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Neuroscience

वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया से एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को अलग करने के लिए आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

यहां प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके बाह्य पुटिकाओं को वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया से पर्याप्त रूप से अलग किया जा सकता है।

Abstract

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) नैनो-आकार के लिपिड-झिल्ली बाध्य संरचनाएं हैं जो सभी कोशिकाओं से जारी की जाती हैं, सभी बायोफ्लुइड्स में मौजूद होती हैं, और इसमें प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड होते हैं जो मूल कोशिका के प्रतिबिंबित होते हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। एक नमूने में अन्य घटकों से ईवी का उचित पृथक्करण उनके संबंधित कार्गो के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और कई बीमारियों के लिए इंटरसेलुलर संचारकों और गैर-इनवेसिव बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। वर्तमान अध्ययन में, ऑलिगोडेंड्रोसाइट व्युत्पन्न ईवी को अत्याधुनिक तकनीकों के संयोजन का उपयोग करके सेल कल्चर मीडिया से अलग किया गया था, जिसमें अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं ताकि ईवी को अन्य बाह्य प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से अलग किया जा सके। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसईसी कॉलम का उपयोग करते हुए, ईवी को नियंत्रण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव स्थितियों दोनों के तहत मानव ऑलिगोडेंड्रोग्लिओमा कोशिकाओं से जारी बाह्य प्रोटीन से अलग किया गया था। कैननिकल ईवी मार्कर सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 को अंश 1-4 में देखा गया था, लेकिन अंश 5-8 में नहीं। जीएम 130, गोल्गी तंत्र का एक प्रोटीन, और कैलनेक्सिन, ईआर का एक अभिन्न प्रोटीन, नकारात्मक ईवी मार्करों के रूप में उपयोग किया गया था, और किसी भी अंश में नहीं देखा गया था। इसके अलावा, जब ईवी अंश के रूप में अंश 1-4 और प्रोटीन अंश के रूप में अंश 5-8 को पूलिंग और केंद्रित किया जाता है, तो ईवी अंश में सीडी 63, सीडी 81 और सीडी 9 की अभिव्यक्ति देखी गई थी। जीएम 130 या कैलनेक्सिन की अभिव्यक्ति किसी भी अंश प्रकार में नहीं देखी गई थी। नियंत्रण और ईआर तनाव दोनों स्थितियों से पूल किए गए अंशों को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया था और ईवी अंशों में पुटिकाओं को देखा गया था, लेकिन प्रोटीन अंशों में नहीं। दोनों स्थितियों से ईवी और प्रोटीन अंशों में कणों को भी नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ परिमाणित किया गया था। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एसईसी वातानुकूलित सेल संस्कृति मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।

Introduction

बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का अध्ययन करने में रुचि का विस्फोट इन नैनो-आकार, विषम कणों को अलग करने और अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रौद्योगिकियों और तकनीकों में प्रमुख प्रगति के साथ हुआ है। लगभग चार दशक पहले 1,2 से उनकी खोज के बाद से, इन छोटे झिल्लीदार संरचनाओं में बायोएक्टिव लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन पाए गए हैं, और अंतरकोशिकीय संचार 3,4 में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। ईवी सभी सेल प्रकारों से जारी किए जाते हैं और इसलिए रक्त प्लाज्मा और सीरम, लार और मूत्र सहित सभी जैविक तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। इन तरल पदार्थों के भीतर ईवी विभिन्न बीमारियों के लिए गैर-इनवेसिव बायोमाकर्स के रूप में काम करने का बहुत वादा करते हैं, जिसमें न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, कैंसर और ऑटोइम्यून विकार 5,6,7 शामिल हैं। इसके अलावा, इन विट्रो यांत्रिक अध्ययनों को संस्कृति माध्यम 3,8,9 में जारी ईवी को अलग करके सेल कल्चर तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है।

रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में ईवी की भूमिका को समझने के लिए, तरल पदार्थ से पर्याप्त पृथक्करण जिसमें वे पाए जाते हैं, सर्वोपरि है। ईवी पृथक्करण के लिए स्वर्ण मानक लंबे समय से अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (डीयूसी) 10 रहा है, हालांकि अन्य बाह्य घटकों से ईवी के बेहतर पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए अधिक परिष्कृत तकनीकें उत्पन्न हुई हैं। इनमें से कुछ तकनीकों में घनत्व ग्रेडिएंट, विषम-प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश (ए 4 एफ), फ्लो साइटोमेट्री, इम्यूनोकैप्चर, पॉलीथीन ग्लाइकोल वर्षा, और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) 11,12,13 शामिल हैं। प्रत्येक तकनीक के फायदे और नुकसान का अपना सेट है; हालांकि, एसईसी को विशेष रूप से जैविक तरल पदार्थ और सेल कल्चर सुपरनैटेंट दोनों से ईवी को अलग करने के लिए दिखाया गया है। एसईसी के पास अपेक्षाकृत सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल होने का अतिरिक्त बोनस भी है।

एसईसी एक विधि है जो आकार के आधार पर तरल पदार्थ के घटकों को अलग करती है। इस तकनीक के साथ, राल का एक स्तंभ (या तो घर में बनाया जाता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जाता है) का उपयोग नमूने को अलग करने के लिए किया जाता है। नमूने में छोटे कण राल के भीतर मोतियों के बीच फंस जाते हैं, जबकि बड़े कण राल के माध्यम से अधिक स्वतंत्र रूप से पारित करने में सक्षम होते हैं, और इस प्रकार प्रक्रिया में पहले होते हैं। चूंकि ईवी कई बाह्य प्रोटीन और प्रोटीन समुच्चय की तुलना में आकार में बड़े होते हैं, ईवी बाह्य प्रोटीन14 की तुलना में पहले के अंशों में स्तंभ से तेजी से गुजरते हैं।

इस विधि पत्र में, नियंत्रण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव स्थितियों दोनों के तहत मानव ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स से सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) से ईवी को अलग करने के लिए एसईसी के उपयोग को रेखांकित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि इस तकनीक के साथ अलग किए गए ईवी विशिष्ट अंशों के भीतर पाए जाते हैं जिन्हें एक साथ पूल किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन के लिए केंद्रित किया जा सकता है, और यह कि अलग ईवी कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, न कि भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जैसे बहिर्जात स्रोत से जिसका उपयोग सीसीएम के पूरक के लिए किया जाता है। ईवी अंशों में कैननिकल ईवी मार्कर, सीडी 63, सीडी 81, और सीडी 9 16,17,18,19 की उपस्थिति, और प्रोटीन अंशों में उनकी अनुपस्थिति पश्चिमी सोख्ता के साथ प्रदर्शित होती है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके, ईवी को कल्पना की जाती है और अपेक्षित आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया जाता है और केवल ईवी अंश में देखा जाता है। कणों को नियंत्रण और ईआर तनाव स्थितियों दोनों के ईवी और प्रोटीन अंशों में भी गिना जाता है, और ईवी नमूनों में व्यास में 50-200 एनएम की अपेक्षित आकार सीमा के भीतर बड़ी संख्या में कण देखे जाते हैं। साथ में, ये डेटा इस धारणा का समर्थन करते हैं कि एसईसी सेल कल्चर मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए एक कुशल और प्रभावी तरीका है।

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Protocol

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: बाँझपन बनाए रखने के लिए सेल कल्चर हुड में सेल कल्चर अभिकर्मक बनाएं।

  1. सेल संस्कृति अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 50 एमएल एफबीएस और 5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोकोकस (पेन-स्ट्रेप) को 500 एमएल उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में जोड़कर सामान्य उच्च ग्लूकोज डीएमईएम तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कोशिकाओं के संवर्धन और विस्तार के लिए इस मीडिया का उपयोग करें।
    2. एक्सोसोम-क्षीण उच्च ग्लूकोज डीएमईएम के 50 एमएल एक्सोसोम-क्षीण एफबीएस और 5 एमएल पेन-स्ट्रेप को 500 एमएल उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में जोड़कर एक्सोसोम-क्षीण उच्च ग्लूकोज डीएमईएम तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ईवी अलगाव से पहले सेल उपचार के लिए इस मीडिया का उपयोग करें।
    3. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम ट्यूनिकामाइसिन जोड़कर ट्यूनिकामाइसिन तैयार करें। 0.2 एमएल ट्यूबों में 50 μL एलिकोट बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. ईवी पृथक्करण अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 1 लीटर स्नातक सिलेंडर में 1 लीटर विआयनीकृत (डीआई) पानी में 9.89 ग्राम पीबीएस पाउडर जोड़कर 1 एक्स फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) तैयार करें। पीबीएस घुलने तक घोल को एक हलचल प्लेट पर हिलाएं।
    2. पीबीएस जोड़ने से पहले ग्लासवेयर को स्टरलाइज़ करने के लिए ऑटोक्लेव का उपयोग करें। ग्लासवेयर को एक बिन में डालें, दरवाजा बंद करें, और 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए स्टरलाइज़ करें।
    3. एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के अंदर, एक वैक्यूम को 0.22 μm फ़िल्टर से कनेक्ट करें और फ़िल्टर को ऑटोक्लेव बोतल के शीर्ष पर रखें। धीरे-धीरे पीबीएस को फिल्टर पर डालें और आटोक्लेव बोतल में फ़िल्टर किए गए पीबीएस को इकट्ठा करें।
    4. 500 एमएल स्नातक सिलेंडर में 1x PBS के 500 एमएल में 9.99 ग्राम सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़कर 0.5 M सोडियम हाइड्रॉक्साइड तैयार करें। घोल को एक हलचल प्लेट पर तब तक हिलाएं जब तक कि सोडियम हाइड्रॉक्साइड पीबीएस में घुल न जाए और फिर 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके एक ऑटोक्लेव 500 एमएल बोतल में फ़िल्टर करें।
    5. 500 एमएल स्नातक सिलेंडर में 1x PBS के 500 एमएल में 0.25 ग्राम सोडियम एज़ाइड जोड़कर 0.05% सोडियम एज़ाइड तैयार करें। सोडियम एज़ाइड पीबीएस में घुलने तक एक हलचल प्लेट पर घोल को हिलाएं, और फिर 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके एक आटोक्लेव 500 एमएल बोतल में फ़िल्टर करें।
  3. प्रोटीन अलगाव, परिमाणीकरण और पहचान अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 1 एम ट्राइस (पीएच 7.4), 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 1 एमएल, डीऑक्सीकोलेट के 1 ग्राम, एनपी -40 के 1 एमएल और सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 0.89 ग्राम के संयोजन से आरआईपीए लाइसिस बफर का 100 एमएल तैयार करें। आसुतH2O के साथ मात्रा को 100 mL तक लाएं और 4 °C पर स्टोर करें। आरआईपीए प्लस फॉस्फेट और प्रोटीज अवरोधक समाधान बनाने के लिए, 15 एमएल ट्यूब में आरआईपीए बफर के प्रत्येक 1 एमएल के लिए फॉस्फेट और प्रोटीज अवरोधक के 10 μL जोड़ें और समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. उपयोग से तुरंत पहले, बीसीए परख किट द्वारा प्रदान किए गए अभिकर्मक ए के 10 एमएल और 200 μL अभिकर्मक बी को 15 एमएल ट्यूब में जोड़कर बीसीए परख काम करने वाले अभिकर्मक तैयार करें। उपयोग से तुरंत पहले, अभिकर्मक ए के 25 भागों, अभिकर्मक बी के 24 भागों और अभिकर्मक सी के 1 भाग को 15 एमएल ट्यूब में जोड़कर माइक्रोबीसीए परख काम करने वाले अभिकर्मक तैयार करें।
    3. 1 लीटर डीआई पानी में 30.3 ग्राम ट्राइस बेस, 144 ग्राम ग्लाइसिन और 10 ग्राम एसडीएस जोड़कर 10 एक्स जेल वैद्युतकणसंचलन रनिंग बफर तैयार करें। चल रहे बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 3.03 ग्राम ट्राइस बेस, 14.4 ग्राम ग्लाइसिन और 200 एमएल मेथनॉल जोड़कर 1एक्स ट्रांसफर बफर तैयार करें और डीआई पानी के साथ मात्रा को 1 एल में समायोजित करें। स्थानांतरण बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 1 लीटर डीआई पानी में 2.4 ग्राम ट्राइस बेस, 8 ग्राम एनएसीएल और 1 एमएल ट्वीन -20 जोड़कर ट्वीन -20 (टीबीएस-ट्वीन) के साथ ट्राइस बफर्ड खारा तैयार करें। टीबीएस-ट्वीन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. टीबीएस-ट्वीन के 100 एमएल में 5 ग्राम पाउडर गैर-वसा वाले दूध को जोड़कर 5% अवरुद्ध समाधान तैयार करें। ब्लॉकिंग बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. उपयोग से तुरंत पहले, 4 एमएल पेरोक्साइड समाधान और 4 एमएल ल्यूमिनोल / एन्हांसर समाधान को 15 एमएल ट्यूब में जोड़कर केमिलुमिनेसेंट सब्सट्रेट तैयार करें और मिश्रण करने के लिए धीरे से उलट दें।

2. कोशिकाओं की संवर्धन और उपचार

  1. बीज दो टी 175 सेल कल्चर फ्लास्क प्रत्येक 2.3 x 106 मानव ऑलिगोडेंड्रोग्लिओमा (एचओजी) कोशिकाओं के साथ। सामान्य उच्च ग्लूकोज डीएमईएम की अंतिम मात्रा को 25 एमएल तक लाएं और 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 48 घंटे के अंत में, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म एक्सोसोम-क्षीण उच्च ग्लूकोज डीएमईएम। उपचार के लिए, ईआर-तनाव को प्रेरित करने के लिए ट्यूनिकामाइसिन के 25 मिलीग्राम / एमएल के 25 मिलीलीटर को एक्सोसोम-क्षीण मीडिया में जोड़ें, ट्यूनिकामाइसिन के 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता। नियंत्रण के लिए, एक्सोसोम-समाप्त मीडिया के 25 एमएल में डीएमएसओ के 25 μL जोड़ें।
  3. कोशिकाओं से सामान्य उच्च ग्लूकोज डीएमईएम को हटा दें और निपटान करें और धीरे से 10 एमएल 1 एक्स पीबीएस के साथ कोशिकाओं और फ्लास्क को कुल्ला करें। एस्पिरेट करें और पीबीएस को त्याग दें।
  4. फ्लास्क लेबल नियंत्रण में 25 एमएल नियंत्रण मीडिया जोड़ें, और फ्लास्क लेबल उपचार में मीडिया में 10 μg / mL ट्यूनिकामाइसिन के 25 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस लाएं।

3. वातानुकूलित सीसीएम का संग्रह और एकाग्रता (चित्रा 1)

  1. पीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। 10x और 100x उद्देश्य लेंस के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत फ्लास्क का निरीक्षण करें। फ्लास्क के बीच किसी भी अंतर का नोट लें। नियंत्रण और उपचारित फ्लास्क दोनों के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
  2. फ्लास्क से मीडिया निकालें और 50 एमएल ट्यूब में रखें। ट्यूब को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. ट्यूब को 2,000 x g पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
  4. चार 15 एमएल 3 केडीए कटऑफ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयां प्राप्त करें और प्रत्येक ट्यूब में 5 एमएल पीबीएस जोड़ें। अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके फ़िल्टर को प्राइम करें।
    नोट: कोशिकाओं से जारी सभी बाह्य प्रोटीन को बनाए रखने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल में 3 केडीए आणविक भार कटऑफ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग किया गया था। बड़े आणविक भार कटऑफ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयां (जैसे, 30 केडीए) भी इस प्रोटोकॉल के साथ काम करेंगी, हालांकि 30 केडीए से छोटे बाह्य प्रोटीन को फ़िल्टर किया जाएगा और नमूने20,21 से हटा दिया जाएगा।
  5. अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों से पीबीएस निकालें। प्रत्येक स्थिति (नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित) से सुपरनैटेंट को दो अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों में विभाजित करें, प्रत्येक में लगभग 12.5 एमएल मीडिया।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे 45 मिनट के लिए 4,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, या जब तक प्रत्येक अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट में केंद्रित मीडिया (रेटेंटेट के रूप में संदर्भित) 250 μL या उससे कम पर केंद्रित न हो।
  7. दोनों नियंत्रण अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों से रेटेंटेट को एक लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। दोनों उपचारित अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों से रेटेंटेट को एक और लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रेटेंटेट की कुल मात्रा को 500 μL मापें। यदि नमूना 500 μL से कम है, तो अंतिम मात्रा 500 μL होने तक 0.22 μm फ़िल्टर किया गया 1x PBS जोड़ें। ट्यूबों को -80 °C फ्रीजर में रखें।

4. सेल संग्रह

  1. ट्रिप्सिन, पीबीएस और एक्सोसोम-क्षीण डीएमईएम को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। नियंत्रण और उपचारित फ्लास्क दोनों में 7 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  2. यह देखने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे देखें कि कोशिकाओं को उठाया गया है या नहीं। यदि कोशिकाओं को नहीं उठाया जाता है, तो कोशिकाओं को हटाने के लिए हाथ की हथेली के खिलाफ फ्लास्क को दृढ़ता से टैप करें।
  3. फ्लास्क को एक्सोसोम-क्षीण डीएमईएम के 7 एमएल के साथ धोएं। फ्लास्क से सेल निलंबन एकत्र करें और 15 एमएल ट्यूबों में रखें।
  4. ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला निकालें और सेल पेलेट में 5 एमएल 1x PBS जोड़ें। गोली को तोड़ने के लिए धीरे से पिपेट मिश्रण करें।
  5. ट्यूबों को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला निकालें और 200 μL RIPA प्लस फॉस्फेट और प्रोटीज अवरोधक समाधान को सेल पेलेट में जोड़ें, मिश्रण करने के लिए पिपेट।
  6. आरआईपीए समाधान में कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। ट्यूबों को 5 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें। ट्यूबों को 14,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सुपरनैटेंट को नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। उपचार की स्थिति और तिथि के साथ ट्यूबों को लेबल करें। ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।

5. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके ईवी पृथक्करण (चित्रा 2)

नोट: निम्नलिखित चरणों को दो बार करें, एक बार नियंत्रण के लिए और एक बार ट्यूनिकामाइसिन उपचारित रेटेंटेट के लिए।
नोट: इस खंड में उपयोग किया गया पीबीएस 0.22 μm फ़िल्टर किया गया 1x PBS है।

  1. स्वचालित अंश कलेक्टर (एएफसी) चालू करें और आठ अंश, 0.5 एमएल प्रति अंश एकत्र करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें, और डिफ़ॉल्ट रूप से बफर (शून्य) मात्रा।
    नोट: एएफसी ऑपरेटिंग स्थितियां निम्नानुसार हैं: कॉलम / बेड वॉल्यूम = 10 एमएल; शून्य आयतन = 2.70 एमएल; फ्लश वॉल्यूम = 15 एमएल; इष्टतम अंश आकार = 500 μL; प्रति रन आवश्यक बफर = 65 एमएल; 20 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह दर = 1.0 एमएल / कॉलम की पुन: प्रयोज्यता = पांच उपयोग।
  2. कॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस से हटा दें (सामग्री की तालिका देखें) और कॉलम को शुरू करने से पहले कमरे के तापमान तक गर्म होने दें (आमतौर पर ~ 30 मिनट)।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पुन: प्रवेश नमूने निकालें और पिघलने के लिए बर्फ पर रखें। प्रतीक्षा करते समय, एएफसी हिंडोला में आठ लेबल वाले 1.5 एमएल ट्यूब सेट करें, जिसमें ढक्कन अंदर की ओर हों।
  4. रीडर के सामने बारकोड के साथ एएफसी में कॉलम डालें। यह सत्यापित करने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करके संग्रह शुरू करें कि हिंडोला में ट्यूब हैं और अपशिष्ट कलेक्टर ठीक से काम कर रहा है।
  5. भंडारण बफर को कॉलम मैट्रिक्स के शीर्ष भाग में पूरी तरह से अवशोषित करने के बाद कॉलम में 1x PBS के 15 एमएल जोड़कर कॉलम को फ्लश करना शुरू करें। पीबीएस को बहुत जल्दी न जोड़ें क्योंकि यह भंडारण बफर को पतला करेगा और पर्याप्त फ्लशिंग को रोक देगा।
  6. इससे पहले कि पीबीएस के सभी 15 एमएल मैट्रिक्स द्वारा अवशोषित हो जाएं, फ्लशिंग को रोकने के लिए ओके पर क्लिक करें और माइक्रोपिपेट के साथ कॉलम मैट्रिक्स के शीर्ष से किसी भी अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें। मैट्रिक्स को न छुएं।
  7. कॉलम के केंद्र में 500 μL नमूना जोड़ें। रन प्रारंभ करने के लिए ठीक क्लिक करें. नमूना को मैट्रिक्स में अवशोषित करते हुए देखें और नमूना पूरी तरह से अवशोषित होने के तुरंत बाद कॉलम में 8 एमएल पीबीएस जोड़ें।
  8. एएफसी स्वचालित रूप से हिंडोला के केंद्र में शून्य मात्रा को दूर करेगा और फिर प्रत्येक 500 μL के सभी आठ अंशों को एकत्र करेगा। रन के समापन पर, हिंडोला से अंशों को हटा दें और बर्फ पर रखें। अंश 1-4 में ईवी होते हैं जबकि अंश 5-8 में बाह्य प्रोटीन होते हैं। हिंडोला के केंद्र से शून्य मात्रा को हटा दें।
  9. कॉलम से किसी भी अवशिष्ट नमूने को धोने के लिए आठ अंश एकत्र किए जाने के बाद कॉलम में 10 एमएल पीबीएस जोड़ें। रिटेन्टेट नमूना कॉलम के माध्यम से पूरी तरह से फ्लश हो जाने के बाद, कॉलम में 15 एमएल 1 एक्स पीबीएस जोड़ें।
  10. चूंकि अंतिम पीबीएस को मैट्रिक्स द्वारा अवशोषित किया जा रहा है, कॉलम के मैट्रिक्स के केंद्र में 0.5 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड का 500 μL जोड़ें। जैसे ही सोडियम हाइड्रॉक्साइड अवशोषित होता है, कॉलम में 1x PBS के 30 एमएल जोड़ें और इसे फ्लश होने दें।
  11. यदि कोई अन्य नमूना चल रहा है, तो हिंडोला में आठ लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब जोड़ें और चरण 5.7-5.10 दोहराएं।
  12. एक बार सभी नमूनों के साथ पूरा हो जाने के बाद, बाद में उपयोग के लिए कॉलम को संरक्षित करने के लिए निम्नलिखित चरणों को पूरा करें। चरण 5.10 में उल्लिखित कॉलम के माध्यम से पीबीएस के 30 एमएल को फ्लश करने के बाद, कॉलम में 0.05% सोडियम एज़ाइड का 15 एमएल जोड़ें।
  13. कॉलम मैट्रिक्स के शीर्ष पर लगभग 5 एमएल सोडियम एजाइड छोड़ दें। एएफसी से कॉलम निकालें और शीर्ष और नीचे की कैप संलग्न करें। भंडारण के लिए कॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें (कॉलम का उपयोग पांच बार तक किया जा सकता है)।

6. ईवी और प्रोटीन अंशों का अल्ट्राफिल्ट्रेशन

  1. प्रति नमूना दो 2 एमएल, 3 केडीए कटऑफ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयां प्राप्त करें। ईवी अंशों (अंश 1-4) को केंद्रित करने के लिए एक इकाई का उपयोग करें, और दूसरा प्रोटीन अंशों (अंश 5-8) को केंद्रित करने के लिए। प्रत्येक इकाई में तीन भाग होते हैं: शंकु, फिल्टर और प्रवाह-माध्यम सिलेंडर; प्रत्येक भाग को ठीक से लेबल करें।
  2. अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट का निर्माण करें और फ़िल्टर भाग में 0.22 μm फ़िल्टर किए गए 1x PBS का 1 mL जोड़ें और शंकु टुकड़े के साथ कैप करें। अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट को सेंट्रीफ्यूज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,500 x g पर शंकु-साइड अप करें।
  3. फ़िल्टर किए गए पीबीएस को प्रवाह-माध्यम सिलेंडर से निकालें। अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट को उल्टा (शंकु-साइड नीचे) और सेंट्रीफ्यूज को 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पलटें। शंकु से किसी भी शेष पीबीएस को हटा दें।
  4. प्रत्येक अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाई में उपयुक्त अंश (संपूर्ण 500 μL वॉल्यूम) जोड़ें (कुल मात्रा 2 एमएल होगी)। सेंट्रीफ्यूज कॉलम 1 घंटे 45 मिनट के लिए 3,500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर, या जब तक रेटेंटेट स्तर 100 μL पर नहीं होता है।
  5. प्रवाह के माध्यम से सिलेंडर को हटा दें और प्रवाह को छोड़ दें। अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट को उल्टा (शंकु-साइड नीचे) और सेंट्रीफ्यूज को 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पलटें।
  6. शंकु में रेटेंटेट को लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रत्येक नमूना मात्रा को 0.22 μm फ़िल्टर किए गए 1x PBS के साथ 150 μL तक लाएं। ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।

7. मीडिया नियंत्रण

  1. दो T175 सेल कल्चर फ्लास्क प्राप्त करें। एक फ्लास्क नियंत्रण और दूसरे उपचार को लेबल करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म एक्सोसोम-क्षीण उच्च ग्लूकोज डीएमईएम।
  2. 25 मिलीलीटर मीडिया में ट्यूनिकामाइसिन स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) का 25 μL जोड़ें और फ्लास्क लेबल उपचार में डालें। 25 एमएल मीडिया में डीएमएसओ के 25 μL जोड़ें और फ्लास्क लेबल नियंत्रण में डालें। फ्लास्क को 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
  3. चरण 3.2-3.8 में उल्लिखित ईवी को अलग करने के लिए मीडिया और प्रक्रिया एकत्र करें। इसके बाद, अनुभाग 5 और 6 में वर्णित सभी चरणों का पालन करें।

8. वेस्टर्न ब्लॉटिंग

  1. बीसीए परख के साथ सेल लाइसेट और प्रोटीन अंशों से प्रोटीन का परिमाणीकरण
    नोट: नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूने दोनों से प्रोटीन परिमाणीकरण निम्नलिखित चरणों के साथ किया जाता है।
    1. बर्फ पर लाइस्ड कोशिकाओं और प्रोटीन अंशों को पिघलाएं। प्रत्येक नमूने के लिए तीन कमजोर पड़ने वाली ट्यूब बनाएं; 1:2, 1:10, और 1:100.
    2. 96-अच्छी तरह से स्पष्ट-तल वाली परख प्लेट पर तीन प्रतियों में लोड, गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) प्रोटीन मानकों के 25 μL और प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने के 25 μL। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके मानक या नमूने वाले प्रत्येक अच्छी तरह से काम करने वाले अभिकर्मक में 200 μL काम करने वाला अभिकर्मक जोड़ें।
    3. प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर 562 एनएम के अवशोषण पर प्लेट रीडर के साथ प्लेट पढ़ें। प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें और सेल लाइसेट के लिए 20 μg प्रोटीन और प्रोटीन अंशों के लिए 15 μg प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा निर्धारित करें।
  2. माइक्रोबीसीए परख के साथ ईवी अंशों से प्रोटीन का परिमाणीकरण
    1. बर्फ पर ईवी नमूने पिघलाएं। प्रत्येक नमूने के लिए दो कमजोर पड़ने बनाएं: 1: 50 और 1: 100।
    2. 96-अच्छी तरह से स्पष्ट-तल वाली परख प्लेट पर तीन प्रतियों में लोड, बीएसए प्रोटीन मानकों के 100 μL, और प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने के 100 μL। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके मानक या नमूने वाले प्रत्येक कुएं में 100 μL माइक्रोबीसीए काम करने वाले अभिकर्मक जोड़ें।
    3. प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर 562 एनएम के अवशोषण पर प्लेट रीडर के साथ प्लेट पढ़ें। प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें और ईवी अंशों के लिए 15 μg प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा निर्धारित करें।
  3. पश्चिमी सोख्ता
    नोट: वेस्टर्न ब्लोटिंग प्रोटोकॉल22 में वर्णित के समान प्रदर्शन किया गया था, और नीचे उल्लिखित के रूप में संशोधित किया गया था।
    1. निर्माता के निर्देशों का उपयोग करके जेल बनाने की किट के साथ 10% पॉलीक्रिलामाइड जैल बनाएं।
    2. जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब में संयोजन करके सेल लाइसेट नमूने तैयार करें, प्रोटीन के 20 μg के लिए आवश्यक सेल लाइसेट की मात्रा, 4x Laemli बफर का 5 μL, और कुल मात्रा को 20 μL तक लाने के लिए आवश्यक RIPA बफर की मात्रा।
    3. 1.5 एमएल ट्यूब में 15 μg प्रोटीन के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा, 4x Laemli बफर के 5 μL और RIPA बफर को 20 μL की मात्रा में संयोजित करके ईवी और प्रोटीन अंश नमूने तैयार करें।
    4. 1.5 एमएल ट्यूब 15 μL नमूने और 4x Laemli बफर के 5 μL में संयोजन करके मीडिया नियंत्रण नमूने तैयार करें।
      नोट: उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के आधार पर, लैमली बफर में एक कम करने वाले एजेंट की आवश्यकता हो सकती है या नहीं, जैसे कि 50 एमएम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी)।
    5. सभी नमूनों को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, नमूनों को ठंडा करने के लिए बर्फ में स्थानांतरित करें, और 10,000 x g पर 30 सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें, फिर नमूने को बर्फ पर वापस करें।
    6. वैद्युतकणसंचलन टैंक में जैल जोड़ें और 1x जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने वाले बफर जोड़ें। प्रोटीन सीढ़ी के 15 μL और नमूने के 20 μL लोड करें। जेल को 30-50 मिनट के लिए 200 वी पर चलाएं, या जब तक कि नमूने जेल के निचले हिस्से तक न पहुंच जाएं, बस चलने से पहले।
    7. प्रोटीन को 100 वी पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1एक्स ट्रांसफर बफर के साथ पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें, या जब तक हस्तांतरण पूरा न हो जाए। पूरक चित्र 1, पूरक चित्र 2, और पूरक चित्र 3 स्थानांतरण पूरा होने के बाद प्रत्येक धब्बा की दाग-मुक्त छवियां दिखाते हैं।
    8. टीबीएस-ट्वीन में झिल्ली को एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध करें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
    9. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और झिल्ली 3x को टीबीएस-ट्वीन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक शेकर पर धो लें।
    10. 5% दूध / टीबीएस-ट्वीन में उचित द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें। कमजोर पड़ने की जानकारी के लिए तालिका 1 देखें। झिल्ली में द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें, फिर एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए टीबीएस-ट्वीन के साथ 3 एक्स धोएं।
    11. झिल्ली में केमिलुमिनेसेंट सब्सट्रेट जोड़ें और एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कलरिमेट्रिक और केमिल्यूमिनेसेंट विश्लेषण का उपयोग करके छवि धब्बा। पूरक चित्र 4, पूरक चित्र 5, और पूरक चित्र 6 प्रत्येक धब्बे की अनक्रॉप्ड छवियां दिखाते हैं।

9. टीईएम इमेजिंग

  1. हाइड्रोकार्बन को हटाने और ग्रिड को हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए23 400 जाल कार्बन / फॉर्मवार लेपित ग्रिड का निर्वहन करें।
  2. ग्रिड में ईवी या प्रोटीन अंश नमूने के 5 μL जोड़ें। 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
  3. फिल्टर पेपर से बात करके अतिरिक्त घोल निकालें। ग्रिड को 5 μL नैनोप्योर पानी से धो लें और बाती करके अतिरिक्त को हटा दें।
  4. 1% जलीय यूरिनिल एसीटेट के 5 μL लागू करें और तुरंत बाती बंद करें। ग्रिड को सूखने दें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर 120 केवी पर छवि ग्रिड और चार्ज-कपल डिवाइस कैमरे के साथ छवियों को कैप्चर करें।

10. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से ईवी और प्रोटीन अंश नमूने प्राप्त करें और बर्फ पर पिघल जाएं।
  2. कंप्यूटर और NTA उपकरण चालू करें। एनटीए सॉफ्टवेयर खोलें और यह स्वचालित रूप से प्रारंभ करना शुरू कर देगा।
  3. उपयुक्त पंप का चयन करें जिसमें कण-मुक्त पानी होता है और सेल को कुल्ला करने के लिए उपकरण पर क्लिक करें। कुल्ला करते समय, एक सिरिंज का उपयोग करके उपकरण के सामने इंजेक्शन पोर्ट में 10-20 एमएल कण-मुक्त पानी इंजेक्ट करें और हवा के बुलबुले से बचें।
  4. सेल गुणवत्ता जांच स्क्रीन पॉप अप होगा; ओके पर क्लिक करें और सेल गुणवत्ता की जांच शुरू हो जाएगी। चेक सफलतापूर्वक पारित होने के बाद, ऑटोअलिग्नमेंट पॉप-अप स्क्रीन दिखाई देगी जिसमें कहा गया है: कृपया सेल को 100 एनएम संरेखण निलंबन (कमजोर पड़ने 1: 250,000) से भरें।
    1. एक ट्यूब (1: 1,000 तनुकरण) में 10 एमएल कण-मुक्त पानी और 100 एनएम पॉलीस्टीरिन मोतियों के 10 μL को जोड़कर संरेखण निलंबन का कमजोर पड़ना 1 तैयार करें। मिश्रण करने के लिए धीरे से उलटा करें। तनुकरण 1 में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों की शेल्फ लाइफ होती है।
    2. 1:250,000 का कमजोर पड़ने का निर्माण करने के लिए एक ट्यूब में 20 एमएल कण-मुक्त पानी और 80 μL तनुकरण 1 (1: 1,000) जोड़कर संरेखण निलंबन का कमजोर पड़ना 2 बनाएं। धीरे से ट्यूब को मिश्रण करने के लिए मोड़ें। कमजोर पड़ने वाले 2 में कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट का शेल्फ जीवन होता है।
  5. सेल को 2 एमएल कमजोर पड़ने के साथ भरें 2 (1: 250,000)। ठीक क्लिक करें और प्रोग्राम ऑटोअलाइनमेंट (फ़ोकस) और फ़ोकस ऑप्टिमाइज़ेशन को पूरा करेगा. विश्लेषण टैब एक प्रोफ़ाइल बनाने के लिए खुल जाएगा जो एक पैराबोला में मापने वाले सेल की स्वच्छता और समरूपता के परिणाम प्रदान करता है। एक पॉप-अप स्क्रीन जिसमें कहा गया है: वीडियो माइक्रोस्कोप अब प्रयोगों के लिए तैयार है, दिखाई देगा; ठीक पर क्लिक करें और प्रोग्राम सेल चेक टैब पर वापस आ जाएगा।
  6. सेल को धोने के लिए इंजेक्शन पोर्ट में कण-मुक्त पानी इंजेक्ट करके सेल से पॉलीस्टाइनिन मोतियों को धोएं। जब तक पता लगाए गए कणों की संख्या 0-10 (आमतौर पर 5-10 एमएल के बीच) के बीच न हो, तब तक धोना जारी रखें। पहले नमूने के लिए सेल को प्राइम करने के लिए 0.22 μm फ़िल्टर किए गए पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें।
  7. पहले नमूने को 0.22 μm फ़िल्टर किए गए पीबीएस (1: 1000 कमजोर पड़ने से शुरू करें) के साथ पतला करें और कार्यक्रम में कमजोर पड़ने वाले कारक को दर्ज करें। सेल में 1 एमएल नमूना डालें और कण आंदोलन को धीमा करने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें, क्योंकि वे शुरू में स्क्रीन पर बहुत तेज़ी से आगे बढ़ेंगे। संवेदनशीलता और शटर को क्रमशः 75.0 और 100 पर सेट करें।
  8. आदर्श नमूना कमजोर पड़ने के लिए पता लगाए गए कणों की संख्या 50-200 कण है। यदि 50 से नीचे या 200 से ऊपर के कणों की सूचना दी जाती है, तो नमूने के कमजोर पड़ने को समायोजित करें। यदि एक नए कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, तो कोशिका को कण-मुक्त पानी से धोएं जब तक कि 0-10 ज्ञात कण न हों। पतला नमूना जोड़ना और तब तक धोना दोहराएं जब तक कि आदर्श कमजोर पड़ने न पाए जाएं।
  9. यह कल्पना करने के लिए सभी 11 कैमरा स्थितियों की जांच करें कि कण आंदोलन धीमा हो गया है और सुनिश्चित करें कि पता लगाए गए कणों की संख्या सभी कैमरा स्थितियों के बीच समान है। यदि कणों की संख्या कैमरे की स्थिति में बहुत भिन्न होती है, तो अधिक नमूना जोड़ें।
  10. मापन टैब पर क्लिक करें और वीडियो अधिग्रहण चलाएँ। वीडियो अधिग्रहण टैब के तहत, नमूने के लिए कस्टम नाम दर्ज करें और एक सुरक्षित स्थान की पहचान करें। डेटा को सहेजने के लिए ऑटोसेव.txt और ऑटोसेव.pdf बॉक्स की जाँच करें।
  11. तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, लेजर सेट करने के लिए 488 एनएम पर क्लिक करें, और कैमरा पोजीशन के लिए 11 पर क्लिक करें। डेटा संग्रह चलाने के लिए ठीक क्लिक करें. कार्यक्रम सभी 11 पदों में कणों की संख्या और आकार का विश्लेषण शुरू करेगा। विश्लेषण टैब के तहत, एक्स-अक्ष पर व्यास / एनएम और वाई-अक्ष पर कणों / एमएल के साथ एक बार ग्राफ दिखाई देगा।
  12. डेटा एकत्र होने के बाद, 11 पदों में से प्रत्येक के लिए डेटा प्रदान करते हुए स्थिति अवलोकन नामक एक पॉप-अप स्क्रीन दिखाई देगी। यदि विश्लेषण से दो से अधिक पदों को हटा दिया गया है, तो प्रक्रिया को अधिक नमूने के साथ दोहराएं। यदि नहीं, तो जारी रखें बटन पर क्लिक करें। परिणामों के साथ एक पीडीएफ और टीएक्सटी फाइल खुल जाएगी। फ़ाइलों को किसी सुरक्षित स्थान पर सहेजें.
  13. अन्य नमूना चलाने के लिए, सेल चेक टैब पर जाएँ और चरण 10.6 से 10.12 तक दोहराएँ। यदि किया जाता है, तो सेल को कण-मुक्त पानी से धोएं जब तक कि पता लगाए गए कणों की संख्या 0-10 (लगभग 5-10 एमएल) न हो। 0.22 μm फ़िल्टर किए गए PBS के 1 mL के साथ सेल को कुल्ला करें, प्रोग्राम बंद करें, और कंप्यूटर को बंद करें।

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Representative Results

वेस्टर्न ब्लॉटिंग से सीसीएम से ईवी के पर्याप्त पृथक्करण का पता चलता है
सेल कल्चर मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए एसईसी की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, तीन कैननिकल ईवी मार्करों, सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81, साथ ही जीएम 130 और कैलनेक्सिन 18 की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए नियंत्रण नमूनों से प्रत्येक व्यक्तिगत अंश का उपयोग करके एक पश्चिमी धब्बा चलाया गया था, जिसे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था (चित्रा 3)। एल्बुमिन अभिव्यक्ति18 की भी जांच की गई ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सीसीएम में बाह्य प्रोटीन को ईवी से पर्याप्त रूप से अलग किया जा सकता है। सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 की मजबूत अभिव्यक्ति अंश 1-4 में देखी गई थी, जिसमें अंश 5-8 में बहुत कम या कोई अभिव्यक्ति नहीं थी; न तो जीएम 130 और न ही कैलनेक्सिन किसी भी अंश में देखा गया था। एल्बुमिन केवल 6-8 अंशों में मौजूद था। साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि पुटिकाएं मुख्य रूप से अंश 1-4 में घुलजाती हैं, जिससे अंश 5-8 में बाह्य प्रोटीन होते हैं। इस वजह से, अंश 1-4 को संयुक्त और केंद्रित किया गया और ईवी अंश माना गया, जबकि अंश 5-8 को संयुक्त और केंद्रित किया गया और प्रोटीन अंश के रूप में संदर्भित किया गया।

इसके बाद, नियंत्रण और उपचारित नमूनों दोनों में अल्ट्राफिल्ट्रेशन के माध्यम से ईवी और प्रोटीन अंशों को केंद्रित करने की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए अतिरिक्त पश्चिमी धब्बे चलाए गए थे। सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 की अभिव्यक्ति सेल लाइसेट और नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों दोनों के ईवी अंशों में देखी गई थी, लेकिन प्रोटीन अंशों में नहीं (चित्रा 4)। ट्यूमर संवेदनशीलता जीन 101 (टीएसजी 101) परिवहन (ईएससीआरटी) 24 के लिए आवश्यक एंडोसोमल सॉर्टिंग कॉम्प्लेक्स से जुड़ा हुआ है और आमतौर पर एक्सोसोम25 के लिए मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। यह प्रोटीन सेल लाइसेट में मौजूद था लेकिन ईवी या प्रोटीन अंशों में नहीं। इसके अतिरिक्त, जीएम 130 और कैलनेक्सिन केवल सेल लाइसेट नमूनों में देखे गए थे। इसलिए, डेटा इंगित करता है कि ईवी प्रभावी रूप से सेल संस्कृति मीडिया से अलग थे।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि ईवी अंशों में देखा गया सकारात्मक संकेत कोशिकाओं द्वारा जारी ईवी से आ रहा था, न कि मीडिया द्वारा, एक्सोसोम-क्षीण मीडिया को वातानुकूलित सीसीएम के समान अल्ट्राफिल्ट्रेशन और एसईसी प्रोटोकॉल से गुजरना पड़ा और फिर पश्चिमी धब्बा (चित्रा 5) के माध्यम से विश्लेषण किया गया। मीडिया युक्त नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन दोनों को संसाधित किया गया था और सेल लाइसेट का उपयोग पश्चिमी धब्बों पर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। मीडिया नमूनों में कोई ईवी मार्कर (सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81, या टीएसजी 101) नहीं देखा गया था, लेकिन सेल लाइसेट में मौजूद थे। एल्बुमिन अभिव्यक्ति प्रोटीन अंशों के भीतर और सेल लाइसेट में न्यूनतम अभिव्यक्ति देखी गई, संभवतः मीडिया से अवशिष्ट। चूंकि ईवी अंशों में किसी भी ईवी मार्कर के लिए कोई संकेत नहीं देखा जाता है, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एक्सोसोम-क्षीण मीडिया में ईवी नहीं होते हैं जो सेल-व्युत्पन्न ईवी के सिग्नल को मुखौटा करते हैं।

टीईएम ईवी की अपेक्षित आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है
टीईएम छवियों को नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित ईवी और प्रोटीन अंशों (चित्रा 6) दोनों से लिया गया था। गोलाकार संरचनाओं को नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों दोनों के ईवी अंशों में देखा जा सकता है, जो ईवी की उपस्थिति का संकेत देता है। इन संरचनाओं को किसी भी नमूना प्रकार के प्रोटीन अंशों में नहीं देखा जाता है, जिसके बजाय महत्वपूर्ण गहरे रंग का धुंधलापन होता है, जो ईएम इमेजिंग में प्रोटीन का संकेत देता है।

एनटीए ने नियंत्रण और उपचारित गुटों में सांद्रता में अंतर का खुलासा किया
नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित ईवी और प्रोटीन अंशों (एन = 3) की कण सांद्रता को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) के साथ निर्धारित किया गया था। चित्र 7)। चित्रा 7 ए नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित ईवी अंशों के लिए कण सांद्रता दिखाता है, जिसमें नियंत्रण के सापेक्ष ट्यूनिकामाइसिन उपचार में थोड़ा अधिक कण मौजूद होते हैं। पीक कण सांद्रता 105-165 एनएम के बीच थी। चित्रा 7 बी नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित प्रोटीन अंशों दोनों के प्रोटीन अंश में पाए गए कणों के लिए सांद्रता दिखाता है। प्रोटीन अंश में, ईवी (109 बनाम 1013) के सापेक्ष कुल मिलाकर कम कणों का पता लगाया गया था, और पीक सांद्रता भी 75-135 एनएम के बीच छोटी थी। दिलचस्प बात यह है कि ट्यूनिकामाइसिन प्रोटीन अंश में नियंत्रण की तुलना में अधिक कण थे। ईवी आकार के अधिकांश कण (लगभग 50-200 एनएम) नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित कोशिकाओं दोनों के ईवी अंश में देखे जाते हैं, जो वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया से ईवी पृथक्करण के प्रभावी साधन के रूप में एसईसी के उपयोग का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: वातानुकूलित सेल संस्कृति मीडिया के विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्राफिल्ट्रेशन। नियंत्रण के 24 घंटे बाद या 10 μg / mL ट्यूनिकामाइसिन उपचार के बाद सुसंस्कृत कोशिकाओं से एकत्र किए गए मीडिया के अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्राफिल्ट्रेशन के चरणों की योजनाबद्ध रूपरेखा। मीडिया सेंट्रीफ्यूज्ड और केंद्रित है, जिससे एसईसी के लिए उपयुक्त 500 μL केंद्रित रिटेनेट छोड़ दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी। एसईसी के माध्यम से ईवी और प्रोटीन के पृथक्करण का योजनाबद्ध। पहले 3 एमएल (प्रत्येक 500 μL के छह अंश) को शून्य मात्रा के रूप में छोड़ दिया जाता है। अंश 1-4 ईवी के रूप में विकसित होते हैं, जबकि अंश 5-8 प्रोटीन के रूप में होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: व्यक्तिगत एसईसी अंशों का प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। नियंत्रण कोशिकाओं के प्रत्येक व्यक्तिगत एसईसी अंश से 15 μL की मात्रा का उपयोग किया जाता है और CD9, CD63, CD81, GM130, calnexin और एल्बुमिन अभिव्यक्ति के लिए जांच की जाती है। सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 को अंश 1-4 में सबसे दृढ़ता से देखा गया था जबकि जीएम 130 और कैलनेक्सिन को किसी भी अंश में नहीं देखा गया था। एल्बुमिन केवल अंश 6-8 में देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कैननिकल ईवी निर्माताओं के लिए प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवियां। सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81, टीएसजी 101, कैलनेक्सिन और जीएम 130 के लिए सेल लाइसेट से 20 μg प्रोटीन और पूल और केंद्रित एसईसी ईवी (1-4) और प्रोटीन (5-8) अंशों से 15 μg प्रोटीन की अंतिम सांद्रता और नियंत्रण से 10 μg / mL ट्यूनिकामाइसिन उपचारित कोशिकाओं की जांच की गई। सेल लाइसेट में सभी मार्कर मौजूद थे। सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 सभी ईवी अंशों में देखे गए थे, जबकि टीएसजी 101 नहीं था। नकारात्मक ईवी मार्कर कैलनेक्सिन और जीएम 130 ईवी और प्रोटीन अंशों में अनुपस्थित थे। नियंत्रण सेल लाइसेट कोशिकाओं के लाइसेट को संदर्भित करता है जो नियंत्रण उपचार से गुजरते हैं, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट उन कोशिकाओं के लाइसेट को संदर्भित करता है जो ट्यूनिकामाइसिन उपचार से गुजरते हैं। नियंत्रण ईवी नियंत्रण नमूने से ईवी को इंगित करता है। एमएल ईवी ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन का अर्थ है कि बाह्य प्रोटीन नियंत्रण नमूनों से थे, जबकि 10 μg / mL प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एक्सोसोम-क्षीण सेल संस्कृति मीडिया की प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवियां। नियंत्रण और 10 μg / mL ट्यूनिकामाइसिन एक्सोसोम-क्षीण सेल कल्चर मीडिया एसईसी और अल्ट्राफिल्ट्रेशन से गुजरा। सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81, टीएसजी 101, कैलनेक्सिन और एल्ब्यूमिन के लिए एसईसी ईवी और प्रोटीन अंशों की कुल मात्रा, और सेल लाइसेट से 20 μg प्रोटीन की कुल मात्रा की जांच की गई। ईवी या प्रोटीन अंशों में कोई ईवी मार्कर नहीं देखा गया था, लेकिन सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले सेल लाइसेट में देखा गया था। एल्बुमिन प्रोटीन अंशों में देखा गया था लेकिन ईवी अंश नहीं। नियंत्रण ईवी नियंत्रण मीडिया नमूनों से ईवी को इंगित करता है। एमएल ईवी ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन का अर्थ है कि बाह्य प्रोटीन नियंत्रण नमूनों से थे। एमएल प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। नियंत्रण सेल लाइसेट नियंत्रण उपचार में कोशिकाओं के लिए खड़ा है जो लाइस्ड थे, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट का मतलब है कि लाइस्ड कोशिकाएं ट्यूनिकामाइसिन उपचार से आई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: ईवी की आकृति विज्ञान के लिए प्रतिनिधि टीईएम छवियां। एसईसी अंश 1-4 और 5-8 को क्रमशः ईवी और प्रोटीन अंशों के रूप में पूल और केंद्रित किया गया था, दोनों नियंत्रण और 10 μg / mL ट्यूनिकामाइसिन उपचारित कोशिकाओं से। ईवी को नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन नमूनों दोनों के ईवी अंशों में 200 एनएम व्यास से कम छोटे गोलाकार कणों के रूप में देखा जाता है और प्रोटीन नमूनों में नहीं देखा जाता है। स्केल सलाखों = 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण से कण आकार और सांद्रता। (ए) ईवी अंशों में कण आकार और मात्रा और (बी) नियंत्रण और ट्यूनिकामाइसिन उपचारित कोशिकाओं से प्रोटीन अंश (एन = 3)। नियंत्रण ईवी नियंत्रण नमूनों से ईवी को इंगित करता है, जबकि उपचारित ईवी ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन नियंत्रण नमूनों से बाह्य प्रोटीन का तात्पर्य है, और उपचारित प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। त्रुटि पट्टियाँ एक मानक विचलन ± हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: चित्रा 3 से पीवीडीएफ झिल्ली की दाग मुक्त छवि। प्रत्येक पीवीडीएफ झिल्ली को चरण 8.3.7 के समापन पर सफल प्रोटीन हस्तांतरण की कल्पना करने के लिए चित्रित किया गया था। अलग-अलग एसईसी अंशों (1-8) को धब्बों के लिए कल्पना की गई थी, जिन्हें बाद में (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) जीएम 130, (ई), कैलनेक्सिन और (एफ) एल्बुमिन के लिए जांच की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: चित्रा 4 से पीबीडीएफ झिल्ली की दाग मुक्त छवि। प्रत्येक पीवीडीएफ झिल्ली को चरण 8.3.7 के समापन पर सफल प्रोटीन हस्तांतरण की कल्पना करने के लिए चित्रित किया गया था। बाद में (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) टीएसजी 101, (ई) जीएम 130, और (एफ) कैलनेक्सिन के लिए ब्लोट्स की जांच की गई। नियंत्रण सेल लाइसेट नियंत्रण उपचारित कोशिकाओं से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट ट्यूनिकामाइसिन उपचार से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है। नियंत्रण ईवी नियंत्रण नमूनों से ईवी को इंगित करता है और 10 μg / mL EV ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन नियंत्रण नमूनों से बाह्य प्रोटीन को संदर्भित करता है, और 10 μg / mL प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: चित्रा 5 से पीवीडीएफ झिल्ली की दाग मुक्त छवि। प्रत्येक पीवीडीएफ झिल्ली को चरण 8.3.7 के समापन पर सफल प्रोटीन हस्तांतरण की कल्पना करने के लिए चित्रित किया गया था। बाद में (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) टीएसजी 101, (ई) कैलनेक्सिन और (एफ) एल्बुमिन के लिए ब्लोट्स की जांच की गई। नियंत्रण ईवी नियंत्रण मीडिया से ईवी को इंगित करता है और 10 μg / mL EV ट्यूनिकामाइसिन उपचारित मीडिया से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन नियंत्रण मीडिया से बाह्य प्रोटीन को संदर्भित करता है, और 10 μg / mL प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित मीडिया से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। नियंत्रण सेल लाइसेट नियंत्रण उपचारित कोशिकाओं से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट ट्यूनिकामाइसिन उपचार से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: चित्रा 3 बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली अनक्रॉप्ड वेस्टर्न ब्लॉट छवियां। (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) जीएम 130, (ई) कैलनेक्सिन, और (एफ) एल्बुमिन के लिए जांच किए गए पश्चिमी धब्बों की अनक्रॉप्ड मिश्रित केमिलुमिनेसेंट और कलरमेट्रिक छवियां प्रत्येक व्यक्तिगत एसईसी अंश (अंश 1-8) के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 5: चित्र 4 से अनक्रॉप्ड वेस्टर्न ब्लॉट छवियां। (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) टीएसजी 101, (ई) जीएम 130, और (एफ) कैलनेक्सिन के लिए जांच किए गए पश्चिमी धब्बों की अनक्रॉप्ड मिश्रित केमिलुमिनेसेंट और कलरमेट्रिक छवियां। नियंत्रण सेल लाइसेट नियंत्रण उपचारित कोशिकाओं से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट ट्यूनिकामाइसिन उपचार से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है। नियंत्रण ईवी नियंत्रण नमूनों से ईवी को इंगित करता है और 10 μg / mL EV ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन का अर्थ है कि बाह्य प्रोटीन नियंत्रण नमूनों से थे, जबकि 10 μg / mL प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित नमूनों से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 6: चित्र 5 से अनक्रॉप्ड वेस्टर्न ब्लॉट छवियां। (ए) सीडी 9, (बी) सीडी 63, (सी) सीडी 81, (डी) टीएसजी 101, (ई) कैलनेक्सिन, और (एफ) एल्बुमिन के लिए जांच किए गए पश्चिमी धब्बों की अनक्रॉप्ड मिश्रित केमिलुमिनेसेंट और कलरमेट्रिक छवियां। नियंत्रण ईवी नियंत्रण मीडिया से ईवी को इंगित करता है जबकि 10 μg / mL EV ट्यूनिकामाइसिन उपचारित मीडिया से ईवी का प्रतिनिधित्व करता है। नियंत्रण प्रोटीन का अर्थ है कि बाह्य प्रोटीन नियंत्रण मीडिया से थे और 10 μg / mL प्रोटीन ट्यूनिकामाइसिन उपचारित मीडिया से बाह्य प्रोटीन को दर्शाता है। नियंत्रण सेल लाइसेट नियंत्रण उपचारित कोशिकाओं से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है, जबकि 10 μg / mL सेल लाइसेट ट्यूनिकामाइसिन उपचार से सेल लाइसेट को संदर्भित करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रोग-प्रतिकारक मेजबान प्रजातियां तनूकरण
CD9 चूहा 1 : 500
CD63 चूहा 1 : 1000
CD81 चूहा 1 : 500
GM130 खरगोश 1 : 500
एल्ब्यूमिन खरगोश 1 : 1000
TSG101* खरगोश 1 : 1000
कैलनेक्सिन * खरगोश 1 : 1000
एंटी-माउस ^ घोड़ा 1 : 1000
खरगोश विरोधी ^ बकरी 1 : 1000

तालिका 1: एंटीबॉडी कमजोर पड़ना। एंटीबॉडी के लिए उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने। टीबीएस-ट्वीन में 5% दूध में स्टॉक एंटीबॉडी को पतला किया गया था। * एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें कम करने वाली स्थितियों के तहत नमूने चलाने की आवश्यकता होती है; - ^ द्वितीयक एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करता है।

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Discussion

एसईसी वातानुकूलित सीसीएम से ईवी को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीका है। विशेष रूप से सेल व्युत्पन्न ईवी को अलग करने के लिए, सीसीएम के प्रकार और इसके पूरक पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। कई सेल कल्चर मीडिया को एफबीएस के साथ पूरक करने की आवश्यकता होती है, जिसमें उस जानवर से प्राप्त ईवी होते हैं जिसमें सीरम काटा गया था। ये सीरम ईवी कल्चर26 में कोशिकाओं से प्राप्त ईवी द्वारा उत्पादित किसी भी सिग्नल को संतृप्त और मुखौटा कर सकते हैं। इसलिए, प्रयोग करते समय, ईवी-क्षीण एफबीएस का उपयोग जब भी संभवहो, यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि पाए गए ईवी को सेल व्युत्पन्न के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, न कि गोजातीय व्युत्पन्न, ईवी इसे या तो व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या विभिन्न तकनीकों के माध्यम से इन-हाउस बनाया जा सकता है।

एसईसी कॉलम के माध्यम से नमूने चलाते समय, यह जरूरी है कि फ़िल्टर किए गए पीबीएस का उपयोग किया जाए। अन्यथा, प्रत्येक अंश केवल सेल व्युत्पन्न ईवी और बाह्य प्रोटीन के बजाय पीबीएस के कणों से दूषित हो जाएगा। एसईसी के लिए इसके उपयोग से पहले 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पीबीएस को फ़िल्टर करके, कोई भी यह सुनिश्चित कर सकता है कि अंशों में कोई भी कण स्वयं कोशिकाओं से है और दूषित पीबीएस नहीं है।

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल को एकत्र किए गए अंशों की संख्या और आकार को बदलने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अंशों को बड़ा बनाया जा सकता है (1 एमएल बनाम 500 μL), या अधिक अंश एकत्र किए जा सकते हैं क्योंकि संभवतः बाह्य प्रोटीन होते हैं जो इस प्रोटोकॉल में अंश 8 से आगे निकल जाते हैं। यह रक्त प्लाज्मा, या अन्य कॉलम रचनाओं28,29 जैसे अन्य नमूना प्रकारों के लिए विशेष रूप से सच है। ये छोटे बाह्य प्रोटीन जो बाद के अंशों में संभावित रूप से भिन्न होते हैं, उनमें महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु हो सकते हैं जो वर्तमान पद्धति के साथ एकत्र या परख नहीं किए जाते हैं। इसके अलावा, अंशों को इकट्ठा करने के लिए एएफसी का उपयोग किसी भी संभावित उपयोगकर्ता त्रुटियों को कम करता है जिसे मैन्युअल अंश संग्रह के माध्यम से पेश किया जा सकता है। चूंकि अंश बूंद द्वारा बूंद से निकलते हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए कि प्रत्येक बूंद को उचित अंश में एकत्र किया जाता है, जो मैन्युअल रूप से प्रदर्शन करते समय चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

एसईसी की एक प्रमुख सीमा नमूने की सीमित मात्रा है जिसे कॉलम के माध्यम से चलाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम के साथ, नमूना का 500 μL अधिकतम मात्रा है जिसका उपयोग किया जा सकता है। अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम या इन-हाउस निर्मित कॉलम नमूने के अन्य संस्करणों को समायोजित कर सकते हैं, हालांकि ये अभी भी अपेक्षाकृत छोटे वॉल्यूम29,30 हैं। अन्य विधियां, उदाहरण के लिए डीयूसी की तरह, बड़े नमूना वॉल्यूम को समायोजित कर सकती हैं, हालांकि यह तकनीक आसानी से ईवी को अन्य बाह्य घटकों से अलग नहीं कर सकती है। सुक्रोज या आयोडिक्सानोल के ग्रेडिएंट घनत्व के आधार पर कणों को अलग करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं, लेकिन यह तकनीक समय लेने वाली है और इसके लिए स्थिर हाथों और बहुत मजबूत पिपेटिंग कौशल31,32 की आवश्यकता होती है।

कुल मिलाकर, एसईसी ईवी अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है जो वातानुकूलित सीसीएम से ईवी के पर्याप्त पृथक्करण की अनुमति देता है। यह वाणिज्यिक कॉलम के लिए विशेष रूप से सच है क्योंकि वे जैविक प्रतिकृति के बीच अधिक प्रजनन क्षमता की अनुमति देते हैं, और फ्रैक्शनेशन को स्वचालित किया जा सकता है, जिससे उपयोगकर्ता त्रुटि की संभावना कम हो जाती है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ईवी मुख्य रूप से शुरुआती अंशों (1-4) में होते हैं, जबकि बाद के अंशों में बाह्य प्रोटीन होते हैं। इन अंशों को तब जोड़ा जा सकता है और पश्चिमी सोख्ता, टीईएम इमेजिंग और एनटीए कण आकार और परिमाणीकरण सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूने को प्रभावी ढंग से केंद्रित करने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन से गुजरना पड़ सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक फंडिंग के लिए पेन स्टेट बेहरेंड और हैमोट हेल्थ फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही यूनिवर्सिटी पार्क, पीए में पेन स्टेट माइक्रोस्कोपी सुविधा भी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
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Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

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