Summary
Este protocolo descreve como construir um sistema de cadeia polimerase de fluxo contínuo baseado em um chip microfluídico e como construir um sistema de eletroforese capilar em laboratório. Apresenta um método simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório.
Abstract
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método tradicional empregado para a amplificação de um gene alvo que tem desempenhado um papel importante no diagnóstico biomolecular. No entanto, a PCR tradicional é muito demorada devido à eficiência de variação de baixa temperatura. Este trabalho propõe um sistema de PCR em fluxo contínuo (CF-PCR) baseado em um chip microfluídico. O tempo de amplificação pode ser bastante reduzido executando a solução de PCR em um microcanal colocado em aquecedores ajustados a diferentes temperaturas. Além disso, como a eletroforese capilar (CE) é uma maneira ideal de diferenciar produtos de PCR positivos e falso-positivos, um sistema CE foi construído para obter uma separação eficiente dos fragmentos de DNA. Este trabalho descreve o processo de amplificação de Escherichia coli (E. coli) pelo sistema CF-PCR construído internamente e a detecção dos produtos de PCR por CE. Os resultados demonstram que o gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min, indicando que estes dois sistemas podem ser usados para a rápida amplificação e detecção de ácidos nucléicos.
Introduction
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular usada para amplificar fragmentos específicos de DNA, amplificando assim traços de DNA centenas de milhões de vezes. Tem sido amplamente utilizado em diagnóstico clínico, pesquisa médica, segurança alimentar, identificação forense, e outros campos. O processo de PCR consiste principalmente de três etapas: desnaturação a 90-95 °C, anelamento a 50-60 °C e extensão a 72-77 °C. A ciclagem térmica é uma parte importante do processo de PCR; no entanto, o termociclador PCR tradicional não é apenas volumoso, mas também ineficiente, exigindo aproximadamente 40 min para completar 25 ciclos. Para superar essas limitações, um sistema de PCR de fluxo contínuo (CF-PCR) foi construído internamente, baseado em um chip microfluídico. A CF-PCR pode economizar muito tempo ao conduzir a solução de PCR em microcanais colocados em aquecedores em diferentes temperaturas 1,2,3,4,5.
Como a eletroforese capilar (CE) apresenta muitas vantagens, como alta resolução, alta velocidade e excelente reprodutibilidade6,7,8,9,10,11, tornou-se uma ferramenta popular no laboratório para a análise de ácidos nucléicos e proteínas. No entanto, a maioria dos laboratórios, especialmente os laboratórios no mundo em desenvolvimento, não pode pagar esta tecnologia devido ao alto preço do instrumento CE. Aqui, descrevemos protocolos de como fabricar o chip microfluídico CF-PCR e como construir um sistema CE versátil no laboratório. Demonstramos também o processo de amplificação de E. coli por este sistema de CF-PCR e a detecção dos produtos de PCR pelo sistema CE. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os usuários devem ser capazes de fabricar chips microfluídicos, preparar soluções de PCR, construir um sistema de CF-PCR para amplificação de ácidos nucleicos e configurar um sistema CE simples, mesmo com recursos limitados, para separar fragmentos de DNA.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Fabricação de chip microfluídico CF-PCR
- Aqueça o wafer de silicone a 200 °C durante 25 minutos para remover a humidade.
- Dispense 1 mL de fotorresistência SU-8-2075 por polegada de wafer. Gire no wafer de silício usando um revestidor de giro a 500 rpm para 5-10 s com uma aceleração de 100 rpm/s, e depois a 2.000 rpm para 30 s com uma aceleração de 500 rpm/s.
- Leve ao forno de silicone a 65 °C por 3 min e, em seguida, a 95 °C por 15 min.
- Defina 150 - 215 mJ/cm² como a energia de exposição para a máquina de fotolitografia e grave o padrão projetado no fotorresiste com uma máscara de fotolitografia. Coloque o wafer de silicone e a máscara prontos para exposição.
- Após a exposição, asse o wafer de silicone a 65 °C por 2 min e, em seguida, a 95 °C por 7 min.
- Mergulhe o wafer de silício na solução reveladora para remover o excesso de fotorresistência e retire-o quando os microcanais puderem ser vistos (Figura 1). Use isopropanol para enxaguar a solução reveladora residual.
- Misturar o pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) e o agente de cura na proporção de 10:1. Despeje a solução PDMS mista no molde da réplica e solidifique-a a 80 °C por 60 min.
- Cole o chip microfluídico do PDMS em uma lâmina após a ativação usando um limpador de plasma e solidifique-o a 80 °C por 30 min o mais rápido possível (Figura 2).
NOTA: As dimensões externas do chip são 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Existem 40 canais serpentinos (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, largura × comprimento × profundidade) no chip microfluídico.
2. Preparação da solução de PCR
- Descongele completamente os reagentes antes da configuração. Use um misturador de vórtices e centrífuga para garantir que os reagentes estejam bem misturados.
- Preparar um tubo de centrífuga, adicionando os seguintes componentes nesta ordem: 33,75 μL de água, 1,0 μL de molde de DNA, 0,5 μL de primer, 5,0 μL de tampão, 4,0 μL de mistura de dNTP, 1,5 μL de Tween 20, 3,5 μL de PVP e, finalmente, 0,25 μL de DNA polimerase.
NOTA: Aqui, o modelo de DNA usado é E. coli. Os primers para E. coli e os componentes da solução de PCR estão listados na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente. - Misture a solução por vórtice.
3. Construção do sistema CF-PCR
- Prepare dois aquecedores cerâmicos de coeficiente de temperatura positivo (PTC), dois relés de estado sólido, dois controladores de temperatura PID, dois sensores de temperatura e um cabo de alimentação.
NOTA: O tamanho dos aquecedores cerâmicos PTC depende do tamanho do chip microfluídico; o comprimento deve ser maior do que o comprimento do chip - o comprimento-largura-altura dos aquecedores cerâmicos PTC usados aqui é de 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Conecte o aquecedor ao relé de estado sólido.
- Conecte o relé de estado sólido ao controlador de temperatura PID.
- Conecte a sonda do sensor de temperatura à parte inferior dos dois aquecedores e conecte o terminal ao controlador de temperatura PID.
- Conecte dois relés de estado sólido em série e conecte o cabo de alimentação.
- Imprima em 3D um slot para os dois aquecedores e mantenha os aquecedores no mesmo plano (consulte Arquivo suplementar 1 para arquivos STL necessários para impressão 3D).
NOTA: Deixe um espaço de ar de 12 mm entre os dois aquecedores. - Coloque o chip microfluídico nos dois aquecedores.
- Prepare uma bomba de seringa e uma seringa, fixe a seringa na bomba de seringa, conecte um tubo de silicone (0,8 mm de diâmetro interno [ID]) com uma seringa e conecte uma agulha de aço (0,7 mm ID) à parte superior do tubo de silicone (Figura 3).
- Insira a agulha de aço na entrada do chip microfluídico.
- Coloque uma ponta de pipeta na saída do chip para coletar os produtos de PCR.
4. Construção do sistema CE
- Use uma fonte de alimentação de alta tensão para gerar um campo elétrico de campo pulsado; Observe os eletrodos positivos e negativos.
- Use uma lâmpada de mercúrio como fonte de luz e filtre o comprimento de onda de excitação da lâmpada de mercúrio através de um filtro.
- Coloque o capilar no estágio do microscópio.
- Colete a emissão de fluorescência com a objetiva e, em seguida, detecte-a usando um tubo fotomultiplicador R928 (PMT). Observe o microscópio e o capilar. Acenda a luz em condições de ambiente escuro; A luz de excitação é coletada pelo objetivo.
- Use o software LABVIEW auto-desenvolvido para controlar a fonte de alimentação e completar a aquisição de dados (descrito nas etapas 6.3-6.6). Veja https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
OBS: Todos os experimentos foram realizados em sala escura, e o esquema do sistema CE é mostrado na Figura 4.
5. Execute a solução de PCR
- Predefina a temperatura dos aquecedores do sistema CF-PCR em 65 °C e 95 °C.
- Coloque o chip microfluídico nos dois blocos de aquecimento.
- Introduzir a ponta do tubo de silicone num tubo de centrifugação contendo 50 μL da solução de PCR (a partir do passo 2.3). Puxe o êmbolo da seringa para retirar lentamente a solução. Fixe a seringa numa bomba de seringa. Insira a agulha de aço na entrada do chip microfluídico.
- Ajuste a taxa de fluxo da bomba para 10 μL/min e pressione o botão de partida para pressionar a solução no microcanal na entrada do microchip.
- Recolha os produtos de PCR na saída do chip microfluídico.
OBS: Enxágue o canal com água ultrapura antes e depois da PCR para remover as impurezas.
6. Detecção dos produtos de PCR por este sistema CE construído internamente
- Prepare um capilar com 8 cm de comprimento total e 6 cm de comprimento efetivo.
- Preparar o tampão de separação misturando 100 μL de hidroxietilcelulose a 1% (HEC, p/v), 2 μL de 100x SYBR Green I e 98 μL de água ultrapura para obter 0,5% de HEC (p/v) contendo 1x SYBR Green I.
- Encha o capilar com o tampão de separação preparado usando uma bomba de vácuo.
- Insira a tensão de injeção (800 V) e o tempo de injeção (2,0 s) na interface do software, clique no botão Iniciar e aguarde que os produtos de PCR sejam introduzidos eletrodinamicamente no capilar a 100 V/cm (2,0 s).
NOTA: Nesta etapa, os produtos de PCR são colocados no eletrodo negativo e o tampão é colocado no eletrodo positivo. - Insira a tensão DC (800 V) na interface do software, clique no botão Iniciar e execute a eletroforese a 100 V/cm de intensidade do campo elétrico.
NOTA: Nesta etapa, os eletrodos positivos e negativos são colocados com tampão. - Clique no botão parar depois que todos os fragmentos de DNA forem separados no capilar.
- Lave o capilar com água esterilizada por 1 min após cada corrida.
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Representative Results
A Figura 5 representa o eletroferograma dos produtos da PCR e os marcadores de DNA. O traço (Figura 5A) é o resultado CE do produto amplificado por CF-PCR, o traço (Figura 5B) é o resultado CE do produto amplificado pela ciclagem térmica e o traço (Figura 5C) é o resultado CE da escada de DNA de 100 pb. Primeiro, amplificamos o gene alvo de E. coli no sistema CF-PCR; a solução de PCR levou ~10 min, 30 s da entrada para a saída do chip. O tamanho do amplicon alvo de E. coli foi de 544 pb. Os produtos amplificados da PCR foram analisados no sistema CE, e a CE de uma escada de DNA de 100 pb também foi realizada nas mesmas condições experimentais. O tamanho do produto da PCR pode ser avaliado de acordo com o eletroferograma da escada de DNA. Cada experimento foi realizado três vezes para reprodutibilidade. Os dados da Figura 5 mostram que os picos correspondentes aos produtos de PCR de E. coli foram observados após a separação, e os tempos de migração dos produtos de PCR no chip microfluídico foram consistentes com os de um termociclador.
Figura 1: O wafer de silício limpo. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Chip microfluídico CF-PCR feito com PDMS. Os microcanais foram preenchidos com tinta vermelha para visualização. Barra de escala = 1 cm. Abreviações: CF-PCR = continuous-flow-PCR; PDMS = polidimetisiloxano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O sistema CF-PCR. (1) Chip microfluídico, (2) aquecedor cerâmico PTC, (3) seringa, (4) bomba, (5) tubo de silicone, (6) ranhura, (7) agulha de aço, (8) ponta de pipeta, (9) controlador de temperatura PID, (10) sensor de temperatura, (11) relé de estado sólido. Abreviação: CF-PCR = continuous-flow-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A construção do sistema CE. Abreviações: CE = eletroforese capilar; TPM = tubo fotomultiplicador; A1, A2 = filtros; B = lente de campo; C = espelho dicroico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Eletroferograma de Escherichia coli. Amplificação por (A) chip microfluídico CF-PCR, (B) termociclador PCR tradicional e (C) marcadores de DNA. Abreviação: CF-PCR = continuous-flow-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo | Sequência 5′...... 3′ | Amplicon (pb) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTCTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabela 1: Primers empregados para Escherichia coli. Abreviações: EC = Escherichia coli; F = para frente; R = reverso.
| 10x Buffer rápido I | 5,0 μL |
| Mistura de dNTP (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA Polimerase | 0,25 μL |
| polivinil pirrolidona (PVP) | 3,5 μL |
| Interpolação 20 | 1,5 μL |
| modelo | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| água ultrapura | 33,75 μL |
Tabela 2: Os componentes da solução de PCR. Abreviações: EC = Escherichia coli; F = para frente; R = reverso.
Arquivo suplementar 1: arquivo STL para impressão 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Tanto a PCR quanto a CE são duas biotecnologias populares na análise de ácidos nucléicos. Este trabalho descreve a amplificação de E. coli e a detecção dos produtos de PCR usando os sistemas CF-PCR e CE, ambos construídos internamente. O gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min devido às altas taxas de transferência de calor. Os fragmentos de DNA menores que 1.500 pb foram separados em 8 min (Figura 5). A grande vantagem dessas duas técnicas é que ela pode economizar muito tempo em comparação com os métodos tradicionais de PCR e eletroforese em gel de laje. Os pesquisadores devem ter em mente que o chip microfluídico CF-PCR precisa ser limpo após o uso, e o sistema CE deve ser construído em uma casa limpa e preta para evitar a contaminação das amostras. O sistema CF-PCR baseado no chip microfluídico e o sistema CE introduzido neste trabalho são fáceis de fabricar e podem oferecer um método simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório. No entanto, uma limitação da CF-PCR é que ela só pode amplificar e detectar apenas uma amostra por vez, o que pode limitar sua ampla aplicação; para combater isso, os usuários podem desenvolver o chip microfluídico integrado CF-PCR e CE array para resolver este problema. A plataforma relatada neste trabalho tem grande potencial de aplicação no campo do diagnóstico clínico de doenças infecciosas e pesquisa de ácidos nucleicos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, China (No. 19ZR1477500 e No.18441900400). Agradecemos o apoio financeiro da Universidade de Xangai para Ciência e Tecnologia (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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