Summary
Этот протокол представляет оперативные детали перевязки и пункции слепой кишки (CLP) в мышиной модели сепсиса. CLP является одним из наиболее широко используемых методов для создания животной модели сепсиса. Поэтому для достижения надежных результатов исследований требуется стандартизированный протокол CLP.
Abstract
Сепсис является тяжелым опасным для жизни и быстро развивающимся заболеванием, которое ежегодно вызывает миллионы смертей во всем мире. Исследователи приложили огромные усилия, чтобы прояснить патофизиологию сепсиса с использованием различных животных моделей; мышиная модель сепсиса, индуцированного перевязкой и пункцией слепой кишки (CLP), широко используется в лабораториях. Тремя техническими аспектами, которые влияют на тяжесть и воспроизводимость модели CLP, являются процент перевязанной слепой кишки, размер иглы, используемой для пункции слепой кишки, и объем фекалий, втиснутых в брюшную полость. Быстрая и специфическая диагностика сепсиса является решающим фактором, влияющим на результат. Золотым стандартом диагностики сепсиса является микробная культура; однако этот процесс отнимает много времени и иногда является неточным. Обнаружение биомаркеров, специфичных для сепсиса, происходит быстро, но существующие биомаркеры неудовлетворительны из-за короткого периода полураспада, неспецифичности и недостаточной чувствительности. Поэтому возникает острая необходимость в надежном биомаркере сепсиса на ранних стадиях. Предыдущие публикации предполагают, что чрезмерные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs) возникают при сепсисе. Цитруллинированный гистон H3 (CitH3), как компонент NET, повышен как у септических животных, так и у пациентов, а наличие CitH3 является надежным диагностическим биомаркером сепсиса. Настоящее исследование было направлено на описание стандартизированной мышиной модели CLP-индуцированного сепсиса и установление надежного биомаркера сепсиса в крови. Наша работа может способствовать ранней и точной диагностике сепсиса в будущем.
Introduction
Сепсис определяется как опасная для жизни дисфункция органа, вызванная нерегулируемой реакцией хозяина на инфекцию1, а септический шок является основной причиной смерти в тяжелых случаях сепсиса2. Сепсис и септический шок ежегодно приводят к миллионам смертей во всем мире3. Ключом к улучшению исхода пациентов с сепсисом является быстрое начало лечения, такого как антибиотики4. Золотым стандартом метода диагностики сепсиса является микробная культура; однако микробная культура отнимает много времени и может привести к ложноположительным и ложноотрицательным результатам, которые значительно ограничивают клиническую значимость5. Таким образом, крайне желательно выявить биомаркер сепсиса крови. Прокальцитонин признан идеальным биомаркером сепсиса, но имеет ограниченную диагностическую эффективность, поскольку он не может отличить сепсис от стерильных заболеваний6.
Перевязка и пункция слепой кости мыши (CLP) обычно используется для создания модели сепсиса в научных исследованиях. CLP является одной из наиболее широко используемых моделей сепсиса, поскольку она имитирует полимикробный перитонит, активируя как провоспалительные, так и противовоспалительные иммунные реакции7. Общепризнано, что CLP создает более клинически значимую модель сепсиса, чем альтернативные методы, такие как инъекция бактериального эндотоксина. Поэтому CLP считается классической моделью сепсиса для использования в исследовании8. Однако основным недостатком CLP является его воспроизводимость, поскольку на тяжесть модели влияют несколько факторов, таких как процент перевязки слепой кишки, размер иглы, количество проколов и метод лапаротомии. Поэтому необходимо стандартизировать модель сепсиса, вызванную CLP. В настоящем исследовании описываются детали протокола модели сепсиса, вызванной CLP, чтобы показать стандартизированную процедуру и повысить ее воспроизводимость.
Воспалительная реакция возникает на ранней стадии сепсиса, когда нейтрофилы высвобождают чрезмерное количество окислителей и протеаз, которые вызывают повреждение органов8. Ключевым фактором в патофизиологии сепсиса является образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (NETs), которые высвобождают ядерные и цитозольные компоненты, такие как ДНК, цитруллинированные гистоны и антимикробные протеиназы9. Последние исследования показывают, что чрезмерная генерация НЭТ опосредует патологию сепсиса; Между тем, снижение NETs, посредством ферментативного ингибирования пептидиларгининдейминазы (PAD) химическими веществами, такими как YW3-56 или Cl-амидин, оказывает эффект выживания в мышиных моделях сепсиса10,11. Цитруллинированный гистон H3 (CitH3) был идентифицирован как сепсис-специфический белок в 2011году 12, и последующие публикации продемонстрировали, что циркулирующая концентрация CitH3 является надежным диагностическим биомаркером сепсиса13,14. CitH3 считается более чувствительным и долговечным биомаркером, чем прокальцитонин, и более специфичен в различении сепсиса, чем воспалительные цитокины13.
В этом исследовании мы оценили надежный диагностический биомаркер сепсиса в clP-индуцированной мышиной модели сепсиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Комитетом по обзору животных в больнице Сяня и Центральном Южном университете (No 202103149).
1. Подготовка
- Отбирают самцов мышей C57BL/6J (вес: 20-25 г; возраст: 8-12 недель) и размещают в течение 3 дней перед выполнением каких-либо процедур.
- Взвесьте мышь.
- Обезболить мышь 1,5% изофлураном путем вдыхания и ущипнуть пальцы ног, чтобы проверить глубину анестезии.
- Закрепите мышь на грелке. Нанесите крем для депиляции на живот и оставьте не дольше 1 мин перед удалением крема и волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальную температуру тела следует поддерживать, помещая теплую прокладку под анестезируемую мышь во время операции.
2. Эксплуатация
- Подготовьте стерильные хирургические инструменты, подходящие для хирургии грызунов на животных. Носите стерильные перчатки, маску для лица и хирургический халат для обеспечения асептических состояний.
- Дезинфицируйте кожу живота йодными салфетками не менее трех раз. Накройте оперативную хирургическую область стерильными хирургическими шторами.
- Используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы сделать разрез примерно 2 см в брюшной стенке вдоль linea alba.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повреждайте органы. - Определите и выделите слепую кишку из брюшинной полости стерильным пинцетом.
- Обжигайте 75% объема слепой кишки с помощью 4-0 шелковых швов. Не следует лишать брыжеечные кровеносные сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент слепой кишки, которая перевязывается, определяет тяжесть сепсиса. - Проколите слепую кишку, создав одну сквозную перфорацию (два отверстия) с иглой 21 G (с одной стороны через стенку слепой кости на противоположную сторону) в средней точке между хвостовым концом и перевязочным набором.
- Выбросьте иглу. Аккуратно выдавите небольшую капельку кала из слепой кишки через отверстия проникновения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кала, втиснутого в брюшную полость, должно быть постоянным, так как это также определяет тяжесть сепсиса. Шаги 2,5-2,7 следует пропустить для фиктивных мышей. - Аккуратно заменить слепую кишку в брюшную полость.
- Закройте мышцы живота и кожу отдельно 6-0 шелковыми швами.
- Продезинфицируйте разрез йодом.
- Вводят кетопрофен (5 мг/кг) в нижний левый квадрант живота, чтобы избежать слепой кишки. Поместите мышь на теплую подушечку до тех пор, пока она полностью не оправится от анестетика.
- Поместите мышь в клетку в помещение с контролируемой температурой (22 °C) и обеспечьте свободный доступ к пище и воде. Проверяйте мышь каждые 6 часов в течение первой недели после операции.
- Усыплите мышь передозировкой углекислого газа, когда симптомы сепсиса встречаются с заранее определенными конечными точками.
3. Лечение
- Случайным образом разделите мышей на фиктивную группу, группу CLP, группу CLP + YW3-56 (рисунок 2a) и группу CLP + Cl-амидин (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная группа прошла те же процедуры, что и группы CLP, за исключением CLP. YW3-56 (5 мг/кг) или Cl-амидин (40 мг/кг) вводили через перитонеальную инъекцию через 1 ч после шага 2,9 при ушивании мышечного и кожного слоя. - Урожай образцов
- Сбор периферической крови из ретробульбарного сплетениячерез 15 24 ч после операции.
- Готовят сыворотку методом центрифугирования (1 000 х г, 5 мин) и хранят при -80 °C до использования.
- Измерьте концентрацию CitH3 с помощью непрямого сэндвич-набора ИФА, как описано ранее13.
- Нанесите анти-CitH3 моноклональное антитело на 96-луночную пластину для захвата белка CitH3.
- Обработать сыворотку ДНКазой I (150 шт/мл, 37° в течение 1 ч) и инкубировать в лунках (20 мкл, комнатная температура).
- Добавьте анти-CitH3 поликлональное антитело (0,33 мкг/мл, 100 мкл, 2 ч) для обнаружения захваченного белка CitH3.
- Инкубировать меченое пероксидазой антитело (0,02 мкг/мл, 100 мкл, 1 ч).
- После тщательной промывки разработать скважины с 3,3',5,5'-тетраметилбензидином (100 мкл, 20 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация о протоколе комплекта ИФА приведена в предыдущей публикации13.
- Статистический анализ
- Выполните один способ ANOVA для анализа различий между тремя группами, а затем Bonferroni post hoc тестирование для нескольких сравнений. Используйте статистическое программное обеспечение для выполнения анализа. значения p 0,05 или менее были признаны значительными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 2A, CitH3 не был обнаружен в фиктивной группе с помощью вестерн-блоттинга. Концентрация CitH3 в сыворотке крови значительно увеличивалась после CLP, и это увеличение блокировалось ингибированием образования NET посредством введения YW3-56, ингибитора PAD10. На фиг.2В показаны концентрацииЦитаН3 в сыворотке крови, определяемые методом ИФА. Через 24 ч после CLP сывороточная концентрация CitH3 была увеличена в группах CLP по сравнению с фиктивной группой (p = 0,0008), и это увеличение CitH3 было значительно ослаблено Cl-амидином, ингибитором PAD, который ограничивает образование NET (p = 0,0028).
Рисунок 1: Экспериментальная группировка. Мыши были случайным образом разделены на фиктивную группу, группу CLP, группу CLP + YW3-56 (A) и группу CLP + Cl-амидин (B). CLP выполнялся так, как описано в протоколе. YW-3-56 (5 мг/кг) или Cl-амидин (40 мг/кг) вводили через перитонеальную инъекцию через 1 ч после CLP. Фиктивная группа прошла те же процедуры, что и группы CLP, за исключением CLP. Кровь собирали в различные моменты времени, а сыворотку готовили и хранили при -80 °C до использования. YW3-56 и Cl-амидин являются ингибиторами пептидиларгининдейминазы, которые значительно ограничивают образование внеклеточных ловушек нейтрофилов. Сокращения: CitH3 = цитруллинированный гистон H3; CLP = перевязка и пункция слепой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Концентрация CitH3 в сыворотке крови была значительно увеличена в модели сепсиса, индуцированного CLP, и была облегчена ингибированием PAD. (A) Для проверки концентрации CitH3 в сыворотке крови проводилось западное блоттинг. В фиктивной группе не было обнаружено CitH3. Концентрация CitH3 была значительно увеличена в группах CLP, и это увеличение было заблокировано лечением YW3-56. (B) Концентрации CitH3 в сыворотке крови измеряли с помощью ИФА. Почти не было обнаружено CitH3 в фиктивной группе. Группы CLP показали заметное увеличение CitH3, которое было ослаблено введением Cl-амидина. YW3-56 и Cl-амидин являются ингибиторами PAD, которые значительно ограничивают образование внеклеточных ловушек нейтрофилов. Сокращения: CitH3 = цитруллинированный гистон H3; CLP = перевязка и пункция слепой кишки; PAD = пептидиларгининдеиминаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP вводит патогены в брюшную полость для создания доклинической модели сепсиса. При выполнении CLP важно использовать стерильные условия для устранения интерференции экзогенных бактерий и использовать точные дозировки анестетиков16. Тремя техническими аспектами CLP, которые влияют на тяжесть и воспроизводимость модели сепсиса, являются процент перевязанной слепой кишки, размер иглы, используемой для пункции слепой кишки, и объем фекалий, втиснутых в брюшную полость. Перевязка примерно 75% слепой кишки приводит к тяжелому сепсису, 50% перевязки приводит к умеренному сепсису, а 25% перевязки или менее приводит к легкому сепсису17. Количество проколов и размер иглы определяют коэффициент смертности18, а наилучший результат достигается при сквозной пункции. Небольшого количества (капли) кала достаточно, чтобы вызвать бактериальный перитонит, и требуется осторожность при выдавливании кала. CLP занимает около 10 минут при выполнении опытным человеком.
Мышиная модель CLP-индуцированного сепсиса, описанная в этом исследовании, имеет несколько ограничений. Во-первых, мышь может быть слишком маленькой, чтобы получить достаточное количество образцов крови для анализа периферической крови и измерения цитокинов. Во-вторых, CLP не может быть выполнен у новорожденных животных. В-третьих, изменчивость все еще имеет место, и воспроизводимые результаты могут быть не получены. Важно убедиться, что хирурги имели адекватную практику в выполнении CLP перед проведением исследовательских тестов.
CLP создает клинически реалистичную модель сепсиса, которая имитирует патофизиологический процесс и профили цитокинов и широко используется у грызунов. Тяжестью CLP можно манипулировать для выполнения различных целей исследования, регулируя размер иглы и процент перевязанной слепой кишки. Согласно нашим результатам, полученным с использованием модели CLP, обнаружение циркулирующей концентрации CitH3 позволяет проводить раннюю диагностику сепсиса у мышей. Диагностическая ценность концентрации CitH3 в сыворотке крови позволяет быстро начать лечение против сепсиса, которое значительно улучшает результаты септических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О конфликте интересов не заявлено.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Ван Вэя и доктора Лю Шуай за помощь в проведении экспериментов. Эта работа финансировалась за счет грантов от Young Research Funding больницы Xiangya, Центрального Южного университета (No 2019Q10), От Национального и научного фонда провинции Хунань (No 2020JJ4902) и от Национального фонда естественных наук Китая (No 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
