Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 من الغشاء المخاطي للأنف في الفأر للكشف عن تعبير CD226

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63525
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 4, 4, 1
1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University
* These authors contributed equally

Summary

تشارك الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) ، المتورطة في التهاب النوع 2 ، بشكل أساسي في الاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية وأمراض الحساسية والتوازن الأيضي وإصلاح الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إثبات إجراء لعزل ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفئران والكشف عن تعبير CD226.

Abstract

مع الأبحاث الوفيرة حول الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية (ILC2s) المنشورة على مر السنين ، من المعروف على نطاق واسع أن ILC2s متورطة في تنظيم العمليات المرضية المختلفة ، بما في ذلك المناعة المضادة للديدان الطفيلية ، وإصلاح الأنسجة ، وتوليد الحرارة ، وأمراض المناعة الذاتية مثل الربو والتهاب الأنف التحسسي (AR). تقيم ILC2s بشكل دائم في الأنسجة المحيطية مثل الجلد والأمعاء والرئتين وتجويف الأنف. ومع ذلك ، هناك معلومات محدودة حول وظائفها الدقيقة في مناعة الغشاء المخاطي للأنف. CD226 هو جزيء مكلف منشط ، يتم التعبير عنه بشكل أساسي على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا التائية والخلايا الوحيدة الالتهابية. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كانت ILC2s تعبر عن CD226 أو تلعب دورا في التسبب في الأمراض المرتبطة ب ILC2s. هنا ، أنشأنا طريقة لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف واكتشفنا تعبير CD226 على ILC2s التي تم الحصول عليها من الفئران السليمة و AR. هنا ، نصف هذا البروتوكول لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفأر ، مما سيساعد في استكشاف الآلية المرضية الداخلية للاضطرابات المناعية في أمراض الغشاء المخاطي للأنف.

Introduction

تم اكتشاف الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) لأول مرة في أنسجة التجويف البريتوني للفئران وثبت لاحقا وجودها في الدم والأنسجة المحيطية الأخرى مثل الرئتين والجلد وتجويف الأنف1،2،3. كخلايا مقيمة في الأنسجة ، يتم الحفاظ على ILC2s بشكل أساسي وتكاثرها محليا وتعمل كأول حراس يستجيبون للمنبهات الضارة الخارجية من خلال إنتاج العديد من السيتوكينات من النوع 2 وتحفيز المناعة من النوع 24،5،6. يمكن ل ILC2s أيضا ممارسة آثارها عن طريق الاتجار نحو الأنسجة المصابة 7,8.

على غرار خلايا T-helper 2 (Th2) ، تضمن الشبكات التنظيمية المعقدة ل ILC2s مشاركتها الكبيرة في تطور الأمراض الالتهابية المختلفة من النوع الثاني ، بما في ذلك أمراض الحساسية في مجرى الهواء 8,9. في الربو ، يمكن للإنذارات المشتقة من الخلايا الظهارية تنشيط ILC2s ، مما يعزز الالتهاب الرئوي من خلال إفراز إنترلوكين (IL) -4 و IL-5 و IL-1310. أشارت الدراسات السريرية أيضا إلى أن مستويات ILC2 كانت مرتفعة بشكل ملحوظ في البلغم والدم للمرضى الذين يعانون من الربو الحاد ، مما يشير إلى ارتباط ILC2s مع شدة الربو ووظيفتها كمؤشر لتطور الربو11.

التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن شائع يصيب ملايين الأشخاص سنويا ، والعلاجات الفعالة لهذا المرض محدودة12,13. تلعب ILC2s أدوارا حاسمة في الفيزيولوجيا المرضية للواقع المعزز ، سواء في مرحلة التوعية أو توليد الأعراض ومرحلةالالتهاب 14. في المرضى الذين يعانون من AR ، تم الإبلاغ عن ارتفاع مستويات ILC2 في الدم المحيطي محليا وجهازيا15. ومع ذلك ، لا تزال بعض التأثيرات والآليات الأساسية ل ILC2s على الفيزيولوجيا المرضية وتطور AR تتطلب مزيدا من الاستكشاف.

يتم التعبير عن CD226 - وهو بروتين سكري عبر الغشاء يعمل كجزيء مكلف - بشكل أساسي على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا التائية وغيرها من الخلايا الوحيدة الالتهابية16,17. يسمح تفاعل CD226 وروابطه (CD155 و / أو CD112) أو المنافس (TIGIT) بالمشاركة في الوظائف البيولوجية للخلايا المناعية المختلفة18. إن ربط الروابط على الخلايا المقدمة للمستضد ب CD226 على الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (CTL) يعزز تنشيط كلتا الخليتين في وقت واحد ، في حين يمكن قمع تنشيط CTL بشكل أكبر بواسطة TIGIT (مستقبلات المناعة للخلايا التائية مع مجالات Ig و ITIM) ، منافس CD22619,20. كشفت دراسة بشرية خارج الجسم الحي أن CD226 و CD155 على الخلايا التائية ينظمان التوازن بين Th1 / Th17 و Th2 من خلال التعديل التفاضلي للمجموعات الفرعيةTh 21. يمكن ل CD226 أيضا التوسط في التصاق الصفائح الدموية ونشاط قتل الورم NK22,23. وفي الوقت نفسه ، تمت دراسة CD226 جيدا في التسبب في الأمراض المعدية المختلفة وأمراض المناعة الذاتية والأورام18،24،25. في الوقت الحاضر ، أصبح CD226 نقطة مضيئة جديدة للعلاج المناعي. وقد وجدت الدراسات أن الحويصلات خارج الخلية يمكن أن تعكس تعبير CD226 على الخلايا القاتلة الطبيعية لاستعادة نشاطها السام للخلايا والتدخل في تطور سرطان الرئة26. كشفت دراسة حديثة عن مجموعة فرعية من المجموعة المعوية الجنينية 3 ILCs تتميز بتعبير CD226 عالي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أحاديالخلية 27 ، مما يشير إلى أن CD226 قد يمارس أدوارا في المناعة الفطرية بوساطة الخلايا اللمفاوية.

تعتمد معرفتنا حول ILC2s في التهاب مجرى الهواء في المقام الأول على دراسات حول الربو. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن وظائفها في مناعة الغشاء المخاطي للأنف. وهكذا ، تم إنشاء بروتوكول لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف. تركز الدراسة على التعبير عن CD226 على ILC2s في أنسجة الأنف وتباينه بين الفئران السليمة و AR. قد يوفر هذا رؤى جديدة حول الآليات الأساسية للتنظيم بوساطة ILC2 في المناعة المحلية ويكون بمثابة أساس لتطوير مناهج جديدة لعلاج AR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات والبروتوكولات من قبل لجنة أخلاقيات البحث العلمي بالجامعة الطبية العسكرية الرابعة (رقم 20211008).

1. إنشاء نموذج AR الفئران

  1. يضم ذكور وإناث الفئران البرية (WT) C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 8-12 أسبوعا في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وتوفر طعاما ومياه مختبرية قياسية.
  2. استحلاب 50 ميكروغرام من البومين البيضاوي (OVA) في 0.2 مل من PBS المعقم الذي يحتوي على 2 ملغ من هيدروكسيد الألومنيوم على مقعد نظيف للحفاظ على العقم. في الأيام 0 و 7 و 14 ، حقن الفئران الإناث أو الذكور داخل الصفاق مع 50 ميكروغرام لكل من OVA المستحلب.
  3. في الأيام 21 و 22 و 23 و 24 و 25 ، قم بغرس الفئران داخل الأنف ب 50 ميكروغرام من OVA المذاب في 30 ميكرولتر من PBS المعقم (15 ميكرولتر لكل منخر) تحت التخدير الاستنشاقي (2-3٪ إيزوفلوران مع معدل تدفق الأكسجين أو 0.5 لتر / دقيقة).
  4. القتل الرحيم للفئران بعد 24 ساعة من التحدي الأخير (اليوم 26).

2. عزل الخلايا أحادية النواة (MNCs) من الغشاء المخاطي للأنف

  1. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق. نقع رأس الفئران في 75 ٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق وتجنب دخول الإيثانول إلى فتحة الأنف الخارجية. ضع البطن لأسفل على طاولة العمليات.
  2. قطع الأسنان الأمامية. في خط الوسط من الرأس ، قم بعمل شق ، وقطع الجلد باستخدام المقص.
  3. قم بإزالة الفك السفلي ، وقطع الأنف بالكامل على طول نهاية الحنك ، وضع الأنسجة في طبق بتري 60 مم يحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد. باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة اللحم والعضلات الملتصقة بالعظام.
  4. انقل أنف الفأر إلى طبق بتري جديد مقاس 60 مم يحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد. اغسل العظام مرتين باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني مثلج.
  5. نقل الأنف إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
  6. تحطيم الأنف ونقله بشكل كاف إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (RPMI 1640 متوسط مكمل ب 1 مجم / مل من كولاجيناز IV و 10 وحدة / مل DNase I).
  7. اربط الغطاء وضع الأنبوب عموديا في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، مع التقليب المستمر عند 120-150 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: قم بتسخين المخزن المؤقت للهضم مسبقا إلى 37 درجة مئوية لتحقيق أعلى نشاط إنزيم.
  8. أضف 5 مل من وسط RPMI 1640 المثلج البارد الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لإيقاف عملية الهضم.
  9. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الشظايا الصلبة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص برفق من المادة الطافية.
  11. أعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI 1640 البارد وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية برفق.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من وسائط التدرج الكثافة بنسبة 40٪ (160 ميكرولتر من 10x PBS + 1.44 مل من محلول مخزون وسائط التدرج الكثافة + 2.4 مل من وسط RPMI 1640).
  13. أدخل ماصة باستور برفق في قاع الأنبوب وأضف ببطء 2.5 مل من وسائط التدرج عالي الكثافة بنسبة 80٪ (200 ميكرولتر من 10x PBS + 1.8 مل من محلول مخزون وسائط تدرج الكثافة + 0.5 مل من وسط RPMI 1640).
  14. اضبط معدل التسارع والتباطؤ لجهاز الطرد المركزي أقل من الترس الثالث وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  15. قم بإزالة الطبقة العليا من الشوائب قبل تصريف الخلايا في الواجهة لتجنب التلوث المحتمل. قم بتصريف طبقة الخلايا أحادية النواة (MNCs) بعناية عند واجهة وسائط التدرج بكثافة 40٪ / 80٪ في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد باستخدام ماصة. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مرتين.

3. تلطيخ السطح لتحليل FCM

  1. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول تلطيخ (PBS مكمل ب 2٪ FBS و 0.1٪ NaN3) وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    تنبيه: كن حذرا عند تحضير المخزن المؤقت للتلطيخ. NaN3 شديد السمية وقد يتسبب في تلف الأعضاء إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه أو ملامسته للجلد. أيضا ، تجنب الإطلاق في البيئة.
  2. أعد تعليق الخلايا في محلول مانع سعة 80 ميكرولتر (جسم مضاد ل CD16 / 32 (1: 100) مخفف في محلول تلطيخ) لكل أنبوب. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  3. بدون غسل ، أضف 20 ميكرولتر من التخفيف المناسب لكوكتيل الأجسام المضادة الملطخ للسطح (الجدول 1).
  4. أضف 1 ميكرولتر (لكل اختبار) من صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت 520 (FVD) قبل إضافة كوكتيل الأجسام المضادة إلى العينات. احتضان في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتعيين مطابقة الأجسام المضادة للنمط المتماثل والتألق ناقص واحد (FMO) كعناصر تحكم سلبية.
  5. اغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التلوين عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. أضف 50 ميكرولتر من حبات العد المطلقة الدوامة إلى الخلايا الملطخة وحركها. إخضاعهم لتحليل قياس التدفق الخلوي (FCM).
    ملاحظة: تم الحصول على بيانات FCM باستخدام محلل الخلايا الطيفية وتحليلها باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (FCM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير نموذج الفئران المستحث ب OVA لاستكشاف دور ILC2s في AR. استند بناء نموذج الفئران AR إلى دراسات سابقة مع تعديلات طفيفة28،29،30،31. تم التقاط مقطع فيديو مدته 10 دقائق لقياس وتيرة العطس وخدش الأنف بعد تحدي الأنف الأخير. تم عرض أعراض الحساسية للفئران التي يسببها OVA AR في الشكل 1. كان تواتر فرك الأنف والعطس في الفئران AR أعلى بكثير من المجموعة الضابطة.

بعد ذلك ، وصفنا إجراء لعزل الشركات متعددة الجنسيات من الغشاء المخاطي للأنف الفئران وإجراء توصيفها باستخدام تحليل FCM. تم الحصول على حوالي 2-3 × 106 خلايا ليمفاوية من كل أنف فأر. تم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ FVD. كانت استراتيجية البوابات ل ILC2s بين الخلايا المعزولة هي Lin (CD11b و CD11c و CD3 و B220) - خلايا CD45 + CD90.2 + KLRG1 +. تم رسم جميع البوابات بناء على النمط المتماثل أو التحكم في FMO. عادة ، ~ 2٪ -3٪ من خلايا Lin− CD45 + تم تحديدها في الغشاء المخاطي للأنف للفئران الضابطة السليمة (الشكل 2). يتراوح العدد المطلق ل ILC2s في الغشاء المخاطي للأنف الفئران من 2000-4000.

ثم قمنا بعزل ILC2s من فئران AR باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. لم يكن هناك فرق في الأعداد المطلقة للخلايا الليمفاوية بين الفئران HC و AR. أشارت نتائج FCM إلى أن جزء ILC2s في فئران AR كان 9٪ -14٪ من إجمالي عدد الخلايا الليمفاوية Lin− CD45 + ، مما يشير إلى زيادة ملحوظة في عدد ILC2s في الغشاء المخاطي للأنف AR مقارنة بالفئران الضابطة السليمة (الشكل 3).

اكتشفنا تعبير CD226 على ILC2s. في المتوسط ، أعرب 51.9٪ من ILC2s عن CD226 في ظل ظروف غير محصنة ، في حين أن متوسط نسبة ILC2s التي تعبر عن CD226 كان 54.8٪ في الفئران AR ، والتي أظهرت ميلا غير ذي دلالة للزيادة مقارنة بالفئران الضابطة. بالإضافة إلى تردد الخلية ، تم أيضا تحديد مستوى تعبير سطح الخلية ل CD226 باستخدام متوسط شدة التألق (MFI) الذي تم حسابه تلقائيا بواسطة برنامج تحليل FCM. ومن المثير للاهتمام ، أن MFI ل CD226 تم تنظيمه بشكل كبير في الفئران AR مقارنة بالفئران الضابطة (الشكل 4) ، مما يشير إلى تعبير مرتفع عن CD226 على ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف التحسسي.

Figure 1
الشكل 1: نموذج AR للفأر الناجم عن OVA. (أ) الرسم التخطيطي لتكوين نموذج AR للفئران. تكرار فرك الأنف (B) والعطس (C) في فترة 10 دقائق. يتم تقديم القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) (n = 3). للمقارنة بين المجموعتين ، تم إجراء اختبار t للطالب ؛ P < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية بوابات FCM ل ILC2s. تم عزل الشركات متعددة الجنسيات على النحو المبين أعلاه. (أ) يوضح رسم الكثافة توزيع الشركات متعددة الجنسيات المعزولة على طول محاور FSC و SSC. (ب) تم إغلاق المفردات بناء على خصائص FSC. (ج) تم تعريف خلايا Lin− على أنها تعبير سلبي CD11b و CD11c و CD3 و B220 لاستبعاد الخلايا النخاعية والخلايا البائية والخلايا التائية في الشركات متعددة الجنسيات. تم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت (FVD). (د) تتميز المجتمعات الأصلية والمحلية ب Lin− CD45+. (ه) وتكون الحلقات المحايدة والثنائية مسورة بواسطة CD90.2+ KLRG1+ فيما بين المجتمعات الأصلية والمحلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ILC2s في الغشاء المخاطي للأنف للفئران السليمة و AR. (أ) توضح صور FCM التمثيلية نسب ILC2s بين المجتمعات الأصلية والمحلية من الغشاء المخاطي للتجويف الأنفي لمجموعات التحكم الصحي (HC) و AR. (ب) نسب ILC2s في خلايا Lin− CD45+ في مجموعات HC وAR. يتم تقديم القيم كمتوسط ± SD (n = 3). تم إجراء اختبار t للطالب للمقارنة بين مجموعتين. P < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تعبير CD226 في الغشاء المخاطي للأنف ILC2s. وقد تم توصيف ILC2s باستخدام الاستراتيجية المذكورة أعلاه. تم تقييم تعبير CD226 على ILC2s باستخدام FCM. (أ) الرسوم البيانية التمثيلية لتعبير CD226 في مجموعات HC وAR ؛ تمثل المنطقة الزرقاء عنصر تحكم CD226 FMO. (ب، ج) نسب CD226-positve ILC2s ومتوسط شدة التألق (MFI) ل CD226 في مجموعة HC ومجموعة AR. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SD (n = 3). تم إجراء اختبار t للطالب للمقارنة بين المجموعتين. P < 0.05 اعتبر مهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جسم فلوروكروم استنساخ التخفيف
CD11b فيتك م1/70 1:100
CD11c فيتك إن 418 1:200
سي دي 226 البولي إيثيلين / السيانين 7 10E5 1:50
CD3e فيتك 145-2 ج11 1:100
سي دي 45 أليكسا فلور 700 30-F11 1:200
CD45R (B220) فيتك RA3-6B2 1:100
CD90.2 بى 30-H12 1:100
كيه إل آر جي 1 ايه بي سي 2F1 1:160

الجدول 1: كوكتيل تلطيخ السطح بالأجسام المضادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ترتبط ILC2s ارتباطا وثيقا بالتهاب النوع 2 والاضطرابات الالتهابية ، كما يتضح من عدد متزايد من الدراسات. تساهم كل من نماذج الفئران والملاحظة البشرية في فهم أفضل لوظيفتها في مجرى الهواء العلوي. في الفيزيولوجيا المرضية للربو ، يتم تنشيط ILC2s من خلال الليمفوبويتين اللمفاوي اللحمي الصعتري ، IL-25 ، و IL-33 ، والتي يتم إنتاجها في الغالب بواسطة الخلايا الظهارية. ثم عكس خلايا Th2 ، تنتج ILC2s IL-4 و IL-5 و IL-13 لتفاقم الالتهاب من النوع 232. علاوة على ذلك ، تنتج مجموعات فرعية مختلفة من ILC2s أيضا IL-10 و IL-1733،34،35. AR هو أيضا نوع من التهاب حساسية مجرى الهواء مدفوعا بخلايا النوع 2. تم إثبات مشاركة ILC2s في الفيزيولوجيا المرضية AR مؤخرا14. ومع ذلك، فإن الآليات التنظيمية المحتملة ل ILC2s في إطار الواقع المعزز لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.

وتشير الدلائل إلى أن التفاعل بين مختلف ILC2s قد يعتمد على جزيئات السطح36. على سبيل المثال ، كل من ICOS و ICOS-ligands المعبر عنها في ILC2s ضرورية لبقائها ووظائفها37. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر ILC2s أيضا عن ICAM-1 و LFA-1 ، والتي تمارس تأثيرات مهمة على هجرة الخلايا والتفاعل بين الخلايا 7,38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل ILC2s التحدث المتبادل مع الخلايا المناعية الأخرى من خلال جزيئات سطح الخلية هذه. على سبيل المثال ، OX40L هو وسيط مهيمن للتفاعل بين خلايا CD4 + T و ILC2s في التهاب الرئة39. نظرا لأن CD226 ، كجزيء مكلف عبر الغشاء ، يعبر عن خلايا مناعية مختلفة ، فقد قمنا أيضا بتقييم تعبيره على ILC2s في أنسجة الأنف من الفئران السليمة و AR في هذه الدراسة.

تتضمن نمذجة AR العامة التي يسببها OVA التحسس الجهازي داخل الصفاق والتحفيز الموضعي داخل الأنف ، والذي يتطلب عادة ما لا يقل عن 3-4 أسابيع لتحقيق نتائج نمذجة مرضية31. يستغرق نموذج AR آخر للتسليم الأنفي فقط الناجم عن OVA وقتا مشابها لطريقة النموذج العام لتحقيق مستوى تقريبي من التهاب النوع 2 وأعراض AR40. ومع ذلك ، فإن عدد ووظيفة الأنف ILC2s من خلال هاتين الطريقتين لنمذجة AR لا تزال بحاجة إلى مزيد من البحث. قمنا بتقييم العطس وفرك الأنف لتقييم أعراض AR. على الرغم من أنه سيكون أكثر إقناعا تضمين تقييم سيلان الأنف ، فقد وجدنا أنه من الصعب رؤية سيلان الأنف دون التدخل في سلوك الفئران أثناء التقييم ، لذلك استبعدنا هذه المعايير للأسف. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقييم العطس وفرك الأنف عميقا بما يكفي لتوضيح شدة أعراض AR للفئران للعديد من المقالات ذات الصلة التي استخدمت هذين المعيارين فقط41،42،43.

وصفت الدراسات السابقة حول الفئران الأنف ILC2s عزل الغشاء المخاطي للأنف الفئران44،45. بروتوكولهم هو كما يلي: لفترة وجيزة ، قم بإزالة الأنسجة الرخوة حول الجمجمة ، وافتح عظم الأنف لفضح تجويف الأنف ، وكشط الأنسجة المخاطية للأنف من سطح الجمجمة بالملقط. في حين تم استخدام معظم الغشاء المخاطي المعزول ل IF أو IHC أو qPCR ، لم يتم الإبلاغ عن سوى القليل حول العزل التالي للخلايا أحادية النواة (MNCs) وتحليل FCM. في هذه الدراسة ، بالنظر إلى الكميات المنخفضة من ILC2s الموجودة في الغشاء المخاطي للأنف ، احتفظت العملية بالحجم الأقصى للغشاء المخاطي للأنف عن طريق هضم الأنف بالكامل بدلا من تجريد الغشاء المخاطي من سطح عظم الأنف. لتحسين بروتوكول الهضم ، قمنا بتقييم ثلاث وسائط هضم: 0.5 مجم / مل من كولاجيناز IV ، 1 مجم / مل من كولاجيناز IV ، و 1 مجم / مل من كولاجيناز IV و 10 وحدة / مل DNase I ، وقارنا النسبة المئوية للخلايا الحية وتردد الخلايا الليمفاوية التي تم الحصول عليها بواسطة وسائط الهضم الثلاثة هذه. نسبة الخلايا الحية المكتسبة من جميع الوسائط الثلاثة ليس لها فرق (90٪ -95٪) ؛ ومع ذلك ، كان النوعان الأولان من الهضم غير كافيين مع انخفاض تواتر الخلايا الليمفاوية (~ 5٪). وهكذا ، تم اختيار 1 مجم / مل من كولاجيناز IV و 10 وحدة / مل من DNase I كوسائط هضم في هذه الدراسة. ومع ذلك ، لم تتم دراسة الإنزيمات الأخرى مثل liberase و dispase التي قد تحل محل الكولاجيناز. نظرا لأن نوع وتركيز الإنزيمات أمران حاسمان لصلاحية الخلية والتعبير عن جزيء سطح الخلية46,47 ، فإن استخدام وجرعة هذه البدائل أثناء هضم الأنف لا يزالان بحاجة إلى استكشاف دقيق وتحسين. استخدمنا FVD eFluor 520 للتحقق من صلاحية الخلية ، لأنه يمكن اكتشافها باستخدام مرشح تمرير النطاق 530/30 وهو ما يعادل FITC ، حتى نتمكن من استبعاد الخلايا الميتة أثناء بوابات خلايا Lin. أصباغ صلاحية الخلايا الأخرى اختيارية أيضا وفقا لألواح الأجسام المضادة المحددة. علاوة على ذلك ، بدلا من تلطيخ عوامل النسخ داخل الخلايا GATA3 ، والتي يتم إجراؤها عادة في دراسات أخرى متعلقة ب ILC2 ، تم تمييز ILC2s في الدراسة الحالية بناء على علامات سطح الخلية مثل Lin (CD11b و CD11c و CD3 و B220) و CD45 و CD90.2 و KLRG1 في تحليل FCM. من بينها ، تم تحديد KLRG1 المعبر عنه على ILC2s كعلامة محددة للأنسجة الناضجة ILC2s48,49. على الرغم من أن CD90.2 أقل تحديدا ، إلا أنه لا يزال مقبولا كعلامة سطحية مرتبطة ب ILC250. في هذه الدراسة ، لم يتم تمييز الفئران حسب الجنس. أظهرت الأبحاث أن وفرة مستضدات سطح الخلية ل ILCs الرئوية في الفئران تختلف في الجنس ، ولكن العلاقة بين الأنف ILC2s مع الجنس لا تزال بحاجة إلى دراسة50. بالإضافة إلى ذلك ، لم يركز البروتوكول على نسبة الخلايا المكونة للدم الأخرى. ستساعد لوحات الأجسام المضادة FCM المختلفة في حل هذه المشكلة.

وصف هذا البروتوكول طريقة لعزل ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفأر. يمكن تلطيخ ILC2s المعزولة لتوصيف FCM ، أو فرزها لزراعة الخلايا ، أو تحفيزها في المختبر لمزيد من التحليلات. تمشيا مع نتائج الدراسات السابقة10،45،51 ، لوحظ تراكم كبير من ILC2s في الغشاء المخاطي للأنف من الفئران AR. والجدير بالذكر أنه تم التعبير عن CD226 على ILC2s المحلية ، وزاد مستواه بشكل ملحوظ في حالات الحساسية. لذلك ، تشير النتائج في هذه الدراسة إلى تورط CD226 في الواقع المعزز المعتمد على ILC2. ما إذا كان يجب التحقيق في الدراسات المستقبلية ما إذا كان ILC2s في المرضى الذين يعانون من AR يعبر عن CD226 وما إذا كان تعبير CD226 على ILC2s يزيد في حالات الحساسية.

في الختام ، أنشأنا بروتوكولا لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف واكتشفنا التعبير عن جزيئات الالتصاق داخلها. يتطلب البروتوكول مزيدا من التحسين. ومع ذلك ، فإن عدم وجود دراسات تصف بشكل منهجي ودقيق إجراء عزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية ، وخاصة الخلايا اللمفاوية الفطرية في الغشاء المخاطي للأنف ، يجعل هذا البروتوكول مرجعا أوليا للباحثين الذين يستكشفون البيئة المناعية الأنفية المحلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم R.Z. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81871258) والأموال المقدمة من الجامعة الطبية العسكرية الرابعة (رقم 2020rcfczr). تم دعم YZ من قبل برنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (رقم 2021JM-081).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum hydroxide Meilun biological Technology 21645-51-2
CD11b eBioscience 11-0112-82 Used in antibody coctail
CD11c BioLegend 117306 Used in antibody coctail
CD16/32 BioLegend 101302 Clone: 93; Dilution 1:100
CD226 BioLegend 128812 Used in antibody coctail
CD3e BioLegend 100306 Used in antibody coctail
CD45 BioLegend 103128 Used in antibody coctail
CD45R eBioscience 11-0452-82 Used in antibody coctail
CD90.2 BD Pharmingen 553014 Used in antibody coctail
Collagenase IV DIYIBio DY40128
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950 absolute counting beads
Dnase Equation 1 Beyotime D7076
Fetal Bovine Serum gibco 10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) eBioscience 65-0867-14 FVD
HBSS, calcium, magnesium Servicebio G4204-500
KLRG1 eBioscience 17-5893-81 Used in antibody coctail
NaN3 SIGMA S2002
NovoExpress software AgilentTechnologies Version 1.5.0 flow cytometry (FCM) analysis software
OVA SIGMA 9006-59-1
PBS, 1x Servicebio G4202-500
PBS, 10x Servicebio G4207-500
Percoll Yeasen 40501ES60 density gradient media
RPMI 1640 culture media Corning 10-040-CVRV
Spectral cell analyzer SONY SA3800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  2. Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
  3. Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
  4. Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
  5. Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
  6. Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
  7. Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
  8. Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
  9. Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
  10. Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
  11. Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
  12. Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
  13. Wheatley, L. M., Togias, A. Clinical practice. Allergic rhinitis. The New England Journal of Medicine. 372 (5), 456-463 (2015).
  14. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 95 (2020).
  15. Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
  16. Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
  17. Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
  18. Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
  19. Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
  20. Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
  21. Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
  22. Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
  23. Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
  24. Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
  25. Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
  26. Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
  27. Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
  28. Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
  29. Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
  30. Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
  31. Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
  32. Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  33. Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
  34. Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
  35. Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
  36. Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
  37. Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
  38. Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
  39. Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
  40. Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
  41. Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
  42. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
  43. Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
  44. Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
  45. Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
  46. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  47. Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
  48. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  49. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  50. Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
  51. Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 183 ،
عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 من الغشاء المخاطي للأنف في الفأر للكشف عن تعبير CD226
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang,… More

Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang, Y., Cheng, K., Zhuang, R., Bian, K. Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226. J. Vis. Exp. (183), e63525, doi:10.3791/63525 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter