Summary
혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.
Abstract
세포는 내부 및 외부 환경에서 발생하는 물질에 지속적으로 노출되어 DNA를 손상시킬 수 있습니다. 이러한 손상은 비정상적인 세포 기능을 유발할 수 있으므로 DNA 손상은 암, 신경 퇴행성 및 심혈관 질환 및 노화와 같은 모든 주요 인간 질병의 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 단일 세포 겔 전기 영동 (즉, 혜성 분석)은 광범위한 유형의 DNA 손상 (예 : 단일 및 이중 가닥 절단, 알칼리 불안정 부위, DNA-DNA 가교 결합 및 특정 복구 효소, 산화 퓨린 및 피리 미딘과 조합)의 형성 및 복구를 연구하는 가장 일반적이고 민감한 방법 중 하나입니다. 시스템. 그러나 기존 분석의 낮은 시료 처리량과 힘든 시료 정밀 검사는 가능한 가장 광범위한 적용에 대한 제한 요소입니다. 혜성의 "채점"이 점점 자동화됨에 따라 한계는 이제 상당한 수의 혜성 슬라이드를 처리하는 능력입니다. 여기에서 혜성 분석(HTP 혜성 분석)의 고처리량(HTP) 변형이 개발되어 분석되는 샘플 수가 크게 증가하고 분석 실행 시간, 개별 슬라이드 조작 횟수, 시약 요구 사항 및 겔의 물리적 손상 위험이 크게 감소합니다. 또한, 전기 영동 탱크의 설치 공간은 슬라이드의 수직 방향과 일체형 냉각으로 인해 크게 감소합니다. 또한 여기에보고 된 것은 혜성 분석 슬라이드를 냉각시키는 새로운 접근법으로, 혜성 겔의 응고를 편리하고 효율적으로 촉진합니다. 여기서, 대표적인 혜성 분석 방법에 이들 장치의 적용이 설명되었다. 이러한 간단한 혁신은 혜성 분석의 사용과 노출 생물학, 생태 독성학, 생물 모니터링, 독성 스크리닝 / 테스트와 같은 연구 분야에 대한 적용과 병인 이해를 크게 지원합니다.
Introduction
세포는 내부 및 외부 환경에서 발생하는 작용제에 지속적으로 노출되어 DNA 1,2를 손상시킬 수 있습니다. 이러한 손상은 비정상적인 세포 기능3을 유발할 수 있으며, 따라서 DNA 손상은 암, 신경퇴행성 및 심혈관 질환, 노화4와 같은 많은 주요 인간 질병의 발병에 중요한 역할을 할 수있다. 혜성 분석(단일 세포 겔 전기영동이라고도 함)은 세포 DNA 손상을 감지하고 정량화하는 데 점점 더 널리 사용되는 방법입니다.
가장 간단한 알칼리성 혜성 분석(ACA)은 알칼리성 조건에서 단일 가닥 절단이 되는 아푸린/아피리미딘 부위 및 알칼리 불안정 부위(ALS)와 함께 가닥 절단(SB, 단일 및 이중 모두)을 감지합니다. 중성 pH 혜성 분석은 솔직한 단일 및 이중 가닥 파손을 평가할 수 있습니다6. 더욱이, ACA는, 다수의 DNA 복구 효소와 조합하여, 상당한 범위의 DNA 손상 유형, 예를 들어, 산화된 퓨린 (인간 8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제 1; hOGG17의 사용에 의해 확인됨); 산화된 피리미딘(엔도뉴클레아제 III 사용; EndoIII) 및 사이클로부탄피리미딘 이량체(T4 엔도뉴클레아제 V; T4엔도V)8. 혜성 분석은 또한 시스플라틴 9,10,11과 같은 가교결합제에 의해 유도된 DNA 병변을 평가하는데 사용될 수 있다. 분석의 공식 이름, 즉 단일 세포 겔 전기 영동에서 알 수 있듯이 분석은 분석중인 세포가 단일 세포 현탁액에 의존합니다. 가장 일반적으로, 이들은 배양된 세포이지만 전혈(12,13)로부터 분리될 수 있거나, 또는 전혈 자체가 사용될 수 있다(14,15). 대안적으로, 단일 세포 현탁액은 고형 조직으로부터 생성될 수 있다.
몇 가지 예외, 특히 Engleward 실험실 16의 CometChip 보고서를 제외하고, 전체 혜성 분석 프로토콜은 분석의 발명가가 원래 설명한 것과 크게 변경되지 않았습니다 (Östling and Johansson17 및 Singh etal.18). 혜성 분석에는 여러 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 단계의 대부분은 한 번에 하나의 슬라이드씩 얇은 세포 함유 아가로스 겔의 이송을 포함하므로 겔의 손상 또는 손실 위험을 초래하여 실험의 성공을 위태롭게 합니다. 결과적으로, 혜성 분석은 특히 상당한 수의 슬라이드가 실행되는 경우 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 일반적으로 최대 40개의 슬라이드가 대형(33cm x 59cm x 9cm) 전기영동 탱크에서 실행되며, 이 탱크는 냉각을 위해 습식 얼음이 들어 있는 훨씬 더 큰 트레이 안에 있습니다. 용해 단계의 지속 시간을 줄이고 염색 전에 슬라이드를 건조시키지 않음으로써 분석 런타임을 1일로 단축할 수 있다고 최근에 보고되었습니다(19).
본 저자들은 이전에 고처리량 알칼리성 혜성 분석(HTP ACA)에 대한 새로운 접근법을 보고했으며, 여기서 다중(25개의 배치) 혜성 분석 현미경 슬라이드가 혜성 분석 공정20,21,22를 통해 동시에 조작될 수 있다. 이 특허 받은 접근법은 현미경 슬라이드를 개별적으로 조작할 필요성을 제거하여 샘플 함유 겔의 손상 또는 손실 위험을 최소화하고 현미경 슬라이드를 사용하는 혜성 분석의 모든 변형에 적용할 수 있습니다. 슬라이드 포함 랙은 조작 중에 젤을 보호하므로 결과적으로 샘플 처리가 더 빠르고 효율적입니다. 슬라이드는 또한 수평 방향이 아닌 수직 방향으로 유지되는 랙에서 전기 영동을 겪을 수 있습니다. 이것과 일체형 냉각은 전기 영동 탱크의 설치 공간을 크게 줄이고 젖은 얼음의 필요성을 제거합니다. 종합하면, 이것은 기존 절차에 비해 상당한 개선을 나타냅니다. 사용된 장비는 그림 2에 나와 있습니다. 이 신규한 접근법을 사용하여, 여기에 기술된 프로토콜은, 알칼리-불안정 부위 (ALS), DNA 간 가닥 가교결합 (ICL), 및 다양한 DNA 복구 효소의 기질의 검출을 위한 배양된 세포 및 전혈(14)에 대한 대표적인 적용을 입증한다.
Protocol
시판되는 혈액 샘플을 본 연구에 사용하였다. 우리 기관에서는 상업적으로 이용 가능한 혈액을 사용하기 위해 기관 검토위원회의 승인이 필요하지 않습니다.
1. 혜성 분석을위한 재료의 준비
- 현미경 슬라이드 준비
- 50mL 튜브에 1%(w/v) 정상 융점 아가로오스[이중 증류수(ddH2O)에 용해]를 붓고 전자레인지에 주입하여ddH2O에 아가로스를 용해시킵니다. 슬라이드 코팅 전에응고를 방지하기 위해 37°C에서 보관하십시오. 응고가 발생하면 버리고 신선하게 준비하십시오.
- 슬라이드를 1%(w/v) 정상 융점 아가로스가 포함된 50mL 튜브에 담가 현미경 슬라이드를 사전 코팅합니다.
- 슬라이드를 담근 후 슬라이드 뒷면을 빠르게 닦습니다.
알림: 슬라이드 뒷면을 제대로 닦지 않으면 현미경으로 분석하는 동안 슬라이드의 배경 소음이 증가합니다. - 젖빛 부분의 오른쪽 하단 모서리에 영구 마커로 코팅된 슬라이드에 레이블을 지정합니다(그림 3A). 이것은 슬라이드의 어느 쪽이 사전 코팅되었는지 보여줍니다.
- 아가로스를 굳히고 실온에서 밤새 건조시킵니다.
- 말린 슬라이드를 티슈 페이퍼에 싸서 상자에 보관하십시오.
2. 샘플 준비
- 배양된 세포
참고: 먼저, 혜성 분석을 시작하기 전에 손상 물질로 세포를 처리하십시오. 그런 후 다음을 수행합니다.- 세포가 부착되면 세포를 트립신화하여 세포의 적절한 합류점에서 세포 배양 플라스크 또는 세포 배양 페트리 접시에서 방출합니다. 혈청 함유 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
- 세포를 50mL 튜브로 옮기고 원심분리기(예: HaCaT의 경우 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리)하고 상청액을 부드럽게 제거하고 1mL의 PBS를 세포 펠릿에 추가합니다.
- 세포 계수를 수행합니다.
- 30,000개의 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 7,607 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 혜성 분석을 수행하기 전에 상청액을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿을 어두운 곳에서 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 세포는 혜성 분석을 수행하기 전에 정기적으로 마이코플라즈마 오염을 테스트하여 다른 영향 중에서도 인공적인 DNA 손상 및 변경된 DNA 손상 반응의 형성을 방지해야 합니다.23. 원심분리 조건은 사용되는 셀 유형에 따라 필요에 따라 변경될 수 있다.
- 복구 분석을 위한 배양 세포의 제조
- 세포 배양 플라스크 또는 페트리 접시에서 세포를 배양합니다.
- 세포를 손상 제제로 처리하기 전에 1mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다 (예 : BE-M17 세포의 경우 50μM의 H 2 O2로 20 분 동안 처리).
- 1mL의 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 씻어 잔류 손상 물질을 제거합니다.
- 세포 배양 배지를 다시 도입하고 가습된 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 다양한 기간(예: 0분, 30분, 2시간, 6시간, 24시간 및 30시간) 동안 세포가 복구되도록 합니다.
- 각 시점에서 10% 디메틸설폭사이드(DMSO) 함유 세포 배양 배지에 30,000개의 세포를 수집하고 -80°C에서 보관합니다.
- 혜성 분석을 수행하기 전에 세포를 수조에서 37°C에서 빠르게 해동하고 4°C에서 5분 동안 7,607 x g 에서 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 분석을 수행하기 전에 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다(즉, 단계 3에서).
- 전혈의 준비
참고: 다음 방법은 (i) 혈액 샘플을 얻기 위한 최소 침습적 접근 방식, (ii) 혜성 분석 전에 PBMC의 분리를 요구하지 않음, (iii) 혈액 샘플(부피 < 250μL)을 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있도록 하는 이점을 얻습니다(보다 최근의 증거는 더 긴 보관이 가능하다는 것을 시사하지만), 냉동 보존제가 필요 없고 위험이나 인공적 손상이 발생하지 않음14. 환자 또는 동물로부터 혈액 샘플을 얻기 전에 윤리적 승인 또는 이와 동등한 것이 필요할 수 있습니다. 대안적으로, 상업적으로 입수가능한 혈액 샘플이 본 연구에서와 같이 사용될 수 있다. 우리 기관에서는 상업적으로 이용 가능한 혈액을 사용하기 위해 기관 검토위원회의 승인이 필요하지 않습니다.- 피펫을 사용하여 전혈 샘플(<250μL)(재료 표)을 0.4mg의 EDTA(혈액 250μL당)가 포함된 최소 부피가 포함된 수집 튜브로 옮깁니다.
- HTP 혜성 분석을 수행하기 전에 혈액 샘플을 -80°C에서 동결시킨다.
- 해동은 혈액 샘플 (<250 μL)을 가열하지 않고 실온에서 저장했습니다.
- 혜성 분석을 수행하기 전에 5μL의 전혈을 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다(3단계 참조).
3. 세포 용해
알림: 얼음 위에서 모든 절차를 수행하십시오.
- 젤당 12,000개의 세포 또는 2.5μL의 전혈을 사용하십시오.
- 마이크로파를 사용하여 PBS에 용해된 0.6%(w/v) 저융점 아가로스를 제조하고 응고를 방지하기 위해 37°C의 수조에 두십시오.
- 영구 마커 또는 연필을 사용하여 사전 코팅된 슬라이드의 젖빛 끝에 조사자의 이름, 날짜 및 치료 정보를 표시합니다.
- 평평한 벤치에 냉각 플레이트를 놓고 두 개의 냉동 냉각 팩을 금속 표면 아래의 슬라이딩 서랍에 삽입합니다( 그림 4 참조)21.
- 슬라이드를 냉각 플레이트에 놓고 0.6%(w/v) 저융점 아가로스 함유 셀을 추가하기 전에 슬라이드를 1-2분 동안 미리 냉각되도록 합니다(단계 3.7).
알림: 슬라이드를 냉각 플레이트에 1-2분 이상 방치하면 주변 습도로 인해 슬라이드 표면에 응결이 생길 수 있습니다. 이것은 슬라이드에서 저융점 아가로스 겔을 덜 안정하게 만들 수 있습니다. - 와동하여 펠릿을 분산시킵니다 (단계 2.2.7). 모든 상청액이 펠릿에서 제거되었는지 확인하십시오. 샘플 튜브(펠릿화된 세포 포함)를 즉시 얼음 위에 놓습니다.
알림: 샘플 함유 튜브를 원심 분리기에 넣을 때 펠릿이 튜브의 이쪽에 수집되도록 힌지가 바깥쪽을 향하도록 놓습니다. 때로는 펠릿을보기가 어렵고 상청액을 제거하는 동안 펠릿을 쉽게 제거 할 수 있습니다. 이 방향으로 튜브 뚜껑으로 원심분리하면 셀 펠릿이 어디에 있는지 알 수 있습니다. - 세포 펠릿을 0.6% 저융점 아가로스(LMP 아가로스) 200μL로 재현탁하고 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 80μL의 LMP 아가로스 함유 세포를 냉각된 슬라이드에 빠르게 옮기고 커버슬립을 젤 위에 빠르게 놓습니다.
- 젤을 냉각 플레이트에 1-2분 동안 그대로 두십시오.
- 한편, 용해 완충액(표 1)의 500mL 작업 용액을 준비하고 용해 접시에 붓습니다(그림 2).
- 젤이 설정되면 엄지와 집게 손가락 사이의 슬라이드를 부드럽게 잡고 커버 슬립을 젤에서 밀어 커버 슬립을 빠르게 제거합니다.
- 샘플이 포함된 슬라이드를 슬라이드 캐리어 내부에 놓은 다음(슬라이드의 모든 검은색 "점" 표시는 캐리어에 넣을 때 같은 방향을 향해야 함)(그림 3B), 슬라이드 캐리어를 용해 접시 안에 넣습니다(그림 2).
- 용해 접시의 뚜껑을 닫고 용해 접시를 4°C 또는 실온에서 30분 중 작업자의 시간표19에 가장 적합한 냉장고에 밤새 보관하십시오.
4. 전기 영동
- 용해 접시에서 슬라이드 캐리어를 조심스럽게 제거하십시오. 젤을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 슬라이드 캐리어를 얼음처럼 차가운 ddH2O가 미리 로드된 세척 접시에 부드럽게 놓고 슬라이드가 ddH2O로 완전히 덮이도록 30분 동안 그대로 두십시오.
- 최적의 완충 온도를 유지하기 위해 전기 영동 탱크 아래의 슬라이딩 서랍 내부에 냉동 냉각 팩을 삽입하십시오.
- 얼음처럼 차가운 전기 영동 작업 용액 (표 1)을 전기 영동 탱크에 조심스럽게 추가하고 슬라이드 캐리어를 전기 영동 탱크로 옮깁니다. 셀 함유 젤이 있는 투명한 부분(즉, 젖빛/라벨링 끝이 아님)이 음극(빨간색 전극)을 향하도록 슬라이드의 방향을 지정합니다.
- 슬라이드를 전기 영동 탱크에 20분 동안 그대로 두어 DNA가 이완되고 풀리도록 합니다. 이 단계에서 전원 공급 장치를 꺼 두십시오.
- 필요한 경우 냉각을 최대화하기 위해 새 냉동 냉각 팩을 삽입합니다.
- 1.19V/cm 또는 최적화된 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행합니다.
참고: 전기영동 실행 조건 및 완충액 부피의 최적화는 모든 실험실에 권장됩니다24. 전기영동 동안 단일 슬라이드 캐리어만 사용하는 것은 전기영동 버퍼의 저항에 대한 슬라이드의 영향을 일으키지 않으며, 저자는 슬라이드의 수가 변경될 때 전압 또는 전류에 큰 영향을 미치지 않았습니다. - 전원 공급 장치를 끄고 전기 영동 탱크에서 슬라이드 캐리어를 조심스럽게 제거한 다음 티슈 페이퍼에서 30 초 동안 배수되도록합니다.
- 슬라이드 캐리어를 중화 버퍼가 들어 있는 접시에 넣습니다(표 1). 20 분 동안 그대로 두십시오.
- 중화 접시에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 얼음처럼 차가운 ddH2O가 들어있는 세척 접시에 넣고 20 분 동안 그대로 두십시오.
- 슬라이드 캐리어를 물에서 제거하고 작업자의 스케줄에 따라 슬라이드를 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 또는 실온에서 밤새 건조시키거나 건조시키지 않도록 합니다(19).
알림: 4.11단계에서 건조가 없으면 5.2단계부터 염색 단계를 수행하십시오.
5. 요오드화프로피듐(PI) 염색
- 슬라이드 캐리어를 얼음처럼 차가운ddH2O가 포함된 세척 접시로 옮겨 슬라이드를 재수화하고 30분 동안 그대로 두십시오.
- 슬라이드 캐리어를 2.5μg/mL 요오드화 프로피듐 용액이 들어 있는 염색 접시에 넣습니다.
알림: 요오드화 프로피듐은 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 다루십시오. 또한 독성이 있습니다. - 염색 접시의 뚜껑을 닫고 실온에서 어두운 곳에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 슬라이드 캐리어를 별도의 접시에 옮기고 얼음처럼 차가운 ddH2O로 20 분 동안 씻으십시오.
- 접시에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 작업자의 일정이나 선호도에 따라 37°C 인큐베이터 또는 실온에서 어두운 곳에서 완전히 건조시킵니다.
- 슬라이드가 완전히 건조되면 슬라이드 캐리어에서 꺼내 이미지 분석할 준비가 될 때까지 어두운 곳에서 슬라이드 상자에 보관하십시오.
참고: 슬라이드는 무기한 읽을 수 있으며 필요한 경우 다시 염색할 수 있습니다.
6. 효소 변형 알칼리성 혜성 분석
참고: 효소 변형 알칼리 혜성 분석은 용해 후 전기영동 전에 효소 처리 단계를 사용합니다. 효소의 활성은 효소의 기질 인 부위에서 DNA를 파괴합니다. 이 분석을 수행하기 전에 효소 농도와 효소 배양 기간을 최적화해야 합니다.
- 세포 용해 후(단계 3), 슬라이드를 각각 20분 동안 빙냉ddH2O로 2회 세척한다.
- 물에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 슬라이드를 종이 타월이 늘어선 트레이에 옮깁니다.
- 최적화된 농도(예: 효소 반응 완충액에 희석된 BE-M17 세포의 경우 hOGG1 3.2U/mL)로 효소 80μL를 추가하고 커버슬립으로 덮어 겔 함유 샘플 위에 효소를 퍼뜨립니다.
- 슬라이드를 최적화된 기간 동안 37°C에서 인큐베이션합니다(예를 들어, hOGG1의 경우 45분).
- 배양 후 커버 슬립을 부드럽게 제거하고 슬라이드를 캐리어로 옮깁니다.
알림: 효소 처리 후 슬라이드를 씻지 마십시오. 4.3 단계에서 전기 영동을 직접 수행하십시오.
7. DNA 가닥 간 가교(ICL) 변형 알칼리성 혜성 분석
참고 : ICL-ACA의이 변종의 개념은 DNA에 ICL이 존재하면 산화 적으로 생성 된 모욕에 노출 된 후 유도 된 손상된 DNA의 전기 영동 이동을 지연시킨다는 것입니다. 이 경우 혜성 꼬리가 짧을수록 ICL25,26,27,28의 수가 많아집니다.
- ICL을 유도하는 시약(예: 시스플라틴, 보충 파일 참조)으로 세포를 처리하십시오.
- 적절한 크기의 혜성 꼬리 (~ 20 % 꼬리 DNA)를 생성하기에 충분한 가닥 절단을 유도하기 위해 처리 된 세포를 다음 약제 중 하나로 노출시킵니다 : 과산화수소 (30 분 동안 50 μM H 2 O 2), 전리 방사선 (2-5 Gy) 또는 자외선 B (UVB) (0.5 J / cm2).
- 추가적으로, 단계 7.2에서 사용된 바와 같이, 세포의 배치를 동일한 제제 및 투여량으로 처리함으로써 가닥 파단 양성 대조군을 생성한다(즉, ICL-유도제로 처리하지 않음).
- 세포를 7,607 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 PBS 1mL로 3회 세척하고, 알칼리성 혜성 분석과 같이 처리한다(단계 3-5).
- 아래 공식을 사용하여 DNA 가닥 간 가교 수준을 계산하십시오.
참고 : MOTM(평균 올리브 꼬리 모멘트)은 ICL 변형 혜성 분석을 설명할 때 널리 사용되는 혜성 분석 종말점이며, 꼬리 길이와 꼬리의 총 DNA 분율의 곱으로 정의됩니다(즉, 꼬리 모멘트 = 꼬리 길이 x 꼬리에 있는 DNA의 %)29; TMdi: 가교결합제 및H2O2(또는 다른 가닥 차단기 유도제) 둘 다로 처리된 샘플의 후모멘트; TMcu: 가교결합제로 처리되지 않고 H2O2로 처리되지 않은 샘플의 꼬리 모멘트(무처리), 및 TMci: 가교결합제로 처리되지 않았지만H2O2로 처리된 샘플의꼬리 모멘트.
8. 혜성 점수 매기기 및 데이터 분석
참고: "혜성"이라는 용어는 분석이 수행된 후 현미경으로 볼 때 손상된 세포의 이미지에서 파생됩니다(그림 5). 전기 영동 조건에서 손상되지 않은 세포의 DNA는 대부분 이동하지 않지만 혜성 "머리"라고하는 스페로이드에 남아 있습니다. 그러나 가닥 파손이 있으면 세포의 DNA가 머리 밖으로 이동하여 "꼬리"를 형성하여 혜성처럼 보입니다 (그림 5). 꼬리에 DNA가 많을수록 더 많은 손상이 발생합니다.
- PI(빨간색) 필터(λ = 536/617nm)와 혜성 분석 스코어링 소프트웨어로 형광 현미경을 켭니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 물 한 방울을 젤에 넣고 커버 슬립으로 덮으십시오.
- 슬라이드를 형광 현미경에 넣고 혜성을 "채점"합니다.
참고 : 점수는 각 혜성에 존재하는 피해의 양을 결정하기 위해 혜성을 평가하는 수단입니다. 대체로, 이것은 사용자의 선택된 선호도에 따라, 눈으로(0 내지 4의 척도로 혜성의 크기를 측정) 또는 자유롭게 또는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어(30)를 사용함으로써 두 가지 접근법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로 두 접근법 모두 혜성 꼬리의 크기를 평가하지만 다양한 혜성 관련 종점을 결정할 수 있습니다. 소프트웨어를 사용하는 경우 혜성 머리의 중간을 클릭하고 소프트웨어가 혜성을 자동으로 감지할 때까지 기다린 다음 선택한 끝점을 평가합니다(그림 5). - 겔당 50개의 혜성과 샘플당 100개의 혜성을 채점합니다(즉, 각 샘플은 서로 다른 DNA 손상 치료 또는 복제에 해당함).
- 실험을 반복하거나(n = 2) 실험을 세 배로 반복합니다(n = 3).
참고: n=2 반복 실험만 수행하는 경우 통계 분석을 수행할 수 없지만 n=3인 경우 D'agostino 정규성 검정을 수행합니다. 대부분의 혜성 분석 데이터는 정규성 테스트를 통과하지 못합니다. 이 경우 비모수 검정(Dunn의 다중 비교 검정을 사용한 Kruskal-Wallis 검정 및 p < 0.05로 설정된 Mann-Whitney 검정)을 사용합니다.
Representative Results
HTP ACA에 대한 전기영동 전압 최적화
인간 각질형성세포(HaCaTs; 재료 표) 상이한 선량의 자외선 A 방사선 (UVA) (5 또는 10 J / cm2; 그림 6A), UVB (0.5 또는 1 J/cm2; 도 6B), 손상을 유도하기 위해 50 μMH2O2(도 6C)로 처리하였다. 전기영동의 3가지 상이한 전압을 시험하여 전기영동을 위한 최적 전압을 결정하였다. 세 가지 DNA 손상 처리 결과 모든 전압이 선형 용량 반응을 생성하는 반면 가장 민감한 반응은 1.19V / cm로 얻어졌습니다. HaCaT는 1 V / cm 및 1.09 V / cm와 비교하여 전기 영동 중에 1.19 V / cm를 사용하여 가장 높은 기준선 DNA 손상을 보였다 (그림 6A-C). 또한 1.19V/cm를 사용하면 모든 손상 처리 후 가장 큰 % 꼬리 DNA가 보입니다(그림 6)31.
Fpg 변형 HTP ACA를 사용한 인간 전혈의 DNA 손상 검출
인간 whold 혈액 (재료 표)은 손상을 유도하기 위해 10 J /cm2 UVA의 다른 용량으로 조사되었다. 4 가지 농도의 Fpg (1, 2, 4 또는 8 U / mL)를 사용하여 HTP ACA에서 효소 처리를위한 최적의 농도를 결정했습니다. 결과는 4 U/mL Fpg에서 DNA 손상의 최적 수준이 밝혀졌음을 보여주었다 (그림 7A). UVA 조사 혈액 샘플의 대표적인 혜성 이미지 (그림 7B).
ICL 변형 HTP ACA를 이용한 대표적인 난소암 세포주에서 DNA ICL 검출
난소암 세포주(SKOV-3; 재료 표) 200μM 시스플라틴의 조합물로 처리하고/하거나 얼음 상에서 30분 동안 50μMH2O2로 후속 처리하였다. 노출되지 않은 세포에서는 현저한 손상이 발견되지 않았습니다(도 8A). H2O2단독에의 노출은 유의한 MOTM을 생성하였다(도 8B). 대조적으로, ICL이 유도 된 세포는 감소 된 MOTM을 보였다 (도 8C) 28.
대표적인 난소암 세포주에서 시스플라틴 유도 DNA ICL의 형성 및 복구
ICL-변형된 HTP ACA는 난소암 세포주에서 시스플라틴에 의해 유도된 DNA ICL 형성 및 복구의 시간 경과를 결정하기 위해 사용되었다 (A2780; 재료 표). 세포를 1시간 동안 100μM 시스플라틴으로 처리한 다음, 후속 시간 동안 시스플라틴이 없는 배지(10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS)가 보충된 RPMI 1640 배지)에서 배양했습니다. 다양한 시점에서 ICL 수준을 설정하기 위해 ICL 수정 HTP ACA가 수행되었습니다(그림 9)28. 시스플라틴 치료 전에 ICL은 검출되지 않았다. 그러나 100μM 시스플라틴으로 단일 처리 한 후 ICL 수치가 크게 증가하여 12 시간에 정점을 찍은 후 30 시간 후에 수치가 다시 0으로 감소했습니다.
DNA ICL과 DNA 백금 수준의 상관 관계
ICL-변형된 HTP ACA 및 유도-결합 질량분석법(ICP-MS; 자세한 내용은 보충 파일 참조)에 의한 분석에 앞서 3개의 난소암 세포를 100μM 시스플라틴으로 처리하여 상이한 수준의 DNA-ICL을 유도하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, DNA에서 상이한 수준의 Pt 와 함께 3개의 세포주에서 상이한 수준의 DNA-ICL이 유도되었다. DNA ICL 수준과 백금 농도 사이에 양의 상관 관계 (R2 = 0.9235)가 관찰되었으며, 이는 DNA 백금 수준과 상응하는 ICL28 사이의 연관성을 나타냅니다.
마이코플라즈마 감염 및 비감염 BE-M17 세포의 염기 절제 복구
마이코플라즈마 감염 및 비감염 BE-M17 세포를 30분 동안 50μMH2O2로 처리하고, 세포가 복구되도록 허용된 동안 상이한 기간(0분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 24시간 또는 30시간) 동안 완전한 배지(10%(v/v) FBS가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지)와 함께 인큐베이션하였다. 각 시점에서, 세포를 수집하고, hOGG1 변형된 HTP ACA를 수행하기 전에 -80°C에서, 10% DMSO 함유 배지에서 동결시켰다(단계 6). 30분 후, SB/ALS 수치는 감염되지 않은 세포에서 21% TD(꼬리 DNA 비율)로 감소한 반면, 감염된 세포는 49% TD를 보였습니다(그림 11A). ~15시간 후, SB/ALS 수준은 감염된 세포와 감염되지 않은 세포 모두에서 기준선으로 돌아왔습니다. 산화된 퓨린의 경우, 감염되지 않은 BE-M17은 처음에는 손상이 약간 증가한 후 30시간 이내에 기준선으로 돌아왔습니다(그림 11B). 대조적으로, 감염된 세포는 산화된 퓨린의 지속적이고 상당한 증가를 보였고, 이는 상승된 상태를 유지했으며 30시간 후에도 기준선 수준으로 돌아오지 않았습니다(그림 11B)23.
그림 1: 기존 알칼리 혜성 분석 절차의 개요 . (i) 배양 된 세포의 단일 세포 현탁액 또는 전혈 샘플을 0.6 % (w / v) LMP 아가 로스와 혼합한다. (ii) 세포/아가로스 혼합물을 사전 코팅된 현미경 슬라이드에 적용하고 응고될 때까지 커버슬립으로 덮습니다. (iii) 세포를 높은 pH 용해 완충액을 사용하여 밤새 용해시켜 (iv)ddH2O로 세척하기 전에 뉴클레오이드 본체를 형성한다. (v) 세포 DNA는 높은 pH 전기영동 완충액에서 풀린다. 가닥 파손의 존재는 DNA가 이완되고 풀릴 수있게하며, 전기 영동 하에서 DNA는 핵체에서 빠져 나와 꼬리를 형성합니다. 이어서, 슬라이드를 (vi) 배수하고, 건조시키고, (vii) 중화시키고, (viii)ddH2O로 세척한 후 (ix) 밤새 건조시킨다. 이어서, 슬라이드는 (x)ddH2O로 재수화되고, (xi) 염색되고, (xii) 세척되고, 최종적으로 (xiii) 스코어링되고 분석되며, 전형적으로 형광 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. 이 그림은 이전 간행물20에서 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고처리량 혜성 전기영동 시스템을 구성하는 재료. HTP 전기 영동 탱크, HTP 랙 및 용해, 세척, 중화 및 염색을위한 접시가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혜성 분석 슬라이드와 HTP 랙 (현미경 슬라이드 캐리어)의 대표 이미지. (A) 올바른 방향을 위해 현미경 슬라이드의 사전 코팅된 면은 현미경 슬라이드의 오른쪽 모서리에 있는 검은색 점으로 인식됩니다. (B) HTP 랙의 이미지는 슬라이드가 전기 영동 탱크 내에서 방향을 고정하기 위해 캐리어의 탭과 함께 단단한 수직 방향으로 유지되는 방법을 보여줍니다. 각 캐리어는 최대 25개의 슬라이드를 수용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 샘플 슬라이드와 냉동 팩이 있는 냉각 플레이트의 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 점수 매기기 중 촬영된 대표적인 혜성의 스크린샷. HaCaT는 (A) 치료없이 (B) HTP ACA를 수행하기 전에 1 J / cm2 UVB로 치료되었습니다. 대부분의 소프트웨어 패키지는 다양한 혜성 끝점을 계산할 수 있지만 가장 일반적인 것은 이러한 이미지를 기반으로 한 % 꼬리 DNA(선호) 또는 꼬리 모멘트(파란색: 머리의 시작, 녹색: 머리 중앙, 보라색: 꼬리 끝)입니다. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: HTP ACA를 사용하여 결정된 백분율 꼬리 DNA에 대한 전기영동 전압의 영향을 보여주는 대표적인 그래프. 세포를 HTP ACA 이전에 (A) 5 또는 10 J/cm2 UVA, (B) 0.5 또는 1.0 J/cm2 UVB, 또는 (C) 50 μMH2O2에 노출시켰고, 전기영동 전압은 1, 1.09 또는 1.19 V/cm였다. 데이터는 n = 2 중복 실험31로부터의 200 결정의 평균을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: Fpg 변형된 HTP ACA에 의해 분석된 인간 혈액의 대표 그래프 및 혜성 이미지. 인간 혈액 샘플은 용해 단계 전에 얼음 위에 10 J / cm2 UVA 또는 가짜 조사 ( 'ctrl')로 조사 되었다. 전기 영동 전에 효소 처리에 다양한 농도의 Fpg (1, 2, 4 또는 8 U / mL)를 사용했습니다. (A) 데이터는 n=3 실험에서 300개의 결정의 평균 ± SEM을 나타냅니다. (B) 10 J/cm2 UVA 조사 혈액 샘플에서 Fpg의 각 농도에 대한 혜성의 대표 이미지. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 시스플라틴 처리 후 ICL 검출을 보여주는 대표적인 혜성 이미지. (A) 아무 처리도 하지 않은 대조군 세포, (B) H2O2(50 μM)만으로 처리한 세포, (C)H2O2(50 μM) 및 시스플라틴(200 μM)으로 처리한 세포는 ICL28의 존재로 인해 (B)에서보다 꼬리가 더 짧음을 도시한다. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 시스플라틴으로 유도된 ICL 형성 및 복구의 동역학 시연. A2780 세포를 1시간 동안 배양 배지에서 100μM의 시스플라틴으로 처리하였다. 이어서, 시스플라틴-함유 배지를 제거하고, 세포를 ICL-변형된 HTP ACA에 의해 분석하기 전에 다양한 시점 동안 배양하였다. 데이터는 n=3± 실험28로부터의 평균 SEM을 나타낸다. P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: DNA ICL과 백금 농도 간의 상관관계. DNA ICL은 ICL-변형된 HTP ACA에 의해 결정되었고, 백금 수준은 3개의 난소암 세포주에서 ICP-MS(단일 쿼드 운동 에너지 차별 포함, SQ-KED 포함)에 의해 측정되었다. R2 = 0.9235. DNA28의 백금 수준을 정량화하기 위한 ICP-MS 방법론에 대한 보충 파일을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 마이코플라즈마 감염 대 비감염 BE-M17 세포에서 hOGG1 변형 혜성 분석에 의해 결정된 DNA 손상 및 복구를 보여주는 대표적인 그래프. 30분 동안 50μMH2O2로 처리한 후, 세포를 상이한 기간(0, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 24시간, 또는 30시간) 동안 복구하도록 허용하였다. hOGG1 변형 HTP ACA는 감염된 (적색 데이터 포인트) 및 감염되지 않은 (블랙 데이터 포인트) BE-M17 세포에서 (A) SB / ALS 및 (B) 산화 퓨린을 측정하는 데 사용되었습니다. 데이터는 n = 2개의 중복 실험에서 200개의 결정의 평균을 나타냅니다. 이 그림은 이전 간행물23의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 스톡 솔루션 | 작업 솔루션 | |
| 용해 버퍼 | ddH2O중 100 mMNa2EDTA, 2.5 M NaCl, 및 10 mM 트리스 염기; 10 M NaOH로 pH를 10으로 조정 | 용해 원액에 1% 트리톤 X-100 | |
| 전기영동 버퍼 | ddH2O중의 10 M NaOH 및 200 mMNa2EDTA | 300 mM NaOH 및 1 mMNa2EDTA; pH > 13 | |
| 중화 버퍼 | ddH2O중의 0.4 M 트리스 염기; HCl로 pH를 7.5로 조정 | ||
| 염색 완충액 | 1 mg / mL 요오드화 프로피듐 | ddH 2 O에서2.5μg / mL 요오드화 프로피듐 | |
표 1 : HTP ACA에 사용 된 시약의 조성. 용해, 전기 영동, 중화 및 염색 완충액의 스톡 및 작업 농도가 표시됩니다.
보충 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구는 혜성 분석의 다양한 대표적인 일반적인 변이체(즉, 알칼리성, 효소 변형, 혈액 및 ICL 및 기타 변이체도 적합함)로 높은 처리량을 달성하는 데 사용할 수 있는 현재 장비가 제공하는 다기능성을 보여줍니다. 또한, 본 접근법은 몇 가지 이점을 제공합니다 20,21 : (a) 여러 슬라이드를 병렬로 조작하여 분석 실행 시간이 단축됩니다 (처리 시간60 % 감소); (b) 젤 손상 위험, 따라서 실험에 대한 위험이 감소합니다. (c) 시약 요구량이 감소한다 (예를 들어, 전기영동 탱크의 부피가 종래의 탱크보다 작음); (d) 슬라이드 실행 수가 증가합니다. 하나의 탱크는 단일 기존 탱크에 비해 슬라이드 실행 수를 20 % 증가시킬 수 있습니다. 그러나 여러 전기 영동 탱크는 동일한 전원 공급 장치에서 병렬로 실행되거나 슬레이브 (즉, 단일 전원 공급 장치로 제어되는 여러 탱크)가 가능하며 얼음 트레이가있는 단일 기존 탱크보다 작은 벤치 탑 풋 프린트가 필요합니다. (e) 슬라이드의 수직 방향과 통합 냉각으로 인해 탱크 설치 공간이 감소합니다 (실험실 공간 절약). HTP 탱크는 하나의 냉동 냉각 팩을 장착할 수 있는 슬라이딩 서랍이 있는 고성능 세라믹 냉각 베이스로 구성되어 있어 냉장실에서 공정을 수행하지 않고도 최적의 완충 온도를 유지할 수 있습니다.
또한, 당사가 개발한 냉각 플레이트는 26개의 혜성 슬라이드를 수용하고, 혜성 분석 슬라이드에서 저융점 아가로스의 신속한 응고를 가능하게 하고, 아가로스 겔이 응고된 후 슬라이드를 쉽게 검색할 수 있도록 합니다. 위의 혁신은 혜성 분석 프로세스를 더 간단하고 쉽게 만듭니다.
다른 고처리량 접근법(예: 12-겔 혜성 분석, CometChip, 또는 96 미니 겔 형식)이 개발되었지만[25), 많은 과학자들은 기존의 현미경 슬라이드(상업적으로 이용 가능한 사전 코팅된 슬라이드 또는 기타 특수 슬라이드 포함)를 사용하는 것을 선호합니다. 본 접근법은 모든 유형의 현미경 슬라이드를 수용할 수 있어서, 이러한 슬라이드를 이용한 실험이 더 빠른 슬라이드 처리 및 취급을 통해 스케일업될 수 있게 한다. 위에서 언급했듯이 HTP 혜성 시스템은 많은 이점을 제공하지만 한 가지 주목할만한 한계가 있습니다 : 현재의 접근 방식은 기존의 수평 탱크에 비해 샘플 수가 20 % 만 증가합니다 (슬라이드 처리가 훨씬 빠르지 만). CometChip 및 96 미니 젤 형식은 더 많은 수의 샘플을 실행합니다. 현재까지 우리는 현재의 접근 방식이 CometChip 또는 96 미니 젤 형식을 수용 할 수 있는지 여부를 알지 못하지만 그렇게 될 것으로 예측합니다. 위에서 언급했듯이 탱크를 단일 전원 공급 장치로 슬레이브로하여 샘플 수를 더 늘릴 수 있습니다. 모든 접근 방식과 마찬가지로 샘플을 로드하고 현미경으로 분석하는 동안 젤이 손실되거나 손상될 가능성이 여전히 있지만 이는 작업자 오류로 인한 것이며 현재 접근 방식으로는 이러한 가능성이 최소화됩니다.
HTP 혜성 시스템의 사용은 DNA 손상을 분석하는 데 크게 도움이 될 수 있으며, 분자 역학, 남성 생식 과학, 유전 독성학 연구 및 환경 독성학과 같은 광범위한 응용 분야에서 혜성 분석의 사용을 용이하게 합니다. 이는 친숙하고 비용 효율적인 기존 현미경 슬라이드에서 벗어나지 않고 처리량 향상과 사용 편의성의 모든 이점을 원하는 사용자에게 특히 해당됩니다.
Disclosures
Cooke 박사와 Karbaschi 박사는 여기에 설명 된 기술과 관련하여 3 개의 부여 된 특허에 대한 발명가입니다.
Acknowledgments
이 간행물에보고 된 연구는 부분적으로 국립 보건원의 국립 환경 건강 과학 연구소에서 수상 번호 1R41ES030274로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
| A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
| Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
| Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
| Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
| HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
| Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
| Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
| ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
| Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
| Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
| Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
| Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
| Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
| NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
| OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
| Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
| Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
| Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
| SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
| Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
| Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
| Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
| Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
| Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
| Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |
References
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