Summary
Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2), inblandade i typ 2-inflammation, deltar huvudsakligen som svar på helminthinfektion, allergiska sjukdomar, metabolisk homeostas och vävnadsreparation. I denna studie demonstreras en procedur för att isolera ILC2s från murin nässlemhinna och detektera uttrycket av CD226.
Abstract
Med riklig forskning om grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2s) publicerade genom åren är ILC2s allmänt kända för att vara inblandade i reglering av olika patologiska processer, inklusive anti-helminth immunitet, vävnadsreparation, termogenes och autoimmuna sjukdomar som astma och allergisk rinit (AR). ILC2s permanent bor i perifera vävnader såsom hud, tarm, lungor och näshålan; Det finns dock begränsad information om deras exakta funktioner i nasal slemhinneimmunitet. CD226 är en aktiverande costimulatorisk molekyl, huvudsakligen uttryckt på naturliga mördarceller (NK), T-celler och inflammatoriska monocyter. Huruvida ILC2s uttrycker CD226 eller spelar en roll i patogenesen av ILC2s-relaterade sjukdomar är dock fortfarande okänt. Här etablerade vi en metod för att isolera och identifiera ILC2 från nässlemhinnan och detekterade CD226-uttryck på ILC2s erhållna från friska och AR-möss. Här beskriver vi detta protokoll för isolering och identifiering av ILC2s från nässlemhinnan hos möss, vilket kommer att bidra till att utforska den inre patologiska mekanismen för immunologiska störningar vid nasala slemhinnesjukdomar.
Introduction
Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2s) upptäcktes först i bukhålans vävnader hos möss och visades därefter vara närvarande i blodet och andra perifera vävnader såsom lungor, hud och näshålan 1,2,3. Som vävnadsresidenta celler upprätthålls och prolifereras ILC2 huvudsakligen lokalt och fungerar som de första vakterna som svarar på exogena skadliga stimuli genom att producera många typ 2-cytokiner och inducera typ 2-immunitet 4,5,6. ILC2 kan också utöva sina effekter genom handel mot de infekterade vävnaderna 7,8.
I likhet med T-hjälpar 2 (Th2) -celler säkerställer de komplicerade regleringsnätverken av ILC2 deras betydande engagemang i utvecklingen av olika typ 2-inflammatoriska sjukdomar, inklusive luftvägsallergiska sjukdomar 8,9. Vid astma kan epitelcellshärledda alarminer aktivera ILC2s, vilket ytterligare främjar lunginflammation genom utsöndring av interleukin (IL)-4, IL-5 och IL-1310. Kliniska studier har också visat att ILC2-nivåerna var signifikant förhöjda i sputum och blod hos patienter med svår astma, vilket tyder på ett samband mellan ILC2 och astmans svårighetsgrad och deras funktion som prediktor för astmaprogression11.
Allergisk rinit (AR) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom som drabbar miljontals människor årligen, och effektiva behandlingar för denna sjukdom är begränsade12,13. ILC2 spelar avgörande roller i patofysiologin vid AR, oavsett om det är i sensibiliseringsfasen eller symtomgenerering och inflammationsfas14. Hos patienter med AR har nivåerna av ILC2 i perifert blod rapporterats vara förhöjda både lokalt och systemiskt15. Vissa effekter och de underliggande mekanismerna för ILC2s på patofysiologin och progressionen av AR kräver dock fortfarande ytterligare utforskning.
CD226 - ett transmembranglykoprotein som fungerar som en costimulatorisk molekyl - uttrycks främst på naturliga mördarceller (NK), T-celler och andra inflammatoriska monocyter16,17. Samspelet mellan CD226 och dess ligander (CD155 och/eller CD112) eller konkurrent (TIGIT) gör det möjligt att delta i de biologiska funktionerna hos olika immunceller18. Bindningen av liganderna på antigenpresenterande celler till CD226 på cytotoxiska lymfocyter (CTL) främjar aktiveringen av båda cellerna samtidigt, medan aktiveringen av CTL kan undertryckas ytterligare av TIGIT (T-cellsimmunreceptor med Ig- och ITIM-domäner), konkurrenten till CD22619,20. En human ex vivo-studie visade att CD226 och CD155 på T-celler reglerar balansen mellan Th1/Th17 och Th2 genom differentiell modulering av Th-delmängder21. CD226 kan också förmedla trombocytadhesion och NK-tumördödande aktivitet22,23. Under tiden är CD226 väl studerad i patogenesen av olika infektionssjukdomar, autoimmuna sjukdomar och tumörer 18,24,25. För närvarande har CD226 blivit en ny ljuspunkt för immunterapi. Studier har visat att extracellulära vesiklar kan vända CD226-uttryck på NK-celler för att återställa deras cytotoxiska aktivitet och ingripa i utvecklingen av lungcancer26. En nyligen genomförd studie har avslöjat ett underkluster av fetalt tarmgrupp 3 ILC som kännetecknas av högt CD226-uttryck genom encells-RNA-sekvensering27, vilket indikerade att CD226 kan utöva roller i den medfödda lymfoida cellmedierade immuniteten.
Vår kunskap om ILC2s vid luftvägsinflammation bygger främst på studier på astma; Men lite är känt om deras funktioner i nasal slemhinneimmunitet. Således upprättades ett protokoll för att isolera och identifiera ILC2s från nässlemhinnan. Studien fokuserar på uttrycket av CD226 på ILC2s i näsvävnader och dess variation mellan friska och AR-möss. Detta kan ge nya insikter i de underliggande mekanismerna för ILC2-medierad reglering i den lokala immuniteten och tjäna som grund för att utveckla nya metoder för AR-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur. Alla förfaranden och protokoll godkändes av den vetenskapliga forskningsetikkommittén vid det fjärde militära medicinska universitetet (nr 20211008).
1. Murin AR-modelletablering
- Hus manliga och kvinnliga vildtyp (WT) C57BL / 6 möss i åldern 8-12 veckor under specifika patogenfria förhållanden och ger standard laboratoriechow och vatten.
- Emulgera 50 μg ovalbumin (OVA) i 0,2 ml steril PBS innehållande 2 mg aluminiumhydroxid på en ren bänk för att bibehålla steriliteten. På dag 0, 7 och 14 injiceras intraperitonealt hon- eller hanmöss med 50 μg vardera emulgerade OVA.
- På dag 21, 22, 23, 24 och 25, intranasalt injicera möss med 50 μg OVA upplöst i 30 μL steril PBS (15 μL per näsborre) under inhalationsanestesi (2-3% isofluran med en syreflödeshastighet eller 0,5 l / min).
- Avliva mössen 24 timmar efter den sista utmaningen (dag 26).
2. Isolering av mononukleära celler (MNC) från nässlemhinnan
- Avliva mössen genom cervikal dislokation under djupbedövning. Blötlägg mössen huvudet upp i 75% etanol i 5 minuter och undvik att etanol kommer in i den yttre näsborren. Placera buken nedåt på operationsbordet.
- Klipp av framtänderna. Vid huvudets mittlinje gör du ett snitt och skär upp huden med sax.
- Ta bort underkäken, skär av hela näsan längs gommen och placera vävnaden i en 60 mm petriskål som innehåller 5 ml iskall PBS. Använd sax och pincett, ta bort köttet och musklerna som fäster vid benen.
- Överför musnosen till en ny 60 mm petriskål som innehåller 5 ml iskall PBS. Tvätta benen två gånger med 5 ml iskall PBS.
- Överför näsan till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Krossa och överför näsan till ett 15 ml rör innehållande 2 ml förvärmd rötbuffert (RPMI 1640-medium kompletterat med 1 mg/ml kollagenas IV och 10 E/ml DNas I).
- Fäst locket och placera röret vertikalt i en orbitalskakapparat vid 37 °C, med kontinuerlig omrörning vid 120–150 varv/min i 40 minuter.
OBS: Förvärm rötbufferten till 37 °C för att uppnå högsta enzymaktivitet. - Tillsätt 5 ml iskallt RPMI 1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) för att stoppa matsmältningsprocessen.
- Filtrera genom en 70 μm cellsil för att avlägsna fasta fragment.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter och kasta sedan supernatanten försiktigt.
- Återsuspendera pelleten i iskallt RPMI 1640-medium och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter. Kassera försiktigt supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 4 ml 40% densitetsgradientmedia (160 μL 10x PBS + 1,44 ml densitetsgradientmedia stamlösning + 2,4 ml RPMI 1640-medium).
- Sätt försiktigt in en Pasteur-pipett i rörets botten och tillsätt långsamt 2,5 ml 80 % densitetsgradientmedia (200 μL 10x PBS + 1,8 ml densitetsgradientmedialösning + 0,5 ml RPMI 1640-medium).
- Ställ in centrifugens accelerations- och retardationshastighet lägre än den tredje växeln och centrifugera på 400 x g i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort det översta lagret av föroreningar innan du tömmer cellerna vid gränssnittet för att undvika potentiell kontaminering. Töm försiktigt det mononukleära cellskiktet (MNC) vid gränssnittet 40% / 80% densitetsgradientmedia i ett 15 ml rör innehållande 2 ml iskall PBS med en pipett. Tvätta cellerna med iskall PBS två gånger.
3. Ytfärgning för FCM-analys
- Skörda cellerna och centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Återsuspendera cellpelleten i färgningsbuffert (PBS kompletterad med 2 % FBS och 0,1 %NaN3) och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.
VARNING: Var försiktig när du förbereder färgningsbufferten. NaN3 är mycket giftigt och kan orsaka skador på organ vid förtäring, inandning eller hudkontakt. Undvik också utsläpp till miljön. - Resuspendera cellerna i 80 μL blockerande lösning (anti-CD16/32-antikropp (1:100) utspädd i färgningsbuffert) per rör. Inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 °C.
- Tillsätt 20 μl av lämplig utspädning av den ytfärgande antikroppscocktailen utan tvättning (tabell 1).
- Tillsätt 1 μL (per test) fixerbart viabilitetsfärgämne 520 (FVD) precis innan antikroppscocktailen tillsätts till proverna. Inkubera i mörker vid 4 °C i 30 minuter. Ange matchande isotypantikroppar och fluorescens minus en (FMO) som negativa kontroller.
- Tvätta cellerna i 500 μl färgningsbuffert genom centrifugering vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Återsuspendera cellpelleten i 200 μL färgningsbuffert. Tillsätt 50 μL virvlade absoluträknande pärlor till de färgade cellerna och agitera. Utsätt dem för en flödescytometrianalys (FCM).
OBS: FCM-data erhölls med hjälp av en spektralcellsanalysator och analyserades med programvara för flödescytometri (FCM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En OVA-inducerad murin modell utvecklades för att utforska ILC2s roll i AR. Konstruktionen av AR-murin modell baserades på tidigare studier med små modifieringar 28,29,30,31. En 10 minuters video fångades för att mäta frekvensen av nysningar och nässkrapning efter den sista nasala utmaningen. Allergiska symtom hos de OVA-inducerade AR-mössen presenterades i figur 1. Frekvensen av nasal gnidning och nysningar hos AR-mössen var signifikant högre än i kontrollgruppen.
Därefter beskrev vi ett förfarande för att isolera MNC från murin nässlemhinna och utföra deras karakterisering med hjälp av FCM-analys. Cirka 2-3 x 106 lymfocyter erhölls från varje murin näsa. De döda cellerna uteslöts genom FVD-färgning. Grindstrategin för ILC2s bland de isolerade cellerna var Lin (CD11b, CD11c, CD3 och B220) - CD45 + CD90.2 + KLRG1 + -celler. Alla grindar drogs baserat på isotyp eller FMO-kontroll. Vanligtvis identifierades ~ 2% -3% av Lin-CD45 + -celler i nässlemhinnan hos friska kontrollmöss (figur 2). Det absoluta antalet ILC2 i murin nässlemhinna varierar mellan 2 000 och 4 000.
Vi isolerade sedan ILC2s från AR-mössen med hjälp av ovan beskrivna metod. Det fanns ingen skillnad i det absoluta antalet lymfocyter mellan HC- och AR-möss. FCM-resultaten indikerade att andelen ILC2s i AR-mössen var 9% -14% av det totala antalet Lin-CD45 + lymfocyter, vilket indikerar en anmärkningsvärd ökning av antalet ILC2s i AR nässlemhinnan jämfört med den hos friska kontrollmöss (figur 3).
Vi upptäckte uttrycket av CD226 på ILC2s. I genomsnitt uttryckte 51,9% av ILC2s CD226 under oimmuniserade förhållanden, medan den genomsnittliga andelen ILC2s som uttryckte CD226 var 54,8% i AR-mössen, vilket visade en obetydlig tendens att öka jämfört med den hos kontrollmöss. Förutom cellfrekvensen bestämdes cellyteuttrycksnivån för CD226 också med hjälp av genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) som beräknades automatiskt av FCM-analysprogramvara. Intressant nog var MFI för CD226 signifikant uppreglerad hos AR-mössen jämfört med kontrollmössen (figur 4), vilket indikerar ett förhöjt uttryck av CD226 på ILC2s i den allergiska nässlemhinnan.
Figur 1: OVA-inducerad murin AR-modell . (A) Det schematiska diagrammet över etableringen av den murina AR-modellen. Frekvensen av nasal gnidning (B) och nysningar (C) under en 10 min period. Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD) (n = 3). För att jämföra de två grupperna utfördes Students t-test; P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: FCM-grindstrategi för ILC2. Multinationella företag isolerades enligt beskrivningen ovan. (A) Täthetsgrafiken visar fördelningen av isolerade multinationella företag längs FSC- och SSC-axlarna. (B) Singlets gated baserat på FSC-egenskaper. (C) Lin-celler definierades som CD11b-, CD11c-, CD3- och B220-negativa uttryck för att utesluta myeloida celler, B-celler och T-celler i MNC. Döda celler uteslöts genom fixerbar viabilitetsfärgning (FVD). (D) ILC kännetecknas av Lin-CD45+. (E) ILC2 är gated av CD90.2 + KLRG1 + bland ILC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: ILC2 i nässlemhinnan hos friska möss och AR-möss. (A) Representativa FCM-bilder illustrerar proportionerna ILC2 bland ILC från näshålans slemhinna hos friska kontroll- (HC) och AR-grupper. (B) Andelen ILC2s i Lin− CD45+ celler i HC- och AR-grupper. Värden presenteras som medelvärdet ± SD (n = 3). Studentens t-test utfördes för en jämförelse med två grupper. P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: CD226-uttryck i nasal mukosal ILC2s. ILC2 karakteriserades med hjälp av ovan nämnda strategi. Uttrycket av CD226 på ILC2s utvärderades med hjälp av FCM. a) Representativa histogram för CD226-uttryck i HC- och AR-grupper. blått område representerar CD226 FMO-kontrollen. (B,C) Proportionerna av CD226-positve ILC2s och genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av CD226 i HC-gruppen och AR-gruppen. Värdena uttrycks som medelvärdet ± SD (n = 3). Studentens t-test utfördes för jämförelse mellan de två grupperna. P < 0,05 ansågs betydande. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antikropp | Fluorokrom | Klon | Utspädning |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/cyanin7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabell 1: Ytfärgande antikroppscocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2 är nära förknippade med typ 2-inflammation och inflammatoriska störningar, vilket framgår av ett ökande antal studier. Både musmodeller och mänsklig observation bidrar till en bättre förståelse av dess funktion i de övre luftvägarna. Inom astmapatofysiologin aktiveras ILC2 genom tymisk stromal lymfopoietin, IL-25 och IL-33, som mestadels produceras av epitelceller. Sedan speglar Th2-celler, ILC2s producerar IL-4, IL-5 och IL-13 för att förvärra typ 2-inflammation32. Dessutom producerar olika undergrupper av ILC2 också IL-10 och IL-1733,34,35. AR är också en typ av luftvägsallergisk inflammation som drivs av typ 2-celler. ILC2s deltagande i AR-patofysiologi har nyligen visats14. De potentiella regleringsmekanismerna för ILC2 enligt AR är dock fortfarande till stor del okända.
Bevis tyder på att interaktionen mellan olika ILC2 kan förlita sig på ytmolekylerna36. Till exempel är både ICOS- och ICOS-ligander uttryckta på ILC2s nödvändiga för deras överlevnad och funktioner37. Dessutom uttrycker ILC2s också ICAM-1 och LFA-1, som utövar viktiga effekter på cellmigration och cell-cellinteraktion 7,38. Dessutom kan ILC2 överhörna med andra immunceller genom dessa cellytemolekyler. Till exempel är OX40L en dominerande mediator för interaktionen mellan CD4+ T-celler och ILC2s vid lunginflammation39. Eftersom CD226, som en transmembran costimulatorisk molekyl, uttrycker på olika immunceller, utvärderade vi också dess uttryck på ILC2s i näsvävnader från friska och AR-möss i denna studie.
Allmän OVA-inducerad AR-modellering inkluderar intraperitonealt systemisk sensibilisering och intranasalt lokal stimulering, som vanligtvis kräver minst 3-4 veckor för att uppnå tillfredsställande modelleringsresultat31. En annan OVA-inducerad AR-modell med endast nasal leverans tar lika lång tid som den allmänna modellmetoden för att uppnå en ungefärlig nivå av typ 2-inflammation och AR-symtom40. Antalet och funktionen av nasala ILC2 av dessa två AR-modelleringsmetoder behöver dock fortfarande ytterligare forskning. Vi bedömde nysningar och näsgnugga för att utvärdera AR-symtom. Även om det skulle vara mer övertygande att inkludera bedömningen för rinorré, fann vi att det är svårt att få syn på rinorré utan att störa mössens beteende under utvärderingen, så vi uteslöt tyvärr dessa kriterier. Dessutom kan utvärderingen för nysningar och nässköljning vara tillräckligt djup för att illustrera svårighetsgraden av murina AR-symtom för många av de relevanta artiklarna som endast använde dessa två kriterier41,42,43.
Tidigare studier om möss nasala ILC2 har beskrivit isolering av murin nässlemhinna44,45. Deras protokoll är som följer: Ta kortfattat bort mjukvävnaden runt skallen, öppna näsbenet för att exponera näshålan och skrapa nässlemhinnan från skallens yta med pincett. Medan det mesta av den isolerade slemhinnan användes för IF, IHC eller qPCR, rapporteras lite om följande isolering av mononukleära celler (MNC) och FCM-analys. I denna studie, med tanke på de låga mängderna ILC2 som finns i nässlemhinnan, behöll operationen den maximala volymen av nässlemhinnan genom att smälta hela näsan istället för att ta bort slemhinnan från näsbenets yta. För att optimera matsmältningsprotokollet utvärderade vi tre matsmältningsmedier: 0,5 mg / ml kollagenas IV, 1 mg / ml kollagenas IV och 1 mg / ml kollagenas IV och 10 U / ml DNas I och jämförde procentandelen levande celler och lymfocytfrekvens erhållen av dessa tre smältmedier. Andelen levande celler som förvärvats av alla tre medierna har ingen skillnad (90%-95%); De två första typerna av matsmältning var dock otillräckliga med lägre lymfocytfrekvens (~ 5%). Således valdes 1 mg / ml kollagenas IV och 10 U / ml DNas I som smältmedium i denna studie. Andra enzymer såsom liberas och dispase som kan ersätta kollagenas har dock inte studerats. Eftersom typen och koncentrationen av enzymer är avgörande för cellviabilitet och cellytemolekyluttryck46,47, behöver användningen och doseringen av dessa alternativ under näsdigestion fortfarande noggrann utforskning och optimering. Vi använde FVD eFluor 520 för att kontrollera cellviabiliteten, eftersom det kan detekteras med hjälp av ett 530/30 bandpassfilter som motsvarar FITC, så att vi kunde utesluta de döda cellerna medan vi grindade Lin-celler. Andra cellviabilitetsfärgämnen är också valfria enligt specifika antikroppspaneler. I stället för intracellulär färgning av transkriptionsfaktorerna GATA3, som vanligtvis utförs i andra ILC2-relaterade studier, karakteriserades ILC2s i den aktuella studien baserat på cellytemarkörer såsom Lin (CD11b, CD11c, CD3 och B220), CD45, CD90.2 och KLRG1 i FCM-analys. Bland dem har KLRG1 uttryckt på ILC2s identifierats som en specifik markör för mogen vävnad ILC2s48,49. Även om CD90.2 är mindre specifik, accepteras det fortfarande som en ILC2-associerad ytmarkör50. I denna studie särskiljdes inte möss efter kön. Forskning har visat att överflöd och cellytantigener hos lung-ILC hos möss är olika i kön, men korrelationen mellan nasala ILC2 och kön behöver fortfarande studeras50. Dessutom fokuserade protokollet inte på andelen andra hematopoetiska celler. Olika FCM-antikroppspaneler skulle hjälpa till att lösa problemet.
Detta protokoll beskrev en metod för att isolera ILC2s från den murina nässlemhinnan. De isolerade ILC2:erna kan färgas för FCM-karakterisering, sorteras för cellodling eller stimuleras in vitro för vidare analyser. I överensstämmelse med resultaten från de tidigare studierna 10,45,51 observerades en betydande ackumulering av ILC2s i nässlemhinnan hos AR-möss. I synnerhet uttrycktes CD226 på lokala ILC2s, och dess nivå ökade signifikant ytterligare vid allergiska tillstånd. Därför tyder resultaten i denna studie på involvering av CD226 i ILC2-beroende AR. Huruvida ILC2 hos patienter med AR uttrycker CD226 och om CD226-uttrycket på ILC2s ökar i allergiska tillstånd bör undersökas i framtida studier.
Sammanfattningsvis upprättade vi ett protokoll för att isolera och identifiera ILC2 från nässlemhinnan och detekterade uttrycket av vidhäftningsmolekyler i dem. Protokollet kräver ytterligare optimering; Bristen på studier som systematiskt och minutiöst beskriver proceduren för att isolera och karakterisera lymfocyter, särskilt medfödda lymfoida celler i nässlemhinnan, gör detta protokoll till en preliminär referens för forskare som utforskar den lokala nasala immunologiska miljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
RZ stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81871258) och medel från Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. stöddes av Shaanxis naturvetenskapliga grundforskningsprogram (nr 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
