1 ± con células al 70-90% de confluencia.
NOTA: El experimento se puede hacer en un formato tan pequeño como una placa de 12 pocillos. En este caso, todas las soluciones se utilizan a 0,5 ml/pozo. - Día 2: Preparar IdU fresco a 20 μM y CldU a 200 μM en medios de cultivo celular precalentados (37 °C).
- Aspirar los medios de cultivo y añadir inmediatamente los medios con 20 μM IdU e incubar las células a 37 °C, 5% CO2 (incubadora de células) durante exactamente 20 min.
- Lave rápidamente las células con PBS precalentado (37 °C) dos veces.
- Irradiar las células con 20 J/m2 UVC. Utilice células no tratadas como controles.
- Añadir inmediatamente el medio con 200 μM de CldU e incubar las células a 37 °C, 5% de CO2 (incubadora de células) durante exactamente 60 min.
NOTA: El etiquetado IdU y CldU se puede intercambiar, pero la concentración del segundo análogo debe ser 5-10 veces mayor que la del primer análogo. El momento de la incubación analógica se puede adaptar al agente genotóxico utilizado, pero el tiempo de la segunda incubación análoga debe ser lo suficientemente largo como para garantizar el tiempo suficiente para la formación de huecos14,16. Si usa un medicamento dañino para el ADN, agregue el medicamento junto con CldU 28,29,30. - Lave las células con PBS precalentado (37 °C) dos veces.
- Permeabilizar las células con el tampón CSK100 durante 8-10 min a temperatura ambiente (RT).
NOTA: La permeabilización exitosa se puede verificar bajo un microscopio de campo brillante donde solo los núcleos deben ser observables - Lave cuidadosamente los núcleos con PBS (vierta 0.5 ml por el costado de cada pozo, solo por unos segundos).
- Lave cuidadosamente los núcleos con tampón S1 (vierta 0.5 ml por el costado de cada pozo, solo por unos segundos).
- Incubar los núcleos con tampón S1 con nucleasa S1 (20 U/mL) o sin (como control) durante 30 min a 37 °C (incubadora celular).
- Aspire el búfer S1 y agregue 0.1% BSA en PBS.
- Raspar los núcleos y transferirlos a un tubo de 1,5 ml debidamente anotado. Mantenga los tubos en hielo todo el tiempo.
NOTA: El desprendimiento exitoso de núcleos se puede verificar bajo un microscopio de campo brillante. - Pellet los núcleos: centrífuga a ~4600 x g durante 5 min, a 4 °C.
NOTA: A diferencia del ensayo estándar de fibra de ADN, los núcleos no se pueden contar, así que considere el número inicial de células chapadas. Alternativamente, se puede usar un pozo adicional que no se sometió a permeabilización para estimar el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador celular. - Resuspend bien los gránulos en PBS a una concentración de ~ 1500 células / μL, coloque los tubos en hielo y proceda a la preparación de la fibra de ADN mediante la propagación inmediata (sección 4) del protocolo
3. Configuración experimental de llenado de brechas (PRR) (3 días)
- Día 1: Placa 2 pocillos para cada línea celular: ± UVC con células a ~70 % de confluencia.
- Día 2: Preparar IdU fresco a 20 μM en medios de cultivo celular precalentados (37 °C).
- Irradiar las células con 20 J/m2 UVC.
- Agregue inmediatamente el medio con 20 μM IdU e incube las células a 37 ° C, 5% de CO2 (incubadora de células) durante exactamente 60 min.
- Lave las células con PBS precalentado (37 °C) dos veces.
- Agregue inmediatamente el medio con 200 ng / ml de nocodazol e incube las células a 37 ° C, 5% DE CO2 (incubadora de células) durante 12-24 h (el tiempo de este paso debe mantenerse consistente entre los experimentos).
NOTA: La concentración de nocodazol podría necesitar ser adaptada de acuerdo con la línea celular utilizada. Si usa un medicamento genotóxico, incube las células con IdU ± medicamento28. - Día 3: Aspirar los medios de cultivo, añadir los medios con 20 μM cldU + nocodazol, e incubar durante las últimas 4 h de tratamiento con nocodazol, a 37 °C, 5% CO2 (incubadora celular).
- Lave las células con PBS precalentado (37 °C).
- Añadir tripsina e incubar durante 1-2 min a 37 °C, 5% CO2 (incubadora de células) para separar las células.
- Añadir el mismo volumen de medios de cultivo celular y recoger células (medio + tripsina) en un tubo de 1,5 ml debidamente anotado. Mantenga los tubos en hielo todo el tiempo.
- Cuente las células usando un hemocitómetro o un contador celular.
- Pellet de las células: centrífuga a ~350 x g durante 5 min, a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en PBS a ~ 1500 células / μL. Mantenga las células en hielo y comience la preparación de la fibra de ADN mediante la propagación del protocolo inmediatamente (Día 3 o 4).
4. Preparación de la fibra de ADN por propagación (~ 1 h para 12 diapositivas)
- Anote los portaobjetos del microscopio con un lápiz de carbón y colóquelos planos en una bandeja.
- Toque la parte inferior del tubo para garantizar la homogeneización.
- Agregue 2 μL de celdas en la parte superior de la diapositiva correspondiente.
NOTA: Se pueden agregar dos gotas, una en la parte superior de la diapositiva y otra en el medio de la diapositiva. - Agregue 6 μL del tampón de lisis y lisa las células mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo unas 5 veces (evite hacer burbujas).
- Tire de la gota un poco hacia la parte inferior de la diapositiva con la punta de la pipeta (para guiar el camino de la propagación de la gota).
- Incubar durante 5 min en RT para lisar los núcleos.
NOTA: El volumen del tampón de lisis y el tiempo de lisis se pueden ajustar si el lisado se seca demasiado rápido o, alternativamente, no se seca lo suficiente. El volumen del tampón de lisis puede variar de 5-7 μL y el tiempo puede caer entre 4-10 min. - Incline la corredera a unos 20-40 ° y permita que la caída se extienda a la parte inferior de la diapositiva a una velocidad constante y baja.
- Deje que la diapositiva se seque a RT en la oscuridad (10-15 min).
- Prepare recién la solución de fijación: Mezcle metanol: ácido acético glacial en una proporción de 3: 1.
- Sumerja las diapositivas en un frasco que contenga la solución de fijación e incube durante 5 minutos en RT para fijar el ADN en las diapositivas.
PRECAUCIÓN: El metanol es altamente tóxico y debe mantenerse bajo una capucha química. Desechar en un recipiente apropiado. - Seque los portaobjetos en RT en la oscuridad y guárdelos a 4 °C protegidos de la luz hasta que se manchen.
5. Inmunotinción de fibras de ADN (~6 h)
- Lave las diapositivas con PBS dos veces durante 5 min.
- Desnaturalizar el ADN con 2,5 M HCl recién preparado durante 40-60 min en RT.
PRECAUCIÓN: Para preparar 2.5 M HCl, vierta ácido en agua y nunca lo contrario. Esta es una reacción exotérmica, por lo que se calentará ligeramente. - Lave las diapositivas con PBS tres veces durante 5 min.
- Bloque con BSA al 5% (se puede almacenar a 20 °C para hasta tres usos) previamente calentado a 37 °C durante 30-60 min a 37 °C.
- Retire el exceso de líquido de las diapositivas golpeando suavemente un papel.
- Agregue 30 μL de anticuerpos primarios (anti-BrdU de ratón 1/20 (para IdU) y anti-BrdU de rata 1/100 (para CldU) diluidos en PBS-T-BSA) a las diapositivas en forma de gota y coloque un cubrebocas en la parte superior. Incubar durante 1-1,5 h en RT en una cámara oscura y húmeda.
- Coloque las diapositivas en un frasco con PBS durante 1-2 minutos, luego retire cuidadosamente las fundas.
- Lave con PBS-T en un frasco tres veces durante 5 minutos, luego coloque las diapositivas en PBS.
- Retire el exceso de líquido golpeando suavemente un papel.
- Agregue 30 μL de anticuerpos secundarios (anti-ratón Alexa Fluor 594 y anti-rata Alexa Fluor 488 diluido a 1/75 en PBS-T-BSA.) a las diapositivas en sentido descendente y coloque un cobertor en la parte superior. Incubar durante 45-60 min en RT en una cámara oscura y húmeda.
- Coloque las diapositivas en un frasco con PBS durante 1-2 minutos, luego retire cuidadosamente las fundas.
- Lave con PBS-T en un frasco tres veces durante 5 minutos, luego coloque las diapositivas en PBS.
- Retire el exceso de líquido golpeando suavemente un papel.
- Agregue 20 μL del reactivo de montaje en forma de gota a las diapositivas y coloque una cubierta en la parte superior. Evita las burbujas.
- Deje que los portaobjetos se sequen a RT en la oscuridad, luego guárdelos a 4 ° C (o -20 ° C para una conservación más prolongada).
6. Adquisición y análisis de imágenes (~1 h por muestra)
NOTA: Se puede utilizar un microscopio de epifluorescencia para ambos protocolos. Sin embargo, para el ensayo de relleno de huecos (PRR), se recomienda encarecidamente el uso de un microscopio confocal para el aumento de la resolución de las imágenes.
- Coloque una gota de aceite de inmersión (específico del microscopio) cerca de la parte superior de la diapositiva donde se lisaron las células y encuentre el foco utilizando el canal verde buscando puntos verdes en el fondo (se pueden usar objetivos de 40x, 63x y 100x).
- Encuentre la concentración principal de fibras y muévase a los bordes para encontrar fibras individuales no superpuestas bien distribuidas utilizando solo un canal para seleccionar las regiones para las imágenes y evitar posibles sesgos.
- Tome alrededor de 15-20 imágenes por diapositiva junto con toda la diapositiva en los canales verde y rojo y fusione los dos canales para obtener fibras de ADN bicolor.
NOTA: Si usa un microscopio confocal, tome fotografías a alta resolución (1024 x 1024 píxeles) y use valores estenopeicos cercanos a 1 para la fluorescencia roja y verde. - Utilice ImageJ (software gratuito proporcionado por los NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) para las mediciones de longitud del tracto IdU y CldU.
- Abra una imagen arrastrándola al cuadro ImageJ.
- Utilice la barra de escala generada por el software del microscopio (calibrada adecuadamente) para convertir la longitud a micrómetros. Utilice la herramienta Línea recta seleccionando el5º icono de izquierda a derecha en el cuadro ImageJ para medir la barra de escala en la imagen proporcionada micrómetros y obtener una medición en píxeles. Haga clic en Analizar > Establecer escala y reemplace la "distancia en píxeles" con el número apropiado y la "unidad de longitud" a μm.
- En el cuadro ImageJ, seleccione la herramienta Línea segmentada haciendo clic con el botón izquierdo en el5º icono de izquierda a derecha y, a continuación, seleccionando la segunda opción de arriba a abajo.
- Dibuje el trazado exacto del tracto rojo (IdU) o verde (CldU) haciendo clic con el botón izquierdo y detenga el dibujo haciendo clic con el botón derecho. Presione el botón M en el teclado para medir la longitud.
- Para la fibra S1, solo analice el rojo-verde (fibras bicolores)16. Mida las longitudes de los tractos rojo y verde de al menos 150 fibras de diferentes imágenes realizando un seguimiento de las mediciones de los tractos rojo y verde para cada fibra individual.
- Para el ensayo de relleno de huecos, solo mida la longitud de los tractos IdU (rojo) que contengan al menos 1 parche CldU (verde) pero sin tinción continua de CldU. Puntúe al menos 10-15 tractos IdU de diferentes imágenes con al menos 1 parche CldU.
NOTA: Se puede utilizar otro software para los análisis, como Zeiss LSM Image Browser.
- Para las fibras S1, trace la longitud de los tractos IdU, la longitud de los tractos CldU y las proporciones (CldU/IdU o viceversa) en gráficos separados como diagramas de puntos de dispersión con medianas.
- Mida los eventos de llenado de brechas como unidades de "densidad por kilobase", divida el número total de parches CldU (PRR, verde) en una longitud dada del tracto IdU (rojo) por la longitud total del tracto rojo en kilobases (considerando 1 μm = 2.59 kilobases31). A continuación, trace los datos como gráficos de puntos de dispersión con medianas.
- En ambos experimentos, realizar análisis estadísticos entre dos muestras utilizando Mann-Whitney (prueba no paramétrica) y entre más de dos muestras utilizando Kruskal-Wallis seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn.
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Representative Results
En el ensayo de fibra S1, si el tratamiento con un agente genotóxico conduce a brechas de ssDNA post-replicativas, las longitudes totales de las fibras de ADN de los núcleos tratados con S1 serán más cortas después del tratamiento con daño en el ADN en comparación con las muestras no tratadas, así como con las muestras que se trataron con el agente genotóxico pero no se enviaron a la escisión S1 (Figura 1).
Alternativamente, si el tratamiento con la nucleasa S1 no afecta significativamente la longitud de las fibras de ADN en comparación con las células no tratadas, son posibles diferentes interpretaciones: (1) No hay formación de brechas de ssDNA post-replicativas en el tratamiento con el agente genotóxico utilizado, y / o en el fondo genético específico investigado. De hecho, hemos demostrado previamente que los fotoproductos 6-4 inducidos por UV (6-4PP) pero no los dímeros de ciclobutano pirimidina (CPD) conducen a la formación de brechas de ssDNA en células deficientes para la reparación por escisión de nucleótidos (células NER, XP-C)14. (2) Las brechas de ssDNA fueron reparadas y ya no se pueden detectar. (3) El acortamiento inducido por el tratamiento con el agente genotóxico solo es demasiado pronunciado para permitir la detección de un acortamiento adicional a través de la escisión S1.
En particular, la falta de efecto del S1 también podría reflejar problemas técnicos como las condiciones deterioradas para la actividad S1, incluido el pH inapropiado del tampón S1 o la cantidad limitada de zinc.
Figura 1: Detección de brechas de ssDNA post-replicativas en bifurcaciones en curso mediante ensayo de fibra S1. (A) Representación esquemática de ensayos de fibra de ADN con la nucleasa S1 específica de ssDNA (fibra S1). Las bifurcaciones de replicación progresivas están marcadas con análogos de timidina (IdU, CldU) y se pueden medir después de la propagación e inmunotinción del ADN. A la izquierda, las horquillas progresivas estándar sin huecos no son susceptibles de escisión por la nucleasa S1. A la derecha, las brechas en el ADN naciente que son convencionalmente indetectables serán atacadas por la nucleasa S1 y se visualizarán como tractos CldU más cortos. (B) Esquema del protocolo S1 Fiber. (C) Imágenes representativas de S1 Fiber. Arriba, controla el tracto de ADN naciente sin huecos, impermeable a la escisión por la nucleasa S1. En la parte inferior, el tracto de ADN positivo para los huecos escindidos por la nucleasa S1, lo que resulta en una longitud de tracto CldU (verde) más corta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En el ensayo de llenado de brechas (PRR), un aumento significativo en la densidad de parches cortos de CldU en tractos de IdU es indicativo de un aumento de los eventos de llenado de brechas (Figura 2). Una alta densidad de eventos PRR puede reflejarse por 1 evento PRR (parche verde/CldU) en un tracto IdU corto, así como por múltiples eventos PRR en un tracto largo (ver imágenes representativas Figura 2C). El análisis debe realizarse rigurosamente puntuando solo los parches CldU que están en la parte superior de los tractos IdU, teniendo en cuenta que los parches CldU son pequeños y podrían confundirse fácilmente con fondo de tinción (ver imágenes representativas Figura 2C).
Figura 2: Detección de reparación post-replicativa por relleno de huecos. (A) Esquema del tracto rojo (IdU) con parche verde (CldU) indicativo de un evento de llenado de huecos. B) Esquema del protocolo utilizado para detectar la colificación de lagunas. (C) Imágenes representativas del ensayo de llenado de brechas (PRR). A la izquierda, los tractos IdU más largos con al menos un parche CldU y / o menos parches CldU totales se corresponden con una baja densidad de llenado de brechas (menos eventos de llenado de brechas). A la derecha, los tractos idU más cortos con al menos un parche CldU y los tractos IdU más largos con más parches CldU totales se corresponden con una alta densidad de llenado de huecos (más eventos de llenado de huecos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos del protocolo estándar de ensayo de fibra de ADN se discutieron en una publicación anterior32. Aquí, describimos versiones modificadas del ensayo estándar de fibra de ADN para investigar la presencia de huecos de ssDNA post-replicativos, así como su reparación mediante el llenado de huecos, descrito inicialmente en14. En el contexto de la presencia de brecha de ssDNA post-replicativa, el uso de la nucleasa S1 en el protocolo S1 Fiber probablemente sería adecuado después de la exposición de un agente genotóxico durante un mínimo de 1 h para dar tiempo a la formación de brechas y la posterior detección. Sin embargo, es esencial tener en cuenta que en algunas líneas celulares o antecedentes genéticos, el uso de la nucleasa S1 podría generar tractos más cortos incluso sin tratamiento adicional con agentes genotóxicos33,34. Por lo tanto, es crucial incluir todos los controles para garantizar una conclusión adecuada sobre si el tratamiento con un agente genotóxico conduce a la acumulación de brechas. Además, es importante validar aún más el resultado de la fibra S1 repitiendo el ensayo en condiciones en las que los huecos de ssDNA ya no se forman o se reparan.
Con respecto al ensayo de llenado de huecos (PRR), es importante optimizar una dosis uvc / concentración de fármaco que no afecte la longitud total de las fibras de ADN, ya que los resultados se calculan como una densidad por kilobase. Si se utiliza una concentración que induce el acortamiento del tracto, los resultados pueden estar sesgados artificialmente hacia una mayor densidad de llenado de huecos, lo que dificulta la interpretación de los datos. Para contrarrestar esta limitación, los eventos de llenado de brechas se pueden visualizar sobre el ADN no marcado mediante la tinción del ADN total utilizando un anticuerpo anti-ssDNA, como se describió anteriormente14,16. Además, se podría realizar un experimento cinético para garantizar la máxima detección de eventos de llenado de huecos.
Tenga en cuenta que los eventos de llenado de huecos también se pueden monitorear utilizando el ensayo de fibra S1 cuando se permite que las células se recuperen antes del tratamiento con la nucleasa S1. Específicamente, cuando se llenan los huecos post-replicativos, las fibras de ADN se vuelven insensibles a la escisión por la nucleasa S1, y por lo tanto la longitud de la fibra de ADN se puede utilizar como una lectura para el llenado de huecos en este contexto28. Por lo tanto, este enfoque se puede utilizar para estudiar el llenado de brechas a lo largo del ciclo celular, de manera diferente del ensayo PRR que se limita a la investigación del llenado de brechas en G2 / M.
Finalmente, los datos obtenidos con el ensayo PRR se validaron utilizando la fibra S128, lo que sugiere que el nocodazol y el bloqueo artificial de las células en G2 / M durante el ensayo PRR no afectan el llenado de huecos. Otros agentes que inducen el bloqueo de fase G2/M pueden ser potencialmente utilizados en este ensayo
La fibra S1 ha sido cada vez más utilizada por laboratorios de todo el mundo, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos de formación de brechas de ssDNA y revelando condiciones previamente no apreciadas en las que se pueden formar estas brechas 14,29,34,35,36. Para futuras investigaciones, sería interesante combinar estos protocolos modificados con el enfoque de puntos cuánticos que permite la visualización directa de la lesión de ADN37 para dilucidar la conversación cruzada entre la formación de brechas de ssDNA post-replicativa y la reparación del ADN, así como la forma en que la naturaleza del daño define el mecanismo de la respuesta al estrés de replicación. Como alternativa al ensayo de fibra S1, la nucleasa S1 también se puede utilizar para estudiar el proceso de llenado de huecos en un ensayo de cometa neutro modificado. Brevemente, si hay huecos, el tratamiento de los cometas con la nucleasa S1 conduce a la formación de roturas de doble cadena, detectables por ensayo de cometa neutro. Los protocolos para el ensayo de cometas neutros, así como el ensayo de cometas modificados por enzimas, se publicaron previamente38,39. En particular, este enfoque permite la detección de brechas de ssDNA en todas las fases del ciclo celular, sin necesidad de detener las células en la fase G2. Usando este enfoque, combinado con los protocolos S1 Fiber y gap-filling (PRR) descritos aquí, encontramos que REV3L (unidad catalítica zeta de ADN polimerasa) es responsable de llenar los vacíos formados cuando los 6-4PPs inducidos por UV están presentes en el genoma humano14.
Con el limitado enfoque técnico disponible, la formación de brechas de ssDNA post-replicativa y, en particular, los eventos de llenado de brechas han permanecido en gran medida inexplorados en las células humanas. En conjunto, estas técnicas modificadas (fibra S1, ensayo de relleno de brechas (PRR) y cometa S1) proporcionan estrategias novedosas para investigar la presencia de brechas de ssDNA y cómo estas brechas se llenan en última instancia en el genoma humano.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo en el laboratorio C.F.M.M. cuenta con el apoyo de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasil, Becas #2019/19435-3, #2013/08028-1 y 2017/05680-0) en el marco de la Colaboración Internacional en Investigación de la FAPESP y la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO, Países Bajos); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasilia, DF, Brasil, Grants # 308868/2018-8] y Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasil, Código financiero 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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