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Neuroscience

In vivo Tomografia ad emissione di positroni per rivelare i modelli di attività indotti dalla stimolazione cerebrale profonda nei ratti

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63478
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1,2,3,4, 2,4,5
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

Summary

Descriviamo un metodo sperimentale preclinico per valutare la neuromodulazione metabolica indotta dalla stimolazione cerebrale profonda acuta con FDG-PET in vivo . Questo manoscritto comprende tutte le fasi sperimentali, dalla chirurgia stereotassica all'applicazione del trattamento di stimolazione e all'acquisizione, elaborazione e analisi di immagini PET.

Abstract

La stimolazione cerebrale profonda (DBS) è una tecnica neurochirurgica invasiva basata sull'applicazione di impulsi elettrici alle strutture cerebrali coinvolte nella fisiopatologia del paziente. Nonostante la lunga storia della DBS, il suo meccanismo d'azione e i protocolli appropriati rimangono poco chiari, evidenziando la necessità di ricerche volte a risolvere questi enigmi. In questo senso, valutare gli effetti in vivo della DBS utilizzando tecniche di imaging funzionale rappresenta una potente strategia per determinare l'impatto della stimolazione sulla dinamica cerebrale. Qui viene descritto un protocollo sperimentale per modelli preclinici (ratti Wistar), combinato con uno studio longitudinale [18F]-fluorodesossiclucosa tomografia ad emissione di positroni (FDG-PET), per valutare le conseguenze acute della DBS sul metabolismo cerebrale. In primo luogo, gli animali sono stati sottoposti a chirurgia stereotassica per l'impianto bilaterale di elettrodi nella corteccia prefrontale. È stata acquisita una tomografia computerizzata post-chirurgica (TC) di ciascun animale per verificare il posizionamento degli elettrodi. Dopo una settimana di recupero, è stato acquisito un primo FDG-PET statico di ciascun animale operato senza stimolazione (D1) e due giorni dopo (D2), un secondo FDG-PET è stato acquisito mentre gli animali venivano stimolati. Per questo, gli elettrodi sono stati collegati a uno stimolatore isolato dopo aver somministrato FDG agli animali. Pertanto, gli animali sono stati stimolati durante il periodo di assorbimento di FDG (45 min), registrando gli effetti acuti della DBS sul metabolismo cerebrale. Data la natura esplorativa di questo studio, le immagini FDG-PET sono state analizzate con un approccio voxel-wise basato su un T-test accoppiato tra studi D1 e D2. Nel complesso, la combinazione di DBS e studi di imaging consente di descrivere le conseguenze della neuromodulazione sulle reti neurali, contribuendo in definitiva a svelare gli enigmi che circondano la DBS.

Introduction

Il termine neurostimolazione comprende una serie di tecniche diverse volte a stimolare il sistema nervoso con un obiettivo terapeutico1. Tra questi, la stimolazione cerebrale profonda (DBS) si distingue come una delle strategie di neurostimolazione più diffuse nella pratica clinica. La DBS consiste nella stimolazione dei nuclei cerebrali profondi con impulsi elettrici erogati da un neurostimolatore, impiantati direttamente nel corpo del paziente, attraverso elettrodi posti nel bersaglio cerebrale per essere modulati mediante chirurgia stereotassica. Il numero di articoli che valutano la fattibilità dell'applicazione della DBS in diversi disturbi neurologici e psichiatrici è in continua crescita2, sebbene solo alcuni di essi siano stati approvati dalla Food and Drug Association (FDA) (cioè tremore essenziale, morbo di Parkinson, distonia, disturbo ossessivo-compulsivo ed epilessia refrattaria dal punto di vista medico)3 . Inoltre, un gran numero di bersagli cerebrali e protocolli di stimolazione sono in fase di ricerca per il trattamento DBS di molte più patologie di quelle ufficialmente approvate, ma nessuna di esse è considerata definitiva. Queste incongruenze nella ricerca sulla DBS e nelle procedure cliniche possono in parte essere dovute alla mancanza di una piena comprensione del suo meccanismo d'azione4. Pertanto, sono stati fatti enormi sforzi per decifrare gli effetti in vivo della DBS sulla dinamica cerebrale, poiché ogni progresso, per quanto piccolo, aiuterà a perfezionare i protocolli DBS per un maggiore successo terapeutico.

In questo contesto, le tecniche di imaging molecolare aprono una finestra diretta per osservare in vivo gli effetti neuromodulatori della DBS. Questi approcci offrono l'opportunità non solo di determinare l'impatto della DBS mentre viene applicata, ma anche di svelare la natura delle sue conseguenze, prevenire effetti collaterali indesiderati e miglioramenti clinici e persino adattare i parametri di stimolazione alle esigenze del paziente5. Tra questi metodi, la tomografia ad emissione di positroni (PET) che utilizza 2-deossi-2-[18F]fluoro-D-glucosio (FDG) è di particolare interesse perché fornisce informazioni specifiche e in tempo reale sullo stato di attivazione di diverse regioni cerebrali6. In particolare, l'imaging FDG-PET fornisce una valutazione indiretta dell'attivazione neurale basata sul principio fisiologico dell'accoppiamento metabolico tra neuroni e cellule gliali6. In questo senso, diversi studi clinici hanno riportato modelli di attività cerebrale modulati da DBS utilizzando FDG-PET (vedi3 per la revisione). Tuttavia, gli studi clinici presentano facilmente diversi inconvenienti quando si concentrano sui pazienti, come l'eterogeneità o le difficoltà di reclutamento, che limitano fortemente il loro potenziale di ricerca6. Questo contesto porta i ricercatori a utilizzare modelli animali di condizioni umane per valutare approcci biomedici prima della loro traduzione clinica o, se già applicati nella pratica clinica, per spiegare l'origine fisiologica dei benefici terapeutici o degli effetti collaterali. Pertanto, nonostante le grandi distanze tra la patologia umana e la condizione modellata negli animali da laboratorio, questi approcci preclinici sono essenziali per una transizione sicura ed efficace nella pratica clinica.

Questo manoscritto descrive un protocollo DBS sperimentale per modelli murini, combinato con uno studio longitudinale FDG-PET, al fine di valutare le conseguenze acute della DBS sul metabolismo cerebrale. I risultati ottenuti con questo protocollo possono aiutare a svelare gli intricati schemi modulatori indotti sull'attività cerebrale dalla DBS. Pertanto, viene fornita un'adeguata strategia sperimentale per esaminare in vivo le conseguenze della stimolazione, consentendo ai medici di anticipare gli effetti terapeutici in circostanze specifiche e quindi adattare i parametri di stimolazione alle esigenze del paziente.

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Protocol

Le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte secondo la direttiva 2010/63 / UE del Consiglio delle Comunità europee e approvate dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'ospedale Gregorio Marañón. Un riepilogo grafico del protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1A.

1. Localizzazione del bersaglio cerebrale mediante neuroimaging in vivo

  1. Preparazione degli animali
    NOTA: Sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di ~ 300 g.
    1. Posizionare l'animale in una scatola di induzione per anestesia e sigillare la parte superiore.
    2. Accendere il vaporizzatore di sevoflurano (5% per induzione in 100% O2). Quando il ratto è anestetizzato, passare il flusso di gas al naso. Confermare lo stato di anestesia pizzicando la zampa del ratto.
    3. Stendere l'animale supino sul letto TC, mantenendo l'anestesia con sevoflurano (3% per il mantenimento in 100% O2).
  2. Imaging TC
    NOTA: la selezione di amperaggio, tensione, numero di proiezioni, numero di colpi e risoluzione voxel dipende dallo scanner CT. Qui, i seguenti parametri: 340 mA, 40 KV, 360 proiezioni, 8 scatti e risoluzione 200 μm sono stati utilizzati 7,8,9.
    1. Fissare la maschera facciale o il cono del naso al ratto.
    2. Fissare il corpo del ratto alla testa, alle spalle, ai fianchi e alla coda con nastro di seta per fornire abbastanza contenimento senza danni.
    3. Monitorare continuamente il ratto.
    4. Individuare la testina al centro del campo visivo dello scanner CT.
    5. Procedere all'acquisizione dell'immagine CT utilizzando i parametri di acquisizione in base alle specifiche dello scanner.
    6. Dopo 10 minuti, quando la TAC in vivo è stata completata, interrompere il flusso di sevoflurano e posizionare il ratto nello scanner MRI.
  3. Imaging MR
    NOTA: le specifiche di acquisizione delle scansioni variano tra gli scanner, inclusi i diversi sistemi software e, soprattutto, la domanda di ricerca specifica. Qui è stato utilizzato uno scanner da 7 Tesla. È stata utilizzata una sequenza spin-echo pesata T2 7,8,9 con TE = 33 ms, TR = 3732 ms e uno spessore della fetta di 0,8 mm (34 fette), dimensioni della matrice di 256 x 256 pixel con un FOV di 3,5 x 3,5 cm2.
    1. Appoggiare l'animale supino sul letto di risonanza magnetica, mantenendo l'anestesia con sevoflurano (3% per il mantenimento in 100% O2).
    2. Fissare la testa a una cornice stereotassica posizionata sul letto dello scanner per evitare movimenti della testa durante l'acquisizione della risonanza magnetica. Inoltre, fissare il resto del corpo del ratto con nastro di seta.
    3. Individuare la testa al centro del campo visivo dello scanner MRI.
    4. Una volta che la posizione è corretta, procedere ad acquisire l'immagine MRI.
    5. Quando la risonanza magnetica in vivo è completa, interrompere il flusso di sevoflurano e posizionare il ratto nella sua gabbia.
    6. Individuare una lampada riscaldante vicino alla gabbia perché i ratti di solito riducono la temperatura corporea durante la scansione.
    7. Monitorare il ratto fino al recupero dall'anestesia.
  4. Co-localizzazione dell'atlante e calcolo delle coordinate target
    1. Una volta acquisite e ricostruite le immagini TC e MRI seguendo le raccomandazioni dello scanner, co-registrare le immagini TC e MRI.
    2. Utilizzare un software di elaborazione delle immagini per normalizzare spazialmente TC e RM utilizzando un algoritmo di registrazione rigido automatico basato su informazioni reciproche10.
    3. Localizzare la linea Bregma nell'immagine co-registrata e misurare la distanza nell'asse anteriore/posteriore (AP: +3,5 mm), mediano/laterale (ML: +0,6 mm) e dorsoventrale (DV: -3,4 mm) da Bregma al bersaglio (cioè corteccia prefrontale mediale, mPFC), secondo l'atlante cerebrale del ratto Paxinos e Watson11.
      NOTA: Le coordinate da Bregma al bersaglio possono differire tra i ratti quando peso, dimensioni, sesso e razza sono diversi.

2. Chirurgia stereotassica

ATTENZIONE: Autoclavare tutto il materiale chirurgico, gli impianti e le unità stereotassiche prima dell'uso e disinfettare l'area chirurgica per evitare infezioni e complicazioni che possono influire sul benessere degli animali. Utilizzare guanti chirurgici sterili e coprire l'animale con tende appiccicose per prevenire la contaminazione.

  1. Preparazione animale e anestesia
    1. Agli animali sono stati somministrati 0,1 mg/kg di buprenorfina per via intraperitoneale il giorno prima dell'intervento. Posizionare l'animale in una camera di induzione per anestesia e sigillare la parte superiore.
    2. Accendere il vaporizzatore di sevoflurano (5% per induzione in 100% O2).
    3. Quando il ratto è sdraiato, spegnere il vaporizzatore di sevoflurano e rimuovere il ratto dalla camera della scatola.
    4. Somministrare per via intraperitoneale una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per anestetizzare l'animale.
    5. Aspetta che l'animale sia completamente anestetizzato. Controllare il livello di anestesia pizzicando l'area interdigitale.
    6. Rasare l'area tra le orecchie e gli occhi.
  2. Posizionamento nel quadro stereotassico e craniotomia
    1. Posizionare l'animale in posizione prona sul telaio stereotassico e utilizzare l'adattatore di tenuta della testa per i ratti per mantenere l'animale nella posizione corretta durante l'intervento.
    2. Garantire l'immobilità della testa utilizzando le barre auricolari del ratto. Fare attenzione con l'inserimento delle barre auricolari, poiché un inserimento troppo profondo potrebbe danneggiare il timpano.
    3. Applicare il gel lubrificante oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'intervento chirurgico e coprirli con una garza sterile.
    4. Coprire l'animale usando tende appiccicose per evitare la contaminazione.
    5. Applicare la soluzione di iodopovidone sulla zona rasata e pulirla con una garza sterile.
    6. Applicare mepivacaina in gel sulla zona rasata per anestetizzare l'area locale.
    7. Fai un'incisione longitudinale nella pelle sovrastante il cranio tra le orecchie, estendendosi per 1,5-2 cm dalla lambda al Bregma (cioè dal vertice cranico verso gli occhi).
    8. Esporre il cranio con l'aiuto di 2 o 3 morsetti. Rimuovere il periostio con un batuffolo di cotone e pulire il sangue con soluzione salina per esporre Bregma e le suture sagittali. Rimuovere la soluzione salina in eccesso con una garza.
    9. Gratta la superficie del cranio con un bisturi per migliorare l'adesione del cemento dentale. Pulire l'area con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno.
  3. Posizionamento e fissazione degli elettrodi al cranio
    1. Raddrizzare gli elettrodi con pinzette di plastica per garantire il corretto posizionamento durante l'intervento.
      NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati elettrodi concentrici bipolari di platino-iridio con la terra.
    2. Individuare un elettrodo sul supporto del braccio destro del telaio stereotassico.
      NOTA: Potrebbe essere necessario adattare il supporto all'elettrodo per fissarlo meglio (vedere Figura 1B). Assicurarsi che l'elettrodo sia parallelo all'asse del supporto.
    3. Spostare il braccio destro tenendo l'elettrodo attraverso il telaio stereotassico e posizionare la punta dell'elettrodo esattamente sopra Bregma. Cercare di avvicinare il più possibile la punta dell'elettrodo al cranio ma senza toccarlo per evitare la deformazione dell'elettrodo, e annotare le coordinate risultanti per Bregma fornite dal telaio stereotassico. Fai un segno sul cranio indicando la posizione iniziale dell'elettrodo con una penna chirurgica.
    4. Spostare il supporto sulle coordinate AP e ML ottenute al punto 1.4.3 e fare un segno sul cranio con una penna chirurgica che indichi la posizione del bersaglio dell'elettrodo.
    5. Rimuovere il braccio destro del telaio stereotassico che tiene l'elettrodo. Fare attenzione a non toccare nulla con l'elettrodo.
    6. Utilizzare un piccolo trapano elettrico per praticare un foro attraverso il cranio (circa 1-1,5 mm di diametro) nella posizione del bersaglio fino a quando la dura è visibile. Fermare qualsiasi sanguinamento usando un batuffolo di cotone.
    7. Praticare 4 fori lungo il cranio per individuare 4 viti (preferibilmente viti in acciaio inossidabile di 2-3 mm di lunghezza) per aumentare la superficie del cemento dentale e per localizzare il terreno. Attaccare le 4 viti.
    8. Individuare il braccio destro del telaio stereotassico con l'elettrodo destro. Spostare il braccio nella posizione calcolata, che dovrebbe coincidere con il foro. Quindi, abbassare l'elettrodo fino a toccare la dura madre. Questa posizione servirà come livello 0 nella direzione DV.
    9. Inserire la punta dell'elettrodo nella direzione DV, utilizzando la posizione DV al punto 1.4.3. Pulire il sangue e il liquido cerebrospinale attorno all'area dell'elettrodo con un batuffolo di cotone.
    10. Attaccare la terra a una delle viti più vicine all'elettrodo.
    11. Applicare il cemento dentale intorno all'elettrodo e alle viti avendo cura di modellare il cemento dentale evitando spigoli vivi, che potrebbero ferire l'animale. Il cemento dentale viene applicato in uno strato per prevenire il surriscaldamento / lesioni termiche al tessuto / cranio. Gli strati spessi richiedono più tempo per polimerizzare prima che vengano aggiunti altri strati. Assicurarsi che il cemento dentale sia completamente indurito prima di rimuovere l'elettrodo dal supporto.
      ATTENZIONE: La preparazione del cemento dentale produce l'emanazione di vapori tossici dalla miscela, che termina con la solidificazione del cemento. Pertanto, indossare una maschera di protezione efficace contro i gas chimici da questo punto e fino alla fine dell'intervento.
    12. Ripetere la stessa procedura dai passaggi 2.3.2-2.3.11 per l'altro emisfero del cervello.
    13. Applicare più cemento dentale per formare un cappuccio senza coprire l'elettrodo. Aspetta che si indurisca.
    14. Utilizzare sutura intrecciata in seta naturale non assorbibile 1/0, con un ago triangolare, per suturare davanti e dietro il cappuccio. Se necessario, rimuovere le suture non assorbibili in un determinato momento in base alla regione del corpo in cui si trovano. Utilizzare una soluzione di iodopovidone per disinfettare l'area chirurgica.
    15. Rimuovi il topo dalla cornice stereotassica.
  4. Imaging TC per la conferma del posizionamento dell'elettrodo
    1. Eseguire i passaggi 1.2.4-1.2.5 e vedere la Figura 1C.
    2. Una volta completata la scansione TC in vivo , posizionare il ratto nella sua gabbia.
    3. Seguire i passaggi 1.3.6. e 1.3.7.
  5. Cure postoperatorie
    1. Somministrare antibiotico (ceftriaxone, 100 mg/kg, sottocutaneo) per 5 giorni e analgesico (buprenorfina, 0,1 mg/kg, intraperitoneale) per 3 giorni come cura postoperatoria. Questo regime antibiotico può essere prolungato per 5 giorni se si osservano segni di infezione (arrossamento, gonfiore ed essudato) intorno al cappuccio.
    2. Eseguire un'ispezione visiva di ogni animale ogni giorno, alla ricerca di segni di dolore o angoscia, e pulire il cappuccio con soluzione di iodopovidone.
    3. Fornire terapia intensiva fino a 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.

3. Acquisizione di immagini PET/CT

NOTA: Ogni animale viene sottoposto a due studi PET/TC (cioè in assenza e durante la somministrazione di DBS) in anestesia per via inalatoria per valutare gli effetti acuti indotti dalla stimolazione elettrica. Entrambe le sessioni di scansione seguono lo stesso protocollo di acquisizione delle immagini, essendo eseguite 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (D1, senza stimolazione) e 2 giorni dopo (D2, durante la DBS).

  1. Preparazione animale e anestesia
    1. Velocizzare il ratto per 8-12 ore prima di ogni scansione PET per consentire un maggiore assorbimento cerebrale di FDG, migliorando il rapporto segnale-rumore12.
    2. Posizionare l'animale in una scatola di induzione per anestesia e sigillare la parte superiore.
    3. Accendere il vaporizzatore di sevoflurano (5% per induzione in 100% O2).
    4. Quando il ratto è anestetizzato, passare il flusso di gas al naso.
  2. Periodo di iniezione e assorbimento di FDG
    ATTENZIONE: FDG è un radiotracciante, quindi considera le misure di radioprotezione per evitare l'esposizione alla radioattività. Confermare che l'istituzione ha tutti i permessi per lavorare con composti radioattivi.
    1. Tenere il flaconcino FDG all'interno di un armadietto rivestito di piombo fino all'uso per evitare un'esposizione indesiderata alla radioattività.
    2. Riempire una siringa di piccolo calibro (~27G) con ~37 MBq della soluzione FDG nel minor volume possibile, misurato in un attivimetro.
    3. Posizionare una piastra elettrica sotto la coda dell'animale o utilizzare la luce a infrarossi per dilatare le vene della coda.
    4. Una volta che le vene laterali sono evidenti nella punta della coda, pulire la zona con alcool sanitario (96%).
    5. Iniettare la soluzione FDG attraverso una delle vene laterali della coda, avvicinandosi alla vena con una siringa parallela alla sua traiettoria e con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto.
    6. Spegnere l'anestesia e rimettere l'animale nella sua gabbia per recuperare completamente sotto una lampada di riscaldamento.
    7. Attendere 45 minuti di assorbimento del radiotracciante prima di iniziare la sessione di acquisizione delle immagini. Durante questo periodo, tenere l'animale sveglio e all'interno di una camera schermata di piombo.
    8. Nel caso dello studio D2, somministrare DBS come spiegato di seguito nel paragrafo 4 (Somministrazione di stimolazione elettrica) durante il periodo di assorbimento di FDG.
  3. Acquisizione PET e ricostruzione dell'imaging
    NOTA: le specifiche di acquisizione delle immagini PET dipendono dallo scanner e dal tempo di scansione. Per questo protocollo, è stata acquisita un'immagine PET statica per 45 minuti con uno scanner PET/CT per piccoli animali, utilizzando una finestra energetica di 400-700 keV 7,8,9. Rivedere le specifiche delle apparecchiature PET/CT prima di progettare il protocollo di acquisizione.
    1. 45 minuti dopo l'iniezione di FDG, posizionare l'animale in una scatola di induzione per anestesia e sigillare la parte superiore.
    2. Accendere il vaporizzatore di sevoflurano (5% per induzione in 100% O2).
    3. Trasferire l'animale sul letto PET/CT e metterlo in posizione supina, fissando il naso al cono nasale dell'anestesia e mantenendo l'anestesia con sevoflurano (3% per il mantenimento al 100% O2). Confermare lo stato di anestesia pizzicando la zampa del ratto.
    4. Ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3.
    5. Posizionare la testina al centro del campo visivo dello scanner PET.
    6. Acquisire l'immagine PET statica utilizzando i parametri di acquisizione in base alle specifiche dello scanner.
    7. Procedere alla ricostruzione dell'immagine utilizzando un algoritmo 2D-OSEM (order subset expectation maximization algorithm) e applicare correzioni di decadimento e dead time 7,8,9.
    8. Quando la scansione PET in vivo è completa, mantenere il flusso di sevoflurano al ratto per procedere successivamente all'acquisizione TC senza spostare la posizione della testa dell'animale sul letto dello scanner.
  4. Acquisizione CT
    1. Senza modificare la posizione dell'animale rispetto alla precedente acquisizione di PET, procedere all'acquisizione dell'immagine TC.
    2. Ripetere i passaggi 1.2.3-1.2.5.
    3. Una volta completata la TAC in vivo , interrompere il flusso di sevoflurano e posizionare il ratto nella rispettiva gabbia per il recupero.
    4. Seguire i passaggi 1.3.6. e 1.3.7.
    5. Mantenere l'animale in una camera schermata di piombo fino al completo decadimento della radioattività.

4. Somministrazione di stimolazione elettrica

NOTA: La stimolazione elettrica viene erogata durante il periodo di assorbimento di FDG nella sessione di imaging D2. Per questo protocollo, la stimolazione è stata erogata con uno stimolatore isolato, con una stimolazione elettrica ad alta frequenza (130 Hz) in modalità corrente costante, 150 μA e una larghezza di impulso di 100 μs 7,13,14.

  1. Configurazione dello stimolatore DBS
    1. Preparare lo stimolatore isolato e i fili necessari in una stanza ampia e silenziosa, con spazio sufficiente per le gabbie degli animali e un'influenza minima di stimoli potenzialmente disturbanti.
    2. Collegare i fili di stimolazione alle girelle per consentire agli animali di muoversi liberamente all'interno delle loro gabbie e allo stimolatore.
    3. Impostare i parametri di stimolazione in base alle esigenze dello studio.
    4. Utilizzare un oscilloscopio per controllare la modalità corrente, la frequenza e l'ampiezza dell'impulso. Confermare la forma d'onda bifasica con una forma di impulso rettangolare (Figura 1D).
  2. Consegna DBS
    1. Dopo la sessione di imaging D1 e fino all'acquisizione di D2, sottoporre gli animali a un protocollo di assuefazione giornaliera (45 min/giorno) per abituarli al sistema di stimolazione e alla manipolazione dell'operatore, evitando risposte indesiderate allo stress in D2. Collegare il sistema di stimolazione a ciascun animale, ma senza attivare la stimolazione.
    2. Una volta che lo stimolatore è stato impostato e l'animale è stato iniettato con FDG, collegare la rotazione agli elettrodi e accendere lo stimolatore.
    3. Dopo 45 minuti, spegnere lo stimolatore, scollegare l'animale dalla girella e trasferirlo rapidamente in una camera di induzione per anestesia per iniziare il passaggio 3.3.

Figure 1
Figura 1: Disegno sperimentale . (A) Sintesi delle fasi sperimentali seguite nel presente protocollo. (B) Immagini rappresentative di un adattamento del supporto per una migliore fissazione dell'elettrodo, con (a sinistra) e senza (a destra) un elettrodo. (C) Immagine fusa di una risonanza magnetica con una TC di un animale operato, che mostra il corretto posizionamento dell'elettrodo nella corteccia prefrontale mediale (mPFC). (D) Screenshot dello schermo dell'oscilloscopio che mostra la forma d'onda della stimolazione bifasica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Elaborazione e analisi delle immagini PET

NOTA: Seguire la stessa elaborazione delle immagini sulle immagini di D1 e D2 per ottenere dati comparabili per la successiva analisi statistica voxel-wise.

  1. Registrazione spaziale delle immagini PET
    1. Utilizzare software di elaborazione delle immagini specializzato. L'intero flusso di lavoro di registrazione è illustrato nella Figura 2.
    2. Centra e ritaglia ogni immagine PET e CT nel campo visivo. Registrare l'immagine PET sul suo CT utilizzando un algoritmo di registrazione rigido automatico basato su informazioni reciproche15.
      NOTA: I metodi di registrazione rigidi sono appropriati solo se non vi sono differenze significative nel peso corporeo o nelle dimensioni tra gli animali. In caso contrario, prendere in considerazione l'utilizzo di metodi elastici.
    3. Registrare ogni immagine CT in una TC di riferimento registrata spazialmente nell'atlante cerebrale del ratto Paxinos e Watson11 come nel punto 5.1.2. Salvare i parametri di trasformazione risultanti.
    4. Applicare i parametri di trasformazione ottenuti al punto 5.1.3. ad ogni immagine PET registrata ottenendo l'immagine PET registrata nell'immagine CT di riferimento.
    5. Salva tutte le immagini PET finali in formato Nifti.
  2. Normalizzazione dell'intensità e livellamento delle immagini PET
    NOTA: la normalizzazione dell'intensità e lo smoothing vengono eseguiti con diversi script interni basati su risorse disponibili pubblicamente.
    1. Smussare le immagini PET con un kernel gaussiano isotropo di 2 mm di FWHM (Full-Width Half Maximum) per correggere possibili errori di registrazione.
      NOTA: La dimensione del filtro di livellamento dipenderà dalla risoluzione dell'acquisizione PET, ma si consiglia di utilizzare un filtro di 2-3 volte la dimensione voxel di FWHM.
    2. Normalizzare l'intensità dei valori dei voxel PET utilizzando un metodo di normalizzazione del cluster di riferimento appropriato16.
    3. Segmentare una maschera cerebrale da una risonanza magnetica di riferimento registrata all'immagine TC di riferimento.
    4. Applicare la maschera cerebrale a ciascuna immagine PET per escludere i voxel al di fuori del cervello dall'analisi voxel-wise.
  3. Analisi voxel-saggia
    NOTA: L'analisi statistica, consistente in un'analisi voxel dei dati dell'immagine PET, è stata eseguita utilizzando un software di analisi di imaging specializzato17.
    1. Confronta le immagini PET D1 e D2 utilizzando un T-test accoppiato, impostando soglie significative statistiche adeguate.
    2. Considerare come risultati definitivi dell'analisi solo quei cluster più grandi di 50 voxel adiacenti per ridurre gli errori di tipo I.
    3. Rappresentare i risultati in mappe T sovrapposte su una risonanza magnetica T2, che mostrano i cambiamenti nel metabolismo cerebrale del glucosio indotti da DBS (colori freddi per la riduzione del FDG e colori caldi per l'incremento dell'FDG).

Figure 2
Figura 2: Flusso di lavoro di registrazione delle immagini Micro PET/CT. Fasi dettagliate dell'elaborazione della normalizzazione spaziale delle immagini PET per la successiva analisi voxel-wise con il software di mappatura statistica parametrica (SPM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Representative Results

Gli animali sono stati sacrificati usando CO2 alla fine dello studio o quando il benessere dell'animale è stato compromesso. Un esempio di uno studio PET/CT completo da un animale operato è mostrato nella Figura 3. Pertanto, l'elettrodo inserito nel cervello del ratto può essere chiaramente osservato nell'immagine TC mostrata in Figura 3A. Questa modalità di imaging fornisce buone informazioni anatomiche e facilita la registrazione delle immagini FDG-PET, dato che le modalità funzionali tendono ad essere più sfocate delle immagini strutturali (Figure 3A,B). Inoltre, un'immagine combinata delle immagini FDG-PET e TC dello stesso animale è mostrata nella Figura 3C.

Figure 3
Figura 3: Micro PET/CT imaging del cervello di ratto con elettrodi DBS impiantati nel mPFC . (A) Sezione sagittale di un'immagine TC. (B) Sezione sagittale di un'immagine FDG-PET dello stesso animale come in A. (C) Un'immagine PET/CT fusa risultava dalla sovrapposizione di immagini A e B registrate spazialmente nello stesso spazio stereotassico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'analisi voxel-wise eseguita con il software SPM12 e fornita qui come esempio consisteva in un T-test accoppiato tra studi D1 (assenza di DBS) e D2 (DBS durante l'assorbimento di FDG), che in realtà appartengono a uno studio precedentemente pubblicato8. Pertanto, la Figura 4 mostra le differenze metaboliche cerebrali tra le due sessioni PET come mappe T sovrapposte a fette cerebrali sequenziali spesse 1 mm da una risonanza magnetica registrata all'immagine TC di riferimento (CTref). Queste differenze consistevano in aumenti e diminuzioni nell'assorbimento di FDG mostrati rispettivamente come colori caldi e freddi. Inoltre, una sintesi dettagliata dei risultati statistici ottenuti dall'analisi è mostrata nella tabella 1. Qui indichiamo la regione cerebrale modulata, l'emisfero cerebrale in cui si osserva la modulazione, la statistica T, la dimensione del cluster nel numero di voxel (k), la direzione della modulazione (cioè cambiamenti ipermetabolici o ipometabolici) e i valori p ottenuti a livelli di picco e cluster. Questo tipo di tabella serve come descrizione dettagliata delle modifiche modulatorie osservate nella figura di sovrapposizione della sezione.

Figure 4
Figura 4: Risultati del T-test accoppiato. T-map risultanti dall'analisi voxel-wise sovrapposte su una risonanza magnetica T2 registrata allo stesso CTref, che mostra i cambiamenti metabolici indotti da un protocollo DBS acuto (D2 vs. D1). Le barre colorate nella parte inferiore dell'immagine rappresentano i valori T corrispondenti agli aumenti regionali (colori caldi) e alle diminuzioni (colori freddi) dell'assorbimento di FDG (p < 0,005; k > 50 voxel). Abbrev.: AHiPM/AL - Area amigdaloippocampale parte posteromediale/anterolaterale, Au - Corteccia uditiva, Bstm - Tronco encefalico, CPU - Caudato-putamen, HTh - Ipotalamo, L - Emisfero sinistro, PMCo - Nucleo amigdaloide corticale posteromediale, R - Emisfero destro, S1 - Corteccia somatosensoriale primaria. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Casquero-Veiga et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

D1 vs D2: effetto di stimolazione
Roi Lato T Okay ↓/↑ p unc. Livello di picco FWE FWE
Livello di picco Livello cluster
Bstm R & L 18.39 1549 ↓ <0,001 0.432 <0,001
AHiPM/AL-PMCo - HTh L 10.39 ↓ <0,001 0.949
CPU L 37.56 738 ↑ <0,001 0.025 <0,001
S1-IT 10.53 ↑ <0,001 0.947
CPu-PIR R 17.74 695 ↑ <0,001 0.497 <0,001
S1-IT 10.45 ↑ <0,001 0.948

Tabella 1: Cambiamenti nel metabolismo cerebrale dopo DBS acuta in mPFC. D1 vs D2: effetto di stimolazione. Strutture: AHiPM/AL: Amigdalohippocampal area posteromediale/anterolaterale parte, Au: Corteccia uditiva, Bstm: Tronco encefalico, CPu: Caudato-putamen, HTh: Ipotalamo, Pir: Corteccia piriforme, PMCo: Nucleo amigdaloide corticale posteromediale, S1: Corteccia somatosensoriale primaria. ROI: Regione di interesse. Lato: destro (R) e sinistro (L). T: valore t, k: dimensione del cluster. Metabolismo del glucosio: aumento (↑) e diminuzione (↓). p: p-value, unc.: uncorrected, FWE: Family wise error correction. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Casquero-Veiga et al.8.

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Discussion

Dati i progressi nella comprensione della funzione cerebrale e delle reti neurali coinvolte nella fisiopatologia dei disturbi neuropsichiatrici, sempre più ricerche stanno riconoscendo il potenziale della DBS in una vasta gamma di patologie neurologiche2. Tuttavia, il meccanismo d'azione di questa terapia rimane poco chiaro. Diverse teorie hanno tentato di spiegare gli effetti ottenuti in specifiche circostanze patologiche e di stimolazione, ma l'eterogeneità degli studi proposti rende molto difficile giungere a conclusioni definitive4. Pertanto, nonostante i grandi sforzi, non c'è un vero consenso, ma il numero di pazienti sottoposti a intervento DBS continua a crescere18. Quindi, comprendere le conseguenze della DBS nel cervello in vivo permetterà di svelare quali parametri di stimolazione e protocolli di stimolazione sono più adeguati alle esigenze di ciascun paziente, ottenendo così un migliore tasso di successo. In questo contesto, le modalità di neuroimaging funzionale non invasive, come FDG-PET, sono essenziali per far luce su ciò che sta realmente accadendo sotto l'influenza diretta della stimolazione elettrica nel cervello. Ad esempio, nel protocollo longitudinale spiegato qui, la DBS viene erogata durante il periodo di assorbimento del radiotracciante dell'immagine PET D2. Pertanto, il confronto degli studi PET D2 (DBS-ON) e D1 (DBS-OFF) consente la visualizzazione delle regioni cerebrali che vengono modulate dalla stimolazione elettrica in vivo, poiché le proprietà di "intrappolamento metabolico" di FDG consentono di registrare i cambiamenti cumulativi che si verificano direttamente durante la stimolazione13,19.

Complessivamente, questo protocollo descrive una strategia fattibile per valutare le conseguenze acute della DBS nel cervello in vivo, ma la varietà di combinazioni di parametri DBS e protocolli disponibili è immensa (ad esempio, trattamenti continui vs. intermittenti20, stimolazione ad alta vs. bassa frequenza21), e anche gli effetti della DBS possono differire insieme al trattamento a causa della deduzione di cambiamenti diretti nella rete cerebrale sotto l'influenza della stimolazione22 . Inoltre, il numero di possibilità diventa ancora maggiore considerando il numero crescente di patologie per le quali la DBS è raccomandata23. Pertanto, gli studi di neuroimaging longitudinale volti a scoprire i modelli di attivazione neurale che consentono di prevedere la potenziale risposta al trattamento con DBS sono di particolare rilevanza clinica24,25. A questo proposito, esiste un ampio numero di studi clinici e preclinici che hanno valutato gli effetti terapeutici di diversi protocolli DBS mediante FDG-PET (vedi3 per la revisione). Pertanto, ci sono diversi esempi in cui il protocollo DBS studiato contrasta il pattern metabolico cerebrale associato alla patologia in trattamento, inducendo un miglioramento dei sintomi del paziente e dimostrando l'utilità clinica degli approcci DBS-PET. Un esempio di ciò si trova nella stimolazione della regione cingolata subcallosa (SCC) per i pazienti con depressione resistente al trattamento. La SCC è metabolicamente iperattiva nei pazienti non medicati con depressione26 e questa iperattivazione è normalizzata dopo la remissione della depressione mediante trattamento farmacologico, psicoterapeutico o DBS27,28,29. Di importante, il metabolismo SCC era più alto in quei pazienti che hanno risposto alla DBS prima di iniziare la stimolazione rispetto ai non responder. Questo studio ha mostrato un'accuratezza dell'80% nella previsione della risposta a SCC-DBS29, evidenziando l'importanza dei biomarcatori di imaging nella selezione di potenziali pazienti per DBS. Pertanto, il contesto spiegato riflette una storia di successo clinico degli studi FDG-PET che mirano a mappare il modello metabolico cerebrale della depressione con i risultati terapeutici ottenuti con SCC-DBS, che dovrebbero porre le basi per approcci simili focalizzati su altri disturbi neuropsichiatrici e protocolli DBS in futuro.

In questo senso, al fine di osservare gli effetti fisiologici della DBS utilizzando FDG-PET, è particolarmente rilevante considerare attentamente le tempistiche specifiche del protocollo DBS da scansionare. Pertanto, pur applicando gli stessi parametri DBS e lo stesso protocollo, la tempistica per l'acquisizione dell'immagine determinerà chiaramente l'origine della modulazione osservata, il che può portare a potenziali fraintendimenti non considerando tutti i fattori coinvolti nella risposta finale ottenuta8. Pertanto, mentre la pianificazione dell'intervento chirurgico è determinante nel porre le basi per la terapia successiva, la progettazione di un protocollo di acquisizione delle immagini adeguato alle conseguenze della stimolazione in studio è essenziale per comprendere appieno il meccanismo molecolare alla base del trattamento di stimolazione applicato. Lungo queste linee, diversi fattori possono modificare drasticamente la risposta a uno specifico protocollo DBS (ad esempio, parametri di stimolazione, inserimento di elettrodi, struttura cerebrale mirata, patologia sotto trattamento, durata e frequenza delle sessioni DBS, ecc.) 7,8,30. I fenomeni riflessi dai dati raccolti nello studio FDG-PET dipenderanno dal momento specifico nel corso della terapia in cui vengono acquisite le immagini. Quindi, tutti questi punti aprono diverse opportunità di ricerca per esplorare la modulazione indotta da DBS e contribuire a spiegare i meccanismi alla base di questa terapia.

Pertanto, nonostante le grandi differenze che separano il cervello dei roditori da quello umano, dovrebbero essere implementate pratiche adeguate a tutti i livelli, con l'obiettivo di sviluppare protocolli traslazionali. In questo senso, non va ignorato che la DBS richiede un intervento chirurgico altamente invasivo basato su una craniotomia in modo che gli elettrodi possano accedere alle strutture cerebrali profonde31. A questo punto, ci sono due importanti fonti di infezione e reazione infiammatoria: da un lato, l'esposizione diretta del tessuto cerebrale durante l'intervento chirurgico e, dall'altro, l'inserimento di due elementi esogeni in un organo interno, creando una cicatrice inserzionale dalla loro traiettoria verso il bersaglio di stimolazione32. Pertanto, la sterilizzazione delle apparecchiature chirurgiche, il mantenimento di un'area operatoria pulita e un'adeguata assistenza postoperatoria basata su trattamenti antibiotici e analgesici33 sono essenziali per garantire che il soggetto ottenga il massimo beneficio dall'intervento e nelle condizioni più salubri. Inoltre, questo è di particolare rilevanza negli studi di imaging FDG-PET, in quanto l'insorgenza di complicanze post-chirurgiche può modificare il modello di assorbimento del radiotracciante dato che i processi infiammatori e infettivi sono chiaramente visti come segnali ipermetabolici34, che possono portare a una risposta modificata al trattamento o a una sovrastima della modulazione prodotta dalla DBS.

Tuttavia, questa metodologia sperimentale è soggetta ad alcune limitazioni: in primo luogo, i protocolli DBS sono di solito trattamenti a lungo termine, continui e cronici. Qui, viene mostrato un protocollo di neuroimaging per valutare gli effetti acuti della DBS in tempo reale. Pertanto, la tempistica suggerita per gli studi di neuroimaging non sarebbe adeguata per ottenere informazioni sulla modulazione a lungo termine indotta da DBS quasi in tempo reale. Tuttavia, può gettare le basi per lo sviluppo di diversi approcci longitudinali che fungano da conoscenze di base per comprendere le risposte derivate dalla DBS. In secondo luogo, poiché sono stati utilizzati animali sani per illustrare questo metodo, l'applicazione delle tecniche spiegate a diverse condizioni patologiche può richiedere il loro adattamento per garantire risultati migliori e condizioni di benessere ottimali. Infine, le analisi voxel-wise richiedono campioni di grandi dimensioni e/o forti fattori di correzione per ottenere risultati affidabili, poiché sono sempre influenzati da un problema di confronti statistici multipli. Tuttavia, la valutazione delle conseguenze della DBS sul metabolismo cerebrale utilizzando FDG-PET con un approccio voxel-wise è un grande vantaggio a causa della natura esplorativa intrinseca di questo metodo, che consente analisi estese dell'intero cervello senza la necessità di alcuna ipotesi preliminare.

Nonostante gli svantaggi spiegati della combinazione di DBS e FDG-PET, questi approcci offrono un'ampia finestra di opportunità. Pertanto, ottenere informazioni metaboliche cerebrali in modo non invasivo è un grande vantaggio nel senso che i dati neurofisiologici possono essere raccolti dal soggetto durante la stimolazione e in molte occasioni diverse insieme al trattamento DBS. Inoltre, FDG-PET è una tecnica di neuroimaging in ambito clinico, che rafforza l'approccio traslazionale che motiva questo metodo. Allo stesso modo, l'uso della FDG-PET è un'alternativa particolarmente adatta poiché, a differenza di altre modalità di imaging, il segnale ottenuto non è influenzato da distorsioni secondarie nei campi elettrici o magnetici derivati dal sistema di neurostimolazione, che possono compromettere sia la qualità dell'immagine che le prestazioni del sistema24. D'altra parte, l'interesse della ricerca nella valutazione delle conseguenze modulatorie della DBS non si limita ai benefici terapeutici. Infatti, poiché la DBS è una terapia di neurostimolazione focale, modulatoria e non permanente, può anche aiutare a svelare i percorsi di attività neurofunzionale valutati mediante tecniche di imaging molecolare e in risposta agli stimoli elettrici forniti dal syste35. Queste informazioni potrebbero essere particolarmente preziose per decifrare enigmi neurofisiologici irrisolti in condizioni sane e patologiche. Infine, la metodologia spiegata in questo manoscritto fornisce la capacità di osservare gli effetti della neuromodulazione indotta da DBS in vivo, essendo una potente strategia per determinare l'impatto della stimolazione durante la sua applicazione. In breve, comprendere l'effetto in vivo della DBS aiuterà a comprendere gli effetti desiderati e indesiderati di questo trattamento, prevedere il miglioramento clinico e, infine, adattare i protocolli di stimolazione alle esigenze di ciascun paziente.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse in relazione a questo articolo.

Acknowledgments

Ringraziamo le Prof. Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco e Yolanda Sierra per il loro prezioso supporto nell'ottimizzazione della metodologia qui descritta. MLS è stato sostenuto dal Ministerio de Ciencia e Innovación, Instituto de Salud Carlos III (numero di progetto PI17/01766 e numero di sovvenzione BA21/0030) cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), "Un modo per fare l'Europa"; CIBERSAM (progetto numero CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (numero di progetto 2017/085); Fundación Mapfre; e Fundación Alicia Koplowitz.  MCV è stato sostenuto dalla Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno come borsista di questa istituzione e dal Programma congiunto dell'UE - Ricerca sulle malattie neurodegenerative (JPND). Il DRM è stato sostenuto dalla Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, cofinanziato dal Fondo sociale europeo "Investing in your future" (numero di sovvenzione PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR è stato sostenuto dall'Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". Il lavoro di MD è stato sostenuto dal Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) e dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PT20/00044). Il CNIC è sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) e dalla Fondazione Pro CNIC, ed è un Centro di Eccellenza Severo Ochoa (SEV-2015-0505).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Tesla Biospec 70/20 scanner Bruker, Germany SN0021 MRI scanner for small animal imaging
Betadine Meda Pharma S.L., Spain 644625.6 Iodine solution (iodopovidone)
Beurer IL 11 Beurer SN87318 Infra-red light
Bipolar cable 50 cm w/50 cm mesh covering up to 100 cm Plastics One, USA 305-305 (CM)
Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm Plastics One, USA 305-340/2 Bipolar cable TT2  50 cm up to 100 cm
Buprex Schering-Plough, S.A 961425 Buprenorphine (analgesic)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IM Laboratorio Reig Jofré S.A., Spain 624239.1 Ceftriaxone (antibiotic)
Commutator Plastics One, USA SL2+2C 4 Channel Commutator for DBS
Concentric bipolar platinum-iridium electrodes Plastics One, USA MS303/8-AIU/Spc Electrodes for DBS
Driller Bosh T58704 Driller
FDG Curium Pharma Spain S.A., Spain ----- 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer)
Heating pad DAGA, Spain 23115 Heating pad
Ketolar Pfizer S.L., Spain 776211.9 Ketamine (anesthetic drug)
Lipolasic 2 mg/g Bausch & Lomb S.A, Spain 65277 Ophthalmic lubricating gel
MatLab R2021a The MathWorks, Inc Support software for SPM12
MRIcro McCausland Center for Brain Imaging,  University of South Carolina, USA v2.1.58-0 Software for imaging preprocessing and analysis
Multimodality Workstation (MMWKS) BiiG, Spain Software for imaging processing and analysis
Omicrom VISION VET RGB Medical Devices, Spain 731100 ReV B Cardiorrespiratory monitor for small imaging
Prevex Cotton buds Prevex, Finland ----- Cotton buds
Sevorane AbbVie Spain, S.L.U, Spain 673186.4 Sevoflurane (inhalatory anesthesia)
Small screws Max Witte GmbH 1,2 x 2 DIN 84 A2 Small screws
Standard U-Frame Stereotaxic Instrument for Rat, 18° Ear Bar Harvard Apparatus, USA 75-1801 Two-arms Stereotactic frame for rat
Statistical Parametric Mapping (SPM12) The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK SPM12 Software for voxel-wise imaging analysis
STG1004 Multi Channel Systems GmbH, Germany STG1004 Isolated stimulator
SuperArgus PET/CT scanner Sedecal, Spain S0026403 NanoPET/CT scanner for small animal imaging
Suture thread with needle, 1/º Lorca Marín S.A., Spain 55325 Braided natural silk non-absorbable suture 1/0, with triangle needle
Technovit 4004 (powder and liquid) Kulzer Technique, Germany 64708471; 64708474 Acrylic dental cement for craniotomy tap
Wistar rats (Rattus norvergicus) Charles River, Spain animal facility Animal model used
Xylagesic Laboratorios Karizoo, A.A, Spain 572599-4 Xylazine (anesthetic drug)
Normon S.A., Spain 602910 Mepivacaine in gel for topical use

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