Summary
Este protocolo describe cómo construir un sistema de cadena de polimerasa de flujo continuo basado en un chip microfluídico y cómo construir un sistema de electroforesis capilar en el laboratorio. Presenta un método sencillo para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio.
Abstract
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método tradicional empleado para la amplificación de un gen diana que ha desempeñado un papel importante en el diagnóstico biomolecular. Sin embargo, la PCR tradicional requiere mucho tiempo debido a la eficiencia de la variación de baja temperatura. En este trabajo se propone un sistema de PCR de flujo continuo (CF-PCR) basado en un chip microfluídico. El tiempo de amplificación se puede reducir en gran medida ejecutando la solución de PCR en un microcanal colocado en calentadores configurados a diferentes temperaturas. Además, dado que la electroforesis capilar (CE) es una forma ideal de diferenciar los productos de PCR positivos y falsos positivos, se construyó un sistema de CE para lograr una separación eficiente de los fragmentos de ADN. En este trabajo se describe el proceso de amplificación de Escherichia coli (E. coli) mediante el sistema CF-PCR construido internamente y la detección de los productos de PCR mediante CE. Los resultados demuestran que el gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos, lo que indica que estos dos sistemas pueden utilizarse para la rápida amplificación y detección de ácidos nucleicos.
Introduction
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN, amplificando así trazas de ADN cientos de millones de veces. Ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico clínico, la investigación médica, la seguridad alimentaria, la identificación forense y otros campos. El proceso de PCR consta principalmente de tres pasos: desnaturalización a 90-95 °C, recocido a 50-60 °C y extensión a 72-77 °C. El ciclo térmico es una parte importante del proceso de PCR; sin embargo, el termociclador de PCR tradicional no solo es voluminoso sino también ineficiente, ya que requiere aproximadamente 40 minutos para completar 25 ciclos. Para superar estas limitaciones, se construyó internamente un sistema de PCR de flujo continuo (CF-PCR), basado en un chip microfluídico. La CF-PCR puede ahorrar mucho tiempo al conducir la solución de PCR a microcanales colocados en calentadores a diferentes temperaturas 1,2,3,4,5.
Como la electroforesis capilar (CE) tiene muchas ventajas, como alta resolución, alta velocidad y excelente reproducibilidad 6,7,8,9,10,11, se ha convertido en una herramienta popular en el laboratorio para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, la mayoría de los laboratorios, especialmente los laboratorios del mundo en desarrollo, no pueden permitirse esta tecnología debido al alto precio del instrumento CE. Aquí, hemos esbozado protocolos sobre cómo fabricar el chip microfluídico CF-PCR y cómo construir un sistema CE versátil en el laboratorio. También demostramos el proceso de amplificación de E. coli por este sistema CF-PCR y la detección de los productos de PCR por el sistema CE. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios deberían ser capaces de fabricar chips microfluídicos, preparar soluciones de PCR, construir un sistema de CF-PCR para la amplificación de ácidos nucleicos y configurar un sistema de CE simple, incluso con recursos limitados, para separar fragmentos de ADN.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Fabricación de chip microfluídico CF-PCR
- Calentar la oblea de silicona a 200 °C durante 25 minutos para eliminar la humedad.
- Dispense 1 ml de fotorresistencia SU-8-2075 por pulgada de oblea. Hágalo girar en la oblea de silicio con un recubridor giratorio a 500 rpm durante 5-10 s con una aceleración de 100 rpm/s, y luego a 2.000 rpm durante 30 s con una aceleración de 500 rpm/s.
- Hornee suavemente la oblea de silicona a 65 °C durante 3 minutos, luego a 95 °C durante 15 minutos.
- Establezca 150 - 215 mJ/cm² como energía de exposición para la máquina de fotolitografía y grabe el patrón diseñado en la fotorresistencia con una máscara de fotolitografía. Coloque la oblea de silicona y la máscara listas para la exposición.
- Después de la exposición, hornee la oblea de silicio a 65 °C durante 2 minutos y luego a 95 °C durante 7 minutos.
- Sumerja la oblea de silicio en la solución reveladora para eliminar el exceso de fotorresistencia y sáquela cuando se puedan ver los microcanales (Figura 1). Use isopropanol para enjuagar la solución reveladora residual.
- Mezcle el prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado en una proporción de 10:1. Vierta la solución mezclada de PDMS en el molde de réplica y solidifique a 80 °C durante 60 min.
- Unir el chip microfluídico PDMS en un portaobjetos después de la activación con un limpiador de plasma y solidificarlos a 80 °C durante 30 min lo antes posible (Figura 2).
NOTA: Las dimensiones exteriores del chip son 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Hay 40 canales serpentinos (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, ancho × largo × profundidad) en el chip microfluídico.
2. Preparación de la solución de PCR
- Descongele los reactivos por completo antes de la configuración. Utilice un mezclador de vórtice y una centrífuga para asegurarse de que los reactivos estén bien mezclados.
- Prepare un tubo de centrífuga, agregando los siguientes componentes en este orden: 33,75 μL de agua, 1,0 μL de plantilla de ADN, 0,5 μL de cebador, 5,0 μL de tampón, 4,0 μL de mezcla de dNTP, 1,5 μL de Tween 20, 3,5 μL de PVP y, finalmente, 0,25 μL de ADN polimerasa.
NOTA: Aquí, la plantilla de ADN utilizada es E. coli. Los cebadores para E. coli y los componentes de la solución de PCR se enumeran en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. - Mezcle la solución por vórtice.
3. Construcción del sistema CF-PCR
- Prepare dos calentadores cerámicos de coeficiente de temperatura positivo (PTC), dos relés de estado sólido, dos controladores de temperatura PID, dos sensores de temperatura y un cable de alimentación.
NOTA: El tamaño de los calentadores cerámicos PTC depende del tamaño del chip microfluídico; la longitud debe ser mayor que la longitud del chip: la longitud, el ancho y la altura de los calentadores cerámicos PTC utilizados aquí es de 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Conecte el calentador al relé de estado sólido.
- Conecte el relé de estado sólido al controlador de temperatura PID.
- Conecte la sonda del sensor de temperatura a la parte inferior de los dos calentadores y conecte el terminal al controlador de temperatura PID.
- Conecte dos relés de estado sólido en serie y conecte el cable de alimentación.
- Imprima en 3D una ranura para los dos calentadores y mantenga los calentadores en el mismo plano (consulte el Archivo complementario 1 para ver los archivos STL necesarios para la impresión 3D).
NOTA: Deje un espacio de aire de 12 mm entre los dos calentadores. - Coloque el chip microfluídico en los dos calentadores.
- Prepare una bomba de jeringa y una jeringa, fije la jeringa en la bomba de jeringa, conecte un tubo de silicona (0,8 mm de diámetro interior [ID]) con una jeringa y conecte una aguja de acero (0,7 mm de diámetro interior) a la parte superior del tubo de silicona (Figura 3).
- Inserte la aguja de acero en la entrada del chip microfluídico.
- Coloque una punta de pipeta en la salida del chip para recoger los productos de PCR.
4. Construcción del sistema CE
- Utilice una fuente de alimentación de alto voltaje para generar un campo eléctrico de campo pulsado; Tenga en cuenta los electrodos positivo y negativo.
- Utilice una lámpara de mercurio como fuente de luz y filtre la longitud de onda de excitación de la lámpara de mercurio a través de un filtro.
- Coloque el capilar en la platina del microscopio.
- Recoja la emisión de fluorescencia con el objetivo y luego decútala usando un tubo fotomultiplicador R928 (PMT). Observa el microscopio y el capilar. Encienda la luz en condiciones de habitación oscura; La luz de excitación es recogida por el objetivo.
- Utilice el software LABVIEW de desarrollo propio para controlar la fuente de alimentación y completar la adquisición de datos (descrito en los pasos 6.3-6.6). Véase https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
NOTA: Todos los experimentos se realizaron en un cuarto oscuro, y el esquema del sistema CE se muestra en la Figura 4.
5. Ejecute la solución de PCR
- Preajuste la temperatura de los calentadores del sistema CF-PCR a 65 °C y 95 °C.
- Coloque el chip microfluídico en los dos bloques calefactores.
- Inserte la punta del tubo de silicona en un tubo de centrífuga que contenga 50 μL de la solución de PCR (a partir del paso 2.3). Tire del émbolo de la jeringa para extraer lentamente la solución. Fije la jeringa en una bomba de jeringa. Inserte la aguja de acero en la entrada del chip microfluídico.
- Ajuste el caudal de la bomba a 10 μL/min y pulse el botón de inicio para empujar la solución en el microcanal a la entrada del microchip.
- Recoja los productos de PCR en la salida del chip microfluídico.
NOTA: Enjuague el canal con agua ultrapura antes y después de la PCR para eliminar las impurezas.
6. Detección de los productos de PCR por este sistema CE construido internamente
- Preparar un capilar con una longitud total de 8 cm y una longitud efectiva de 6 cm.
- Prepare el tampón de separación mezclando 100 μL de hidroxietilcelulosa al 1 % (HEC, p/v), 2 μl de 100 veces SYBR Green I y 98 μl de agua ultrapura para obtener un 0,5 % de HEC (p/v) que contenga 1 x SYBR Green I.
- Llene el capilar con el tampón de separación preparado utilizando una bomba de vacío.
- Introduzca la tensión de inyección (800 V) y el tiempo de inyección (2,0 s) en la interfaz del software, haga clic en el botón de inicio y espere a que los productos de PCR se introduzcan electrodinámicamente en el capilar a 100 V/cm (2,0 s).
NOTA: En este paso, los productos de PCR se colocan en el electrodo negativo y el tampón se coloca en el electrodo positivo. - Introduzca la tensión continua (800 V) en la interfaz del software, haga clic en el botón de inicio y ejecute la electroforesis a 100 V/cm de intensidad de campo eléctrico.
NOTA: En este paso, tanto el electrodo positivo como el negativo se colocan con tampón. - Haga clic en el botón de parada después de que todos los fragmentos de ADN se separen en el capilar.
- Enjuague el capilar con agua esterilizada durante 1 minuto después de cada ejecución.
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Representative Results
La figura 5 representa el electroferograma de los productos de PCR y los marcadores de ADN. La traza (Figura 5A) es el resultado de CE del producto amplificado por CF-PCR, la traza (Figura 5B) es el resultado de CE del producto amplificado por ciclos térmicos y la traza (Figura 5C) es el resultado de CE de la escalera de ADN de 100 pb. Primero amplificamos el gen diana de E. coli en el sistema CF-PCR; la solución de PCR tardó ~ 10 min, 30 s desde la entrada hasta la salida del chip. El tamaño del amplicón diana de E. coli fue de 544 pb. Los productos de PCR amplificados se analizaron en el sistema CE, y también se realizó la CE de una escalera de ADN de 100 pb en las mismas condiciones experimentales. El tamaño del producto de PCR se puede evaluar de acuerdo con el electroferograma de la escalera de ADN. Cada experimento se realizó tres veces para comprobar su reproducibilidad. Los datos de la Figura 5 muestran que los picos correspondientes a los productos de PCR de E. coli se observaron después de la separación, y los tiempos de migración de los productos de PCR en el chip microfluídico fueron consistentes con los de un termociclador.
Figura 1: La oblea de silicio limpia. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El chip microfluídico CF-PCR fabricado con PDMS. Los microcanales se rellenaron con tinta roja para su visualización. Barra de escala = 1 cm. Abreviaturas: CF-PCR = PCR de flujo continuo; PDMS = polidimetisiloxano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El sistema CF-PCR. (1) Chip microfluídico, (2) calentador cerámico PTC, (3) jeringa, (4) bomba, (5) tubo de silicona, (6) ranura, (7) aguja de acero, (8) punta de pipeta, (9) controlador de temperatura PID, (10) sensor de temperatura, (11) relé de estado sólido. Abreviatura: CF-PCR = PCR de flujo continuo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Construcción del sistema CE. Abreviaturas: CE = electroforesis capilar; PMT = tubo fotomultiplicador; A1, A2 = filtros; B = lente de campo; C = espejo dicroico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Electroferograma de Escherichia coli. Amplificación por (A) chip microfluídico CF-PCR, (B) termociclador PCR tradicional y (C) marcadores de ADN. Abreviatura: CF-PCR = PCR de flujo continuo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Blanco | Secuencia 5′...... 3′ | Amplicón (pb) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTTTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabla 1: Imprimaciones empleadas para Escherichia coli. Abreviaturas: EC = Escherichia coli; F = hacia adelante; R = reverso.
| Búfer rápido 10x I | 5,0 μL |
| Mezcla de dNTP (2,5 μM) | 4,0 μL |
| ADN polimerasa SpeedSTAR HS | 0,25 μL |
| polivinil pirrolidona (PVP) | 3,5 μL |
| Preadolescente 20 | 1,5 μL |
| plantilla | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| Agua ultrapura | 33,75 μL |
Tabla 2: Componentes de la solución de PCR. Abreviaturas: EC = Escherichia coli; F = hacia adelante; R = reverso.
Archivo complementario 1: Archivo STL para impresión 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Tanto la PCR como la CE son dos biotecnologías populares en el análisis de ácidos nucleicos. En este trabajo se describe la amplificación de E. coli y la detección de los productos de PCR utilizando los sistemas CF-PCR y CE, ambos de fabricación propia. El gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos debido a las altas tasas de transferencia de calor. Los fragmentos de ADN menores de 1.500 pb se separaron en 8 minutos (Figura 5). La gran ventaja de estas dos técnicas es que puede ahorrar mucho tiempo en comparación con los métodos tradicionales de PCR y electroforesis en gel de losa. Los investigadores deben tener en cuenta que el chip microfluídico CF-PCR debe limpiarse después de su uso, y el sistema CE debe construirse en una casa limpia y negra para evitar la contaminación de las muestras. El sistema CF-PCR basado en el chip microfluídico y el sistema CE introducidos en este trabajo son fáciles de fabricar y pueden ofrecer un método sencillo para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio. Sin embargo, una limitación de la CF-PCR es que solo puede amplificar y detectar una sola muestra a la vez, lo que puede limitar su amplia aplicación; para contrarrestar esto, los usuarios pueden desarrollar el chip microfluídico integrado CF-PCR y CE array para resolver este problema. La plataforma reportada en este trabajo tiene un gran potencial de aplicación en el campo del diagnóstico clínico de enfermedades infecciosas y la investigación de ácidos nucleicos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái, China (Nº 19ZR1477500 y Nº 18441900400). Agradecemos el apoyo financiero de la Universidad de Shanghái para la Ciencia y la Tecnología (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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