Summary
우리는 생체 내 FDG-PET를 이용한 급성 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 대사 신경 조절을 평가하는 전임상 실험 방법을 설명합니다. 이 원고에는 정위 수술에서 자극 치료의 적용, PET 이미지의 획득, 처리 및 분석에 이르기까지 모든 실험 단계가 포함되어 있습니다.
Abstract
심부 뇌 자극 (DBS)은 환자의 병태 생리학에 관여하는 뇌 구조에 전기 펄스를 적용하는 것을 기반으로하는 침습적 신경 외과 기술입니다. DBS의 오랜 역사에도 불구하고 그 작용 메커니즘과 적절한 프로토콜은 불분명하여 이러한 수수께끼를 해결하기위한 연구의 필요성을 강조합니다. 이러한 의미에서 기능적 이미징 기술을 사용하여 DBS의 생체 내 효과를 평가하는 것은 자극이 뇌 역학에 미치는 영향을 결정하는 강력한 전략을 나타냅니다. 여기에서는 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 결과를 평가하기 위해 종단 연구 [18F]-플루오로 데 옥시 클루 코스 양전자 방출 단층 촬영 (FDG-PET)과 결합 된 전임상 모델 (Wistar rats)에 대한 실험 프로토콜이 설명됩니다. 첫째, 동물들은 전두엽 피질에 전극을 양측 이식하기 위해 정위 수술을 받았다. 전극 배치를 확인하기 위해 각 동물의 수술 후 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔을 획득했습니다. 회복 1주일 후, 자극 없이 각각의 조작된 동물의 제1 정적 FDG-PET를 획득하고(D1), 이틀 후(D2), 동물을 자극하는 동안 제2 FDG-PET를 획득하였다. 이를 위해 전극은 FDG를 동물에게 투여 한 후 분리 된 자극기에 연결되었습니다. 따라서, FDG 흡수 기간 (45 분) 동안 동물을 자극하여 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 효과를 기록했다. 이 연구의 탐색적 특성을 감안할 때, FDG-PET 이미지는 D1과 D2 연구 사이의 쌍을 이루는 T-검정을 기반으로 한 복셀-현명한 접근 방식으로 분석되었습니다. 전반적으로 DBS와 영상 연구의 결합을 통해 신경망에 대한 신경 조절 결과를 설명할 수 있어 궁극적으로 DBS를 둘러싼 수수께끼를 푸는 데 도움이 됩니다.
Introduction
신경 자극이라는 용어는 치료 목표1로 신경계를 자극하기위한 다양한 기술을 포함합니다. 그 중 심뇌 자극 (DBS)은 임상 실습에서 가장 널리 퍼진 신경 자극 전략 중 하나입니다. DBS는 정위 수술에 의해 조절되는 뇌 표적에 배치 된 전극을 통해 환자의 신체에 직접 이식 된 신경 자극기에 의해 전달되는 전기 펄스로 심부 뇌 핵의 자극으로 구성됩니다. 다양한 신경 및 정신 장애에서 DBS 적용의 타당성을 평가하는 논문의 수는 지속적으로 증가하고 있습니다.2 그 중 일부만이 식품의약국(FDA)의 승인을 받았습니다(즉, 본태성 진전, 파킨슨병, 근긴장이상, 강박 장애 및 의학적으로 불응성 간질)3 . 또한, 공식적으로 승인 된 것보다 더 많은 병리의 DBS 치료를 위해 많은 뇌 표적과 자극 프로토콜이 연구 중이지만 그 중 어느 것도 결정적인 것으로 간주되지 않습니다. DBS 연구 및 임상 절차의 이러한 불일치는 부분적으로 작용 메커니즘에 대한 완전한 이해 부족 때문일 수 있습니다4. 따라서 DBS가 뇌 역학에 미치는 생체 내 효과를 해독하기 위해 엄청난 노력을 기울이고 있으며, 모든 발전은 아무리 작더라도 DBS 프로토콜을 개선하여 더 큰 치료 성공을 거둘 수 있도록 도와줍니다.
이러한 맥락에서 분자 이미징 기술은 DBS의 생체 내 신경 조절 효과를 관찰할 수 있는 직접적인 창을 엽니다. 이러한 접근법은 DBS가 적용되는 동안 DBS의 영향을 결정할 뿐만 아니라 그 결과의 본질을 밝히고, 원치 않는 부작용 및 임상적 개선을 예방하고, 자극 매개변수를환자의 필요에 맞게 조정할 수 있는 기회를 제공합니다5. 이들 방법들 중에서, 2-데옥시-2-[18F]플루오로-D-글루코오스 (FDG)를 사용하는 양전자 방출 단층촬영(PET)은 상이한뇌 영역(6)의 활성화 상태에 대한 특정 및 실시간 정보를 제공하기 때문에 특히 흥미롭다. 구체적으로, FDG-PET 영상화는 뉴런과 신경교 세포 사이의 대사 결합의 생리학적 원리에 기초한 신경 활성화의 간접적인 평가를 제공한다6. 이러한 의미에서 여러 임상 연구에서 FDG-PET를 사용하여 DBS 조절 뇌 활동 패턴을보고했습니다 (검토를 위해3 참조). 그럼에도 불구하고 임상 연구는 이질성 또는 모집 어려움과 같은 환자에게 초점을 맞출 때 연구 잠재력을 크게 제한하는 몇 가지 단점을 쉽게 발생시킵니다6. 이러한 맥락에서 연구자들은 인간 상태의 동물 모델을 사용하여 임상 번역 전에 생물 의학적 접근법을 평가하거나 이미 임상 실습에 적용된 경우 치료 이점 또는 부작용의 생리적 기원을 설명하게됩니다. 따라서 인간 병리학과 실험실 동물의 모델링 된 조건 사이의 먼 거리에도 불구하고 이러한 전임상 접근법은 임상 실습으로의 안전하고 효과적인 전환에 필수적입니다.
이 원고는 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 결과를 평가하기 위해 종단 FDG-PET 연구와 결합 된 쥐 모델에 대한 실험적 DBS 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜로 얻은 결과는 DBS에 의해 뇌 활동에 유도 된 복잡한 조절 패턴을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서, 생체 내에서 자극의 결과를 조사하기 위한 적절한 실험 전략이 제공되어, 임상의가 특정 상황에서 치료 효과를 예상한 다음 자극 파라미터를 환자의 필요에 맞게 조정할 수 있다.
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Protocol
실험 동물 절차는 유럽 공동체 이사회 지침 2010 / 63 / EU에 따라 수행되었으며 Gregorio Marañón 병원의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험 프로토콜의 그래픽 요약이 그림 1A에 나와 있습니다.
1. 생체 내 신경영상에 의한 뇌 표적 국소화
- 동물 준비
참고 : ~ 300g의 수컷 Wistar 쥐가 사용되었습니다.- 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
- 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다. 쥐가 마취되면 가스 흐름을 노즈 콘으로 전환하십시오. 쥐 발을 꼬집어 마취 상태를 확인하십시오.
- 동물 앙와위를 CT 침대에 놓고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (100 % O2에서 유지 보수를 위해 3 %).
- CT 영상
알림: 암페어, 전압, 투사 수, 촬영 컷 수 및 복셀 해상도의 선택은 CT 스캐너에 따라 다릅니다. 여기서 다음 매개 변수 : 340mA, 40KV, 360 프로젝션, 8 샷 및 200μm 분해능이 사용되었습니다 7,8,9.- 안면 마스크 또는 코 콘을 쥐에게 고정하십시오.
- 쥐의 머리, 어깨, 엉덩이, 꼬리를 실크 테이프로 고정하여 손상없이 충분한 구속을 제공합니다.
- 쥐를 지속적으로 모니터링하십시오.
- CT 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
- 스캐너 사양에 따라 획득 파라미터를 사용하여 CT 이미지 획득을 진행합니다.
- 10분 후, 생체 내 CT 스캔이 완료되면, 세보플루란 흐름을 멈추고 쥐를 MRI 스캐너에 넣는다.
- MR 이미징
참고: 스캔 획득 사양은 다양한 소프트웨어 시스템과 더 중요한 특정 연구 질문을 포함하여 스캐너마다 다릅니다. 여기에는 7-Tesla 스캐너가 사용되었습니다. TE = 33ms, TR = 3732ms, 및 슬라이스 두께가 0.8mm(34슬라이스)인 T2-가중 스핀-에코 시퀀스 7,8,9, FOV가 3.5 x 3.5cm2인 256 x 256픽셀의 매트릭스 크기를 사용하였다.- MRI 침대에 동물 앙와위를 놓고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (100 % O2에서 유지 보수를 위해 3 %).
- MRI 획득 중 머리의 움직임을 방지하기 위해 스캐너 베드에 놓인 정위 프레임에 머리를 고정합니다. 또한 실크 테이프로 쥐 몸의 나머지 부분을 고정하십시오.
- MRI 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
- 위치가 정확하면 MRI 이미지 획득을 진행합니다.
- 생체 내 MRI 스캔이 완료되면 세보 플루 란 흐름을 멈추고 쥐를 새장에 넣습니다.
- 쥐는 일반적으로 스캔하는 동안 체온을 낮추기 때문에 케이지 근처에 가열 램프를 배치하십시오.
- 마취에서 회복 될 때까지 쥐를 모니터링하십시오.
- Atlas 공동 위치 파악 및 대상 좌표 계산
- 스캐너의 권장 사항에 따라 CT 및 MRI 이미지를 획득하고 재구성한 후 CT 및 MRI 이미지를 공동 등록합니다.
- 영상 처리 소프트웨어를 사용하여 상호 정보10을 기반으로 하는 자동 경직 등록 알고리즘을 사용하여 CT와 MRI를 공간적으로 정규화합니다.
- Paxinos 및 Watson 쥐 뇌 아틀라스11에 따라 공동 등록된 이미지에서 브레그마 선을 국소화하고 브레그마에서 대상(즉, 내측 전전두엽 피질, mPFC)까지의 전방/후방(AP: +3.5mm), 정중선/외측(ML: +0.6mm) 및 배복부(DV: -3.4mm) 축의 거리를 측정합니다.
알림: Bregma에서 대상까지의 좌표는 체중, 크기, 성별 및 품종이 다를 때 쥐마다 다를 수 있습니다.
2. 정위 수술
주의 : 사용하기 전에 모든 수술 재료, 임플란트 및 정위 장치를 오토 클레이브하고 동물 복지에 영향을 미칠 수있는 감염 및 합병증을 피하기 위해 수술 부위를 소독하십시오. 멸균 수술 장갑을 사용하고 오염을 방지하기 위해 끈적 끈적한 커튼으로 동물을 덮으십시오.
- 동물 준비 및 마취
- 동물에게 수술 전날 0.1mg/kg 부프레노르핀 복강내 투여하였다. 동물을 마취 유도 상자 챔버에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
- 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
- 쥐가 기대어 앉으면 세보 플루 란 기화기를 끄고 상자 챔버에서 쥐를 꺼냅니다.
- 동물을 마취하기 위해 케타민 (100 mg / kg)과 자일 라진 (10 mg / kg)의 혼합물을 복강 내 투여하십시오.
- 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다리십시오. 인터 디지털 영역을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오.
- 귀와 눈 사이의 영역을 면도하십시오.
- 정위 프레임과 개두술에 배치
- 동물을 정위 프레임의 엎드린 위치에 놓고 쥐가 수술 중에 동물을 올바른 위치에 유지하기 위해 머리 고정 어댑터를 사용하십시오.
- 쥐 귀 바를 사용하여 머리의 움직이지 않도록하십시오. 이어바를 너무 깊게 삽입하면 고막이 손상될 수 있으므로 주의하세요.
- 수술 중 건조를 방지하기 위해 안과 용 윤활 젤을 눈에 바르고 멸균 거즈로 덮으십시오.
- 오염을 방지하기 위해 끈적 끈적한 커튼으로 동물을 덮으십시오.
- 면도 부위에 요오드 포비돈 용액을 바르고 멸균 거즈로 닦으십시오.
- 면도 한 부위의 젤에 메피 바카 인을 바르면 국소 부위가 마취됩니다.
- 귀 사이의 두개골 위에있는 피부에 세로 절개를하여 람다에서 브레그마까지 (즉, 두개골 정점에서 눈으로) 1.5-2cm 연장합니다.
- 2 개 또는 3 개의 클램프를 사용하여 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 골막을 제거하고 식염수로 혈액을 깨끗이하여 Bregma와 시상 봉합사를 노출시킵니다. 과량의 식염수를 거즈로 제거하십시오.
- 치과용 시멘트 접착력을 향상시키기 위해 메스로 두개골 표면을 긁습니다. 과산화수소에 적신 면봉으로 해당 부위를 청소하십시오.
- 두개골에 전극 배치 및 고정
- 수술 중 올바른 위치를 보장하기 위해 플라스틱 핀셋으로 전극을 곧게 펴십시오.
알림: 접지가 있는 동심 양극성 백금-이리듐 전극이 이 프로토콜에 사용됩니다. - 입체 프레임의 오른팔 홀더에 하나의 전극을 배치하십시오.
알림: 더 잘 고정하려면 홀더를 전극에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다( 그림 1B 참조). 전극이 홀더의 축과 평행한지 확인하십시오. - 정위 프레임을 통해 전극을 잡고 있는 오른팔을 움직이고 전극 끝을 Bregma 위에 정확히 놓습니다. 전극의 변형을 피하기 위해 전극 팁을 두개골에 최대한 가깝게 가져 오되 만지지 말고 입체 프레임에서 제공하는 Bregma의 결과 좌표를 기록하십시오. 수술 용 펜으로 전극의 초기 위치를 나타내는 두개골에 표시를하십시오.
- 홀더를 1.4.3단계에서 얻은 AP 및 ML 좌표로 이동하고 전극 대상의 위치를 나타내는 수술용 펜으로 두개골에 표시를 합니다.
- 전극을 잡고 있는 입체 프레임의 오른팔을 제거합니다. 전극으로 아무것도 만지지 않도록주의하십시오.
- 작은 전기 드릴을 사용하여 경막이 보일 때까지 목표 위치의 두개골 (직경 약 1-1.5mm)을 통해 구멍을 뚫습니다. 면봉을 사용하여 출혈을 멈추십시오.
- 두개골을 따라 4 개의 구멍을 뚫어 4 개의 나사 (바람직하게는 2-3mm 길이의 스테인레스 스틸 나사)를 찾아 치과 용 시멘트의 표면적을 늘리고지면을 찾습니다. 나사 4개를 부착합니다.
- 오른쪽 전극으로 입체 프레임의 오른팔을 찾습니다. 구멍과 일치해야하는 계산 된 위치로 팔을 이동하십시오. 그런 다음 경막에 닿을 때까지 전극을 내립니다. 이 위치는 DV 방향으로 0 레벨로 사용됩니다.
- 단계 1.4.3에서 DV 위치를 사용하여 전극의 끝을 DV 방향으로 삽입합니다. 면봉으로 전극 부위 주변의 혈액과 뇌척수액을 청소하십시오.
- 전극에 가장 가까운 나사 중 하나에 접지를 부착하십시오.
- 전극과 나사 주위에 치과용 시멘트를 바르고 동물을 다치게 할 수 있는 날카로운 모서리를 피하면서 치과용 시멘트의 모양을 만듭니다. 치과용 시멘트는 조직/두개골의 과열/열 손상을 방지하기 위해 층에 적용됩니다. 두꺼운 층은 추가 층이 추가되기 전에 경화하는 데 더 많은 시간이 필요합니다. 홀더에서 전극을 제거하기 전에 치과용 시멘트가 완전히 경화되었는지 확인하십시오.
주의 : 치과 용 시멘트의 준비는 혼합물에서 독성 증기를 방출하여 시멘트의 응고로 끝납니다. 따라서이 시점부터 수술이 끝날 때까지 화학 가스에 효과적인 보호 마스크를 착용하십시오. - 뇌의 다른 반구에 대해 2.3.2-2.3.11 단계에서 동일한 절차를 반복하십시오.
- 전극을 덮지 않고 캡을 형성하기 위해 더 많은 치과 용 시멘트를 바르십시오. 굳을 때까지 기다리십시오.
- 삼각형 바늘로 꼰 천연 실크 비 흡수성 봉합사 1/0을 사용하여 캡 앞뒤로 봉합하십시오. 필요한 경우 비흡수성 봉합사가 위치한 신체 부위에 따라 특정 시간에 봉합사를 제거합니다. 요오드 포비돈 용액을 사용하여 수술 부위를 소독하십시오.
- 입체 프레임에서 쥐를 제거하십시오.
- 수술 중 올바른 위치를 보장하기 위해 플라스틱 핀셋으로 전극을 곧게 펴십시오.
- 전극 배치 확인을 위한 CT 영상
- 1.2.4-1.2.5단계를 수행하고 그림 1C를 참조하십시오.
- 생체 내 CT 스캔이 완료되면 쥐를 케이지에 넣습니다.
- 1.3.6 단계를 따르십시오. 및 1.3.7.
- 수술 후 관리
- 수술 후 치료로 항생제 (세프 트리 악손, 100mg / kg, 피하)를 5 일 동안 투여하고 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.1mg / kg, 복강 내)를 3 일 동안 투여합니다. 이 항생제 요법은 뚜껑 주변에서 감염 징후 (발적, 부기 및 삼출물)가 관찰되면 5 일 동안 연장 될 수 있습니다.
- 매일 각 동물을 육안으로 검사하여 통증이나 고통의 징후를 찾고 요오드 포비돈 용액으로 뚜껑을 청소하십시오.
- 수술 후 최대 1주일 동안 집중 치료를 제공합니다.
3. PET/CT 영상 획득
참고: 각 동물은 전기 자극에 의해 유도된 급성 효과를 평가하기 위해 흡입 마취 하에 두 번의 PET/CT 연구(즉, 부재 시 및 DBS 투여 중)를 받습니다. 두 스캔 세션 모두 동일한 영상 획득 프로토콜을 따르며 수술 후 1주일(D1, 자극 없음)과 2일 후(D2, DBS 중)에 수행됩니다.
- 동물 준비 및 마취
- FDG의 더 높은 뇌 흡수를 허용하기 위해 각 PET 스캔 전에 8-12 시간 동안 쥐를 빠르게 하여 신호 대 잡음비12를 개선합니다.
- 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
- 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
- 쥐가 마취되면 가스 플럭스를 코 콘으로 전환하십시오.
- FDG 주입 및 섭취 기간
주의 : FDG는 방사능 추적자이므로 방사능 노출을 피하기 위해 방사선 보호 조치를 고려하십시오. 기관이 방사성 화합물로 작업 할 수있는 모든 권한을 가지고 있는지 확인하십시오.- 바람직하지 않은 방사능 노출을 피하기 위해 사용될 때까지 FDG 바이알을 납이 늘어선 캐비닛 안에 보관하십시오.
- 작은 게이지 주사기 (~ 27G)에 활성 측정기에서 측정 한 것처럼 가능한 한 적은 양의 ~ 37MBq의 FDG 용액을 채 웁니다.
- 동물의 꼬리 아래에 가열 패드를 놓거나 적외선을 사용하여 꼬리 정맥을 확장하십시오.
- 꼬리의 정점에서 측면 정맥이 분명 해지면 위생 알코올 (96 %)로 해당 부위를 청소하십시오.
- 측면 꼬리 정맥 중 하나를 통해 FDG 용액을 주입하고 궤적과 평행 한 주사기와 바늘의 경사가 위쪽을 향하도록 정맥에 접근합니다.
- 마취를 끄고 동물을 새장에 다시 넣어 가열 램프 아래에서 완전히 회복하십시오.
- 이미지 획득 세션을 시작하기 전에 45분 동안 방사성 추적자를 흡수하십시오. 이 기간 동안 동물을 깨어 있고 납 차폐 챔버 안에 두십시오.
- D2 연구의 경우 FDG 섭취 기간 동안 아래 섹션 4(전기 자극 투여)에 설명된 대로 DBS를 전달합니다.
- PET 획득 및 이미징 재구성
참고: PET 이미지 획득 사양은 스캐너와 스캔 시간에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 경우 400-700keV 7,8,9의 에너지 창을 사용하여 소형 동물 PET/CT 스캐너로 45분 동안 정적 PET 이미지를 획득했습니다. 획득 프로토콜을 설계하기 전에 PET/CT 장비의 사양을 검토하십시오.- FDG 주사 45 분 후, 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
- 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
- 동물을 PET / CT 침대로 옮기고 앙와위 자세로 눕히고 코를 마취 코 콘에 고정하고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (3 % O100에서 유지를 위해 2 %). 쥐 발을 꼬집어 마취 상태를 확인하십시오.
- 1.2.2단계와 1.2.3단계를 반복합니다.
- PET 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
- 스캐너 사양에 따른 획득 파라미터를 사용하여 정적 PET 이미지를 획득합니다.
- 2D-OSEM (정렬 된 부분 집합 기대 최대화 알고리즘)을 사용하여 이미지를 재구성하고 감쇠 및 부동 시간 보정 7,8,9를 적용합니다.
- 생체내 PET 스캔이 완료되면, 스캐너 베드 상에서 동물의 머리 위치를 옮기지 않고 CT 획득을 후속적으로 진행하기 위해 래트에 대한 세보플루란의 흐름을 유지한다.
- CT 획득
- 이전 PET 획득과 관련하여 동물의 위치를 변경하지 않고 CT 이미지 획득을 진행하십시오.
- 1.2.3-1.2.5단계를 반복합니다.
- 생체 내 CT 스캔이 완료되면 세보플루란 흐름을 멈추고 회복을 위해 쥐를 각각의 케이지에 넣습니다.
- 1.3.6 단계를 따르십시오. 및 1.3.7.
- 방사능이 완전히 붕괴 될 때까지 동물을 납 차폐 챔버에 보관하십시오.
4. 전기 자극 관리
알림: 전기 자극은 D2 이미징 세션의 FDG 흡수 기간 동안 전달됩니다. 이 프로토콜의 경우, 자극은 정전류 모드, 150μA에서 고주파(130Hz) 전기 자극 및 100μs(7,13,14)의 펄스 폭과 함께 분리된 자극기로 전달되었습니다.
- DBS 자극기 구성
- 격리 된 자극기와 필요한 전선을 넓고 조용한 방에 준비하고 동물 케이지를위한 충분한 공간과 잠재적으로 방해 할 수있는 자극의 영향을 최소화하십시오.
- 자극 와이어를 스위블에 연결하여 동물이 우리 안과 자극기에 자유롭게 움직일 수 있도록합니다.
- 연구의 필요에 따라 자극 매개 변수를 설정하십시오.
- 오실로스코프를 사용하여 전류 모드, 주파수 및 펄스 폭을 확인하십시오. 직사각형 펄스 모양의 이상성 파형을 확인합니다(그림 1D).
- DBS 전달
- D1 이미징 세션 후 D2 획득 시까지 동물에게 일일 습관화 프로토콜(45분/일)을 적용하여 자극 시스템과 작업자의 취급에 익숙해지도록 하여 D2에서 바람직하지 않은 스트레스 반응을 피합니다. 자극 시스템을 각 동물에 연결하되 자극을 켜지 마십시오.
- 자극기가 설치되고 동물에게 FDG가 주입되면 스위블을 전극에 연결하고 자극기를 켭니다.
- 45 분 후 자극기를 끄고 동물을 스위블에서 분리 한 다음 신속하게 마취 유도 챔버로 옮겨 3.3 단계를 시작합니다.
그림 1: 실험 설계 . (A) 이 프로토콜에서 따르는 실험 단계의 요약. (B) 전극의 더 나은 고정을 위한 홀더 적응의 대표 사진, 전극이 있는 (왼쪽) 및 없는 것(오른쪽). (C) MRI와 수술 동물의 CT의 융합 이미지, 내측 전두엽 피질 (mPFC)의 올바른 전극 배치를 보여줍니다. (D) 이상성 자극 파형을 보여주는 오실로스코프 화면의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. PET 이미지 처리 및 분석
참고: D1 및 D2의 이미지에 대해 동일한 이미지 처리를 수행하여 후속 복셀별 통계 분석을 위해 비교 가능한 데이터를 얻습니다.
- PET 이미지의 공간 정합
- 특수 이미징 처리 소프트웨어를 사용하십시오. 전체 등록 워크플로는 그림 2에 나와 있습니다.
- 각 PET 및 CT 이미지를 시야각에 맞게 중앙에 놓고 자릅니다. 상호 정보15에 기초한 자동 경질 등록 알고리즘을 사용하여 PET 이미지를 CT에 등록한다.
참고: 엄격한 등록 방법은 동물 간에 체중이나 크기에 큰 차이가 없는 경우에만 적합합니다. 그렇지 않으면 탄력적 메서드를 사용하는 것이 좋습니다. - 각 CT 영상을 단계 5.1.2에서와 같이 Paxinos 및 Watson 래트 뇌 지도책(11 )에 공간적으로 등록된 기준 CT에 등록한다. 결과 변환 매개 변수를 저장합니다.
- 5.1.3단계에서 얻은 변환 매개변수를 적용합니다. 등록된 각 PET 영상을 참조CT 영상에 등록된 PET 영상을 획득한다.
- 모든 최종 PET 이미지를 Nifti 형식으로 저장합니다.
- PET 이미지의 강도 정규화 및 평활화
참고: 강도 정규화 및 평활화는 공개적으로 사용 가능한 리소스를 기반으로 하는 다양한 사내 스크립트로 수행됩니다.- 2mm의 FWHM(전폭 반치)의 등방성 가우스 커널로 PET 이미지를 매끄럽게 하여 가능한 등록 오류를 수정합니다.
알림: 평활화 필터의 크기는 PET 획득의 해상도에 따라 다르지만 FWHM 복셀 크기의 2-3배인 필터를 사용하는 것이 좋습니다. - 적절한 참조 클러스터 정규화 방법16을 사용하여 PET 복셀 값의 강도를 정규화합니다.
- 참조 CT 영상에 등록된 기준 MRI로부터 뇌 마스크를 분할한다.
- 각 PET 이미지에 뇌 마스크를 적용하여 복셀별 분석에서 뇌 외부의 복셀을 제외합니다.
- 2mm의 FWHM(전폭 반치)의 등방성 가우스 커널로 PET 이미지를 매끄럽게 하여 가능한 등록 오류를 수정합니다.
- 복셀별 분석
참고: PET 이미지 데이터의 복셀-단위 분석으로 구성된 통계 분석은 특수 이미징 분석 소프트웨어(17)를 사용하여 수행되었다.- 쌍체 T-검정을 사용하여 D1 및 D2 PET 이미지를 비교하여 적절한 통계적 유의성 임계값을 설정합니다.
- 유형 I 오류를 줄이기 위해 50개의 인접한 복셀보다 큰 클러스터만 분석의 최종 결과로 간주합니다.
- 결과를 T2 MRI에 오버레이된 T-맵으로 나타내고, DBS에 의해 유도된 포도당 뇌 대사의 변화를 보여준다(FDG 감소를 위한 차가운 색, FDG 증가를 위한 따뜻한 색).
그림 2: 마이크로 PET/CT 이미징 등록 워크플로우. 통계 파라메트릭 매핑(SPM) 소프트웨어를 사용한 후속 복셀별 분석을 위한 PET 이미지 공간 정규화 처리의 세부 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
동물은 연구 종료 시 또는 동물의 복지가 손상되었을 때CO2를 사용하여 희생되었습니다. 수술한 동물의 완전한 PET/CT 연구의 예가 그림 3에 나와 있습니다. 따라서, 랫트 뇌에 삽입된 전극은 도 3A에 도시된 CT 이미지에서 명확하게 관찰될 수 있다. 이 이미징 양식은 우수한 해부학적 정보를 제공하고 기능적 양식이 구조적 이미지보다 흐릿한 경향이 있다는 점을 감안할 때 FDG-PET 이미지의 등록을 용이하게 합니다(그림 3A,B). 또한, FDG-PET의 병합 이미지와 동일 동물의 CT 이미지를 도 3C에 나타내었다.
그림 3: mPFC에 DBS 전극을 이식한 쥐 뇌의 마이크로 PET/CT 영상 . (A) CT 이미지의 시상 부분. (B) A에서와 동일한 동물의 FDG-PET 이미지의 시상 부분. (C) 융합 된 PET / CT 이미지는 동일한 입체 공간에 공간적으로 등록 된 A 및 B 이미지를 오버레이 한 결과입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SPM12 소프트웨어로 수행되고 여기에 예로서 제공된 복셀-와이즈 분석은 D1(DBS 부재)과 D2(FDG 흡수 중 DBS) 연구 사이의 쌍을 이루는 T-검정으로 구성되었으며, 이는 실제로 이전에 발표된 연구8에 속한다. 따라서 도 4 는 참조 CT 영상(CTref)에 등록된 MRI로부터 순차적인 1 mm 두께의 뇌 절편에 T-map을 중첩한 것과 같은 두 PET 세션 간의 뇌 대사 차이를 보여준다. 이러한 차이는 FDG 흡수의 증가 및 감소로 각각 따뜻한 색과 차가운 색으로 나타났다. 또한, 분석으로부터 얻어진 통계 결과의 상세한 요약을 표 1에 나타내었다. 여기서 우리는 변조 된 뇌 영역, 변조가 관찰되는 뇌 반구, T 통계량, 복셀 수 (k)의 클러스터 크기, 변조 방향 (즉,과 대사 또는 저 대사 변화), 피크 및 클러스터 수준에서 얻은 p- 값을 나타냅니다. 이 유형의 테이블은 슬라이스 오버레이 그림에서 관찰된 변조 변경에 대한 자세한 설명 역할을 합니다.
그림 4: 쌍체 T-검정 결과. 동일한 CTref에 등록된 T2 MRI에 오버레이된 복셀별 분석의 결과 T-맵은 급성 DBS 프로토콜(D2 대 D1)에 의해 유도된 대사 변화를 보여줍니다. 이미지 하단의 색상 막대는 FDG 흡수의 지역적 증가(따뜻한 색상) 및 감소(차가운 색상)에 해당하는 T 값을 나타냅니다(p < 0.005; k > 50 복셀). 약어 : AHiPM / AL - 편도체 부위 후 / 전 외측 부분, Au - 청각 피질, Bstm - 뇌간, Cpu - 꼬리 - 푸 타멘, HTh - 시상 하부, L - 왼쪽 반구, PMCo - 후엽 피질 편도체 핵, R - 우반구, S1 - 일차 체성 감각 피질. 이 그림은 Casquero-Veiga et al.8의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| D1 대 D2 : 자극 효과 | |||||||
| 투자 수익 | 쪽 | T | k | ↓/↑ | p unc. 피크 레벨 | FWE | FWE |
| 피크 레벨 | 클러스터 수준 | ||||||
| 증권 시세 표시기 | R & L | 18.39 | 1549 | ↓ | <0.001 | 0.432 | <0.001 |
| AHiPM/AL-PMCo - HTh | L | 10.39 | ↓ | <0.001 | 0.949 | ||
| CPu | L | 37.56 | 738 | ↑ | <0.001 | 0.025 | <0.001 |
| S1-AU | 10.53 | ↑ | <0.001 | 0.947 | |||
| CPu-Pir | R | 17.74 | 695 | ↑ | <0.001 | 0.497 | <0.001 |
| S1-AU | 10.45 | ↑ | <0.001 | 0.948 | |||
표 1: mPFC에서 급성 DBS 후 뇌 대사의 변화. D1 대 D2 : 자극 효과. 구조 : AHiPM / AL : 편도체 대뇌 피장 영역 후 / 전 외측 부분, Au : 청각 피질, Bstm : 뇌간, CPu : 꼬리 - 푸 타멘, HTh : 시상 하부, Pir : 이상형 피질, PMCo : 후엽 피질 편도체 핵, S1 : 일차 체성 감각 피질. ROI: 관심 영역. 측면: 오른쪽(R) 및 왼쪽(L). T: t 값, k: 클러스터 크기. 포도당 대사 : 증가 (↑) 및 감소 (↓). p: p-값, unc.: 수정되지 않음, FWE: 패밀리 현명한 오류 수정. 이 표는 Casquero-Veiga et al.8의 허가를 받아 수정되었습니다.
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Discussion
신경 정신 장애의 병태 생리학에 관여하는 뇌 기능 및 신경망에 대한 이해의 발전을 감안할 때, 점점 더 많은 연구가 광범위한 신경 기반 병리학에서 DBS의 잠재력을 인식하고 있습니다2. 그러나이 요법의 작용 메커니즘은 불분명합니다. 특정 병리학 및 자극 상황에서 얻은 효과를 설명하기 위해 여러 이론이 시도되었지만 제안 된 연구의 이질성으로 인해 결정적인 결론에 도달하기가 매우 어렵습니다4. 따라서 많은 노력에도 불구하고 실질적인 합의는 없지만 DBS 중재를받는 환자의 수는계속 증가하고 있습니다 18. 그런 다음 생체 내 뇌에서 DBS 결과를 이해하면 각 환자의 요구에 더 적합한 자극 매개 변수와 자극 프로토콜을 밝혀 더 나은 성공률을 얻을 수 있습니다. 이러한 맥락에서 FDG-PET와 같은 비 침습적 기능적 신경 영상 양식은 뇌에서 전기 자극의 직접적인 영향으로 실제로 일어나는 일을 밝히는 데 필수적입니다. 예를 들어, 여기에 설명된 종단 프로토콜에서 DBS는 D2 PET 이미지의 방사성 추적자 흡수 기간 동안 전달됩니다. 따라서, D2 (DBS-ON) 및 D1 (DBS-OFF) PET 연구의 비교는 FDG의 "대사 트래핑"특성이 자극 동안 직접 발생하는 누적 변화를 기록 할 수 있기 때문에 생체 내에서 전기 자극에 의해 조절되는 뇌 영역의 시각화를 가능하게한다13,19.
전체적으로 이 프로토콜은 생체 내 뇌에서 DBS의 급성 결과를 평가하기 위한 실현 가능한 전략을 설명하지만, 사용 가능한 DBS 매개변수 조합 및 프로토콜의 다양성은 엄청나며(예: 연속 대 간헐적 치료20, 고주파 대 저주파 자극21), DBS의 효과조차도 자극 영향 하에서 뇌 네트워크의 직접적인 변화를 추론하기 때문에 치료와 함께 다를 수 있습니다.22 . 또한, DBS가 권장되는 병리의 수가 증가함에 따라 가능성의 수는 더욱 커집니다23. 따라서 DBS 치료에 대한 잠재적 반응을 예측할 수있는 신경 활성화 패턴을 밝히는 것을 목표로하는 종단 신경 영상 연구는 특히 임상 적 관련성이 있습니다24,25. 이와 관련하여 FDG-PET에 의한 다양한 DBS 프로토콜의 치료 효과를 평가 한 많은 임상 및 전임상 연구가 있습니다 (검토는3 참조). 따라서 연구 된 DBS 프로토콜이 치료중인 병리와 관련된 뇌 대사 패턴을 상쇄하여 환자 증상의 개선을 유도하고 DBS-PET 접근법의 임상 적 유용성을 입증하는 몇 가지 예가 있습니다. 이것의 예는 치료 저항성 우울증 환자를위한 뇌하 대상 영역 (SCC)의 자극에서 발견됩니다. SCC는 우울증26을 가진 비약물 환자에서 대사적으로 과민성이며, 이러한 과활성화는 약리학적, 정신치료적 또는 DBS 치료27,28,29에 의한 우울증 완화 후에 정상화된다. 중요한 것은 SCC 대사가 자극을 시작하기 전에 DBS에 반응한 환자에서 비반응자에 비해 더 높았다는 것입니다. 이 연구는 SCC-DBS29에 대한 반응 예측에서 80%의 정확도를 보여 DBS에 대한 잠재적 환자를 선택할 때 이미징 바이오마커의 중요성을 강조했습니다. 따라서 설명 된 맥락은 우울증의 뇌 대사 패턴을 SCC-DBS로 얻은 치료 결과와 매핑하는 것을 목표로하는 FDG-PET 연구의 임상 적 성공의 역사를 반영하며, 이는 향후 다른 신경 정신 질환 및 DBS 프로토콜에 초점을 맞춘 유사한 접근법의 기초를 설정해야합니다.
이러한 의미에서, FDG-PET를 이용한 DBS의 생리학적 효과를 관찰하기 위해서는, 스캔될 DBS 프로토콜의 특정 타이밍을 신중하게 고려하는 것이 특히 적절하다. 따라서, 동일한 DBS 파라미터 및 동일한 프로토콜을 적용함에도 불구하고, 이미지 획득을 위한 타이밍은 관찰된 변조의 원점을 명확하게 결정할 것이며, 이는 획득된 최종 응답에 관련된 모든 인자를 고려하지 않음으로써 잠재적인 오해를 초래할 수 있다(8). 따라서 수술 계획은 후속 치료의 기초를 마련하는 데 결정적인 요소이지만, 연구 중인 자극의 결과에 적합한 이미지 획득 프로토콜의 설계는 적용된 자극 치료의 기초가 되는 분자 메커니즘을 완전히 이해하는 데 필수적입니다. 이러한 라인을 따라 몇 가지 요인이 특정 DBS 프로토콜에 대한 반응을 크게 수정할 수 있습니다(예: 자극 매개변수, 전극 삽입, 표적화된 뇌 구조, 치료 중인 병리, DBS 세션의 기간 및 빈도 등). 7,8,30. FDG-PET 연구에서 수집 된 데이터에 의해 반영된 현상은 이미지가 획득되는 치료 과정의 특정 시간에 따라 달라집니다. 그런 다음 이러한 모든 점은 DBS 유도 조절을 탐구하고이 요법의 기본 메커니즘을 설명하는 데 기여할 수있는 다양한 연구 기회를 열어줍니다.
따라서 설치류와 인간의 뇌를 분리하는 큰 차이에도 불구하고 번역 프로토콜을 개발하기 위해 모든 수준에서 적절한 관행을 구현해야합니다. 이러한 의미에서, DBS는 전극이 심부 뇌 구조(31)에 접근할 수 있도록 개두술에 기초한 고도로 침습적인 수술을 필요로 한다는 것을 무시해서는 안 된다. 이 시점에서, 감염과 염증 반응의 두 가지 중요한 원천이 있다: 한편으로는 수술 중 뇌 조직의 직접적인 노출과, 다른 한편으로는, 두 개의 외인성 요소를 내부 장기에 삽입하여, 자극 표적32를 향한 그들의 궤적에 의해 삽입 흉터를 생성한다. 따라서, 수술 장비의 멸균, 깨끗한 수술 영역 유지, 및 항생제 및 진통 치료(33 )에 기초한 적절한 수술 후 관리는 피험자가 개입으로부터 가장 큰 이익을 얻고 가장 건강한 조건에서 얻는 것을 보장하기 위해 필수적이다. 또한, 이것은 FDG-PET 영상 연구에서 특히 관련이 있는데, 수술 후 합병증의 발생은 염증 및 감염 과정이 과대사 신호(34)로 명확하게 간주되어 치료에 대한 수정된 반응 또는 DBS에 의해 생성된 조절의 과대 평가로 이어질 수 있다는 점을 감안할 때 방사성 추적자 흡수 패턴을 수정할 수 있기 때문입니다.
그러나, 이 실험적 방법론은 몇 가지 한계에 노출되어 있다: 첫째, DBS 프로토콜은 일반적으로 장기적이고 지속적이며 만성적인 치료이다. 여기에서는 DBS의 급성 효과를 실시간으로 평가하기 위해 신경 영상 프로토콜을 보여줍니다. 따라서 신경 영상 연구에 제안 된시기는 DBS 유도 장기 변조에 대한 정보를 거의 실시간으로 얻기에 적절하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 DBS 파생 응답을 이해하기 위한 기본 지식 역할을 하는 다양한 종단적 접근 방식을 개발하기 위한 토대를 마련할 수 있습니다. 둘째, 건강한 동물이이 방법을 설명하기 위해 사용 되었기 때문에 설명 된 기술을 다른 병리학 적 조건에 적용하려면 더 나은 결과와 최적의 복지 조건을 보장하기 위해 적응이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 복셀별 분석은 항상 여러 통계 비교 문제의 영향을 받기 때문에 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 큰 표본 크기 및/또는 강력한 보정 계수가 필요합니다. 그럼에도 불구하고 복셀 방식으로 FDG-PET를 사용하여 뇌 대사에 대한 DBS의 결과를 평가하는 것은 사전 가정 없이도 광범위한 전체 뇌 분석을 허용하는 이 방법의 본질적인 탐색적 특성으로 인해 큰 이점입니다.
DBS와 FDG-PET를 결합하는 것의 단점에도 불구하고 이러한 접근 방식은 큰 기회를 제공합니다. 따라서 뇌 대사 정보를 비 침습적으로 얻는 것은 DBS 치료와 함께 자극 동안 그리고 다양한 경우에 피험자로부터 신경 생리 학적 데이터를 수집 할 수 있다는 점에서 큰 이점입니다. 또한 FDG-PET는 임상 환경에서 신경 영상 기술로,이 방법에 동기를 부여하는 번역 접근법을 강화합니다. 마찬가지로, FDG-PET의 사용은 다른 이미징 양식과 달리, 수득된 신호가 영상 품질 및 시스템 성능 모두를 손상시킬 수 있는 신경자극 시스템으로부터 유도된 전기장 또는 자기장의 2차 왜곡에 의해 영향을 받지 않기 때문에 특히 적합한 대안이다(24). 반면에 DBS의 조절 결과를 평가하는 연구 관심은 치료 이점에만 국한되지 않습니다. 사실, DBS는 초점적, 조절적 및 비영구적 신경자극 요법이기 때문에, 분자 이미징 기술에 의해 그리고 시스템(35)에 의해 제공되는 전기적 자극에 반응하여 평가되는 신경기능적 활동 경로를 밝히는 것도 도움이 될 수 있다. 이 정보는 건강하고 병리학적인 상태에서 해결되지 않은 신경 생리 학적 수수께끼를 해독하는 데 특히 유용 할 수 있습니다. 마지막으로,이 원고에서 설명 된 방법론은 생체 내에서 DBS 유도 신경 조절의 효과를 관찰 할 수있는 능력을 제공하며, 적용 중 자극의 영향을 결정하는 강력한 전략입니다. 요컨대, DBS의 생체 내 효과를 이해하면 이 치료의 원하는 효과와 원하지 않는 효과를 이해하고 임상 개선을 예측하며 궁극적으로 각 환자의 요구에 맞게 자극 프로토콜을 조정하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는이 기사와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
여기에 설명된 방법론의 최적화에 귀중한 지원을 해주신 Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco 및 Yolanda Sierra 교수에게 감사드립니다. MLS는 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)이 공동 자금을 지원하는 살루드 카를로스 III 연구소 (프로젝트 번호 PI17/01766 및 보조금 번호 BA21/0030)의 지원을 받았습니다. 시버 삼 (프로젝트 번호 CB07 / 09 / 0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (프로젝트 번호 2017/085); 마프레 재단; 그리고 Fundación Alicia Koplowitz. MCV는이 기관의 장학금 보유자 인 Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno와 EU 공동 프로그램-신경 퇴행성 질환 연구 (JPND)의 지원을 받았습니다. DRM은 Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid가 지원했으며, 유럽 사회 기금 "미래에 투자"(보조금 번호 PEJD-2018-PRE/BMD-7899)가 공동 자금을 지원했습니다. NLR은 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019"의 지원을 받았습니다. MD 작업은 MCIN(Ministerio de Ciencia e Innovación)과 ISCIII(Instituto de Salud Carlos III)(PT20/00044)의 지원을 받았습니다. CNIC는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) 및 Pro CNIC Foundation의 지원을 받고 있으며 Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Tesla Biospec 70/20 scanner | Bruker, Germany | SN0021 | MRI scanner for small animal imaging |
| Betadine | Meda Pharma S.L., Spain | 644625.6 | Iodine solution (iodopovidone) |
| Beurer IL 11 | Beurer | SN87318 | Infra-red light |
| Bipolar cable 50 cm w/50 cm mesh covering up to 100 cm | Plastics One, USA | 305-305 (CM) | |
| Bipolar cable TT2 50 cm up to 100 cm | Plastics One, USA | 305-340/2 | Bipolar cable TT2 50 cm up to 100 cm |
| Buprex | Schering-Plough, S.A | 961425 | Buprenorphine (analgesic) |
| Ceftriaxona Reig Jofré 1g IM | Laboratorio Reig Jofré S.A., Spain | 624239.1 | Ceftriaxone (antibiotic) |
| Commutator | Plastics One, USA | SL2+2C | 4 Channel Commutator for DBS |
| Concentric bipolar platinum-iridium electrodes | Plastics One, USA | MS303/8-AIU/Spc | Electrodes for DBS |
| Driller | Bosh | T58704 | Driller |
| FDG | Curium Pharma Spain S.A., Spain | ----- | 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer) |
| Heating pad | DAGA, Spain | 23115 | Heating pad |
| Ketolar | Pfizer S.L., Spain | 776211.9 | Ketamine (anesthetic drug) |
| Lipolasic 2 mg/g | Bausch & Lomb S.A, Spain | 65277 | Ophthalmic lubricating gel |
| MatLab R2021a | The MathWorks, Inc | Support software for SPM12 | |
| MRIcro | McCausland Center for Brain Imaging, University of South Carolina, USA | v2.1.58-0 | Software for imaging preprocessing and analysis |
| Multimodality Workstation (MMWKS) | BiiG, Spain | Software for imaging processing and analysis | |
| Omicrom VISION VET | RGB Medical Devices, Spain | 731100 ReV B | Cardiorrespiratory monitor for small imaging |
| Prevex Cotton buds | Prevex, Finland | ----- | Cotton buds |
| Sevorane | AbbVie Spain, S.L.U, Spain | 673186.4 | Sevoflurane (inhalatory anesthesia) |
| Small screws | Max Witte GmbH | 1,2 x 2 DIN 84 A2 | Small screws |
| Standard U-Frame Stereotaxic Instrument for Rat, 18° Ear Bar | Harvard Apparatus, USA | 75-1801 | Two-arms Stereotactic frame for rat |
| Statistical Parametric Mapping (SPM12) | The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK | SPM12 | Software for voxel-wise imaging analysis |
| STG1004 | Multi Channel Systems GmbH, Germany | STG1004 | Isolated stimulator |
| SuperArgus PET/CT scanner | Sedecal, Spain | S0026403 | NanoPET/CT scanner for small animal imaging |
| Suture thread with needle, 1/º | Lorca Marín S.A., Spain | 55325 | Braided natural silk non-absorbable suture 1/0, with triangle needle |
| Technovit 4004 (powder and liquid) | Kulzer Technique, Germany | 64708471; 64708474 | Acrylic dental cement for craniotomy tap |
| Wistar rats (Rattus norvergicus) | Charles River, Spain | animal facility | Animal model used |
| Xylagesic | Laboratorios Karizoo, A.A, Spain | 572599-4 | Xylazine (anesthetic drug) |
| Normon S.A., Spain | 602910 | Mepivacaine in gel for topical use |
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