Summary
이 프로토콜은 패혈증의 마우스 모델에서 맹장 결찰 및 천자 (CLP)의 수술 세부 사항을 제시합니다. CLP는 패혈증의 동물 모델을 만들기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 따라서 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻으려면 표준화된 CLP 프로토콜이 필요합니다.
Abstract
패혈증은 생명을 위협하고 빠르게 발전하는 심각한 질병으로 전 세계적으로 매년 수백만 명이 사망합니다. 연구자들은 다양한 동물 모델을 사용하여 패혈증의 병태생리학을 밝히기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다. 맹장 결찰 및 천자 (CLP)에 의해 유도 된 패혈증의 마우스 모델은 실험실에서 널리 사용됩니다. CLP 모델의 심각도와 재현성에 영향을 미치는 세 가지 기술적 측면은 맹장 결찰의 비율, 맹장 천자에 사용되는 바늘의 크기 및 복강 내로 압착 된 대변의 양입니다. 패혈증의 신속하고 구체적인 진단은 결과에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 패혈증 진단의 황금 표준은 미생물 배양입니다. 그러나이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 때로는 정확하지 않습니다. 패혈증 특이적 바이오마커의 검출은 빠르지만, 기존 바이오마커는 짧은 반감기, 비특이성 및 불충분한 민감도로 인해 만족스럽지 못하다. 따라서, 초기 단계에서 패혈증의 신뢰성 있는 바이오마커에 대한 절실한 필요성이 있다. 이전 간행물은 과도한 호중구 세포 외 트랩 (NET)이 패혈증에서 발생한다고 제안합니다. 시트룰린화 히스톤 H3(CitH3)는 NET 성분으로서 패혈증 동물과 환자 모두에서 상승하며, CitH3의 존재는 패혈증의 신뢰할 수 있는 진단 바이오마커입니다. 본 연구는 CLP 유발 패혈증의 표준화된 마우스 모델을 기술하고 패혈증의 신뢰할 수 있는 혈액 바이오마커를 확립하는 것을 목표로 했습니다. 우리의 연구는 미래에 패혈증의 조기 및 정확한 진단에 기여할 수 있습니다.
Introduction
패혈증은 감염1에 대한 조절되지 않는 숙주 반응으로 인한 생명을 위협하는 장기 기능 장애로 정의되며, 패혈성 쇼크는 패혈증2의 심각한 경우 주요 사망 원인입니다. 패혈증 및 패혈성 쇼크는 매년 전 세계적으로 수백만 명의 사망을 초래합니다3. 패혈증 환자의 결과를 개선하는 열쇠는 항생제4와 같은 치료의 즉각적인 시작입니다. 패혈증 진단을위한 황금 표준 방법은 미생물 배양입니다. 그러나 미생물 배양은 시간이 많이 걸리고 위양성 및 위음성 결과를 초래할 수 있어 임상적 중요성을 크게 제한할 수있습니다5. 따라서, 패혈증의 혈액 바이오마커를 동정하는 것이 매우 바람직하다. 프로칼시토닌은 이상적인 패혈증 바이오마커로 인식되고 있으나 패혈증과 멸균 질환을 구별할 수 없기 때문에 진단 효능이 제한적이다6.
마우스 맹장 결찰 및 천자 (CLP)는 일반적으로 과학 연구에서 패혈증 모델을 만드는 데 사용됩니다. CLP는 다발성 미생물 복막염을 모방하여 전염증 및 항염증면역 반응을 모두 활성화하기 때문에 가장 널리 사용되는 패혈증 모델 중 하나입니다7. CLP가 박테리아 내 독소 주입과 같은 대체 기술보다 임상 적으로 더 관련성이 높은 패혈증 모델을 생성한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서, CLP는 연구8에서 사용하기 위한 고전적 패혈증 모델로 간주된다. 그러나 CLP의 주요 단점은 모델 심각도가 맹장 결찰 비율, 바늘 크기, 천자 수 및 개복술 기술과 같은 여러 요인의 영향을 받기 때문에 재현성입니다. 따라서, CLP 유발 패혈증 모델을 표준화할 필요가 있다. 본 연구는 표준화된 절차를 보여주고 그의 재현성을 증가시키기 위해 CLP-유도된 패혈증 모델의 프로토콜 세부사항을 기술한다.
염증 반응은 패혈증의 초기 단계에서 발생하며, 호중구는 장기 손상을 일으키는 과도한 양의 산화제와 프로테아제를 방출합니다8. 패혈증의 병태생리학의 핵심 인자는 DNA, 시트룰린화 히스톤 및 항균 프로테이나제9와 같은 핵 및 세포질 성분을 방출하는 호중구 세포외 트랩(NET)의 형성이다. 최근 연구에 따르면 NET의 과도한 생성은 패혈증의 병리를 매개합니다. 한편, YW3-56 또는 Cl-아미딘과 같은 화학 물질에 의한 펩티딜 아르기닌 데이미나제(PAD)의 효소적 억제를 통한 NET의 감소는 패혈증10,11의 마우스 모델에서 생존 촉진 효과를 발휘합니다. 시트룰린화 히스톤 H3(CitH3)는 2011년12월에 패혈증 특이적 단백질로 확인되었으며, 후속 간행물에서는 순환 CitH3 농도가 패혈증13,14의 신뢰할 수 있는 진단 바이오마커임을 입증했습니다. CitH3는 프로칼시토닌보다 더 민감하고 오래 지속되는 바이오마커로 간주되며, 염증성 사이토카인13보다 패혈증을 구별하는데 더 특이적이다.
이 연구에서, 우리는 패혈증의 CLP 유도 마우스 모델에서 패혈증의 신뢰할 수있는 진단 바이오 마커를 평가했습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 샹야 병원 및 중남대학교 동물심사위원회(No. 202103149)에서 승인한 지침에 따라 수행하였다.
1. 준비
- 수컷 C57BL/6J 마우스(체중: 20-25g, 연령: 8-12주)를 선택하고 절차를 수행하기 전에 3일 동안 보관합니다.
- 마우스의 무게를 잰다.
- 흡입으로 마우스를 1.5 % 이소 플루 란으로 마취시키고 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인하십시오.
- 가열 패드에 마우스를 고정하십시오. 복부에 제모 크림을 바르고 크림과 머리카락을 제거하기 전에 1 분 이상 방치하지 마십시오.
참고: 수술 중 마취된 마우스 아래에 따뜻한 패드를 놓아 정상 체온을 유지해야 합니다.
2. 운영
- 설치류 동물 수술에 적합한 멸균 수술기구를 준비하십시오. 멸균 장갑, 안면 마스크 및 수술 가운을 착용하여 무균 상태를 확인하십시오.
- 요오드 물티슈로 복부 피부를 적어도 세 번 소독하십시오. 수술 부위를 멸균 수술 커튼으로 덮으십시오.
- 멸균 수술 가위를 사용하여 선형 알바를 따라 복벽에 약 2cm 절개를하십시오.
알림: 장기를 손상시키지 마십시오. - 멸균 핀셋으로 복강 밖으로 맹장을 확인하고 분리하십시오.
- 맹장 부피의 75 %를 4-0 실크 봉합사로 결지하십시오. 장간막 혈관을 결찰하지 마십시오.
알림: 결찰되는 맹장의 비율은 패혈증의 중증도를 결정합니다. - 꼬리 끝과 결찰 세트 사이의 중간 지점에 21G 바늘 (맹장 벽을 통해 반대쪽으로)로 하나의 관통 및 관통 천공 (두 개의 구멍)을 만들어 맹장을 뚫습니다.
- 바늘을 버리십시오. 침투 구멍을 통해 맹장에서 대변의 작은 방울을 부드럽게 짜냅니다.
참고: 복강으로 압착된 대변의 양은 패혈증의 중증도를 결정하기 때문에 일정해야 합니다. 가짜 마우스의 경우 2.5-2.7단계를 건너뛰어야 합니다. - 맹장을 복강으로 부드럽게 교체하십시오.
- 복부 근육과 피부를 6-0 실크 봉합사로 별도로 닫으십시오.
- 요오드로 절개 부위를 소독하십시오.
- 맹장을 피하기 위해 복부의 왼쪽 아래 사분면에 케토 프로 펜 (5mg / kg)을 주사하십시오. 마취제에서 완전히 회복 될 때까지 마우스를 따뜻한 패드 위에 놓습니다.
- 마우스를 온도가 조절되는 방 (22 ° C)의 케이지에 넣고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록하십시오. 수술 후 첫 주 동안 6 시간마다 마우스를 확인하십시오.
- 패혈증의 증상이 미리 정의된 종점을 충족할 때 이산화탄소 과량투여에 의해 마우스를 안락사시킨다.
3. 치료
- 마우스를 무작위로 가짜 그룹, CLP 그룹, CLP + YW3-56 그룹 (그림 2a) 및 CLP + Cl- 아미 딘 그룹 (그림 1)으로 나눕니다.
참고: 가짜 그룹은 CLP를 제외하고 CLP 그룹과 동일한 절차를 거쳤습니다. YW3-56 (5 mg / kg) 또는 Cl- 아미 딘 (40 mg / kg)은 근육과 피부층을 봉합 할 때 1 단계 후 2.9 시간 복막 주사를 통해 투여되었습니다. - 샘플 수확
- 수술 후 24 시간 후에 구후 신경총15 에서 말초 혈액을 채취하십시오.
- 원심분리(1,000 x g, 5분)로 혈청을 준비하고 사용 전까지 -80°C에서 보관합니다.
- 앞서설명한 바와 같이 간접 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 CitH3 농도를 측정합니다.
- 항-CitH3 단일클론 항체를 96웰 플레이트에 코팅하여 CitH3 단백질을 포획합니다.
- 혈청을 DNase I (150 단위 / mL, 37 ° for 1 h)로 처리하고 웰 (20 μL, 실온)에서 배양합니다.
- 포획된 CitH3 단백질을 검출하기 위해 항-CitH3 다클론 항체(0.33μg/mL, 100μL, 2h)를 추가합니다.
- 항토끼 과산화효소 표지된 2차 항체(0.02μg/mL, 100μl, 1h)를 웰에서 배양합니다.
- 철저히 세척 한 후 3,3',5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (100 μL, 20 분)으로 웰을 개발하십시오.
참고: ELISA 키트에 대한 추가 프로토콜 세부 정보는 이전 간행물13에 나와 있습니다.
- 통계 분석
- 단방향 분산 분석을 수행하여 세 그룹 간의 차이를 분석한 다음 다중 비교를 위한 Bonferroni 사후 테스트를 수행합니다. 통계 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다. 0.05 이하의 p 값은 유의한 것으로 간주되었다.
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Representative Results
도 2A에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯팅에 의해 가짜 그룹에서 CitH3가 검출되지 않았다. 혈청 CitH3 농도는 CLP 후 유의하게 증가하였고, 이러한 증가는 PAD 억제제10인 YW3-56의 투여를 통한 NET 형성의 억제에 의해 차단되었다. 도 2B는 ELISA에 의해 결정된 혈청CitH3 농도를 나타낸다. CLP 후 24 시간에, CitH3의 혈청 농도는 가짜 그룹 (p = 0.0008)에 비해 CLP 그룹에서 증가했으며,이 CitH3 증가는 NET 형성을 제한하는 PAD 억제제 인 Cl-amidine에 의해 유의하게 약화되었다 (p = 0.0028).
그림 1: 실험적 그룹화. 마우스를 무작위로 가짜 그룹, CLP 그룹, CLP + YW3-56 그룹 (A) 및 CLP + Cl-아미딘 그룹 (B)으로 나누었다. CLP는 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행하였다. YW-3-56 (5 mg / kg) 또는 Cl- 아미 딘 (40 mg / kg)은 CLP 후 1 시간 복막 주사를 통해 투여되었습니다. 가짜 그룹은 CLP를 제외하고 CLP 그룹과 동일한 절차를 거쳤습니다. 다양한 시점에서 혈액을 수집하고, 혈청을 준비하여 사용 전까지 -80°C에서 보관하였다. YW3-56 및 Cl-아미딘은 모두 호중구 세포외 트랩의 형성을 상당히 제한하는 펩티딜 아르기닌 데이미나제 억제제이다. 약어 : CitH3 = 시트룰린 화 히스톤 H3; CLP = 맹장 결찰 및 천자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 혈청 CitH3 농도는 CLP-유도된 패혈증 모델에서 유의하게 증가하였고, PAD 억제에 의해 완화되었다. (a) 혈청 CitH3 농도를 시험하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 가짜 그룹에서는 CitH3가 검출되지 않았습니다. CitH3 농도는 CLP 그룹에서 유의하게 증가하였고, 이러한 증가는 YW3-56 처리에 의해 차단되었다. (B) 혈청 CitH3 농도를 ELISA로 측정하였다. 가짜 그룹에서는 CitH3가 거의 검출되지 않았습니다. CLP 그룹은 CitH3에서 현저한 증가를 보였는데, 이는 Cl- 아미 딘의 투여에 의해 약화되었다. YW3-56 및 Cl-아미딘은 모두 호중구 세포외 트랩의 형성을 유의하게 제한하는 PAD 억제제이다. 약어 : CitH3 = 시트룰린 화 히스톤 H3; CLP = 맹장 결찰 및 천자; PAD = 펩티딜 아르기닌 데이미나제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CLP는 패혈증의 전임상 모델을 만들기 위해 복부에 병원체를 도입합니다. CLP를 수행 할 때, 외인성 박테리아의 간섭을 제거하고 정확한 마취제16을 사용하기 위해 멸균 조건을 사용하는 것이 중요하다. 패혈증 모델의 중증도와 재현성에 영향을 미치는 CLP의 세 가지 기술적 측면은 결찰 된 맹장의 비율, 맹장 천자에 사용되는 바늘의 크기 및 복강으로 압착 된 대변의 양입니다. 맹장의 약 75%의 결찰은 중증 패혈증을 초래하고, 50% 결찰은 중등도 패혈증을 초래하고, 25% 이하의 결찰은 경증 패혈증을 초래한다17. 천자 수와 바늘 크기는 사망률18을 결정하며, 최상의 결과는 관통 및 관통 천자에 의해 얻어집니다. 소량의 대변 (물방울)은 세균성 복막염을 일으키기에 충분하며 대변을 짜낼 때는주의가 필요합니다. CLP는 숙련 된 개인이 수행 할 때 약 10 분이 걸립니다.
본 연구에 기재된 CLP 유도성 패혈증의 마우스 모델에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, 마우스가 너무 작아서 말초 혈액 분석 및 사이토카인 측정을 위한 충분한 혈액 샘플을 얻을 수 없다. 둘째, CLP는 신생아에서 수행 할 수 없습니다. 셋째, 가변성이 여전히 발생하고 재현 가능한 결과를 얻지 못할 수 있습니다. 외과의가 연구 테스트를 수행하기 전에 CLP를 수행하는 데 적절한 연습을했는지 확인하는 것이 중요합니다.
CLP는 병태생리학적 과정 및 사이토카인 프로파일을 모방하는 패혈증의 임상적으로 현실적인 모델을 생성하며 설치류에서 널리 사용되었습니다. CLP의 중증도는 바늘의 크기와 결찰된 맹장의 비율을 조정하여 다양한 연구 목적을 수행하도록 조작할 수 있습니다. CLP 모델을 사용하여 얻은 결과에 따르면 순환 CitH3 농도를 검출하면 마우스에서 패혈증을 조기에 진단 할 수 있습니다. 혈청 CitH3 농도의 진단 적 가치는 패혈증 환자의 결과를 크게 개선하는 패혈증 치료 치료를 신속하게 시작할 수있게합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
실험을 도와주신 왕웨이 교수님과 류슈아이 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중남대학교 샹야 병원 청년연구기금(2019Q10), 후난성 국립과학재단(2020JJ4902), 중국 국립자연과학재단(제10 82202394호)의 보조금으로 지원받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
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