Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

सेलुलर डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट धूमकेतु परख दृष्टिकोण

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63559
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 5, 1
1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences, University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.), US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment, Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, De Montfort University
* These authors contributed equally

Summary

धूमकेतु परख डीएनए क्षति का पता लगाने का एक लोकप्रिय साधन है। यह अध्ययन धूमकेतु परख के प्रतिनिधि वेरिएंट में स्लाइड चलाने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण ने परख रन-टाइम, स्लाइड जोड़तोड़ की संख्या और जैल को नुकसान के जोखिम को कम करते हुए नमूनों की संख्या में काफी वृद्धि की।

Abstract

कोशिकाएं लगातार आंतरिक और बाहरी वातावरण से उत्पन्न होने वाले एजेंटों के संपर्क में आती हैं, जो डीएनए को नुकसान पहुंचा सकती हैं। यह क्षति असामान्य सेल फ़ंक्शन का कारण बन सकती है, और इसलिए डीएनए क्षति सभी प्रमुख मानव रोगों, जैसे, कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी और उम्र बढ़ने के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। सिंगल-सेल जेल वैद्युतकणसंचलन (यानी, धूमकेतु परख) डीएनए क्षति की एक विस्तृत श्रृंखला के गठन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए सबसे आम और संवेदनशील तरीकों में से एक है (उदाहरण के लिए, एकल और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, क्षार-लेबिल साइट, डीएनए-डीएनए क्रॉसलिंक, और, कुछ मरम्मत एंजाइमों, ऑक्सीकृत प्यूरीन और पाइरिमिडाइन के साथ संयोजन में), विट्रो और विवो दोनों में । सिस्टम। हालांकि, पारंपरिक परख और श्रमसाध्य नमूना वर्कअप के कम नमूना थ्रूपुट इसके व्यापक संभव अनुप्रयोग के लिए कारकों को सीमित कर रहे हैं। धूमकेतुओं के "स्कोरिंग" के साथ तेजी से स्वचालित, सीमा अब धूमकेतु स्लाइड की महत्वपूर्ण संख्या को संसाधित करने की क्षमता है। यहां, धूमकेतु परख (एचटीपी धूमकेतु परख) का एक उच्च-थ्रूपुट (एचटीपी) संस्करण विकसित किया गया है, जो विश्लेषण किए गए नमूनों की संख्या में काफी वृद्धि करता है, परख रन टाइम को कम करता है, व्यक्तिगत स्लाइड जोड़तोड़ की संख्या, अभिकर्मक आवश्यकताओं और जैल को शारीरिक क्षति का जोखिम। इसके अलावा, स्लाइड के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास और अभिन्न शीतलन के कारण वैद्युतकणसंचलन टैंक के पदचिह्न में काफी कमी आई है। यहां धूमकेतु परख स्लाइड्स को ठंडा करने के लिए एक नया दृष्टिकोण भी बताया गया है, जो धूमकेतु जैल के जमने की सुविधा आसानी से और कुशलता से प्रदान करता है। यहां, प्रतिनिधि धूमकेतु परख विधियों के लिए इन उपकरणों के आवेदन का वर्णन किया गया है। ये सरल नवाचार धूमकेतु परख के उपयोग और अध्ययन के क्षेत्रों जैसे एक्सपोजर बायोलॉजी, इकोटॉक्सिकोलॉजी, बायोमॉनिटरिंग, विषाक्तता स्क्रीनिंग / परीक्षण के साथ-साथ रोगजनन को समझने के लिए इसके आवेदन का बहुत समर्थन करते हैं।

Introduction

कोशिकाओं को आंतरिक और बाहरी वातावरण से उत्पन्न होने वाले एजेंटों के लगातार संपर्क में लाया जाता है, जो डीएनए1,2 को नुकसान पहुंचा सकता है। यह क्षति असामान्य सेल फ़ंक्शन3 का कारण बन सकती है, और इसलिए डीएनए क्षति कई प्रमुख मानव रोगों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है, जैसे, कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, और उम्र बढ़ने4। धूमकेतु परख (जिसे एकल-सेल जेल वैद्युतकणसंचलन भी कहा जाता है) सेलुलर डीएनए क्षति का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तरीका है।

अपने सबसे सरलतम पर, क्षारीय धूमकेतु परख (एसीए) स्ट्रैंड ब्रेक (एसबी; एकल और डबल दोनों) का पता लगाता है, साथ ही एपुरिनिक / एपिरिमिडिनिक साइटों और क्षार-लेबिल साइटों (एएलएस) के साथ, जिनमें से दोनों क्षारीय परिस्थितियोंमें एकल-स्ट्रैंड ब्रेक बन जाते हैं। तटस्थ पीएच धूमकेतु परख फ्रैंक सिंगल- और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक6 का मूल्यांकन कर सकती है। इसके अलावा, एसीए, कई डीएनए मरम्मत एंजाइमों के संयोजन में, डीएनए क्षति के काफी प्रकार का पता लगा सकता है, उदाहरण के लिए, ऑक्सीकृत प्यूरीन (मानव 8-ऑक्सोगुआनिन डीएनए ग्लाइकोसिलेज 1; एचओजीजी 17 के उपयोग से पहचाना जाता है); ऑक्सीकृत पाइरिमिडाइन (एंडोन्यूक्लिज़ III का उपयोग करके; एंडोIII) और साइक्लोब्यूटेन पाइरिमिडीन डिमर (टी 4 एंडोन्यूक्लिज़ वी का उपयोग करके; T4endoV)8. धूमकेतु परख का उपयोग क्रॉसलिंकिंग एजेंटों द्वारा प्रेरित डीएनए घावों का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि सिस्प्लाटिन 9,10,11। जैसा कि परख के औपचारिक नाम, यानी, एकल सेल जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इंगित किया गया है, परख एकल सेल निलंबन होने के नाते विश्लेषण के तहत कोशिकाओं पर निर्भर करता है; आमतौर पर, ये सुसंस्कृत कोशिकाएं होती हैं लेकिन पूरे रक्त12,13 से अलग हो सकती हैं, या पूरे रक्त का उपयोग14,15 किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ठोस ऊतकों से एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न हो सकता है।

कुछ अपवादों के अलावा, विशेष रूप से एंगलवर्ड लैब16 से कॉमेटचिप रिपोर्ट, समग्र धूमकेतु परख प्रोटोकॉल मूल रूप से परख के आविष्कारकों (ओस्टलिंग और जोहानसन 17 और सिंह एट अल.18) द्वारा वर्णित से नाटकीय रूप से नहीं बदला है। धूमकेतु परख में कई चरण शामिल हैं (चित्रा 1)। इनमें से कई चरणों में पतले, सेल युक्त अगारोस जैल का स्थानांतरण शामिल है, एक समय में एक स्लाइड, और इसलिए, जेल के नुकसान या हानि का खतरा पैदा करता है, जिससे प्रयोग की सफलता खतरे में पड़ जाती है। नतीजतन, धूमकेतु परख समय लेने वाली हो सकती है, खासकर अगर बड़ी संख्या में स्लाइड चलाए जा रहे हैं। आमतौर पर, अधिकतम 40 स्लाइडएक बड़े (33 सेमी x 59 सेमी x 9 सेमी) वैद्युतकणसंचलन टैंक में चलाए जाते हैं, जो ठंडा करने के लिए गीली बर्फ युक्त एक और भी बड़ी ट्रे के भीतर बैठता है। हाल ही में यह बताया गया है कि लाइसिस चरण की अवधि को कम करके और19 को धुंधला करने से पहले स्लाइड्स को सुखाकर परख रनटाइम को 1 दिन तक छोटा किया जा सकता है।

वर्तमान लेखकों ने पहले उच्च थ्रूपुट क्षारीय धूमकेतु परख (एचटीपी एसीए) के लिए एक नया दृष्टिकोण बताया है, जिसमें कई (25 के बैच) धूमकेतु परख माइक्रोस्कोप स्लाइड को धूमकेतु परख प्रक्रिया20,21,22 में एक साथ हेरफेर किया जा सकता है। यह पेटेंट दृष्टिकोण माइक्रोस्कोप स्लाइड्स को व्यक्तिगत रूप से हेरफेर करने की आवश्यकता को हटाकर नमूना युक्त जैल को नुकसान या हानि के जोखिम को कम करता है और धूमकेतु परख के सभी रूपों पर लागू किया जा सकता है, जो माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करते हैं। स्लाइड युक्त रैक जोड़तोड़ के दौरान जैल की रक्षा करते हैं, और नतीजतन, नमूना प्रसंस्करण तेज और अधिक कुशल होता है। स्लाइड क्षैतिज, अभिविन्यास के बजाय ऊर्ध्वाधर में आयोजित रैक में वैद्युतकणसंचलन से भी गुजर सकते हैं। यह, और अभिन्न शीतलन, वैद्युतकणसंचलन टैंक के पदचिह्न को काफी कम कर देता है और गीली बर्फ की आवश्यकता को दूर करता है। एक साथ लिया गया, यह पारंपरिक प्रक्रिया पर एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। उपयोग किए गए उपकरण चित्र 2 में चित्रित किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल, इस नए दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, क्षार-लेबिल साइटों (एएलएस), डीएनए इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक्स (आईसीएल), और विभिन्न डीएनए मरम्मत एंजाइमों के सब्सट्रेट्स का पता लगाने के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं और पूरे रक्त14 के प्रतिनिधि अनुप्रयोग को प्रदर्शित करते हैं।

Protocol

वर्तमान अध्ययन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त के नमूनों का उपयोग किया गया था। हमारे संस्थान में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त के उपयोग के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी की आवश्यकता नहीं है।

1. धूमकेतु परख के लिए सामग्री की तैयारी

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड की तैयारी
    1. 50 एमएल ट्यूब में 1% (डब्ल्यू /वी) सामान्यपिघलनेबिंदु अगारोस [डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच 2 ओ)] में घोलें और डीडीएच2ओ में अगारोस को भंग करने के लिए माइक्रोवेव करें। यदि ठोसकरण होता है, तो त्याग दें और ताजा तैयार करें।
    2. प्री-कोट माइक्रोस्कोप स्लाइड्स को 50 एमएल ट्यूब में डुबोकर स्लाइड करता है जिसमें 1% (डब्ल्यू / वी) सामान्य पिघलने बिंदु होता है।
    3. स्लाइड्स को डुबोने के बाद स्लाइड्स के पिछले हिस्से को जल्दी से पोंछ लें।
      नोट: स्लाइड के पिछले हिस्से को ठीक से पोंछने में विफलता माइक्रोस्कोप द्वारा विश्लेषण चरण के दौरान स्लाइड्स के पृष्ठभूमि शोर को बढ़ाएगी।
    4. ठंढ वाले अनुभाग के निचले-दाएं कोने पर एक स्थायी मार्कर के साथ लेपित स्लाइड को लेबल करें (चित्रा 3 ए)। इससे पता चलता है कि स्लाइड के किस तरफ प्री-लेपित है।
    5. कमरे के तापमान पर रात भर अगारोस को सेट और सूखने दें।
    6. सूखे स्लाइड्स को टिशू पेपर में लपेटें और उन्हें एक बॉक्स में स्टोर करें।

2. नमूने की तैयारी

  1. सुसंस्कृत कोशिकाएं
    नोट: सबसे पहले, धूमकेतु परख शुरू करने से पहले हानिकारक एजेंट (ओं) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। उसके बाद, निम्न कार्य करें।
    1. यदि कोशिकाएं अनुगामी हैं, तो कोशिकाओं के उचित संयोजन पर सेल कल्चर फ्लास्क या सेल कल्चर पेट्री डिश से उन्हें छोड़ने के लिए कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। सीरम युक्त मीडिया जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
    2. कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेंट्रीफ्यूज (उदाहरण के लिए, हेकैट के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज), धीरे से सतह पर तैरने वाला हटा दें, और सेल गोली में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें।
    3. सेल गिनती करें।
    4. 30,000 कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 7,607 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
    5. धीरे से सतह पर तैरने वाले को हटा दें और धूमकेतु परख करने से पहले अंधेरे में बर्फ पर सेल पेलेट स्टोर करें।
      नोट: धूमकेतु परख करने से पहले कोशिकाओं को नियमित रूप से माइकोप्लाज़्मा संदूषण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, ताकि अन्य प्रभावों के अलावा, कलात्मक डीएनए क्षति के गठन और परिवर्तित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया को रोका जा सके, जैसा कि कहीं और बताया गयाहै। उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर, आवश्यकतानुसार सेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों को बदला जा सकता है।
  2. मरम्मत परख के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं की तैयारी
    1. सेल कल्चर फ्लास्क या पेट्री व्यंजन में संस्कृति कोशिकाएं।
    2. कोशिकाओं को हानिकारक एजेंटों (उदाहरण के लिए, बीई-एम 17 कोशिकाओं के लिए,20मिनट के लिए एच 2ओ 2 के 50 μM के साथ इलाज करने से पहले कोशिकाओं को पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धोएं ताकि उपचार के दौरान मरम्मत को रोका जा सके।
    3. किसी भी अवशिष्ट हानिकारक एजेंटों को हटाने के लिए कोशिकाओं को पीबीएस के 1 एमएल के साथ धीरे से धोएं।
    4. सेल कल्चर माध्यम को फिर से पेश करें और कोशिकाओं को एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में अलग-अलग अवधि (जैसे, 0 मिनट, 30 मिनट, 2 घंटे, 6 घंटे, 24 घंटे और 30 घंटे) के लिए मरम्मत करने की अनुमति दें।
    5. प्रत्येक समय बिंदु पर, 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त सेल कल्चर माध्यम में 30,000 कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. धूमकेतु परख करने से पहले, पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को जल्दी से पिघलाएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,607 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और परख करने से पहले सेल पेलेट को बर्फ पर स्टोर करें (यानी, चरण 3 से)।
  3. पूरे रक्त की तैयारी
    नोट: निम्नलिखित विधि से लाभ होता है (i) रक्त का नमूना प्राप्त करने के लिए न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण होने से लाभ होता है, (ii) धूमकेतु परख से पहले पीबीएमसी के अलगाव की आवश्यकता नहीं होती है, और (iii) रक्त के नमूनों (250 μL < मात्रा के साथ) को 1 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की अनुमति देता है (हालांकि हाल के सबूत बताते हैं कि लंबे समय तक भंडारण संभव है), क्रायोप्रिजर्वेटिव की आवश्यकता के बिना, और बिना किसी जोखिम या कलात्मक क्षति गठनके साथ। रोगियों या जानवरों से रक्त के नमूने प्राप्त करने से पहले नैतिक अनुमोदन, या समकक्ष की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त के नमूनों का उपयोग वर्तमान अध्ययन में किया जा सकता है। हमारे संस्थान में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त के उपयोग के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी की आवश्यकता नहीं है।
    1. पिपेट का उपयोग करके, पूरे रक्त के नमूने (<250 μL) (सामग्री की तालिका) को एक संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.4 मिलीग्राम ईडीटीए (प्रति 250 μL रक्त) युक्त न्यूनतम मात्रा होती है।
    2. एचटीपी धूमकेतु परख करने से पहले रक्त के नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    3. गर्म किए बिना कमरे के तापमान पर रक्त के नमूने (<250 μL) संग्रहीत करें।
    4. धूमकेतु परख करने से पहले पूरे रक्त के 5 μL को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें (चरण 3 देखें)।

3. सेल लाइसिस

नोट: बर्फ पर सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें।

  1. प्रति जेल 12,000 कोशिकाओं या पूरे रक्त के 2.5 μL का उपयोग करें।
  2. माइक्रोवेव का उपयोग करके पीबीएस में घुलने वाले 0.6% (डब्ल्यू / वी) कम पिघलने बिंदु तैयार करें, और इसे जमने से रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
  3. एक स्थायी मार्कर या पेंसिल का उपयोग करके अन्वेषक के नाम, तिथि और उपचार की जानकारी के साथ पूर्व-लेपित स्लाइड के ठंढे छोर को लेबल करें।
  4. एक सपाट बेंच पर एक चिलिंग प्लेट रखें और धातु की सतह के नीचे स्लाइडिंग दराज में दो जमे हुए शीतलन पैक डालें (जैसा कि चित्र 4)21 में दिखाया गया है।
  5. चिलिंग प्लेट पर स्लाइड रखें और स्लाइड्स को 0.6% (डब्ल्यू / वी) कम पिघलने बिंदु अगारोस युक्त कोशिकाओं (चरण 3.7) को जोड़ने से पहले 1-2 मिनट के लिए प्री-चिल करने दें।
    नोट: चिलिंग प्लेट पर स्लाइड्स को 1-2 मिनट से अधिक समय तक छोड़ने से परिवेश आर्द्रता के कारण स्लाइड सतह पर संक्षेपण बन सकता है। यह स्लाइड्स पर कम पिघलने बिंदु अगारोस जैल को कम स्थिर बना सकता है।
  6. भंवर द्वारा गोली (चरण 2.2.7) को फैलाएं। सुनिश्चित करें कि सभी सतह पर तैरने वाले को गोली से हटा दिया गया है। नमूना ट्यूबों (छर्रों वाली कोशिकाओं से युक्त) को तुरंत बर्फ पर वापस रखें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूज में नमूना युक्त ट्यूबों को रखते समय, उन्हें बाहर की ओर हिंज के साथ रखें ताकि गोली ट्यूब के इस तरफ एकत्र हो जाए। कभी-कभी गोली को देखना मुश्किल होता है, और सतह पर तैरने वाले को हटाते समय इसे हटाना आसान होता है। इस अभिविन्यास में ट्यूब ढक्कन के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग से यह पता चल जाएगा कि सेल पेलेट कहां होगा।
  7. सेल पेलेट को 0.6% कम पिघलने बिंदु अगारोस (एलएमपी अगारोस) के 200 μL के साथ पुन: निलंबित करें और बुलबुले बनाए बिना ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। इसके बाद, जल्दी से एक ठंडी स्लाइड पर एलएमपी अगारोस युक्त कोशिकाओं के 80 μL स्थानांतरित करें और जल्दी से जेल पर एक कवरस्लिप रखें।
  8. जेल को 1-2 मिनट के लिए चिलिंग प्लेट पर सेट होने दें।
  9. इस बीच, लाइसिस बफर (तालिका 1) का 500 एमएल काम करने वाला समाधान तैयार करें और इसे लाइसिस डिश (चित्रा 2) में डालें।
  10. एक बार जैल सेट हो जाने के बाद, अंगूठे और फोरफिंगर के बीच धीरे से स्लाइड को पकड़कर और जेल से कवरस्लिप को स्लाइड करके कवरलिप को जल्दी से हटा दें।
  11. स्लाइड वाहक के अंदर नमूने वाले स्लाइड रखें (स्लाइड पर सभी काले "डॉट" निशान एक वाहक में रखे जाने पर एक ही दिशा में होना चाहिए) (चित्रा 3 बी), और फिर स्लाइड वाहक को लाइसिस डिश (चित्रा 2) के अंदर रखें।
  12. लाइसिस डिश के ढक्कन को बंद करें और लाइसिस डिश को कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस या 30 मिनट पर रात भर फ्रिज में रखें, जो भी ऑपरेटर के समय अनुसूची19 के लिए सबसे अच्छा हो।

4. वैद्युतकणसंचलन

  1. लाइसिस डिश से स्लाइड वाहक को सावधानीपूर्वक हटा दें। जैल को परेशान न करें इसका ध्यान रखें।
  2. धीरे से स्लाइड वाहक को बर्फ-ठंडे डीडीएच2ओ के साथ पहले से लोड किए गए वॉशिंग डिश में रखें और इसे 30 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि स्लाइड पूरी तरह से डीडीएच2ओ के साथ कवर किए गए हैं।
  3. इष्टतम बफर तापमान बनाए रखने के लिए वैद्युतकणसंचलन टैंक के तहत स्लाइडिंग दराज के अंदर एक जमे हुए शीतलन पैक डालें।
  4. वैद्युतकणसंचलन टैंक में बर्फ-ठंडा वैद्युतकणसंचलन कार्य समाधान (तालिका 1) को सावधानीपूर्वक जोड़ें और स्लाइड वाहक को वैद्युतकणसंचलन टैंक में स्थानांतरित करें। स्लाइडों को इस तरह उन्मुख करें कि सेल युक्त जैल के साथ उनके स्पष्ट भाग (यानी, ठंढ / लेबलिंग छोर नहीं) कैथोड (लाल इलेक्ट्रोड) की ओर इशारा करते हैं।
  5. स्लाइड्स को वैद्युतकणसंचलन टैंक में 20 मिनट के लिए बैठने दें ताकि डीएनए आराम करे और आराम करे। इस चरण के दौरान बिजली की आपूर्ति बंद रखें।
  6. यदि आवश्यक हो, तो शीतलन को अधिकतम करने के लिए एक नया जमे हुए शीतलन पैक डालें।
  7. 1.19 वी / सेमी पर 20 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन करें, या जो भी स्थितियां अनुकूलित की गई हैं।
    नोट: वैद्युतकणसंचलन चलने की स्थिति और बफर की मात्रा का अनुकूलन प्रत्येक प्रयोगशालाके लिए अनुशंसित है। वैद्युतकणसंचलन के दौरान केवल एक स्लाइड वाहक का उपयोग करने से वैद्युतकणसंचलन बफर के प्रतिरोध पर स्लाइड का कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, और स्लाइड की संख्या बदलने पर लेखकों ने वोल्टेज या धारा में महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं देखा।
  8. बिजली की आपूर्ति बंद करें, वैद्युतकणसंचलन टैंक से स्लाइड वाहक को सावधानीपूर्वक हटा दें, और इसे 30 सेकंड के लिए टिशू पेपर पर निकालने की अनुमति दें।
  9. स्लाइड वाहक को न्यूट्रलाइजेशन बफर वाले डिश में रखें (तालिका 1)। इसे 20 मिनट के लिए छोड़ दें।
  10. न्यूट्रलाइजेशन डिश से स्लाइड वाहक को निकालें, इसे बर्फ-ठंडा डीडीएच 2 ओ युक्तधोनेवाले पकवान में रखें, और इसे 20 मिनट के लिए छोड़ दें।
  11. स्लाइड वाहक को पानी से निकालें और स्लाइड को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सूखने दें, या रात भर कमरे के तापमान पर, या ऑपरेटर के शेड्यूल19 के आधार पर सूखें नहीं।
    नोट: यदि चरण 4.11 में कोई सुखाने नहीं है, तो 5.2 से धुंधला चरण निष्पादित करें।

5. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला

  1. स्लाइड वाहक को बर्फ-ठंडा ddH2O युक्त वाशिंग डिश में स्थानांतरित करें ताकि स्लाइड को फिर से हाइड्रेट किया जा सके और 30 मिनट के लिए छोड़ दिया जा सके।
  2. स्लाइड वाहक को एक धुंधला डिश में रखें जिसमें 2.5 μg / mL प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान होता है।
    नोट: प्रोपिडियम आयोडाइड प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए इसे अंधेरे क्षेत्र में संभालें। यह विषाक्त भी है।
  3. धुंधला पकवान का ढक्कन बंद करें और इसे कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. स्लाइड वाहक को एक अलग डिश में स्थानांतरित करें, और इसे20मिनट के लिए बर्फ-ठंडा डीडीएच 2 ओ के साथ धो लें।
  5. डिश से स्लाइड वाहक को हटा दें और ऑपरेटर के शेड्यूल या वरीयता के आधार पर इसे अंधेरे में पूरी तरह से सुखाएं, या तो 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में या कमरे के तापमान पर।
  6. एक बार स्लाइड पूरी तरह से सूख जाने के बाद, उन्हें स्लाइड वाहक से हटा दें और छवि विश्लेषण के लिए तैयार होने तक अंधेरे में स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: स्लाइड अनिश्चित काल तक पठनीय रहेंगी और यदि आवश्यक हो तो उन्हें फिर से दाग दिया जा सकता है।

6. एंजाइम-संशोधित क्षारीय धूमकेतु परख

नोट: एंजाइम-संशोधित क्षारीय धूमकेतु परख लाइसिस के बाद लेकिन वैद्युतकणसंचलन से पहले एक एंजाइम उपचार चरण को नियोजित करता है। एंजाइम की गतिविधि उन साइटों पर डीएनए में टूटने का कारण बनती है जो एंजाइम के लिए सब्सट्रेट हैं। इस परख को करने से पहले, एंजाइम एकाग्रता और एंजाइम इनक्यूबेशन की अवधि को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. सेल लाइसिस (चरण 3) के बाद, स्लाइड को20मिनट के लिए बर्फ-ठंडे ddH 2 O के साथ दो बार धोएं।
  2. स्लाइड वाहक को पानी से निकालें और स्लाइड को पेपर तौलिए के साथ पंक्तिबद्ध ट्रे में स्थानांतरित करें।
  3. अनुकूलित सांद्रता पर एंजाइम के 80 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, बीई-एम 17 कोशिकाओं के लिए एचओजीजी 1 का 3.2 यू / एमएल, एंजाइम प्रतिक्रिया बफर में पतला) और जेल युक्त नमूने पर एंजाइम फैलाने के लिए एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
  4. अनुकूलित अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, एचओजीजी 1 के लिए 45 मिनट)।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, कवरलिप्स को धीरे से हटा दें और स्लाइड को वाहक में स्थानांतरित करें।
    नोट: एंजाइम उपचार के बाद स्लाइड्स को न धोएं; चरण 4.3 से सीधे वैद्युतकणसंचलन करें।

7. डीएनए इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक्स (आईसीएल) -संशोधित क्षारीय धूमकेतु परख

नोट: आईसीएल-एसीए के इस संस्करण की अवधारणा यह है कि डीएनए में आईसीएल की उपस्थिति क्षतिग्रस्त डीएनए के इलेक्ट्रोफोरेटिक माइग्रेशन को मंद कर देगी, जो ऑक्सीडेटिव रूप से उत्पन्न अपमान के संपर्क में आने के बाद प्रेरित होगी। इस उदाहरण में, धूमकेतु की पूंछ जितनी छोटी होगी, आईसीएल की संख्याउतनी ही अधिक होगी 25,26,27,28 होगी।

  1. कोशिकाओं को एक अभिकर्मक के साथ इलाज करें जो आईसीएल को प्रेरित करता है (उदाहरण के लिए, सिस्प्लैटिन; पूरक फ़ाइल देखें)।
  2. उपचारित कोशिकाओं को निम्नलिखित एजेंटों में से एक के साथ उजागर करें ताकि उपयुक्त आकार की धूमकेतु पूंछ (~ 20% पूंछ डीएनए) बनाने के लिए पर्याप्त स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित किया जा सके: हाइड्रोजन पेरोक्साइड (30 मिनट के लिए 50 μMH2 O 2), आयनकारी विकिरण (2-5 GY), या पराबैंगनी B (UVB) (0.5 J / cm2)।
  3. इसके अतिरिक्त, चरण 7.2 (यानी, आईसीएल-उत्प्रेरण एजेंट के साथ कोई उपचार नहीं) में उपयोग किए जाने वाले समान एजेंट और खुराक के साथ कोशिकाओं के एक बैच का इलाज करके एक स्ट्रैंड ब्रेक पॉजिटिव कंट्रोल का उत्पादन करें।
  4. 5 मिनट के लिए 7,607 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, सेल पेलेट को 1 एमएल पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और क्षारीय धूमकेतु परख (चरण 3-5) के लिए प्रक्रिया करें।
  5. नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करके डीएनए इंटर-स्ट्रैंड क्रॉस-लिंकिंग के स्तर की गणना करें।
    Equation 1
    नोट: एमओटीएम (मीन ओलिव टेल मोमेंट) आईसीएल-संशोधित धूमकेतु परख का वर्णन करते समय व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला धूमकेतु परख समापन बिंदु है, और इसे पूंछ की लंबाई और पूंछ में कुल डीएनए के अंश के रूप में परिभाषित किया गया है (यानी, पूंछ क्षण = पूंछ की लंबाई x पूंछ में डीएनए का %) 29; टीएमडीआई: क्रॉसलिंकिंग एजेंट और एच2ओ2 (या अन्य स्ट्रैंड ब्रेकर इंड्यूसर) दोनों के साथ इलाज किए गए नमूनों का पूंछ क्षण; TMcu: नमूनों के पूंछ का क्षण एक क्रॉसलिंकिंग एजेंट के साथ इलाज नहीं किया गया और H2 O 2(कोई उपचार नहीं) के साथ इलाज नहीं कियागया , और TMCI: नमूनों के पूंछ क्षण को क्रॉसलिंकिंग एजेंट के साथ इलाज नहीं किया गया, लेकिन H2 O 2के साथ इलाज कियागया।

8. धूमकेतु स्कोरिंग और डेटा विश्लेषण

नोट: "धूमकेतु" शब्द क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की छवियों से उत्पन्न होता है जब परख किए जाने के बाद माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है (चित्रा 5)। वैद्युतकणसंचलन स्थितियों के तहत, क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में डीएनए बड़े पैमाने पर पलायन नहीं करता है, लेकिन धूमकेतु "सिर" नामक एक स्फेरॉइड में रहता है। हालांकि, स्ट्रैंड ब्रेक की उपस्थिति कोशिका के डीएनए को सिर से बाहर माइग्रेट करने और एक "पूंछ" बनाने की अनुमति देती है, इस प्रकार धूमकेतु की तरह दिखाई देती है (चित्रा 5)। पूंछ में जितना अधिक डीएनए होता है, उतना ही अधिक नुकसान मौजूद होता है।

  1. पीआई (लाल) फिल्टर (5 = 536/617 एनएम) और धूमकेतु परख स्कोरिंग सॉफ्टवेयर के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चालू करें।
  2. जेल में पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पानी की एक बूंद जोड़ें और कवरस्लिप के साथ कवर करें।
  3. स्लाइड्स को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में रखें और धूमकेतु को "स्कोर" करें।
    नोट: स्कोरिंग एक साधन है जिसके द्वारा धूमकेतु का मूल्यांकन किया जाता है, ताकि प्रत्येक धूमकेतु में मौजूद क्षति की मात्रा निर्धारित की जा सके। मोटे तौर पर, यह उपयोगकर्ता की चुनी हुई वरीयता के अनुसार दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, या तो आंख से (शून्य से चार के पैमाने पर धूमकेतु के आकार का अनुमान लगाना) या स्वतंत्र रूप से उपयोग करके, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर30। आम तौर पर, दोनों दृष्टिकोण धूमकेतु पूंछ के आकार का आकलन करते हैं, हालांकि धूमकेतु से संबंधित समापन बिंदुओं की एक किस्म निर्धारित की जा सकती है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय, धूमकेतु के सिर के मध्य पर क्लिक करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से धूमकेतु का पता नहीं लगाता है, और फिर चुने हुए समापन बिंदु का आकलन करता है (चित्रा 5)।
  4. प्रति जेल 50 धूमकेतु और प्रति नमूना 100 धूमकेतु स्कोर करें (यानी, प्रत्येक नमूना विभिन्न डीएनए हानिकारक उपचारों, या उनकी प्रतिकृति के अनुरूप)।
  5. प्रयोगों (n = 2) को दोहराएँ या प्रयोगों को तीन प्रतियों (n = 3) करें।
    नोट: यदि केवल एन = 2 प्रतिकृति प्रयोग किए जाते हैं, तो सांख्यिकीय विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, लेकिन यदि एन = 3 है, तो डी'एगोस्टिनो सामान्यता परीक्षण करें। अधिकांश धूमकेतु परख डेटा एक सामान्य परीक्षण पास नहीं करता है। इस मामले में, एक गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग करें (डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण, और मैन-व्हिटनी परीक्षण पी < 0.05 पर निर्धारित महत्व का परीक्षण करता है)।

Representative Results

एचटीपी एसीए के लिए वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज का अनुकूलन
मानव केराटिनोसाइट्स (एचसीएटी; सामग्री की तालिका) पराबैंगनी ए विकिरण (यूवीए) (5 या 10 जे / सेमी 2) की विभिन्न खुराक के साथ विकिरणित कियागया था; चित्रा 6 ए), यूवीबी (0.5 या 1 जे / सेमी2; चित्रा 6 बी), या क्षति को प्रेरित करने के लिए 50 μM H2O2 (चित्रा 6C) के साथ इलाज किया जाता है। वैद्युतकणसंचलन के लिए इष्टतम वोल्टेज निर्धारित करने के लिए वैद्युतकणसंचलन के तीन अलग-अलग वोल्टेज का परीक्षण किया गया था। सभी तीन डीएनए हानिकारक उपचारों के परिणामों से पता चला है कि, जबकि सभी वोल्टेज ने रैखिक खुराक-प्रतिक्रियाएं उत्पन्न कीं, सबसे संवेदनशील प्रतिक्रिया 1.19 वी / सेमी के साथ प्राप्त की गई थी। 1 V/cm और 1.09 V/cm (चित्रा 6A-C) की तुलना में वैद्युतकणसंचलन के दौरान 1.19 V/cm का उपयोग करके HACATs ने उच्चतम बेसलाइन डीएनए क्षति दिखाई। इसके अलावा, 1.19 वी / सेमी का उपयोग करके, सभी हानिकारक उपचारों (चित्रा 6)31) के बाद सबसे बड़ा % पूंछ डीएनए देखा जाता है।

एफपीजी संशोधित एचटीपी एसीए का उपयोग करके मानव पूरे रक्त में डीएनए क्षति का पता लगाना
मानव व्हूल्ड रक्त (सामग्री की तालिका) को क्षति को प्रेरित करने के लिए 10 जे / सेमी2 यूवीए की विभिन्न खुराक के साथ विकिरणित किया गया था। एचटीपी एसीए में एंजाइम उपचार के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एफपीजी (1, 2, 4 या 8 यू / एमएल) की चार अलग-अलग सांद्रता का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि डीएनए क्षति के इष्टतम स्तर 4 यू / एमएल एफपीजी (चित्रा 7 ए) के साथ सामने आए थे। यूवीए विकिरणित रक्त नमूनों से प्रतिनिधि धूमकेतु छवियां (चित्रा 7 बी)।

आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए का उपयोग करके एक प्रतिनिधि डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन में डीएनए आईसीएल का पता लगाना
एक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन (SKOV-3; सामग्री की तालिका) बर्फ पर 30 मिनट के लिए 200 μM सिस्प्लाटिन और / या बाद के उपचार के साथ 50 μM H2O2 के संयोजन के साथ इलाज किया गया था। अनएक्सपोज़्ड कोशिकाओं (चित्रा 8 ए) में कोई सराहनीय क्षति नहीं देखी गई थी। अकेले एच2ओ2 के संपर्क में आने से एक महत्वपूर्ण एमओटीएम उत्पन्न हुआ (चित्रा 8 बी)। इसके विपरीत, जिन कोशिकाओं में आईसीएल को प्रेरित किया गया था, उनमें एमओटीएम (चित्रा 8 सी) 28 में कमी देखी गई।

एक प्रतिनिधि, डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन में सिस्प्लैटिन-प्रेरित डीएनए आईसीएल का गठन और मरम्मत
आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए का उपयोग डीएनए आईसीएल गठन और डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन (ए 2780) में सिस्प्लाटिन द्वारा प्रेरित मरम्मत के लिए समय पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए किया गया था। सामग्री की तालिका)। कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 100 μM सिस्प्लाटिन के साथ इलाज किया गया था, और फिर सिस्प्लाटिन-मुक्त मीडिया (RPMI 1640 माध्यम को 10% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) के साथ पूरक किया गया था। विभिन्न समय बिंदुओं पर, आईसीएल के स्तर को स्थापित करने के लिए आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए किया गया था (चित्रा 9)28)। सिस्प्लैटिन उपचार से पहले कोई आईसीएल का पता नहीं चला था। हालांकि, 100 μM सिस्प्लाटिन के साथ एकल उपचार के बाद, आईसीएल का स्तर काफी बढ़ गया, 12 घंटे पर चरम पर पहुंच गया, जिसके बाद स्तर 30 घंटे के बाद शून्य हो गया।

डीएनए आईसीएल और डीएनए प्लैटिनम स्तरों के बीच सहसंबंध
आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए और प्रेरक रूप से युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस; विवरण के लिए पूरक फ़ाइल देखें) द्वारा विश्लेषण से पहले डीएनए-आईसीएल के विभिन्न स्तरों को प्रेरित करने के लिए तीन डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का 100 μM सिस्प्लाटिन के साथ इलाज किया गया था। जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है, डीएनए-आईसीएल के विभिन्न स्तरों को तीन सेल लाइनों में प्रेरित किया गया था, साथ ही डीएनए में पीटी के अलग-अलग स्तर भी थे। डीएनए आईसीएल स्तरों और प्लैटिनम सांद्रता के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध(आर 2 = 0.9235) देखा गया, जो डीएनए प्लैटिनम स्तरों और संबंधित आईसीएल28 के बीच संबंध को दर्शाता है।

माइकोप्लाज्मा-संक्रमित और असंक्रमित बीई-एम 17 कोशिकाओं में बेस एक्सिशन मरम्मत
माइकोप्लाज्मा संक्रमित और असंक्रमित बीई-एम 17 कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 50 μM H2O2 के साथ इलाज किया गया और विभिन्न अवधि (0 मिनट, 30 मिनट, 1 घंटे, 2 घंटे, 2 घंटे, या 30 घंटे) के लिए पूर्ण माध्यम (डुलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम को 10% (v/v) FBS के साथ पूरक) के साथ इनक्यूबेट किया गया, जिसके दौरान कोशिकाओं को मरम्मत करने की अनुमति दी गई। प्रत्येक समय बिंदु पर, कोशिकाओं को एचओजीजी 1-संशोधित एचटीपी एसीए (चरण 6) करने से पहले, 10% डीएमएसओ युक्त माध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र और जमे हुए थे। 30 मिनट के बाद, असंक्रमित कोशिकाओं में एसबी / एएलएस का स्तर 21% टीडी (प्रतिशत पूंछ डीएनए) तक कम हो गया था, जबकि संक्रमित कोशिकाओं ने 49% टीडी दिखाया (चित्रा 11 ए)। ~ 15 घंटे के बाद, एसबी / एएलएस का स्तर संक्रमित और असंक्रमित दोनों कोशिकाओं में बेसलाइन पर लौट आया था। ऑक्सीकृत प्यूरीन के लिए, असंक्रमित बीई-एम 17 ने शुरू में 30 घंटे के भीतर बेसलाइन पर लौटने से पहले क्षति में थोड़ी वृद्धि दिखाई (चित्रा 11 बी)। इसके विपरीत, संक्रमित कोशिकाओं ने ऑक्सीकृत प्यूरीन में एक निरंतर, महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, जो ऊंचा रहा, और 30 घंटे (चित्रा 11 बी) 23 के बाद भी बेसलाइन स्तरों पर वापस नहीं आया।

Figure 1
चित्र 1: पारंपरिक क्षारीय धूमकेतु परख प्रक्रिया का अवलोकन। (i) सुसंस्कृत कोशिकाओं के एकल-कोशिका निलंबन या पूरे रक्त के नमूने को 0.6% (w/v) LMP Agarose के साथ मिलाया जाता है। (ii) सेल/अगारोस मिश्रण को पूर्व-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर लगाया जाता है और ठोस होने तक कवरस्लिप के साथ कवर किया जाता है। (iii) कोशिकाओं को रात भर एक उच्च पीएच लाइसिस बफर का उपयोग करके, न्यूक्लियोइड बॉडी का निर्माण करने से पहले, (iv) डीडीएच2ओ के साथ धोने से पहले अलग किया जाता है। स्ट्रैंड ब्रेक की उपस्थिति डीएनए को आराम करने और आराम करने की अनुमति देती है, और वैद्युतकणसंचलन के तहत, डीएनए को न्यूक्लियोइड शरीर से बाहर निकाला जाता है, जिससे एक पूंछ बनती है। स्लाइडों को फिर (vi) सूखा, सुखाया जाता है, (vii) बेअसर किया जाता है, और (viii) रात भर सुखाए जाने से पहले ddH2O के साथ धोया जाता है। स्लाइड्स को तब (x) ddH2O के साथ पुनर्जलीकृत किया जाता है, (xi) दाग, (xii) धोया जाता है, और अंत में (xiii) स्कोर और विश्लेषण किया जाता है, आमतौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सामग्री जिसमें उच्च-थ्रूपुट धूमकेतु वैद्युतकणसंचलन प्रणाली शामिल है। एचटीपी वैद्युतकणसंचलन टैंक, एचटीपी रैक, और लाइसिस, धोने, बेअसर करने और धुंधला करने के लिए व्यंजन दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: धूमकेतु परख स्लाइड और एचटीपी रैक (माइक्रोस्कोप स्लाइड वाहक) की प्रतिनिधि छवियां। (ए) सही अभिविन्यास के लिए, माइक्रोस्कोप स्लाइड के पूर्व-लेपित चेहरे को माइक्रोस्कोप स्लाइड के दाहिने कोने में एक काले बिंदु द्वारा पहचाना जाता है। (बी) एचटीपी रैक की छवि दिखाती है कि कैसे स्लाइड्स को एक तंग ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में रखा जाता है, जिसमें वैद्युतकणसंचलन टैंक के भीतर अपने अभिविन्यास को ठीक करने के लिए वाहक पर टैब होते हैं। प्रत्येक वाहक 25 स्लाइड्स तक समायोजित कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: नमूना स्लाइड और फ्रीजर पैक के साथ चिलिंग प्लेट का प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: स्कोरिंग के दौरान लिए गए प्रतिनिधि धूमकेतु का स्क्रीनशॉट। एच.टी.पी.ए.टी.(ए) बिना उपचार के और (बी) एचटीपी एसीए करने से पहले 1 जे/सेमी2 यूवीबी के साथ इलाज किया जाता है। अधिकांश सॉफ्टवेयर पैकेज विभिन्न प्रकार के धूमकेतु समापन बिंदुओं की गणना कर सकते हैं, लेकिन सबसे आम इन छवियों के आधार पर % पूंछ डीएनए (पसंदीदा) या पूंछ क्षण हैं (नीला: सिर की शुरुआत, हरा: सिर का मध्य, और बैंगनी: पूंछ का अंत)। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एचटीपी एसीए का उपयोग करके निर्धारित प्रतिशत पूंछ डीएनए पर वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज के प्रभाव को दर्शाने वाले प्रतिनिधि ग्राफ। कोशिकाओं को एचटीपी एसीए से पहले (ए) 5 या 10 जे / सेमी2 यूवीए, (बी) 0.5 या 1.0 जे / सेमी2 यूवीबी, या (सी) 50 μM H2O 2 के संपर्क में लायागया था, जिसमें वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज 1, 1.09, या 1.19 वी / सेमी था। डेटा एन = 2 डुप्लिकेट प्रयोगों 31 से 200निर्धारणों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एफपीजी संशोधित एचटीपी एसीए द्वारा विश्लेषण किए गए मानव रक्त के प्रतिनिधि ग्राफ और धूमकेतु चित्र। मानव रक्त के नमूनों को लाइसिस चरण से पहले बर्फ पर 10 जे / सेमी2 यूवीए या शाम विकिरणित ('सीटीआरएल') के साथ विकिरणित किया गया था। वैद्युतकणसंचलन से पहले एंजाइम उपचार के लिए एफपीजी (1, 2, 4, या 8 यू / एमएल) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया गया था। (ए) डेटा एन = 3 प्रयोगों से 300 निर्धारणों के एसईएम ± औसत का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) 10 जे / सेमी2 यूवीए विकिरणित रक्त नमूनों में एफपीजी की प्रत्येक एकाग्रता के लिए धूमकेतु की प्रतिनिधि छवियां। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: सिस्प्लैटिन उपचार के बाद आईसीएल का पता लगाने वाली प्रतिनिधि धूमकेतु छवियां। (ए) बिना किसी उपचार के कोशिकाओं को नियंत्रित करना, (बी) कोशिकाएं जिन्हें केवल एच2ओ2 (50 μM) के साथ इलाज किया गया था, (C) कोशिकाएं जिन्हें H2O2 (50 μM) और सिस्प्लाटिन (200 μM) के साथ इलाज किया गया था, जो आईसीएल28 की उपस्थिति के कारण पूंछ को (B) से छोटा दर्शाता है। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: सिस्प्लैटिन-प्रेरित आईसीएल गठन और मरम्मत के कैनेटीक्स का प्रदर्शन। ए 2780 कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए संस्कृति माध्यम में सिस्प्लाटिन के 100 μM के साथ इलाज किया गया था। सिस्प्लाटिन युक्त माध्यम को तब हटा दिया गया था, और आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए द्वारा विश्लेषण से पहले कोशिकाओं को विभिन्न समय बिंदुओं के लिए सुसंस्कृत किया गया था। डेटा एन = 3 प्रयोगों28 से एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: डीएनए आईसीएल और प्लैटिनम एकाग्रता के बीच सहसंबंध। डीएनए आईसीएल को आईसीएल-संशोधित एचटीपी एसीए द्वारा निर्धारित किया गया था और प्लैटिनम स्तर को आईसीपी-एमएस (सिंगल क्वाड-काइनेटिक एनर्जी डिस्क्रिमिनेशन, एसक्यू-केईडी के साथ) द्वारा तीन डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों में मापा गया था। R2 = 0.9235 डीएनए28 में प्लैटिनम स्तरों को निर्धारित करने के लिए आईसीपी-एमएस पद्धति के लिए पूरक फाइल देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11: माइकोप्लाज्मा संक्रमित बनाम असंक्रमित बीई-एम 17 कोशिकाओं में एचओजीजी 1-संशोधित धूमकेतु परख द्वारा निर्धारित डीएनए क्षति और मरम्मत को दर्शाने वाला एक प्रतिनिधि ग्राफ। 30 मिनट के लिए 50 μM H2O2 के साथ उपचार के बाद, कोशिकाओं को विभिन्न अवधि (0, 30 मिनट, 1 घंटे, 2 घंटे, 6 घंटे, 24 घंटे, या 30 घंटे) के लिए मरम्मत करने की अनुमति दी गई थी। एचओजीजी 1-संशोधित एचटीपी एसीए का उपयोग संक्रमित (लाल डेटा बिंदु) और असंक्रमित (काले डेटा बिंदु) बीई-एम 17 कोशिकाओं में (ए) एसबी / एएलएस और (बी) ऑक्सीकृत प्यूरीन को मापने के लिए किया गया था। डेटा एन = 2 डुप्लिकेट प्रयोगों से 200 निर्धारणों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन23 की अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक समाधान कार्य समाधान
लाइसिस बफर 100 mM Na2EDTA, 2.5 M NaCl, और ddH2O में 10 mM Tris बेस; 10 M NaOH के साथ pH को 10 में समायोजित करें लाइसिस स्टॉक समाधान में 1% ट्राइटन एक्स -100
वैद्युतकणसंचलन बफर 10 M NaOH और 200 mM Na2EDTA ddH2O में 300 mM NaOH और 1 mM Na2EDTA; पीएच > 13
न्यूट्रलाइजेशन बफर 0.4 डीडीएच2ओ में एम ट्रिस बेस; HCl के साथ pH को 7.5 में समायोजित करें
धुंधला बफर 1 मिलीग्राम / एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड 2.5 μg/mL प्रोपिडियम आयोडाइड ddH2O में

तालिका 1: एचटीपी एसीए में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की संरचना। लाइसिस, वैद्युतकणसंचलन, न्यूट्रलाइजेशन और स्टेनिंग बफर के स्टॉक और कामकाजी सांद्रता को दिखाया गया है।

अनुपूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन वर्तमान उपकरणों द्वारा प्रदान की गई बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है, जिसका उपयोग धूमकेतु परख के विभिन्न प्रतिनिधि, सामान्य रूपों (यानी, क्षारीय, एंजाइम-संशोधित, रक्त, और आईसीएल, और अन्य वेरिएंट भी उपयुक्त होंगे) के साथ उच्च थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान दृष्टिकोण अपने साथ कई लाभ लाता है20,21: (ए) समानांतर में कई स्लाइडों के हेरफेर के कारण परख रन टाइम कम हो जाता है (हैंडलिंग समय 60% तक कम हो जाता है); (बी) जैल को नुकसान का जोखिम, और इसलिए प्रयोग के लिए जोखिम कम हो जाता है; (ग) अभिकर्मक आवश्यकताओं में कमी आई है (उदाहरण के लिए, वैद्युतकणसंचलन टैंक की मात्रा पारंपरिक टैंक की तुलना में छोटी है); (घ) रन किए गए स्लाइडों की संख्या में वृद्धि की गई है। एक टैंक एकल पारंपरिक टैंक की तुलना में चलने वाली स्लाइडों की संख्या में 20% की वृद्धि प्रदान कर सकता है; हालांकि, एक ही बिजली की आपूर्ति के समानांतर कई वैद्युतकणसंचलन टैंकों को चलाया या गुलाम बनाया जा सकता है (यानी, एक ही बिजली की आपूर्ति द्वारा नियंत्रित कई टैंक), और अभी भी बर्फ ट्रे के साथ एकल पारंपरिक टैंक से छोटे बेंचटॉप पदचिह्न की आवश्यकता होती है; और (ई) स्लाइड और इंटीग्रल कूलिंग के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास के कारण टैंक पदचिह्न कम हो जाता है (प्रयोगशाला स्थान बचाता है); एचटीपी टैंक में स्लाइडिंग दराज के साथ एक उच्च प्रदर्शन सिरेमिक कूलिंग बेस शामिल है जो ठंडे कमरे में प्रक्रिया किए बिना इष्टतम बफर तापमान बनाए रखने के लिए एक जमे हुए शीतलन पैक को फिट कर सकता है।

इसके अलावा, हमारे द्वारा विकसित चिलिंग प्लेट 26 धूमकेतु स्लाइडों को समायोजित करती है, धूमकेतु परख स्लाइड पर कम पिघलने बिंदु अगारोस के तेजी से ठोसकरण को सक्षम करती है और अगारोस जेल के जमने के बाद स्लाइडों की आसान पुनर्प्राप्ति की सुविधा प्रदान करती है। उपरोक्त नवाचार धूमकेतु परख प्रक्रिया को सरल और आसान बनाते हैं।

जबकि अन्य उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं (उदाहरण के लिए, 12-जेल धूमकेतु परख, धूमकेतु, या 96 मिनी-जेल प्रारूप)25, कई वैज्ञानिक पारंपरिक माइक्रोस्कोप स्लाइड (जिसमें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व-लेपित स्लाइड, या अन्य विशेष स्लाइड शामिल हैं) का उपयोग करना पसंद करते हैं। वर्तमान दृष्टिकोण सभी प्रकार के माइक्रोस्कोप स्लाइडों को समायोजित कर सकता है, जिससे इन स्लाइडों का उपयोग करने वाले प्रयोगों को तेजी से स्लाइड प्रोसेसिंग और हैंडलिंग के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एचटीपी धूमकेतु प्रणाली कई फायदे लाती है, लेकिन एक उल्लेखनीय सीमा है: वर्तमान दृष्टिकोण पारंपरिक क्षैतिज टैंक की तुलना में चलने वाले नमूनों की संख्या में केवल 20% की वृद्धि प्रदान करता है (हालांकि स्लाइड का प्रसंस्करण बहुत तेज है)। धूमकेतुचिप और 96 मिनी-जेल प्रारूप अधिक संख्या में नमूने चलाते हैं। आज तक, हम नहीं जानते कि वर्तमान दृष्टिकोण धूमकेतु या 96 मिनी-जेल प्रारूपों को समायोजित कर सकता है, हालांकि हम भविष्यवाणी करते हैं कि यह होगा। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, नमूनों की संख्या को एकल बिजली की आपूर्ति के लिए टैंकों को स्लाव करके और बढ़ाया जा सकता है। सभी दृष्टिकोणों के साथ, नमूने लोड करते समय और माइक्रोस्कोप के तहत उनका विश्लेषण करते समय जैल को खोने या नुकसान पहुंचाने का मौका अभी भी है, लेकिन यह ऑपरेटर त्रुटि के कारण अधिक है, और वर्तमान दृष्टिकोण के साथ इसकी संभावना कम हो जाती है।

एचटीपी धूमकेतु प्रणाली का उपयोग डीएनए क्षति का विश्लेषण करने में बहुत मदद कर सकता है, आणविक महामारी विज्ञान, पुरुष प्रजनन विज्ञान, जीनोटॉक्सिकोलॉजी अध्ययन और पर्यावरण विष विज्ञान जैसे अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में धूमकेतु परख के उपयोग की सुविधा प्रदान करता है। यह उन उपयोगकर्ताओं के लिए विशेष रूप से सच है जो परिचित, लागत प्रभावी, पारंपरिक माइक्रोस्कोप स्लाइड से दूर जाने के बिना, बेहतर थ्रूपुट, और उपयोग में आसानी के सभी लाभ प्राप्त करना चाहते हैं।

Disclosures

डॉ कुक और डॉ कार्बास्की यहां वर्णित प्रौद्योगिकियों से संबंधित तीन स्वीकृत पेटेंट पर आविष्कारक हैं।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए काम को आंशिक रूप से, पुरस्कार संख्या: 1R41ES030274 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 mm glass coverslips Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 631-0124
A2780 ECACC, 
Louis, MO,
 USA		 93112519
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA A467-250
Fluorescence microscope equipped with a camera Zeiss, Jena, Germany
Fresh human whole blood Zen Bio Inc SER-WB10ML Commercial human whole blood sample
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, California Data analysis software
HTP Comet Assay system Cleaver Scientific COMPAC- 50
Human Keratinocyte (HaCaTs) American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Discontinued Can be purchased from another company
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
Cat# T0020001
Hydrogen peroxide (H2O2)
30% in water		 Fisher Scientific, Hampton, NH, USA BP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS system		 Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Image and Data Analysis software Perceptive Instrument,
Bury St Edmunds, England,
UK		 125525 Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ
Internal Standard Mix SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 CL-ISM1-500 Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3
Low melting point Agarose Invitrogen
Waltham, MA, USA		 P4864
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 E5134
NaCl (Sodium chloride) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 S7653
NanoDrop One Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 701-058108 Nanodrop for measuring DNA concentration
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		 D11901 Ultrapure water (16 MΩ cm-1)
NaOH (sodium Hydroxide) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		 E5134
Normal melting point Agarose Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 16520100 For pre-coating slides
OCI-P5X University of Miami,
Miami, FL,
USA		 N/A Live Tumor Culture Core facility provided the cells
Platinum (Pt) reference standard SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 PLPT3-2Y (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch
Propidium Iodide
(1.0 mg/mL in water)		 Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen
Valencia, CA,
USA		 51304 DNA extraction Kit
Single-frosted glass microscope slides Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 12-541B
SKOV3 ECACC,
Louis, MO,
USA		 91091004
Slide box Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 03-448-2 Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye
Slide Chilling plate Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 CSL-CHILLPLATE
Treatment dish Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 STAINDISH4X
Tris-base Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 93362
Triton X-100 Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 BP151-500
Trypsin EDTA (0.5%) Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		 15400054
Vertical Slide Carrier Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 COMPAC-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  3. Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
  4. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
  5. Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
  6. Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
  7. Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
  8. Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
  9. Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
  10. Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
  11. Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
  12. Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
  13. Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
  14. Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
  15. Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
  16. Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
  17. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  18. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  19. Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
  20. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
  21. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
  22. Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
  23. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
  24. Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
  25. Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
  26. Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
  27. Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
  28. Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
  29. Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
  30. Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
  31. Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 183 धूमकेतु परख डीएनए क्षति डीएनए की मरम्मत ऑक्सीडेटिव तनाव बायोमार्कर वैद्युतकणसंचलन
सेलुलर डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट धूमकेतु परख दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, Y., Karbaschi, M., Abdulwahed,… More

Ji, Y., Karbaschi, M., Abdulwahed, A., Quinete, N. S., Evans, M. D., Cooke, M. S. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (183), e63559, doi:10.3791/63559 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter