Summary
Detta protokoll presenterar de operativa detaljerna för cecal ligering och punktering (CLP) i en musmodell av sepsis. CLP är en av de mest använda teknikerna för att skapa en djurmodell av sepsis. Därför krävs ett standardiserat CLP-protokoll för att uppnå tillförlitliga forskningsresultat.
Abstract
Sepsis är en allvarlig livshotande och snabbt utvecklande sjukdom som orsakar miljontals dödsfall årligen över hela världen. Forskare har gjort enorma ansträngningar för att belysa patofysiologin för sepsis med hjälp av olika djurmodeller; musmodellen av sepsis inducerad av cecal ligering och punktering (CLP) används ofta i laboratorier. De tre tekniska aspekterna som påverkar CLP-modellens svårighetsgrad och replikerbarhet är andelen cecum ligerad, storleken på nålen som används för cekal punktering och volymen avföring som pressas in i bukhålan. Den snabba och specifika diagnosen sepsis är en avgörande faktor som påverkar utfallet. Guldstandarden för sepsisdiagnos är mikrobiell kultur; Denna process är dock tidskrävande och ibland felaktig. Detektionen av sepsisspecifika biomarkörer går snabbt, men de befintliga biomarkörerna är otillfredsställande på grund av kort halveringstid, icke-specificitet och otillräcklig känslighet. Därför finns det ett akut behov av en tillförlitlig biomarkör för sepsis i de tidiga stadierna. Tidigare publikationer tyder på att överdrivna neutrofila extracellulära fällor (NET) förekommer i sepsis. Citrullinerat histon H3 (CitH3), som en NET-komponent, är förhöjd både hos septiska djur och patienter, och närvaron av CitH3 är en tillförlitlig diagnostisk biomarkör för sepsis. Den aktuella studien syftade till att beskriva en standardiserad musmodell av CLP-inducerad sepsis och etablera en tillförlitlig blodbiomarkör för sepsis. Vårt arbete kan bidra till en tidig och korrekt diagnos av sepsis i framtiden.
Introduction
Sepsis definieras som livshotande organdysfunktion orsakad av ett dysreglerat värdsvar på infektion1, och septisk chock är den främsta dödsorsaken i allvarliga fall av sepsis2. Sepsis och septisk chock orsakar miljontals dödsfall världen över varje år3. Nyckeln till att förbättra resultatet för patienter med sepsis är att snabbt initiera behandlingar som antibiotika4. Guldstandardmetoden för diagnos av sepsis är mikrobiell kultur; Mikrobiell kultur är dock tidskrävande och kan leda till falskt positiva och falskt negativa resultat, vilket i hög grad begränsar den kliniska betydelsen5. Således är det mycket önskvärt att identifiera en blodbiomarkör för sepsis. Procalcitonin är erkänt som en idealisk sepsisbiomarkör men har begränsad diagnostisk effekt eftersom det inte kan skilja sepsis från sterila sjukdomar6.
Mus cecal ligering och punktering (CLP) används ofta för att skapa en modell av sepsis i vetenskaplig forskning. CLP är en av de mest använda sepsismodellerna eftersom den efterliknar polymikrobiell peritonit och aktiverar både proinflammatoriska och antiinflammatoriska immunsvar7. Det är väl accepterat att CLP skapar en mer kliniskt relevant sepsismodell än alternativa tekniker, såsom injektion av bakteriellt endotoxin. Därför anses CLP vara den klassiska sepsismodellen för användning i forskning8. En stor nackdel med CLP är dock dess reproducerbarhet, eftersom modellens svårighetsgrad påverkas av flera faktorer såsom andelen cecum ligerad, nålstorlek, antal punkteringar och laparotomiteknik. Därför finns det ett behov av att standardisera den CLP-inducerade sepsismodellen. Den aktuella studien beskriver protokolldetaljerna för den CLP-inducerade sepsismodellen för att visa det standardiserade förfarandet och öka dess reproducerbarhet.
Det inflammatoriska svaret uppträder i det tidiga skedet av sepsis, med neutrofiler som frigör alltför stora mängder oxidanter och proteaser som orsakar organskador8. En nyckelfaktor i patofysiologin för sepsis är bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET), som frigör kärn- och cytosoliska komponenter såsom DNA, citrullinerade histoner och antimikrobiella proteinaser9. Nya studier tyder på att överdriven generering av NET förmedlar patologin för sepsis; Under tiden utövar en minskning av NETs, genom enzymatisk hämning av peptidylarginindiminas (PAD) av kemikalier som YW3-56 eller Cl-amidin, en pro-överlevnadseffekt i musmodeller av sepsis10,11. Citrullinerat histon H3 (CitH3) identifierades som ett sepsisspecifikt protein 201112, och efterföljande publikationer har visat att den cirkulerande CitH3-koncentrationen är en tillförlitlig diagnostisk biomarkör för sepsis13,14. CitH3 anses vara en känsligare och mer långvarig biomarkör än prokalcitonin och är mer specifik för att skilja sepsis än inflammatoriska cytokiner13.
I denna studie har vi utvärderat en tillförlitlig diagnostisk biomarkör för sepsis i en CLP-inducerad musmodell av sepsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som godkänts av Animal Review Committee vid Xiangya Hospital och Central South University (nr 202103149).
1. Förberedelse
- Välj manliga C57BL / 6J-möss (vikt: 20-25 g; ålder: 8-12 veckor) och hus i 3 dagar innan du utför några procedurer.
- Väg musen.
- Bedöva musen med 1,5% isofluran genom inandning och nyp tårna för att kontrollera anestesidjupet.
- Fäst musen på värmedynan. Applicera hårborttagningskräm i buken och låt stå i högst 1 min innan du tar bort krämen och håret.
OBS: Normal kroppstemperatur bör bibehållas genom att placera en varm dyna under den bedövade musen under operationen.
2. Användning
- Förbered sterila kirurgiska instrument som är lämpliga för gnagaredjurkirurgi. Använd sterila handskar, ansiktsmask och kirurgisk klänning för att säkerställa aseptiska förhållanden.
- Desinficera bukhuden med jodservetter minst tre gånger. Täck det operativa kirurgiska området med sterila kirurgiska draperier.
- Använd steril kirurgisk sax för att göra ett snitt på cirka 2 cm i bukväggen längs linea alba.
OBS: Skada inte organen. - Identifiera och isolera cecum ut ur bukhålan med steril pincett.
- Ligate 75% av cecumens volym med 4-0 silkesutuer. Ligera inte de mesenteriska blodkärlen.
OBS: Procentandelen av cecum som ligeras bestämmer svårighetsgraden av sepsis. - Punktera cecum genom att skapa en genomgående perforering (två hål) med en 21 G nål (från ena sidan genom cecalväggen till motsatt sida) vid mittpunkten mellan svansänden och ligeringssatsen.
- Kassera nålen. Pressa försiktigt en liten droppe avföring ur cecum genom penetrationshålen.
OBS: Mängden avföring som pressas in i bukhålan bör vara konsekvent, eftersom detta också bestämmer svårighetsgraden av sepsis. Steg 2.5-2.7 bör hoppas över för skenmöss. - Byt försiktigt ut cecum i bukhålan.
- Stäng bukmuskeln och huden separat med 6-0 silkesutueturer.
- Desinficera snittet med jod.
- Injicera ketoprofen (5 mg/kg) i nedre vänstra kvadranten av buken för att undvika cecum. Placera musen på en varm dyna tills den har återhämtat sig helt från bedövningsmedlet.
- Placera musen i en bur i ett temperaturkontrollerat rum (22 °C) och ge fri tillgång till mat och vatten. Kontrollera musen var 6: e timme under den första veckan postoperativt.
- Avliva musen genom överdosering av koldioxid när symtom på sepsis uppfyller de fördefinierade slutpunkterna.
3. Behandling
- Dela slumpmässigt möss i skengruppen, CLP-gruppen, CLP + YW3-56-gruppen (figur 2a) och CLP + Cl-amidingruppen (figur 1).
OBS: Bluffgruppen genomgick samma procedurer som CLP-grupperna utom CLP. YW3-56 (5 mg/kg) eller Cl-amidin (40 mg/kg) administrerades via peritoneal injektion 1 h efter steg 2.9 vid suturering av muskeln och hudlagret. - Provskörd
- Skörda perifert blod från retrobulbar plexus15 24 h efter operationen.
- Bered serumet genom centrifugering (1 000 x g, 5 min) och förvara det vid -80 °C tills det används.
- Mät CitH3-koncentrationen med hjälp av ett indirekt ELISA-kit för sandwich som tidigare beskrivits13.
- Täck den monoklonala anti-CitH3-antikroppen på en 96-brunnsplatta för att fånga CitH3-proteinet.
- Behandla serumet med DNase I (150 enhet/ml, 37°i 1 h) och inkubera i brunnarna (20 μl, rumstemperatur).
- Tillsätt anti-CitH3 polyklonal antikropp (0,33 μg/ml, 100 μl, 2 timmar) för att detektera det fångade CitH3-proteinet.
- Inkubera den antikaninperoxidasmärkta sekundära antikroppen (0,02 μg/ml, 100 μl, 1 h) i brunnarna.
- Efter noggrann tvättning, utveckla brunnarna med 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (100 μl, 20 min).
OBS: Ytterligare protokollinformation om ELISA-satsen finns i tidigare publikation13.
- Statistisk analys
- Utför envägs ANOVA för att analysera skillnaderna mellan de tre grupperna, följt av Bonferroni post hoc-testning för flera jämförelser. Använd en statistisk programvara för att utföra analysen. p-värden på 0,05 eller mindre ansågs signifikanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som visas i figur 2A upptäcktes ingen CitH3 i skengruppen genom western blotting. Serum CitH3-koncentrationen ökade signifikant efter CLP, och denna ökning blockerades av hämningen av NET-bildning via administrering av YW3-56, en PAD-hämmare10. Figur 2B visar serumCitH3-koncentrationerna bestämda av ELISA. Vid 24 timmar efter CLP ökade serumkoncentrationen av CitH3 i CLP-grupperna jämfört med skengruppen (p = 0,0008), och denna CitH3-ökning dämpades signifikant av Cl-amidin, en PAD-hämmare som begränsar NET-bildning (p = 0,0028).
Figur 1: Experimentell gruppering. Möss delades slumpmässigt in i skengruppen, CLP-gruppen, CLP +YW3-56-gruppen (A) och CLP + Cl-amidingruppen (B). CLP utfördes enligt beskrivningen i protokollet. YW-3-56 (5 mg/kg) eller Cl-amidin (40 mg/kg) administrerades via peritoneal injektion 1 h efter CLP. Bluffgruppen genomgick samma procedurer som CLP-grupperna förutom CLP. Blod samlades in vid olika tidpunkter och serum bereddes och lagrades vid -80 °C tills det användes. YW3-56 och Cl-amidin är båda peptidylarginindeiminashämmare som signifikant begränsar bildandet av neutrofila extracellulära fällor. Förkortningar: CitH3 = citrullinerad histon H3; CLP = cecal ligering och punktering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Serum CitH3-koncentrationen ökade signifikant i den CLP-inducerade sepsismodellen och lindrades av PAD-hämning . (A) Western blotting utfördes för att testa serumkoncentrationen av CitH3. Ingen CitH3 upptäcktes i bluffgruppen. CitH3-koncentrationen ökade signifikant i CLP-grupperna, och denna ökning blockerades av YW3-56-behandling. (B) Serum CitH3-koncentrationerna mättes med ELISA. Nästan ingen CitH3 upptäcktes i bluffgruppen. CLP-grupperna visade markanta ökningar av CitH3, vilket dämpades av administreringen av Cl-amidin. YW3-56 och Cl-amidin är båda PAD-hämmare som signifikant begränsar bildandet av neutrofila extracellulära fällor. Förkortningar: CitH3 = citrullinerad histon H3; CLP = cecal ligering och punktering; PAD = peptidylarginindeiminas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP introducerar patogener i buken för att skapa en preklinisk modell av sepsis. Vid utförande av CLP är det viktigt att använda sterila förhållanden för att eliminera störningar av exogena bakterier och att använda exakta doser av anestetika16. De tre tekniska aspekterna av CLP som påverkar svårighetsgraden och replikerbarheten hos sepsismodellen är procentandelen av cecum ligerad, storleken på nålen som används för cekal punktering och volymen avföring som pressas in i bukhålan. Ligering av cirka 75% av cecum resulterar i svår sepsis, 50% ligering resulterar i måttlig sepsis och 25% ligering eller mindre resulterar i mild sepsis17. Antalet punkteringar och nålstorleken bestämmer dödligheten18, och det bästa resultatet uppnås genom genomgående punktering. En liten mängd (en droppe) avföring räcker för att orsaka bakteriell peritonit, och vård krävs när man klämmer ut avföringen. CLP tar cirka 10 minuter när det utförs av en erfaren individ.
Musmodellen av CLP-inducerad sepsis som beskrivs i denna studie har flera begränsningar. För det första kan musen vara för liten för att få tillräckligt med blodprover för perifer blodanalys och cytokinmätning. För det andra kan CLP inte utföras på nyfödda djur. För det tredje förekommer fortfarande variabilitet, och reproducerbara resultat kan inte erhållas. Det är viktigt att se till att kirurgerna har haft tillräcklig praxis för att utföra CLP innan de utför forskningstester.
CLP skapar en kliniskt realistisk modell av sepsis som efterliknar den patofysiologiska processen och cytokinprofiler och har använts i stor utsträckning hos gnagare. Svårighetsgraden av CLP kan manipuleras för att uppfylla olika studieändamål genom att justera nålens storlek och procentandelen av cecum ligerad. Enligt våra resultat som erhållits med hjälp av CLP-modellen möjliggör detektering av den cirkulerande CitH3-koncentrationen tidig diagnos av sepsis hos möss. Det diagnostiska värdet av serum CitH3-koncentration möjliggör snabb initiering av anti-sepsisbehandlingar som avsevärt förbättrar resultaten hos septiska individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Vi tackar professor Wang Wei och doktor Liu Shuai för att de hjälpte till med experimenten. Detta arbete finansierades av bidrag från Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (nr 2019Q10), från National and Science Foundation of Hunan-provinsen (nr 2020JJ4902) och från National Natural Science Foundation of China (nr 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
