Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette manuskript beskriver en forenklet protokol til isolering af retinale pigmenterede epitel (RPE) celler fra museøjne på en trinvis måde. Protokollen inkluderer enukleation og dissektion af museøjne efterfulgt af isolering, såning og dyrkning af RPE-celler.

Abstract

Det retinale pigmenterede epitel (RPE) lag ligger umiddelbart bag fotoreceptorerne og har et komplekst metabolisk system, der spiller flere kritiske roller i opretholdelsen af fotoreceptorernes funktion. Således er RPE-strukturen og -funktionen afgørende for at opretholde et normalt syn. Dette manuskript præsenterer en etableret protokol for primær RPE-celleisolering af mus. RPE-isolering er et godt værktøj til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for RPE-patologi i de forskellige musemodeller af okulære lidelser. Desuden kan RPE-isolering hjælpe med at sammenligne primære muse-RPE-celler isoleret fra vildtype og genetisk modificerede mus samt teste lægemidler, der kan fremskynde udviklingen af terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet præsenterer en trin-for-trin RPE-isolationsprotokol; Hele proceduren, fra enukleation til såning, tager cirka 4 timer. Medierne bør ikke ændres i 5-7 dage efter såning for at tillade vækst af de isolerede celler uden forstyrrelse. Denne proces efterfølges af karakterisering af morfologi, pigmentering og specifikke markører i cellerne via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire gange.

Introduction

Retinale pigmenterede epitelceller (RPE) er placeret mellem choroid og neurale nethinden og danner et simpelt monolag af kuboidale celler, der ligger bag fotoreceptorcellerne (PR)1. RPE spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af et sundt miljø for PR-celler, hovedsageligt ved at reducere overdreven ophobning af reaktive iltarter (ROS) og deraf følgende oxidative skader1. RPE-celler overvåger mange funktioner, såsom omdannelse og opbevaring af retinoider, absorption af spredt lys-, væske- og iontransport og fagocytose af skurets PR-ydre segmentmembran 2,3. Ændringer i RPE (morfologi/funktion) kan forringe deres funktion, hvilket fører til retinopati, og dette er et fælles træk, der deles af mange okulære lidelser4. Mange okulære sygdomme er forbundet med ændringer i RPE-cellernes morfologi og funktion, herunder nogle genetiske sygdomme såsom retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6 samt aldersrelaterede okulære lidelser såsom diabetisk retinopati (DR) og aldersrelateret makuladegeneration (AMD)7,8 . Humane celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt at studere RPE-lidelser i primære humane RPE-celler til dannelse af RPE-monolag. Etiske spørgsmål og den begrænsede tilgængelighed af humane donorer på grund af det faktum, at de fleste af disse lidelser fører til sygelighed9, men ikke nødvendigvis dødelighed10, forhindrer derved isolering af primære humane RPE-celler. Dette gør dyrkning af RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnavere, især mus, betragtes som en god model til undersøgelse af forskellige okulære sygdomme, da transgen teknologi er mere omfattende etableret i disse arter11. Selvom brugen af dyrkede primære RPE-celler giver mange fordele, har det været svært at vedligeholde voksende celler i mange passager eller at opbevare og genbruge cellerne. Den største begrænsning af denne protokol er musenes alder; mus, der bruges til RPE-isolering, bør være i en meget ung alder (18-21 dage gammel er optimal), da det har været vanskeligt at dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøjne i alle aldre, men op til fire cellepassager var kun vellykkede med unge mus (18-21 dage gamle). RPE-isolering fra musenethinder ved hjælp af både C57BL6-mus og transgene mus med sletning af N-methyl-D-aspartatreceptorerne (NMDAR'er) ved RPE-cellerne blev udført for at studere effekten af forhøjet aminosyrehomocystein på udviklingen og progressionen af AMD14. Derudover hjalp isolerede primære RPE-celler med at foreslå et terapeutisk mål for AMD ved hæmning af NMDAR'erne ved RPE-celler14. Der er nogle NMDAR-blokkere, der er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og bruges i øjeblikket til behandling af moderat til svær forvirring (demens) relateret til Alzheimers sygdom (AD), såsom memantin16, som kan være et potentielt terapeutisk mål for AMD14. Desuden blev isolerede primære muse-RPE-celler anvendt til påvisning af inflammatoriske markører og den foreslåede induktion af inflammation som en underliggende mekanisme for homocysteininducerede træk ved AMD og AD ved anvendelse af en genetisk modificeret mus (CBS), som præsenterer et højt niveau af homocystein16,17.

Denne protokol blev brugt til at isolere RPE-celler fra både vildtype C57BL/6-mus og transgene mus udviklet i vores laboratorium som en forenklet tilpasning af andre offentliggjorte isolationsprotokoller13,18,19 for at nå en let anvendelig og pålidelig protokol. Der er ingen sexpræference i denne protokol. Mens mus aldre er kritiske for isolationsprocessen, blev unge, gamle mus (18-21 dage gamle) og ældre mus i alle aldre (op til 12 måneder) brugt til RPE-isolering. Vi bemærkede imidlertid, at RPE-cellerne isoleret fra de unge ældre mus levede længere, og op til fire passager kunne udføres. RPE-cellerne isoleret fra ældre mus kunne passeres en eller to gange, så ville de stoppe med at vokse med en normal hastighed og ændre deres form til at være mere langstrakt (fibroblastlignende celler). Tab af pigmentering og nedsat vedhæftning til vævskulturpladen efterfulgt af løsrivelse blev også observeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr blev brugt i henhold til retningslinjerne fra Oakland University IACUC dyreprotokolnummer 21063 og retningslinjerne i ARVO-erklæringen for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning.

1. Forberedelse af opløsning

  1. Forbered det komplette RPE-cellekulturmedie ved at supplere Dulbeccos modificerede Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Føtal Bovin Serum (FBS), 1,5% penicillin / streptomycin og 0,02% gentamicin.
  2. Forbered enzym A ved at supplere 741 μL af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) med 127 μL kollagenasestamopløsning og 132 μL Hyaluronidase-stamopløsning. Dette gør et endeligt volumen på 1 ml, som kan behandle fire øjne.
    1. Collagenasestamopløsningen fremstilles ved at opløse 1 mg kollagenase fra Clostridium histolyticum i 41 ml HBSS (19,5 enheder/ml).
    2. Hyaluronidasestamopløsningen fremstilles ved at opløse 1 mg Hyaluronidase fra testikler fra kvæg i 18,4 ml HBSS (38 enheder /ml).
  3. Forbered enzym B ved at tilføje to dele af 0,25% Trypsin-EDTA til tre dele af HBSS. Bemærk, at det samlede volumen afhænger af antallet af dissekerede øjne; 1 ml enzym B kan bruges til at behandle fire øjne.

2. Enukleation

  1. Afliv musen etisk ved hjælp af indånding af kuldioxid (CO2) i henhold til IACUC-standarder21.
    1. Kort fortalt skal du placere dyret/dyrene i CO 2 -kammeret for at introducere 100% CO 2 med en fyldningshastighed på 30% -70% af kammervolumenet pr. Minut med CO 2 for at opnå bevidstløshed inden for2 til 3 minutter med minimal nød for musene.
    2. Bekræft døden (manglende åndedræt og falmet øjenfarve), og flyt derefter musen fra buret til et rent steriliseret kirurgisk område (skrubbet med alkohol) udstyret med steriliseret kirurgisk udstyr.
  2. Placer musen på en steril underpude.
  3. Enukleate øjnene ved at trykke 5/45 stil pincet på orbitalområdet for at fremkalde proptose, efterfulgt af at flytte pincetten til den bageste af øjet. Uddrag øjnene, med synsnerven intakt, ved at trække øjnene forsigtigt fra orbitalhulen.
  4. Brug tang til at nedsænke øjnene i et 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml 5% Povidon-jod. Inkuber øjnene ved stuetemperatur i 2-3 min.
  5. Fjern øjnene fra povidon-jodopløsningen og læg dem i en petriskål. Brug en steril overførselspipette til at vaske øjnene med HBSS, indtil povidon-jods orange farve er væk. Dette tager omkring to eller tre vaske.
  6. Øjnene anbringes i en ny 60 mm petriskål, og nedsænk dem i koldt (2-8 °C) komplet RPE-cellekulturmedie tilberedt i trin 1.1.

3. Dissektion

  1. Under et kirurgisk mikroskop skal du bruge M5S-stil pincet og Vannas saks til at fjerne bindevæv og ekstraokulære muskler.
    BEMÆRK: Dissektionen udføres under en vævshætte i et helt sterilt miljø. Til videoformål blev dissekeringsmikroskopet imidlertid placeret uden for emhætten for at opnå en demonstration / filmoptagelse af højere kvalitet. Placering af et lille stykke fnugfrit silkepapir under øjet forbedrer stabiliteten under dissektion. Øjnene kan derefter holdes midlertidigt (ikke i mere end 1 time) i det kolde RPE-cellekulturmedie. Det foretrækkes dog at gå direkte til næste trin umiddelbart efter rengøring af øjnene.
  2. Overfør øjnene til et 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml enzym A-opløsning for hver fire øjne. Derefter inkuberes øjnene i en inkubator ved 37 ° C i 40 minutter.
  3. Fjern øjnene fra inkubatoren og mikrocentrifugerøret. Overfør dem derefter til et nyt mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml enzym B-opløsning for hvert fjerde øje. Røret inkuberes i en inkubator ved 37 °C i 50 min.
  4. Placer øjnene i en ny 60 mm ophængskulturskål, der indeholder 10 ml komplet RPE-cellevækstmedie. Derefter inkuberes øjnene ved 4 °C i 30 min.
  5. Placer skålen under et kirurgisk mikroskop og begynd at dissekere.
  6. Fjern den forreste del af øjet (hornhinde, iris og linse) fra den bageste del af øjenkoppen (bageste nethinden).
    1. Tag fat i øjet med tang i M5S-stil, og lav et snit i ora serrata-sektionen (den forreste del af nethinden, hvor den lyseblå slutter) med et #11-blad eller nålen på en sprøjte.
    2. Tag fat i den indre del af snittet med et par tang, og tag fat i hornhinden med et andet par tang. Begynd langsomt at trække eller rive hornhinden fra nethinden. Sørg for at rive i små trin og flytte tåren ned, mens du fjerner hornhinden, for at sikre, at RPE forbliver for det meste intakt og resulterer i en renere tåre.
      BEMÆRK: Når hornhinden er helt løsrevet, kan iris og linse ses.
    3. Adskil både hornhinden og iris.
  7. Adskil linsen fra øjenkoppen med blid kompression af den bageste halvdel af øjet.
  8. For at fjerne den neurale nethinde fra RPE-laget skal du tage fat i det ydre lag af øjenkoppen med et par pincetter og placere armen på et andet par pincet mellem både RPE og neurale lag. Derfra skal du forsigtigt trække eller øse den neurale nethinde væk fra RPE-laget. Kassér den neurale nethinde.
    BEMÆRK: I videoen fjernes neurale nethinden og linsen sammen. Men for begyndere vil det være lettere at fjerne hver separat. Tilbage står RPE, choroid og sclera.
  9. Kassér hornhinden, iris, linsen og neurale nethinden. Flyt den resterende øjenkop til et nyt område på fadet uden snavs.
  10. For at adskille RPE fra choroid og sclera skal du forsigtigt skrabe indersiden af øjenkoppen med 5/45 stil pincet for at sikre adskillelsen af RPE-cellerne. RPE-cellerne ser uklare ud, når de er suspenderet i det komplette RPE-cellevækstmedie.
  11. Aspirer cellerne ved hjælp af en 3,2 ml steril overførselspipette og overfør til et nyt 15 ml centrifugerør indeholdende komplet RPE-cellevækstmedie.

4. Centrifugering

  1. Centrifugerøret på 15 ml indeholdende primære RPE-celler anbringes i en centrifuge, og cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
  2. Supernatanten aspireres, og pelleten genoptages med 10 ml komplet RPE-vækstmedie. Det komplette RPE-vækstmedie er mere specifikt for RPE-vækst end andre forurenende celler, såsom Müller-celler eller choroidale endotelceller. Müller-celler kræver høje glukosemedier, mens choroidale endotelceller kræver specifikke vækstfaktorer. Ved at ændre medierne og videregive kulturen vil kun RPE-cellerne fortsætte med at vokse.

5. Cellekultur

  1. De resuspenderede primære RPE-celler hældes på en steril 100 mm petriskål, og dem overføres til en inkubator (efter at have verificeret renheden ved at farve celler med specifikke RPE/Müller-cellemarkører, som angivet i figur 1E-N). Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
    BEMÆRK: De anvendte markører er nævnt i materialetabellen. Dette trin udføres, efter at kulturen er etableret.
  2. Inkuber cellerne i ca. 5 dage for at vokse. I løbet af denne tid må du ikke ændre mediet, forstyrre cellerne eller flytte cellekulturpladen (dette er et kritisk trin i protokollen; efter isolering skal cellerne inkuberes og ikke forstyrres i 5 dage).
    BEMÆRK: Antallet af celler afhænger af antallet af øjne, der bruges til isoleringen. Et større antal isolerede øjne vil give et større antal celler. RPE-isolering fra to øjne vil give ~ 440.000-880.000 celler eller 5% -10% af 100 mm petriskålen, som kan rumme 8,8 millioner celler.

6. Aflevering

  1. Aspirer ud af medierne og vask med 2 ml PBS. Derefter aspireres PBS ud.
  2. Tilsæt 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x), eller nok til at dække bunden af skålen. Inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
  3. Tilføj 8 ml forvarmet RPE-medie eller dobbelt så meget som hvor meget trypsin der blev brugt i trin 6.2. Saml derefter cellerne og læg dem i et 15 ml centrifugerør.
  4. Centrifuge ved 300 x g i 7 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og suspender pelleten i 10 ml komplet RPE-cellekulturmedie. Plade hele suspensionen i en steril 100 mm petriskål.
    BEMÆRK: Cellerne kan passeres op til fire eller fem gange18. De mest konsistente eksperimentresultater findes dog efter to eller tre passager. Efter to til fire passager ændrede cellerne deres form (som vist i figur 1D) for at være mere aflange, akkumuleret midt på pladen, stoppede med at vokse og løsnes.
  5. Brug immunfluorescensprotokoller i henhold til de tidligere offentliggjorte metoder 8,14,15,16 til at plette og validere RPE-specificiteten.

7. Immunfluorescens

BEMÆRK: Immunfluorescens blev udført i henhold til de tidligere offentliggjorte metoder 8,14,15,16,17,18 for at plette og validere RPE-specificiteten. Farvningen af primære RPE-celler blev typisk udført ved passagerne P1 og P2. Her præsenteres en kort oversigt over den immunfluorescerende protokol.

  1. Frø cellerne på et cellekulturkammer dias (30.000 celler pr. Brønd til 8-brønds kammerdias).
  2. Kultur cellerne i komplette RPE-cellekulturmedier ved 37 °C og 5% CO2 i 24-48 timer.
  3. Når cellerne er 80% -90% sammenflydende, skal du suge mediet ud og vaske kammerrutsjebanen med 1x PBS.
  4. Fastgør diaset med 4% paraformaldehyd i 10-15 min.
  5. Opsæt 4% paraformaldehyd og bloker derefter med blokerende opløsning (se Materialetabel).
  6. Blokeringsopløsningen aspireres ud, og det primære antistof, RPE65, tilsættes, og der inkuberes i tre timer ved 37 °C (med en antistofkoncentration på mellem 1:200-1:250 i blokeringsbuffer ved et volumen på 150-200 μL/dias). Vask derefter tre gange med PBS/TX-100 (5-10 min hver vask).
  7. Det primære antistof aspireres ud, og det sekundære antistof tilsættes (med en antistofkoncentration på 1:1.000 i blokeringsbuffer ved et volumen på 150-200 μL/dias). Inkuberes i en time ved 37 °C.
  8. Aspirer ud af det sekundære antistof. Vask tre gange med PBS/Trtion X-100 (5-10 min hver vask).
  9. Tilføj en dråbe DAPI-monteringsmedium for at mærke kernerne, og læg en dækseddel over diaset. Sørg for, at der ikke er bobler under dækslippen.
  10. Tag derefter billeder med et fluorescerende mikroskop ledsaget af et højopløsningsmikroskop (HRM) kamera og billedbehandlingssoftware (se Materialetabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af specificitet, renhed og barrierefunktion/dannelse af isolerede RPE-celler
De isolerede celler blev undersøgt under et lysmikroskop for at verificere deres levedygtighed, morfologi og pigmentering. Billeder fra P0 og P1 (figur 1A, B) og billeder fra P0 og P4 blev taget (figur 1C, D) for at vise ændringerne i cellerne; form, størrelse og pigmentering, da passagerne fortsatte til den fjerde passage (sorte pile peger på de isolerede RPE-celler i P4). Et antistof til RPE65-proteinet blev brugt til at verificere identiteten af de isolerede celler. Immunofluorescensfarvning af de isolerede celler blev udført med et antistof mod RPE65 efterfulgt af undersøgelse under det fluorescerende mikroskop (figur 1E, F: lav forstørrelse og figur 1G, H: høj forstørrelse, der viser positivt farvede RPE-celler i grønt og en nuklear markør, DAPI, i blåt). RPE65 er en isomerohydrolase udtrykt i RPE. Det er afgørende for regenerering af det visuelle pigment, der kræves til stang- og keglemedieret syn21 . At validere barrierefunktionen af den isolerede
celler, både cytoskeletalprotein F-actin og tæt krydsprotein ZO-1 immunfluorescensfarvning8 til de isolerede celler blev anvendt (figur 1I, J: grøn ZO-1 og blå nuklear farvning). og figur 1K,L: rød F-actin og blå nuklear farvning). Imidlertid er den typiske brostensform af RPE meget tydelig, når cellerne er fuldt sammenflydende.

Negativ kontrol blev brugt i eksperimenterne, hvor det sekundære antistof blev tilsat til RPE-cellerne uden at tilføje det primære antistof for at sikre, at antistoffets specificitet og den resulterende farve er specifik for de antistoffer, der blev brugt (ikke vist).

For at validere renheden og forureningen af den isolerede RPE af Müller-celler blev immunofluorescensfarvning af de isolerede celler med en specifik cellemarkør for Müller-celler, vimentin, anvendt (grøn og blå til nuklear farvning som vist i figur 1M, N) ved hjælp af Müller-celler som en positiv kontrol. Isolerede RPE-celler viste negativ farvning for vimentin.

De isolerede celler blev undersøgt under et lysmikroskop for at verificere deres levedygtighed, morfologi og pigmentering. Billeder fra P0 og P1 (figur 1K, L) og billeder fra P0 og P4 blev taget (figur 1M, N) for at vise ændringerne i cellernes form, størrelse og pigmentering, da passagerne fortsatte til den fjerde passage (sorte pile peger på de isolerede RPE-celler i P4).

Figure 1
Figur 1: Validering af RPE-isolation. (A) Lysmikroskop til RPE-passage nul (P0). (B) Let mikroskop til RPE passage et (P1). (C) Morfologi karakterisering ved P0. (D) Morfologi karakterisering på P4. (E) Immunostaining til RPE65 ved lav forstørrelse. (F) Immunostaining til RPE65 med nuklear farvning med DAPI. (G) Immunostaining til RPE65 ved høj forstørrelse. (H) Immunostaining til RPE65 med nuklear farvning med DAPI ved høj forstørrelse. (I) ZO-1 farvning til RPE-celler. (G) ZO-1-farvning til RPE-celler med nuklear farvning med DAPI. (K) F-actin farvning til RPE-celler. (L) F-actin farvning til RPE-celler med nuklear farvning med DAPI. (M) Vimentinfarvning til RPE-celler. (N) Vimentinfarvning til Müller-celler som en positiv kontrol (RMc-1) med nuklear farvning med DAPI. Skalastænger er lig med henholdsvis 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm og 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol er en rapporteret, ændret og forenklet detaljeret procedure for RPE-isolering fra museøjne. Protokollen inkluderer enukleation, dissektion, indsamling, såning, kultur og karakterisering af RPE-celler isoleret fra museøjne.

Der er nogle begrænsninger og kritiske trin, der skal opfyldes for en vellykket RPE-isolering, såsom musens alder, antallet af dissekerede øjne, størrelsen på vævskulturpladen eller skålen og advarsler efter såning, opbevaring og passaging. For at kunne passere de isolerede celler op til tre eller fire gange er de bedste musealdre mellem 18-21 dage. For at have et rimeligt antal isolerede celler, der er i stand til at vokse og formere sig, er der brug for mindst to øjne til enkelt isolering. Antallet af celler, der resulterer i isolation, er proportionalt med antallet af øjne dissekeret (~ 220.000 celler / øje). En steril 100 mm petriskål/kolbe anbefales for at opnå et større antal celler i en tidlig passage (P0). Efter såning bør celler ikke forstyrres ved at flytte vævskulturpladen fra inkubatoren eller ved at ændre mediet i mindst 5 dage. En af begrænsningerne ved denne teknik er også opbevaring og passaging af de isolerede celler. Celler kan ikke opbevares (fryses og genoptøes) og kan kun passeres tre eller fire gange. Efter passage 4 begynder cellerne at ændre deres størrelse og form for at blive aflange (spindelform) med et markant fald i cellepigmentering (figur 1D).

Denne protokol adskiller sig fra andre værdifulde og pålidelige offentliggjorte protokoller til primær mus RPE-isolering1 3,19,20, idet den er forenklet med et par trin, der er lette at følge. RPE-celler er i stand til at blive identificeret ved deres morfologi, pigmentering og specifikke RPE-markører såsom RPE65 4,5,21. Validering af renheden og kontamineringen af Müller-celler blev opnået ved farvning af isolerede celler med en specifik cellemarkør for Müller-celler (vimentin)22. Mange teknikker er blevet brugt til at evaluere integriteten af blod-retinal barrieren (BRB) in vitro, såsom elektronmikroskop (EM) undersøgelse, vurdering af tætte krydsproteiner (TJP'er), FITIC dextran lækage assay og transepitelial elektrisk modstand (TER) måling, der evaluerer den fysiologiske funktion af RPE som et monolag 8,23 . RPE-celler spiller en vigtig rolle i vedligeholdelsen af den ydre BRB, og for at validere denne funktion evaluerede vi tætte krydsproteiner (TJP'er) såsom Zona ocludin-1 (ZO-1) og cytoskeletale proteiner som F-actin som tidligere offentliggjort8. TJP'er evaluering er en mere bekvem metode til evaluering af BRB integritet og barriere funktion, som ikke kræver dyrt udstyr, der muligvis ikke er tilgængeligt i alle forskningslaboratorier, i modsætning til EM evaluering eller TER.

Primær RPE-isolering er en teknik, der kan være et vigtigt redskab til at studere underliggende mekanismer og patogenese og til at foreslå nye terapeutiske anvendelser for forskellige øjensygdomme. Den nuværende teknik gjorde det muligt at studere ændringerne i RPE-cellestruktur og funktion og deres indvirkning på den ydre BRB i aldersrelateret makuladegeneration8. Desuden hjalp det med at studere ændringerne i RPE-celler isoleret fra vildtype C57BL6-mus og forskellige genetisk modificerede mus samt teste de forskellige farmakologiske forbindelser, der søgte et terapeutisk mål for AMD14,16.

Afslutningsvis viste mange tilgængelige offentliggjorte protokoller primær mus RPE-isolation. Den præsenterede protokol er en forenklet procedure, der er resultatet af at ændre nogle eksisterende protokoller ved hjælp af materiale, metoder og udstyr, der er tilgængelige i de fleste forskningslaboratorier til at isolere primære RPE-celler fra museøjne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære, der er relevante for indholdet af denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biologi udgave 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter