Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Abstract

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücrelerden salınan, tüm biyoakışkanlarda bulunan ve türetildikleri ana hücreyi yansıtan proteinler, nükleik asitler ve lipitler içeren nano boyutlu lipit-membrana bağlı yapılardır. EV'lerin bir numunedeki diğer bileşenlerden uygun şekilde ayrılması, ilişkili kargolarının karakterizasyonuna izin verir ve sayısız hastalık için hücreler arası iletişimciler ve invaziv olmayan biyobelirteçler olarak potansiyelleri hakkında fikir verir. Bu çalışmada, oligodendrosit türevi EV'ler, EV'leri diğer hücre dışı proteinlerden ve protein komplekslerinden ayırmak için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) dahil olmak üzere en son tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak hücre kültürü ortamından izole edildi. Ticari olarak temin edilebilen SEC kolonları kullanılarak, EV'ler hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendroglioma hücrelerinden salınan hücre dışı proteinlerden ayrıldı. Kanonik EV belirteçleri CD9, CD63 ve CD81, 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, ancak 5-8 fraksiyonlarında gözlenmedi. Golgi aparatının bir proteini olan GM130 ve ER'nin ayrılmaz bir proteini olan kalneksin, negatif EV belirteçleri olarak kullanıldı ve herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Ayrıca, EV fraksiyonu olarak 1-4 fraksiyonlarını ve protein fraksiyonu olarak 5-8 fraksiyonlarını bir araya getirip yoğunlaştırırken, EV fraksiyonunda CD63, CD81 ve CD9 ekspresyonu gözlenmiştir. GM130 veya kalneksin ekspresyonu, fraksiyon tiplerinin hiçbirinde gözlenmedi. Hem kontrol hem de ER stres koşullarından toplanan fraksiyonlar transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirildi ve veziküller EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi. EV'deki parçacıklar ve her iki koşuldan protein fraksiyonları da nanopartikül izleme analizi ile ölçüldü. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri şartlandırılmış hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Introduction

Hücre dışı vezikülleri (EV'ler) incelemeye olan ilginin patlamasına, bu nano boyutlu, heterojen parçacıkları ayırmak ve incelemek için kullanılan teknoloji ve tekniklerdeki büyük gelişmeler eşlik etmiştir. Yaklaşık kırk yıl önce 1,2 keşfedilmelerinden bu yana geçen sürede, bu küçük membranöz yapıların biyoaktif lipitler, nükleik asitler ve proteinler içerdiği ve hücreler arası iletişimde önemli roller oynadığı bulunmuştur 3,4. EV'ler tüm hücre tiplerinden salınır ve bu nedenle kan plazması ve serum, tükürük ve idrar dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvılarda bulunur. Bu sıvıların içindeki EV'ler, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar, kanserler ve otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için invaziv olmayan biyobelirteçler olarak hizmet etme konusunda büyük umut vaat etmektedir 5,6,7. Ayrıca, in vitro mekanik çalışmalar, kültür ortamı 3,8,9'a salınan EV'leri ayırarak hücre kültürü teknikleri aracılığıyla gerçekleştirilebilir.

EV'lerin hastalık patofizyolojisindeki rolünü anlamak için, bulundukları sıvıdan yeterli ayrılma çok önemlidir. EV ayırma için altın standart uzun zamandır diferansiyel ultrasantrifüjleme (dUC)10 olmuştur, ancak EV'lerin diğer hücre dışı bileşenlerden daha iyi ayrılmasını sağlamak için daha sofistike teknikler ortaya çıkmıştır. Bu tekniklerden bazıları yoğunluk gradyanları, asimetrik akış alanı-akış fraksiyonu (A4F), akış sitometrisi, immünocapture, polietilen glikol çökeltmesi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) 11,12,13'tür. Her tekniğin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır; Bununla birlikte, özellikle SEC'in EV'leri hem biyolojik sıvılardan hem de hücre kültürü süpernatantlarından oldukça etkili bir şekilde ayırdığı gösterilmiştir 8,14,15. SEC ayrıca nispeten basit ve kullanıcı dostu olma bonusuna sahiptir.

SEC, bir sıvının bileşenlerini boyuta göre ayıran bir yöntemdir. Bu teknikle, bir numuneyi fraksiyone etmek için bir reçine sütunu (şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın alınan) kullanılır. Numunedeki küçük parçacıklar reçine içindeki boncuklar arasında sıkışıp kalırken, daha büyük parçacıklar reçineden daha serbest bir şekilde geçebilir ve böylece işlemin başlarında ortaya çıkabilir. EV'ler birçok hücre dışı proteinden ve protein agregalarından daha büyük boyuttadır, EV'ler kolondan daha hızlı geçer ve hücre dışı proteinlerden daha erken fraksiyonlarda süzülür14.

Bu yöntem makalesinde, EV'lerin hücre kültürü ortamından (CCM) hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendrositlerinden ayrılması için SEC'in kullanımı özetlenmiştir. Bu protokolü kullanarak, bu teknikle ayrılan EV'lerin, birlikte toplanabilen ve aşağı akış karakterizasyonu için konsantre edilebilen spesifik fraksiyonlar içinde bulunduğu ve ayrılan EV'lerin, CCM'yi desteklemek için kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi eksojen bir kaynaktan değil, hücrelerden türetildiği gösterilmiştir. EV fraksiyonlarında kanonik EV belirteçleri, CD63, CD81 ve CD916,17,18,19'un varlığı ve protein fraksiyonlarında yokluğu batı lekelenmesi ile gösterilmiştir. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak, EV'ler görselleştirilir ve beklenen morfolojiyi gösterir ve sadece EV fraksiyonunda gözlenir. Parçacıklar ayrıca hem kontrol hem de ER stres koşullarının EV ve protein fraksiyonlarında sayılır ve EV numunelerinde 50-200 nm çapında beklenen boyut aralığında çok sayıda parçacık gözlenir. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili ve etkili bir yöntem olduğu fikrini desteklemektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Steriliteyi korumak için hücre kültürü reaktiflerini hücre kültürü davlumbazında yapın.

  1. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması
    1. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptokok (Pen-Strep) ekleyerek normal yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Hücreleri kültürlemek ve genişletmek için bu ortamı kullanın.
    2. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL eksozom tükenmiş FBS ve 5 mL Pen-Strep ekleyerek eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Bu medyayı EV izolasyonundan önce hücre tedavileri için kullanın.
    3. 1 mL dimetil sülfoksite (DMSO) 10 mg tunikamisin ekleyerek tunikamisin hazırlayın. 0,2 mL tüplerde 50 μL alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın.
  2. EV ayırma reaktiflerinin hazırlanması
    1. 1 L dereceli bir silindirde 1 L deiyonize (DI) suya 9.89 g PBS tozu ekleyerek 1x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. PBS çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın.
    2. PBS eklemeden önce cam eşyaları sterilize etmek için otoklav kullanın. Cam eşyaları bir kutuya koyun, kapıyı kapatın ve 121 ° C'de 30 dakika sterilize edin.
    3. Laminer akış kabininin içinde, 0,22 μm filtreye bir vakum bağlayın ve filtreyi otoklavlanmış şişenin üzerine yerleştirin. PBS'yi yavaşça filtrenin üzerine dökün ve filtrelenmiş PBS'yi otoklavlanmış şişede toplayın.
    4. 500 mL dereceli bir silindirde 500 mL 1x PBS'ye 9.99 g sodyum hidroksit ekleyerek 0.5 M sodyum hidroksit hazırlayın. Sodyum hidroksit PBS'ye çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın ve ardından 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak otoklavlanmış 500 mL'lik bir şişeye filtreleyin.
    5. 500 mL dereceli bir silindirde 500 mL 1x PBS'ye 0.25 g sodyum azid ekleyerek% 0.05 sodyum azid hazırlayın. Sodyum azid PBS'ye çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın ve ardından 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak otoklavlanmış 500 mL'lik bir şişeye filtreleyin.
  3. Protein izolasyonunun hazırlanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanması reaktifleri
    1. 1 mL 1 M Tris (pH 7.4), 1 mL% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 g deoksikolat, 1 mL NP-40 ve 0.89 g sodyum klorür (NaCl) birleştirerek 100 mL RIPA lizis tamponu hazırlayın. DamıtılmışH2O ile hacmi 100 mL'ye getirin ve 4 °C'de saklayın. RIPA artı fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi yapmak için, 15 mL'lik bir tüpte her 1 mL RIPA tamponu için 10 μL fosfataz ve proteaz inhibitörü ekleyin ve çözeltiyi 4 ° C'de saklayın.
    2. Kullanımdan hemen önce, BCA tahlil kiti tarafından sağlanan 10 mL reaktif A ve 200 μL reaktif B ekleyerek BCA tahlili çalışma reaktifini 15 mL'lik bir tüpe hazırlayın. Kullanımdan hemen önce, 15 mL'lik bir tüpe 25 parça reaktif A, 24 parça reaktif B ve 1 parça reaktif C ekleyerek mikroBCA testi çalışma reaktifini hazırlayın.
    3. 1 L DI suya 30.3 g Tris bazı, 144 g glisin ve 10 g SDS ekleyerek 10x jel elektroforez çalışma tamponu hazırlayın. Çalışan tamponu 4 °C'de saklayın. 3.03 g Tris bazı, 14.4 g glisin ve 200 mL metanol ekleyerek 1x transfer tamponu hazırlayın ve hacmi DI su ile 1 L'ye ayarlayın. Transfer tamponunu 4 °C'de saklayın.
    4. 1 L DI suyuna 2.4 g Tris bazı, 8 g NaCl ve 1 mL Tween-20 ekleyerek Tris tamponlu salini Tween-20 (TBS-Tween) ile hazırlayın. TBS-Ara'yı 4 °C'de saklayın.
    5. 100 mL TBS-Ara'ya 5 g toz yağsız süt ekleyerek% 5 bloke edici çözelti hazırlayın. Blokaj tamponunu 4 °C'de saklayın.
    6. Kullanımdan hemen önce, 15 mL'lik bir tüpe 4 mL peroksit çözeltisi ve 4 mL luminol / arttırıcı çözeltisi ekleyerek kemilüminesan substratı hazırlayın ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin.

2. Hücrelerin kültürlenmesi ve işlenmesi

  1. Her biri 2.3 x 106 insan oligodendroglioma (HOG) hücresine sahip iki T175 hücre kültürü şişesini tohumlayın. Normal yüksek glikoz DMEM'in son hacmini 25 mL'ye getirin ve 48 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 48 saatin sonunda, 37 ° C'lik bir su banyosunda ılık eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM. Tedavi için, 25 mL eksozom tükenmiş ortama 25 μL 10 mg / mL tunikamisin, ER stresini indüklemek için son konsantrasyonda 10 μg / mL tunikamisin ekleyin. Kontrol için, 25 mL eksozom tükenmiş ortama 25 μL DMSO ekleyin.
  3. Normal yüksek glikoz DMEM'ini hücrelerden çıkarın ve atın ve hücreleri nazikçe durulayın ve 10 mL 1x PBS ile şişeleyin. PBS'yi aspire edin ve atın.
  4. Kontrol etiketli şişeye 25 mL kontrol ortamı ve şişe etiketli işleme 25 mL 10 μg/mL tunicamisin ekleyin. Şişeleri 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün.

3. Şartlandırılmış CCM'nin toplanması ve konsantrasyonu (Şekil 1)

  1. PBS'yi 37 °C su banyosuna yerleştirin. Şişeleri 10x ve 100x objektif lensli bileşik bir mikroskop altında gözlemleyin. Şişeler arasındaki farkları not alın. Hem kontrol hem de işlem görmüş şişeler için aşağıdaki adımları uygulayın.
  2. Medyayı şişeden çıkarın ve 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
  3. Tüpü 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
  4. Dört adet 15 mL 3 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi elde edin ve her tüpe 5 mL PBS ekleyin. Ultrafiltrasyon ünitelerini 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj ederek filtreyi astarlayın.
    NOT: Hücrelerden salınan tüm hücre dışı proteinleri tutmak için mevcut protokolde 3 kDa moleküler ağırlık kesme ultrafiltrasyon üniteleri kullanılmıştır. Daha büyük moleküler ağırlıklı kesme ultrafiltrasyon üniteleri (örneğin, 30 kDa) da bu protokolle çalışacaktır, ancak 30 kDa'dan küçük hücre dışı proteinler filtrelenecek ve20,21 örneklerinden çıkarılacaktır.
  5. PBS'yi ultrafiltrasyon birimlerinden çıkarın. Süpernatantı her koşuldan (kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş) her biri iki ultrafiltrasyon ünitesine, her birinde yaklaşık 12.5 mL ortama bölün.
  6. Tüpleri 4.000 x g'de 4 ° C'de 1 saat 45 dakika boyunca veya her ultrafiltrasyon ünitesindeki konsantre ortam (retentat olarak adlandırılır) 250 μL veya daha azına konsantre olana kadar santrifüj edin.
  7. Retentatı her iki kontrol ultrafiltrasyon ünitesinden etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Retentatı her iki işlenmiş ultrafiltrasyon ünitesinden başka bir etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  8. Her mikrosantrifüj tüpündeki retentatın toplam hacmini 500 μL olacak şekilde ölçün. Numune 500 μL'den küçükse, son hacim 500 μL olana kadar 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ekleyin.

4. Hücre toplama

  1. Tripsin, PBS ve eksozom tükenmiş DMEM'i 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hem kontrol hem de tedavi şişelerine 7 mL tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
  2. Hücrelerin kaldırılıp kaldırılmadığını görmek için mikroskop altında görüntüleyin. Hücreler kaldırılmazsa, hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi elin avucuna sıkıca dokunun.
  3. Şişeyi 7 mL eksozom tükenmiş DMEM ile yıkayın. Şişedeki hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL tüplere yerleştirin.
  4. Tüpleri 4 °C'de 500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletine 5 mL 1x PBS ekleyin. Peletin parçalanması için pipetle hafifçe karıştırın.
  5. Tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletine, karıştırmak için pipete 200 μL RIPA artı fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin.
  6. RIPA çözeltisindeki hücreleri 1,5 mL tüplere aktarın. Tüpleri 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Tüpleri tedavi durumu ve tarihi ile etiketleyin. Tüpleri -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

5. Boyut dışlama kromatografisi kullanılarak EV ayrımı (Şekil 2)

NOT: Aşağıdaki adımları iki kez, bir kez kontrol retentat için ve bir kez tunikamisin ile tedavi edilmiş retentat için gerçekleştirin.
NOT: Bu bölümde kullanılan PBS, 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS'dir.

  1. Otomatik kesir toplayıcıyı (AFC) açın ve sekiz kesir, kesir başına 0,5 mL ve arabellek (boşluk) ses seviyesini varsayılan olarak toplamak için ayarları yapın.
    NOT: AFC çalışma koşulları aşağıdaki gibidir: sütun/yatak hacmi = 10 mL; boşluk hacmi = 2,70 mL; yıkama hacmi = 15 mL; optimal fraksiyon boyutu = 500 μL; çalıştırma başına gerekli tampon = 65 mL; 20 °C'de akış hızı = 1,0 mL/dak; sütunun yeniden kullanılabilirliği = beş kullanım.
  2. Kolonu 4 °C'den çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve başlamadan önce (genellikle ~ 30 dakika) sütunun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
  3. Retentat numunelerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin. Beklerken, AFC atlıkarınca içinde kapakları içe dönük olacak şekilde sekiz adet etiketli 1,5 mL tüp yerleştirin.
  4. Barkodu okuyucuya bakacak şekilde AFC'ye sütun yerleştirin. Atlıkarınca içinde tüpler olduğunu ve atık toplayıcının düzgün çalıştığını doğrulamak için ekrandaki talimatları izleyerek toplamaya başlayın.
  5. Depolama arabelleği sütun matrisinin üst kısmına tamamen emildikten sonra sütuna 15 mL 1x PBS ekleyerek sütunu temizlemeye başlayın. PBS'yi çok erken eklemeyin, çünkü bu depolama arabelleğini seyreltir ve yeterli yıkamayı önler.
  6. 15 mL'lik PBS'nin tamamı matris tarafından emilmeden hemen önce, yıkamayı durdurmak ve sütun matrisinin üst kısmındaki artık PBS'yi bir mikropipetle çıkarmak için Tamam'ı tıklatın. Matrise dokunmayın.
  7. Kolonun ortasına 500 μL örnek ekleyin. Çalıştırmaya başlamak için Tamam'ı tıklatın. Numunenin matrise emilmesini izleyin ve numune tamamen emildikten hemen sonra sütuna hızlı bir şekilde 8 mL PBS ekleyin.
  8. AFC, boşluk hacmini otomatik olarak atlıkarınca merkezine atar ve ardından her biri 500 μL'lik sekiz fraksiyonun tümünü toplar. Koşunun sonunda, atlıkarınca kesirlerini çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. 1-4 fraksiyonları EV'leri içerirken, 5-8 fraksiyonları hücre dışı proteinler içerir. Döngünün ortasından boşluk hacmini kaldırın.
  9. Sütundan kalan herhangi bir örneği yıkamak için sekiz fraksiyon toplandıktan sonra sütuna 10 mL PBS ekleyin. Retentate örneği sütundan tamamen temizlendikten sonra, sütuna 15 mL 1x PBS ekleyin.
  10. Son PBS matris tarafından emildiğinden, kolonun matrisinin merkezine 500 μL 0,5 M sodyum hidroksit ekleyin. Sodyum hidroksit emildiğinde, kolona 30 mL 1x PBS ekleyin ve akmasına izin verin.
  11. Başka bir numune çalıştırıyorsanız, döngüye sekiz adet etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü ekleyin ve 5,7-5,10 arasındaki adımları tekrarlayın.
  12. Tüm örneklerle işiniz bittiğinde, sütunu daha sonra kullanmak üzere korumak için aşağıdaki adımları tamamlayın. Adım 5.10'da belirtildiği gibi sütundan 30 mL PBS akıttıktan sonra, sütuna 15 mL% 0.05 sodyum azid ekleyin.
  13. Kolon matrisinin üstüne yaklaşık 5 mL sodyum azid bırakın. Sütunu AFC'den çıkarın ve üst ve alt kapakları takın. Depolama için sütunu 4 ° C'ye geri yerleştirin (sütun beş defaya kadar kullanılabilir).

6. EV ve protein fraksiyonlarının ultrafiltrasyonu

  1. Numune başına iki adet 2 mL, 3 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi elde edin. EV fraksiyonlarını (fraksiyonlar 1-4) konsantre etmek için bir birim ve protein fraksiyonlarını (fraksiyonlar 5-8) konsantre etmek için diğerini kullanın. Her ünite üç bölümden oluşur: koni, filtre ve akış silindiri; her parçayı düzgün bir şekilde etiketleyin.
  2. Ultrafiltrasyon ünitesini oluşturun ve filtre kısmına 1 mL 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ekleyin ve koni parçasıyla kapatın. Ultrafiltrasyon ünitesini, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.500 x g'de koni tarafı yukarı doğru santrifüj edin.
  3. Filtrelenmiş PBS'yi akış silindirinden çıkarın. Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin (koni tarafı aşağı) ve 4 °C'de 1.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan PBS'yi koniden çıkarın.
  4. Her ultrafiltrasyon ünitesine uygun fraksiyonları (500 μL hacmin tamamı) ekleyin (toplam hacim 2 mL olacaktır). Santrifüj sütunları, 4 ° C'de 3.500 x g'de 1 saat 45 dakika boyunca veya retentat seviyesi 100 μL'de olana kadar koni tarafı yukarı doğru uzanır.
  5. Akış silindirini çıkarın ve içinden akışı atın. Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin (koni tarafı aşağı) ve 4 °C'de 1.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Konideki retentatı etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her numune hacmini 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ile 150 μL'ye getirin. Tüpleri -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

7. Medya kontrolleri

  1. İki T175 hücre kültürü şişesi elde edin. Bir şişe kontrolünü ve diğer tedaviyi etiketleyin. 37 °C su banyosunda ılık eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM.
  2. 25 mL ortama 25 μL tunikamisin stok çözeltisi (10 mg / mL) ekleyin ve şişe etiketli işleme koyun. 25 mL ortama 25 μL DMSO ekleyin ve şişe etiketli kontrole koyun. Şişeleri 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
  3. 3.2-3.8 numaralı adımlarda belirtildiği gibi EV'leri ayırmak için medya ve süreç toplayın. Daha sonra, bölüm 5 ve 6'da açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.

8. Batı lekelenmesi

  1. BCA testi ile hücre lizatlarından ve protein fraksiyonlarından protein nicelleştirmesi
    NOT: Hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden protein niceliği aşağıdaki adımlarla gerçekleştirilir.
    1. Lize edilmiş hücreleri ve protein fraksiyonlarını buz üzerinde çözün. Her numune için üç seyreltme tüpü yapın; 1:2, 1:10 ve 1:100.
    2. 96 kuyucuklu berrak tabanlı bir tahlil plakasına, 25 μL sığır serum albümini (BSA) protein standartlarına ve her numune seyreltmesinin 25 μL'sine üçlü olarak yükleyin. Çok kanallı pipet kullanarak standart veya numune içeren her bir kuyucuğa 200 μL çalışma reaktifi ekleyin.
    3. Plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından plakayı 562 nm emici bir plaka okuyucu ile okuyun. Her numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre lizatları için 20 μg protein ve protein fraksiyonları için 15 μg protein elde etmek için gereken numune hacmini belirleyin.
  2. MikroBCA testi ile EV fraksiyonlarından protein nicelleştirme
    1. EV örneklerini buz üzerinde çözün. Her örnek için iki seyreltme yapın: 1:50 ve 1:100.
    2. 96 kuyucuklu şeffaf tabanlı bir tahlil plakasına, 100 μL BSA protein standartlarına ve her numune seyreltmesinin 100 μL'sine üçlü olarak yükleyin. Çok kanallı pipet kullanarak standart veya numune içeren her bir kuyucuğa 100 μL microBCA çalışma reaktifi ekleyin.
    3. Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından plakayı 562 nm emici bir plaka okuyucu ile okuyun. Her numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın ve EV fraksiyonları için 15 μg protein elde etmek için gereken numune hacmini belirleyin.
  3. Batı lekelenmesi
    NOT: Batı lekeleme protokolü22'de açıklananlara benzer şekilde gerçekleştirilmiş ve aşağıda belirtildiği gibi değiştirilmiştir.
    1. Üreticinin talimatlarını kullanarak, jel yapım kiti ile% 10 poliakrilamid jeller yapın.
    2. Jel elektroforezi için, 1.5 mL'lik bir tüpte, 20 μg protein için gerekli hücre lizatının hacmini, 5 μL 4x Laemmli tamponunda ve toplam hacmi 20 μL'ye getirmek için gerekli RIPA tamponunun hacmini birleştirerek hücre lizat örnekleri hazırlayın.
    3. 15 μg protein, 5 μL 4x Laemmli tamponu ve RIPA tamponu için gerekli numune hacmini 1,5 mL'lik bir tüpte birleştirerek EV ve protein fraksiyonu numuneleri hazırlayın.
    4. 1,5 mL'lik bir tüp 15 μL numune ve 5 μL 4x Laemmli tamponunda birleştirerek ortam kontrol numuneleri hazırlayın.
      NOT: Kullanılacak antikorlara bağlı olarak, Laemmli tamponunun 50 mM ditiyotreitol (DTT) gibi bir indirgeyici ajan içermesi gerekebilir veya gerekmeyebilir.
    5. Tüm numuneleri 95 ° C'de 5 dakika kaynatın, numuneleri soğuması için buza aktarın ve 10.000 x g'de 30 s için kısaca santrifüj yapın, ardından numuneleri buza geri verin.
    6. Elektroforez tankına jeller ekleyin ve 1x jel elektroforez çalışma tamponu ekleyin. 15 μL protein merdiveni ve 20 μL numune yükleyin. Jeli 200 V'ta 30-50 dakika boyunca veya numuneler jelin dibine ulaşana kadar, akmadan hemen önce çalıştırın.
    7. Proteini, 100 V'ta 30 dakika boyunca veya transfer tamamlanana kadar 4 ° C'de 1x transfer tamponu olan bir PVDF membranına aktarın. Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3, transfer tamamlandıktan sonra her lekenin lekesiz görüntülerini gösterir.
    8. Membranı %5 süt/TBS-Ara'da oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca bloke edin. Membranı birincil antikor çözeltisinde gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Antikor seyreltme bilgileri için Tablo 1'e bakınız.
    9. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın ve membranı 3x TBS-Tween ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde yıkayın.
    10. % 5 süt / TBS-Ara'da uygun ikincil antikorları hazırlayın. Seyreltme bilgileri için Tablo 1'e bakın. Membrana ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin, ardından bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca TBS-Tween ile 3x yıkayın.
    11. Membrana kemilüminesan substrat ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kolorimetrik ve kemilüminesan analiz kullanılarak görüntü lekesi. Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6, her lekenin kırpılmamış görüntülerini gösterir.

9. TEM görüntüleme

  1. Hidrokarbonları uzaklaştırmak ve ızgaraları hidrofilik hale getirmek için23 400 örgü karbon / formvar kaplı ızgaraları kızdırma deşarjı.
  2. Izgaralara 5 μL EV veya protein fraksiyonu örneği ekleyin. Izgaraları oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Filtre kağıdı ile fitil yaparak fazla çözeltiyi çıkarın. Izgaraları 5 μL nanosaf su ile yıkayın ve fazlalığı fitil ile temizleyin.
  4. 5 μL% 1 sulu uranil asetat uygulayın ve hemen fitil yapın. Izgaraların kurumasına izin verin. Bir iletim elektron mikroskobunda 120 kV'luk görüntü ızgaraları ve yüklü çift cihaz kamerasıyla görüntü yakalar.

10. Nanopartikül izleme analizi (NTA)

  1. -80 °C'den EV ve protein fraksiyonu örnekleri alın ve buz üzerinde çözün.
  2. Bilgisayarı ve NTA aygıtını açın. NTA yazılımını açtığınızda otomatik olarak başlatılmaya başlayacaktır.
  3. Parçacıksız su içeren uygun pompayı seçin ve hücreyi durulamak için Cihazı Durula'ya tıklayın. Durulama sırasında, bir şırınga kullanarak aletin önündeki enjeksiyon portuna 10-20 mL parçacıksız su enjekte edin ve hava kabarcıklarından kaçının.
  4. Hücre kalitesi kontrol ekranı açılacaktır; tıklayın Tamam ve hücre kalitesi kontrolü başlayacaktır. Kontrol başarıyla geçildikten sonra, otomatik hizalama açılır ekranı görünecektir: Lütfen hücreyi 100 nm hizalama süspansiyonu ile doldurun (seyreltme 1: 250.000).
    1. Bir tüpe 10 mL parçacıksız su ve 10 μL 100 nm polistiren boncuk ekleyerek hizalama süspansiyonunun seyreltme 1'ini hazırlayın (1:1.000 seyreltme). Karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Seyreltme 1, 4 °C'de 2-3 günlük raf ömrüne sahiptir.
    2. 1:250.000 seyreltme oluşturmak için bir tüpe 20 mL parçacıksız su ve 80 μL seyreltme 1 (1:1.000) ekleyerek hizalama süspansiyonunun seyreltme 2'sini oluşturun. Karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. Seyreltme 2, oda sıcaklığında 30-60 dakika raf ömrüne sahiptir.
  5. Hücreyi 2 mL seyreltme 2 (1:250.000) ile doldurun. Tamam'a tıkladığınızda program otomatik hizalamayı (odak) ve odak optimizasyonunu tamamlayacaktır. Analiz sekmesi, bir paraboldeki ölçüm hücresinin temizliğinin ve simetrisinin sonuçlarını sağlayan bir profil oluşturarak açılacaktır. Bir açılır ekran şunları belirtir: Video Mikroskobunu Görüntüle artık deneyler için hazır, görünecektir; Tamam'ı tıklattığınızda program hücre denetimi sekmesine geri dönecektir.
  6. Hücreyi yıkamak için enjeksiyon portuna parçacıksız su enjekte ederek polistiren boncukları hücreden durulayın. Tespit edilen partikül sayısı 0-10 arasında olana kadar (genellikle 5-10 mL arasında) yıkamaya devam edin. İlk numune için hücreyi hazırlamak üzere 1 mL 0,22 μm filtrelenmiş PBS ekleyin.
  7. İlk numuneyi 0,22 μm filtrelenmiş PBS ile seyreltin (1:1000 seyreltme ile başlayın) ve seyreltme faktörünü programa girin. Hücreye 1 mL numune yerleştirin ve başlangıçta ekran boyunca çok hızlı hareket edecekleri için parçacık hareketinin yavaşlaması için 5 dakika bekleyin. Hassasiyeti ve deklanşörü sırasıyla 75,0 ve 100 olarak ayarlayın.
  8. İdeal numune seyreltmesi için tespit edilen partikül sayısı 50-200 partiküldür. 50'nin altında veya 200'ün üzerinde partikül bildirilirse, numunenin seyreltilmesini ayarlayın. Yeni bir seyreltme gerekiyorsa, 0-10 partikül tespit edilene kadar hücreyi parçacıksız suyla yıkayın. Seyreltilmiş numune eklemeyi tekrarlayın ve ideal seyreltme bulunana kadar yıkayın.
  9. Parçacık hareketinin yavaşladığını görselleştirmek için 11 kamera konumunun tümünü kontrol edin ve algılanan parçacık sayısının tüm kamera konumları arasında benzer olduğundan emin olun. Parçacık sayısı kamera konumları arasında büyük farklılıklar gösteriyorsa, daha fazla örnek ekleyin.
  10. Ölçüm sekmesine tıklayın ve Video Çekimini Çalıştır'ı çalıştırın. Video alma sekmesinin altında, örnek için özel bir ad girin ve güvenli bir konum belirleyin. Verileri kaydetmek için otomatik kaydet.txt ve otomatik kaydet.pdf kutularını işaretleyin.
  11. Sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlayın, lazeri ayarlamak için 488 nm'ye tıklayın ve kamera konumları için 11'e tıklayın. Veri toplamayı çalıştırmak için Tamam'ı tıklatın. Program, 11 pozisyonun hepsinde parçacık sayısını ve boyutunu analiz etmeye başlayacaktır. Analiz sekmesinin altında, x ekseninde çap/nm ve y ekseninde parçacıklar/mL içeren bir çubuk grafik görünür.
  12. Veriler toplandıktan sonra, 11 pozisyonun her biri için veri sağlayan Pozisyonlara Genel Bakış başlıklı bir açılır ekran görünecektir. Analizden çıkarılan ikiden fazla pozisyon varsa, prosedürü daha fazla numune ile tekrarlayın. Değilse, Devam düğmesine tıklayın. Sonuçları içeren bir PDF ve txt dosyası açılır. Dosyaları güvenli bir konuma kaydedin.
  13. Başka bir örnek çalıştırmak için Hücre Denetimi sekmesine gidin ve 10.6 ile 10.12 arasındaki adımları yineleyin. Yapılırsa, tespit edilen partikül sayısı 0-10 (yaklaşık 5-10 mL) olana kadar hücreyi parçacıksız suyla yıkayın. 1 mL'lik 0,22 μm filtrelenmiş PBS ile hücreyi durulayın, programı kapatın ve bilgisayarı kapatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Batı lekelenmesi, EV'lerin CCM'den yeterli şekilde ayrıldığını ortaya koymaktadır
EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için SEC'in etkinliğini değerlendirmek için, kontrol örneklerinden her bir fraksiyon kullanılarak, üç kanonik EV belirtecinin, CD9, CD63 ve CD81'in yanı sıra negatif kontroller olarak kullanılan GM130 ve calnexin18'in ekspresyonunu araştırmak için bir batı lekesi çalıştırıldı (Şekil 3). Albümin ekspresyonu18 , CCM'deki hücre dışı proteinlerin EV'lerden yeterince ayrılabilmesini sağlamak için de araştırıldı. CD9, CD63 ve CD81'in güçlü ekspresyonu 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, 5-8 fraksiyonlarında çok az ekspresyon oldu veya hiç ekspresyon olmadı; Herhangi bir fraksiyonda ne GM130 ne de kalneksin gözlenmedi. Albümin sadece 6-8 fraksiyonlarında mevcuttu. Birlikte, bu veriler veziküllerin ağırlıklı olarak 1-4 fraksiyonlarına sıçradığını ve 5-8 fraksiyonlarını hücre dışı proteinler içerecek şekilde bıraktığını göstermektedir. Bu nedenle, 1-4 fraksiyonları birleştirildi ve konsantre edildi ve EV fraksiyonu olarak kabul edilirken, 5-8 fraksiyonları birleştirildi ve konsantre edildi ve protein fraksiyonu olarak adlandırıldı.

Daha sonra, hem kontrol hem de işlenmiş numunelerde ultrafiltrasyon yoluyla EV ve protein fraksiyonlarının konsantre edilmesinin etkinliğini değerlendirmek için ek batı lekeleri çalıştırıldı. CD9, CD63 ve CD81 ekspresyonu, hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş örneklerin hücre lizatlarında ve EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi (Şekil 4). Tümör duyarlılık geni 101 (TSG101), taşıma için gerekli endozomal sıralama kompleksi (ESCRT)24 ile ilişkilidir ve yaygın olarak eksozomlar25 için bir belirteç olarak kullanılır. Bu protein hücre lizatlarında mevcuttu, ancak EV veya protein fraksiyonlarında mevcut değildi. Ek olarak, GM130 ve kalneksin sadece hücre lizat örneklerinde gözlenmiştir. Bu nedenle, veriler EV'lerin hücre kültürü ortamından etkili bir şekilde ayrıldığını göstermektedir.

EV fraksiyonlarında gözlenen pozitif sinyalin, medyanın kendisinden değil, hücreler tarafından salınan EV'lerden geldiğinden emin olmak için, eksozomla tükenmiş medya, şartlandırılmış CCM ile aynı ultrafiltrasyon ve SEC protokolüne tabi tutuldu ve daha sonra batı lekesi ile analiz edildi (Şekil 5). Hem kontrol hem de tunikamisin içeren ortamlar işlendi ve batı lekeleri üzerinde pozitif kontrol olarak hücre lizatları kullanıldı. Medya örneklerinde EV belirteçleri (CD9, CD63, CD81 veya TSG101) gözlenmedi, ancak hücre lizatlarında mevcuttu. Albümin ekspresyonu, protein fraksiyonları içinde ve hücre lizatlarında minimal ekspresyon, muhtemelen medyadan kalıntı olarak gözlendi. EV fraksiyonlarındaki EV belirteçlerinin hiçbiri için sinyal gözlenmediğinden, bu veriler eksozomla tükenmiş ortamın hücre kaynaklı EV'lerin sinyalini maskeleyen EV'ler içermediğini göstermektedir.

TEM, EV'lerin beklenen morfolojisini gösteriyor
Hem kontrol hem de tunikamisin ile tedavi edilen EV ve protein fraksiyonlarının TEM görüntüleri alındı (Şekil 6). Hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerin EV fraksiyonlarında küresel yapılar gözlenebilir ve bu da EV'lerin varlığını gösterir. Bu yapılar, her iki örnek tipinin protein fraksiyonlarında gözlenmez, bunun yerine EM görüntülemede proteinin göstergesi olan önemli koyu boyama vardır.

NTA, kontrol ve tedavi edilen gruplardaki konsantrasyonlardaki farklılıkları ortaya koymaktadır.
Kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş EV partikül konsantrasyonları ve protein fraksiyonları (n = 3) nanopartikül izleme analizi (NTA; Şekil 7). Şekil 7A, kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş EV fraksiyonları için partikül konsantrasyonlarını gösterirken, tunikamisin işleminde kontrole göre biraz daha fazla parçacık bulunur. Pik parçacık konsantrasyonları 105-165 nm arasındaydı. Şekil 7B, hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş protein fraksiyonlarının protein fraksiyonunda tespit edilen partiküllerin konsantrasyonlarını göstermektedir. Protein fraksiyonunda, EV'lere göre genel olarak daha az parçacık tespit edildi (109'a karşı 10 13) ve pik konsantrasyonları da 75-135 nm arasında daha küçüktü. İlginç bir şekilde, tunikamisin protein fraksiyonu kontrolden daha fazla parçacığa sahipti. EV boyutundaki parçacıkların çoğunluğu (yaklaşık 50-200 nm), hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş hücrelerin EV fraksiyonunda gözlenir ve SEC'in şartlandırılmış hücre kültürü ortamından EV ayırmanın etkili bir aracı olarak kullanılmasını destekler.

Figure 1
Resim 1: Şartlandırılmış hücre kültürü ortamının diferansiyel santrifüjlenmesi ve ultrafiltrasyonu. Kontrolden 24 saat sonra veya 10 μg / mL tunikamisin tedavisinden 24 saat sonra kültürlenmiş hücrelerden toplanan ortamın diferansiyel santrifüjleme ve ultrafiltrasyon adımlarının şematik olarak özetlenmesi. Medya santrifüjlenmiş ve konsantre edilmiştir, geriye SEC için uygun 500 μL konsantre retentat bırakılmıştır.

Figure 2
Şekil 2: Boyut hariç tutma kromatografisi. EV'lerin ve proteinlerin SEC yoluyla ayrılmasının şeması. İlk 3 mL (her biri 500 μL'nin altı fraksiyonu) boşluk hacmi olarak atılır. 1-4 fraksiyonları EV'ler olarak süzülürken, 5-8 fraksiyonları protein olarak süzülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bireysel SEC fraksiyonlarının temsili batı leke analizi. Kontrol hücrelerinin her bir SEC fraksiyonundan 15 μL'lik bir hacim kullanılır ve CD9, CD63, CD81, GM130, kalneksin ve albümin ekspresyonu için incelenir. CD9, CD63 ve CD81 en güçlü şekilde 1-4 fraksiyonlarında gözlenirken, GM130 ve calnexin herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Albümin sadece 6-8 fraksiyonlarında gözlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kanonik EV üreticileri için temsili batı lekesi görüntüleri. CD9, CD63, CD81, TSG101, calnexin ve GM130 için hücre lizatlarından 20 μg protein ve havuzlanmış ve konsantre SEC EV (1-4) ve protein (5-8) fraksiyonlarından ve kontrolden protein (5-8) fraksiyonlarından 15 μg protein içeren son konsantrasyon araştırıldı. Tüm belirteçler hücre lizatlarında mevcuttu. CD9, CD63 ve CD81 tüm EV fraksiyonlarında gözlenirken, TSG101 gözlenmedi. Negatif EV belirteçleri calnexin ve GM130, EV ve protein fraksiyonlarında yoktu. Kontrol hücresi lizatı kontrol tedavisi gören hücrelerin lizatlarını ifade ederken, 10 μg / mL hücre lizatı tunikamisin tedavisi gören hücrelerin lizatlarını ifade eder. Control EV, kontrol numunelerinden EV'leri gösterir. 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, hücre dışı proteinlerin kontrol örneklerinden geldiğini ima ederken, 10 μg / mL protein, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden hücre dışı proteinleri ifade eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Eksozom-tükenmiş hücre kültürü ortamının temsili batı lekesi görüntüleri. Kontrol ve 10 μg / mL tunikamisin eksozom-tükenmiş hücre kültürü medyasına SEC ve ultrafiltrasyon uygulandı. CD9, CD63, CD81, TSG101, calnexin ve albümin için toplam 15 μL SEC EV ve protein fraksiyonları ve hücre lizatlarından 20 μg protein hacmi araştırıldı. EV veya protein fraksiyonlarında EV belirteçleri gözlenmedi, ancak pozitif kontrol olarak kullanılan hücre lizatlarında gözlendi. Albümin, protein fraksiyonlarında gözlendi, ancak EV fraksiyonunda gözlenmedi. Control EV, kontrol ortamı örneklerinden EV'leri gösterir. 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, hücre dışı proteinlerin kontrol örneklerinden geldiğini ima eder. 10 μg / mL protein, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden hücre dışı proteinleri ifade eder. Kontrol hücresi lizatı kontrol tedavisinde lize edilen hücreleri temsil ederken, 10 μg / mL hücre lizatı lize edilmiş hücrelerin tunikamisin tedavisinden geldiği anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: EV'lerin morfolojisi için temsili TEM görüntüleri. SEC fraksiyonları 1-4 ve 5-8, hem kontrol hem de 10 μg / mL tunikamisin ile tedavi edilen hücrelerden sırasıyla EV ve protein fraksiyonları olarak havuzlandı ve konsantre edildi. EV'ler, hem kontrol hem de tunikamisin numunelerinin EV fraksiyonlarında, çapı 200 nm'den küçük küçük küresel parçacıklar olarak gözlenir ve protein numunelerinde gözlenmez. Ölçek çubukları = 200 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Nanopartikül izleme analizinden partikül boyutu ve konsantrasyonları. Kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş hücrelerden (A) EV fraksiyonları ve (B) protein fraksiyonlarındaki partikül boyutu ve miktarı (n = 3). Kontrol EV'leri kontrol örneklerinden EV'yi gösterirken, işlenmiş EV'ler tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, kontrol örneklerinden hücre dışı proteinleri ifade eder ve işlenmiş protein, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden hücre dışı proteinleri ifade eder. Hata çubukları bir standart sapma ±. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Şekil 3'ten PVDF membranlarının lekesiz görüntüsü. Her PVDF membranı, adım 8.3.7'nin sonunda başarılı protein transferini görselleştirmek için görüntülendi. Bireysel SEC fraksiyonları (1-8), daha sonra (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E), kalneksin ve (F) albümin için incelenen lekeler için görselleştirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Şekil 4'ten PBDF membranlarının lekesiz görüntüsü. Her PVDF membranı, adım 8.3.7'nin sonunda başarılı protein transferini görselleştirmek için görüntülendi. Lekeler daha sonra (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 ve (F ) kalneksin için araştırıldı. Kontrol hücresi lizatı kontrol ile tedavi edilen hücrelerden hücre lizatlarını ifade ederken, 10 μg / mL hücre lizatı tunikamisin tedavisinden hücre lizatlarını ifade eder. Kontrol EV, kontrol numunelerinden EV'leri gösterir ve 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, kontrol numunelerinden hücre dışı proteinleri ifade eder ve 10 μg / mL protein, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden hücre dışı proteinleri ifade eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Şekil 5'ten PVDF membranlarının lekesiz görüntüsü. Her PVDF membranı, adım 8.3.7'nin sonunda başarılı protein transferini görselleştirmek için görüntülendi. Lekeler daha sonra (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) kalneksin ve (F ) albümin için incelendi. Kontrol EV, kontrol ortamından EV'leri ve 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş ortamdan EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, kontrol ortamından hücre dışı proteinleri ifade eder ve 10 μg / mL protein, tunikamisin ile muamele edilmiş ortamdan hücre dışı proteinleri ifade eder. Kontrol hücresi lizatı kontrol ile tedavi edilen hücrelerden hücre lizatlarını ifade ederken, 10 μg / mL hücre lizatı tunikamisin tedavisinden hücre lizatlarını ifade eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Şekil 3'ü oluşturmak için kullanılan kırpılmamış batı lekesi görüntüleri. Batı lekelerinin kırpılmamış kompozit kemilüminesan ve kolorimetrik görüntüleri, her bir SEC fraksiyonu (fraksiyon 1-8) için (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E) kalneksin ve (F) albümin için incelenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: Şekil 4'ten kırpılmamış batı lekesi görüntüleri. Batı lekelerinin kırpılmamış kompozit kemilüminesan ve kolorimetrik görüntüleri (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 ve (F) calnexin için incelenmiştir. Kontrol hücresi lizatı kontrol ile tedavi edilen hücrelerden hücre lizatlarını ifade ederken, 10 μg / mL hücre lizatı tunikamisin tedavisinden hücre lizatlarını ifade eder. Kontrol EV, kontrol numunelerinden EV'leri gösterir ve 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, hücre dışı proteinlerin kontrol örneklerinden geldiğini ima ederken, 10 μg / mL protein, tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden hücre dışı proteinleri ifade eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6: Şekil 5'ten kırpılmamış batı lekesi görüntüleri. Batı lekelerinin kırpılmamış kompozit kemilüminesan ve kolorimetrik görüntüleri (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) kalneksin ve (F) albümin için incelenmiştir. Kontrol EV, kontrol ortamından EV'leri gösterirken, 10 μg / mL EV, tunikamisin ile muamele edilmiş ortamdan EV'leri temsil eder. Kontrol proteini, hücre dışı proteinlerin kontrol ortamından olduğunu ve 10 μg / mL proteinin, tunikamisin ile muamele edilen ortamdan hücre dışı proteinleri ifade ettiğini ima eder. Kontrol hücresi lizatı kontrol ile tedavi edilen hücrelerden hücre lizatlarını ifade ederken, 10 μg / mL hücre lizatı tunikamisin tedavisinden hücre lizatlarını ifade eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Antikor Konakçı Türler Seyreltme
CD9 Fare 1 : 500
CD63 Fare 1 : 1000
CD81 Fare 1 : 500
GM130 Serisi Tavşan 1 : 500
Albümin Tavşan 1 : 1000
TSG101* Tavşan 1 : 1000
Calnexin* Tavşan 1 : 1000
Anti-fare^ At 1 : 1000
Anti-tavşan^ Keçi 1 : 1000

Tablo 1: Antikor seyreltmeleri. Antikorlar için kullanılan seyreltmeler. Stok antikorları TBS-Tween'de% 5 sütte seyreltildi. *Numunelerin indirgeyici koşullar altında çalıştırılmasını gerektiren antikorları temsil eder; ^ sekonder antikorları temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SEC, EV'leri şartlandırılmış CCM'den yeterince ayırmak için kullanıcı dostu bir yöntemdir. Hücre kaynaklı EV'leri spesifik olarak izole etmek için, CCM tipinin ve takviyelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Birçok hücre kültürü ortamının, serumun toplandığı hayvandan türetilen EV'leri içeren FBS ile desteklenmesi gerekir. Bu serum EV'leri, kültür26'daki hücrelerden türetilen EV'ler tarafından üretilen herhangi bir sinyali doyurabilir ve maskeleyebilir. Bu nedenle, deneyler yapılırken, bulunan EV'lerin sığır türevi değil, türetilmiş hücreye atfedilebilmesini sağlamak için mümkün olduğunda EV-tükenmiş FBS kullanılmalıdır, EV'ler Bu ya ticari olarak satın alınabilir ya da başka bir yerde gözden geçirilen çeşitli tekniklerle şirket içinde yapılabilir26,27.

Örnekleri bir SEC sütunu üzerinden çalıştırırken, filtrelenmiş PBS'nin kullanılması zorunludur. Aksi takdirde, her fraksiyon, yalnızca hücre kaynaklı EV'ler ve hücre dışı proteinler yerine PBS'den gelen parçacıklar tarafından kontamine olacaktır. PBS'yi SEC için kullanılmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek, fraksiyonlardaki herhangi bir parçacığın hücrelerin kendisinden olmasını ve PBS'yi kirletmemesini sağlayabilirsiniz.

Burada özetlenen protokol, toplanan fraksiyonların sayısını ve boyutunu değiştirmek için de değiştirilebilir. Örneğin, fraksiyonlar daha büyük hale getirilebilir (1 mL'ye karşı 500 μL) veya bu protokolde fraksiyon 8 olarak kabul edileni geçen hücre dışı proteinler olduğu için daha fazla fraksiyon toplanabilir. Bu özellikle kan plazması veya diğer sütun bileşimleri28,29 gibi diğer örnek türleri için geçerlidir. Daha sonraki fraksiyonlarda potansiyel olarak ortaya çıkan bu küçük hücre dışı proteinler, mevcut metodoloji ile toplanmayan veya test edilmeyen önemli sinyal molekülleri içerebilir. Ek olarak, kesirleri toplamak için AFC'nin kullanılması, manuel kesir toplama yoluyla ortaya çıkabilecek olası kullanıcı hatalarını hafifletir. Fraksiyonlar damlacık damlacığı damlacık ile sönükleştirdiğinden, her damlacığın uygun fraksiyonda toplanmasını sağlamak için büyük özen gösterilmelidir, bu da manuel olarak gerçekleştirilirken zor olabilir.

SEC'in önemli bir sınırlaması, sütunda çalıştırılabilen sınırlı örnek hacmidir. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilen sütunlarla, 500 μL numune kullanılabilecek maksimum hacimdir. Ticari olarak temin edilebilen diğer sütunlar veya şirket içi yapılan sütunlar diğer örnek hacimlerini barındırabilir, ancak bunlar hala nispeten küçük hacimlerdir 29,30. Örneğin dUC gibi diğer yöntemler daha büyük numune hacimlerini barındırabilir, ancak bu teknik EV'leri diğer hücre dışı bileşenlerden kolayca ayıramaz. Sakkaroz veya iyodiksanol gradyanları, yoğunluğa göre parçacıkları ayırmak için yararlı olabilir, ancak bu teknik zaman alıcıdır ve sabit eller ve çok güçlü pipetleme becerileri gerektirir31,32.

Genel olarak, SEC, EV'lerin şartlandırılmış CCM'den yeterli şekilde ayrılmasını sağlayan EV araştırması için önemli bir yöntemdir. Bu, biyolojik replikalar arasında daha fazla tekrarlanabilirliğe izin verdikleri için özellikle ticari sütunlar için geçerlidir ve fraksiyonasyon otomatikleştirilerek kullanıcı hatası olasılığını azaltır. Burada özetlenen protokol, EV'lerin ağırlıklı olarak erken fraksiyonlarda (1-4) ortaya çıktığını, daha sonraki fraksiyonların hücre dışı proteinler içerdiğini göstermektedir. Bu fraksiyonlar daha sonra birleştirilebilir ve batı lekeleme, TEM görüntüleme ve NTA partikül boyutlandırma ve niceleme dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için numuneyi etkili bir şekilde konsantre etmek için ultrafiltrasyona tabi tutulabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, Penn State Behrend ve Hamot Sağlık Vakfı'na finansman için ve ayrıca University Park, PA'daki Penn State Mikroskopi Tesisi'ne teşekkür etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Tags

Nörobilim Sayı 183
Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, M. T., Manioci, S. W.,… More

Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter