Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים הקשורים לממברנות ליפידים בגודל ננומטרי המשתחררים מכל התאים, נמצאים בכל הביופלואידים ומכילים חלבונים, חומצות גרעין ושומנים המשקפים את תא האב שממנו הם נגזרים. הפרדה נכונה של כלי רכב חשמליים מרכיבים אחרים במדגם מאפשרת אפיון של המטען הקשור אליהם ומעניקה תובנה לגבי הפוטנציאל שלהם כמתקשרים בין-תאיים וסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות רבות. במחקר הנוכחי, כלי רכב חשמליים שמקורם באוליגודנדרוציטים בודדו ממדיית תרביות תאים באמצעות שילוב של טכניקות חדישות, כולל אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל (SEC) כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים לבין חלבונים חוץ-תאיים אחרים וקומפלקסים של חלבונים. באמצעות עמודי SEC הזמינים מסחרית, הופרדו כלי רכב חשמליים מחלבונים חוץ-תאיים ששוחררו מתאי אוליגודנדרוגליומה אנושיים בתנאי בקרה ותנאי עקה אנדופלסמית רשתית (ER). סמני EV קנוניים CD9, CD63 ו- CD81 נצפו בשברים 1-4, אך לא בשברים 5-8. GM130, חלבון של מנגנון גולג'י, וקלקסין, חלבון אינטגרלי של ER, שימשו כסמני EV שליליים, ולא נצפו בשום שבר. יתר על כן, בעת איגום וריכוז שברים 1-4 כשבר EV, ושברים 5-8 כשבר החלבון, נצפה ביטוי של CD63, CD81 ו- CD9 בשבר EV. הביטוי של GM130 או calnexin לא נצפה באף אחד מסוגי השברים. השברים המאוגדים הן מתנאי הבקרה והן מתנאי ה-ER הודגמו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה ושלפוחיות נצפו בשברים EV, אך לא בשברים החלבונים. חלקיקים ב-EV ושברי חלבונים משני התנאים כומתו גם הם באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. יחד, נתונים אלה מראים כי SEC היא שיטה יעילה להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה מותנית של תרביות תאים.

Introduction

התפוצצות העניין בחקר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) לוותה בהתקדמות משמעותית בטכנולוגיות ובטכניקות המשמשות להפרדה ולמחקר של חלקיקים הטרוגניים בגודל ננומטרי. בזמן שחלף מאז גילוים לפני כמעט ארבעה עשורים1,2, נמצא כי מבנים ממברניים קטנים אלה מכילים שומנים ביו-אקטיביים, חומצות גרעין וחלבונים, וממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין-תאית 3,4. כלי רכב חשמליים משתחררים מכל סוגי התאים ולכן נמצאים בכל הנוזלים הביולוגיים, כולל פלסמה וסרום, רוק ושתן. כלי רכב חשמליים בתוך נוזלים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה לשמש כסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות שונות, כולל מחלות נוירו-דלקתיות ומחלות נוירודגנרטיביות, סרטן והפרעות אוטואימוניות 5,6,7. יתר על כן, ניתן לבצע מחקרים מכניסטיים במבחנה באמצעות טכניקות של תרביות תאים על ידי הפרדת כלי רכב חשמליים המשתחררים למדיום התרבית 3,8,9.

כדי להבין את תפקידם של כלי רכב חשמליים בפתופיזיולוגיה של מחלות, הפרדה נאותה מהנוזל שבו הם נמצאים היא בעלת חשיבות עליונה. תקן הזהב להפרדת EV הוא זה מכבר אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית (dUC)10, אולם נוצרו טכניקות מתוחכמות יותר להשגת הפרדה טובה יותר של כלי רכב חשמליים מרכיבים חוץ-תאיים אחרים. חלק מטכניקות אלה כוללות מעברי צבע של צפיפות, שבר זרימת שדה אסימטרי-זרימה (A4F), ציטומטריה של זרימה, אימונוקסטור, משקעי פוליאתילן גליקול וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)11,12,13. לכל טכניקה יש קבוצה משלה של יתרונות וחסרונות; עם זאת, הוכח כי SEC בפרט מפריד בין כלי רכב חשמליים לבין נוזלים ביולוגיים ותרבי-על של תרביות תאים בצורה יעילה למדי 8,14,15. ל-SEC יש גם את הבונוס הנוסף של היותה פשוטה יחסית וידידותית למשתמש.

SEC היא שיטה המפרידה בין רכיבים של נוזל בהתבסס על גודל. עם טכניקה זו, עמודה של שרף (או עשה בתוך הבית או נרכש מסחרית) משמש כדי לחלק מדגם. חלקיקים קטנים בדגימה נלכדים בין החרוזים בתוך השרף, בעוד שחלקיקים גדולים יותר מסוגלים לעבור דרך השרף בחופשיות רבה יותר, וכך לחמוק מוקדם יותר בתהליך. מאחר שרכבים חשמליים גדולים יותר בגודלם מחלבונים חוץ-תאיים רבים ומאגרגטים של חלבונים, כלי רכב חשמליים עוברים דרך העמודה מהר יותר ומתחמקים בשברים מוקדמים יותר מאשר חלבונים חוץ-תאיים14.

במאמר שיטות זה, מתואר השימוש ב-SEC להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים (CCM) מאוליגודנדרוציטים אנושיים תחת בקרה ותנאי עקה אנדופלסמיים של הרשתית (ER). באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי כלי רכב חשמליים המופרדים בטכניקה זו נמצאים בתוך שברים ספציפיים שניתן לאגד יחד ולרכז לאפיון במורד הזרם, וכי כלי הרכב החשמליים המופרדים מופקים מתאים ולא ממקור אקסוגני כגון סרום בקר עוברי (FBS) המשמש להשלמת CCM. נוכחותם של סמני EV קנוניים, CD63, CD81 ו- CD916,17,18,19 בשברים EV, והיעדרם בשברי החלבון מודגמת בכתם מערבי. באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM), כלי רכב חשמליים מוצגים באופן חזותי ומציגים את המורפולוגיה הצפויה ונצפים רק בחלק EV. חלקיקים נספרים גם בשברי EV וחלבון של תנאי בקרה ו-ER, ומספר רב של חלקיקים בטווח הגודל הצפוי של 50-200 ננומטר בקוטר נצפו בדגימות EV. יחד, נתונים אלה תומכים ברעיון ש-SEC היא שיטה יעילה ואפקטיבית להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

הערה: צור ריאגנטים של תרביות תאים במכסה המנוע של תרבית תאים כדי לשמור על סטריליות.

  1. הכנת ריאגנטים של תרביות תאים
    1. הכן DMEM גלוקוז גבוה רגיל על ידי הוספת 50 מ"ל של FBS ו -5 מ"ל של פניצילין-סטרפטוקוקוס (Pen-Strep) לתוך 500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה ולאחסן ב 4 °C. השתמש במדיה זו להתרבות והרחבה של תאים.
    2. הכן DMEM מדולדל גלוקוז גבוה על-ידי הוספת 50 מ"ל של FBS מדולדל באקסוזום ו-5 מ"ל של Pen-Strep ל-500 מ"ל של DMEM עם גלוקוז גבוה ואחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמשו במדיה זו לטיפולים בתאים לפני בידוד EV.
    3. הכינו טוניקמיצין על ידי הוספת 10 מ"ג של טוניקמיצין ל-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). הכינו 50 μL aliquots בצינורות 0.2 מ"ל ואחסנו ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת ריאגנטים להפרדת EV
    1. הכינו 1x פוספט מלח מאגור (PBS) על ידי הוספת 9.89 גרם של אבקת PBS לליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה (DI) בצילינדר מדורג של 1 ליטר. מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב עד שה-PBS מתמוסס.
    2. השתמש autoclave כדי לעקר את כלי הזכוכית לפני הוספת PBS. שים את כלי הזכוכית לפח, סגור את הדלת, ועקר במשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
    3. בתוך ארון זרימה למינרית, חברו ואקום למסנן 0.22 מיקרומטר והניחו מסנן על גבי הבקבוק האוטומטי. שפכו באיטיות את ה-PBS על המסנן ואספו את ה-PBS המסונן בבקבוק האוטומטי.
    4. הכן 0.5 M נתרן הידרוקסיד על ידי הוספת 9.99 גרם של נתרן הידרוקסידי ל 500 מ"ל של 1x PBS בצילינדר מדורג 500 מ"ל. ערבבו את התמיסה על צלחת ערבוב עד שהנתרן הידרוקסידי מתמוסס לתוך ה-PBS ולאחר מכן סננו באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק אוטוקלאב של 500 מ"ל.
    5. הכן 0.05% נתרן אזיד על ידי הוספת 0.25 גרם של נתרן אזיד ל 500 מ"ל של 1x PBS בצילינדר מדורג 500 מ"ל. מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב עד שנתרן אזיד מתמוסס לתוך PBS, ולאחר מכן מסננים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved 500 מ"ל.
  3. הכנת ריאגנטים לבידוד חלבונים, כימות וזיהוי
    1. הכן 100 מ"ל של חיץ ליזה RIPA על ידי שילוב של 1 מ"ל של 1 M Tris (pH 7.4), 1 מ"ל של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS), 1 גרם של deoxycholate, 1 מ"ל של NP-40, ו 0.89 גרם של נתרן כלורי (NaCl). הביאו את הנפח ל-100 מ"ל עם H2O מזוקק ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס. כדי לייצר RIPA בתוספת תמיסת מעכבי פוספטאז ופרוטאז, הוסף 10 μL של פוספטאז ומעכב פרוטאז עבור כל 1 מ"ל של חיץ RIPA בצינור של 15 מ"ל ואחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. מיד לפני השימוש, הכן את מגיב העבודה של בדיקת BCA על ידי הוספת 10 מ"ל של מגיב A ו-200 μL של מגיב B המסופק על ידי ערכת הבדיקה של BCA לתוך צינור של 15 מ"ל. מיד לפני השימוש, הכן את הריאגנט עובד של בדיקת microBCA על ידי הוספת 25 חלקים של מגיב A, 24 חלקים של מגיב B, וחלק אחד של מגיב C לתוך צינור 15 מ"ל.
    3. הכינו חיץ ריצה של 10x אלקטרופורזה בג'ל על ידי הוספת 30.3 גרם של Tris base, 144 גרם של גליצין ו-10 גרם של SDS בליטר אחד של מי DI. אחסן את המאגר הפועל ב- 4 °C. הכינו מאגר העברה 1x על ידי הוספת 3.03 גרם של בסיס Tris, 14.4 גרם של גליצין ו-200 מ"ל של מתנול והתאימו את עוצמת הקול ל-1 ליטר עם מי DI. אחסן את מאגר ההעברה ב-4 °C.
    4. הכינו תמיסת מלח עם Tween-20 (TBS-Tween) על ידי הוספת 2.4 גרם של בסיס Tris, 8 גרם של NaCl ו-1 מ"ל של Tween-20 לתוך 1 ליטר של מי DI. אחסן את TBS-Tween ב-4 °C.
    5. הכינו תמיסת חסימה של 5% על ידי הוספת 5 גרם של אבקת חלב ללא שומן ל-100 מ"ל של TBS-Tween. אחסן את המאגר החוסם ב-4 °C.
    6. מיד לפני השימוש, יש להכין מצע כימילומינסנטי על ידי הוספת 4 מ"ל של תמיסת מי חמצן ו-4 מ"ל של תמיסת לומינול/משפר לתוך צינור של 15 מ"ל ולהפוך בעדינות כדי לערבב.

2. גידול וטיפול בתאים

  1. זרע שתי צלוחיות תרבית תאי T175 עם 2.3 x 106 תאי אוליגודנדרוגליומה אנושית (HOG) כל אחת. הביאו את הנפח הסופי של DMEM רגיל עם גלוקוז גבוה ל-25 מ"ל ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באינקובטור של תרבית תאים למשך 48 שעות.
  2. בתום 48 שעות, DMEM גבוה של גלוקוז גבוה מרוקן אקסוזומים חם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לטיפול, יש להוסיף 25 μL של 10 מ"ג/מ"ל של טוניקמיצין ל-25 מ"ל של חומר מדולדל באקסוזומים, ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל של טוניקמיצין כדי לגרום ללחץ ER. עבור הבקרה, הוסף 25 μL של DMSO ל-25 מ"ל של מדיה מדולדלת אקסוזומים.
  3. הסר והשליך את ה- DMEM הרגיל עם גלוקוז גבוה מהתאים, ושטוף בעדינות תאים ובקבוקון עם 10 מ"ל של PBS אחד. לשאוף ולהשליך PBS.
  4. הוסף 25 מ"ל של מדיית בקרה לתוך הפקד המסומן בבקבוקון, ו-25 מ"ל של 10 מיקרוגרם/מ"ל טוניקמיצין במדיה לתוך הטיפול המסומן בבקבוקון. החזירו צלוחיות לאינקובטור תרביות תאים למשך 24 שעות.

3. איסוף וריכוז של CCM מותנה (איור 1)

  1. הניחו PBS באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שימו לב לצלוחיות מתחת למיקרוסקופ מורכב עם עדשה אובייקטיבית של 10x ו-100x. רשום לעצמך את כל ההבדלים בין הצלוחיות. בצע את השלבים הבאים הן עבור צלוחיות בקרה והן עבור צלוחיות מטופלות.
  2. הסר מדיה מן הבקבוקון ומניחים בצינור 50 מ"ל. צנטריפוגה הצינור ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט לצינור חדש של 50 מ"ל.
  3. צנטריפוגה הצינור ב 2,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 50 מ"ל ומניחים על הקרח.
  4. השג ארבע יחידות אולטרה-סינון של 15 מ"ל 3 kDa והוסף 5 מ"ל של PBS לכל צינור. הכינו את המסנן על ידי צנטריפוגה של יחידות האולטרה-סינון ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש ביחידות אולטרה-סינון של 3 kDa במשקל מולקולרי כדי לשמור על כל החלבונים החוץ-תאיים המשתחררים מהתאים. יחידות אולטרה-סינון גדולות יותר של חיתוך משקל מולקולרי (למשל, 30 kDa) יעבדו גם הן עם פרוטוקול זה, אולם חלבונים חוץ-תאיים הקטנים מ-30 kDa יסוננו החוצה ויוסרו מהדגימותב-20,21.
  5. הסר PBS מיחידות הסינון האולטרה. חלקו את הסופר-נאטנט מכל מצב (בקרה וטוניקמיצין שטופלו) לשתי יחידות אולטרה-סינון כל אחת, כ-12.5 מ"ל של מדיה בכל אחת מהן.
  6. צנטריפוגה הצינורות ב 4,000 x גרם במשך שעה אחת 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, או עד המדיה המרוכזת (המכונה retentate) בכל יחידת אולטרה סינון מרוכז ל 250 μL או פחות.
  7. העבר את ה- retentate משתי יחידות האולטרה-סינון של הבקרה לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד שכותרתו 1.5 מ"ל. העבר את ה- retentate משתי יחידות האולטרה-סינון שטופלו לצינור מיקרוצנטריפוגה אחר המסומן בגודל 1.5 מ"ל.
  8. מדוד את הנפח הכולל של retentate בכל צינור microcentrifuge להיות 500 μL. אם הדגימה קטנה מ- 500 μL, הוסף 0.22 מיקרומטר מסונן 1x PBS עד שהנפח הסופי הוא 500 μL. מניחים את הצינורות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.

4. איסוף תאים

  1. יש להניח טריפסין, PBS ו-DMEM מדולדל באקסוזומים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. יש להוסיף 7 מ"ל של טריפסין כדי לשלוט בצלוחיות מטופלות ולהניח באינקובטור למשך 5 דקות.
  2. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם התאים מורמים. אם התאים אינם מורמים, יש להקיש בחוזקה על הבקבוקון כנגד כף היד כדי לעקור את התאים.
  3. שטפו את הבקבוקון עם 7 מ"ל של DMEM מדולדל באקסוזומים. לאסוף את ההשעיה התא מן הבקבוקון ומניחים לתוך צינורות 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 10 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של 1x PBS לכדור התא. תערובת פיפטה עדינה לפירוק הכדור.
  5. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף 200 μL של RIPA בתוספת פוספטאז ותמיסת מעכבי פרוטאז לכדור התא, פיפטה לערבוב.
  6. העבר את התאים בתמיסת RIPA לצינורות 1.5 מ"ל. תן את הצינורות לשבת על קרח במשך 5 דקות. צנטריפוגה את הצינורות ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. העבר את הסופרנטנט לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל. תייג את הצינורות עם מצב הטיפול ותאריך. הכניסו את הצינורות למקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

5. הפרדת EV באמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (איור 2)

הערה: בצע את השלבים הבאים פעמיים, פעם אחת עבור retentate שליטה ופעם אחת עבור tunicamycin שטופל retentate.
הערה: PBS המשמש בסעיף זה הוא 0.22 מיקרומטר מסונן 1x PBS.

  1. הפעל את אספן השברים האוטומטי (AFC) והתאם את ההגדרות לאיסוף שמונה שברים, 0.5 מ"ל לשבר ועוצמת הקול של המאגר (ריק) לברירת המחדל.
    הערה: תנאי ההפעלה של AFC הם כדלקמן: נפח עמודה/מיטה = 10 מ"ל; נפח חלל = 2.70 מ"ל; נפח סומק = 15 מ"ל; גודל שבר אופטימלי = 500 μL; מאגר נדרש לכל הפעלה = 65 מ"ל; קצב זרימה ב 20 °C = 1.0 מ"ל / דקה; שימוש חוזר בעמודה = חמישה שימושים.
  2. הסירו את העמודה (ראו טבלת חומרים) מ-4 מעלות צלזיוס ותנו לעמודה להתחמם לטמפרטורת החדר לפני ההתחלה (בדרך כלל ~30 דקות).
  3. מוציאים דגימות מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומניחים על הקרח להפשרה. בזמן ההמתנה, הציבו שמונה צינורות מסומנים בגודל 1.5 מ"ל בקרוסלת AFC עם מכסים הפונים פנימה.
  4. הוסף עמודה ל- AFC כאשר הברקוד פונה לקורא. התחל את האיסוף על ידי ביצוע ההוראות על המסך כדי לוודא שיש צינורות בקרוסלה ואספן הפסולת מתפקד כראוי.
  5. התחל לשטוף את העמודה על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1x לעמודה לאחר שמאגר האחסון נספג לחלוטין בחלק העליון של מטריצת העמודות. אל תוסיף PBS מוקדם מדי מכיוון שהדבר ידלל את מאגר האחסון וימנע שטיפה מספקת.
  6. רגע לפני שכל 15 המ"ל של PBS נספגים על ידי המטריצה, לחץ על אישור כדי לעצור את השטיפה ולהסיר את שאריות ה- PBS מראש מטריצת העמודות עם מיקרופיפט. אל תיגע במטריצה.
  7. הוסף 500 μL של דגימה למרכז העמודה. לחץ על אישור כדי להתחיל בריצה. צפה בדגימה נספגת לתוך המטריצה והוסף במהירות 8 מ"ל של PBS לעמודה מיד לאחר שהדגימה נספגת במלואה.
  8. AFC יפזר באופן אוטומטי את נפח הריק למרכז הקרוסלה ולאחר מכן יאסוף את כל שמונת השברים של 500 μL כל אחד. בסיום הריצה, להסיר שברים מן הקרוסלה ומניחים על קרח. שברים 1-4 מכילים כלי רכב חשמליים ואילו שברים 5-8 מכילים חלבונים חוץ-תאיים. הסר נפח חלל ממרכז הקרוסלה.
  9. הוסף 10 מ"ל של PBS לעמודה לאחר ששמונת השברים נאספו כדי לשטוף כל דגימה שיורית מהעמודה. לאחר שדוגמת ה- retentate נשטפה במלואה דרך העמודה, הוסף 15 מ"ל של PBS 1x לעמודה.
  10. כאשר ה-PBS הסופי נספג על ידי המטריצה, הוסף 500 μL של 0.5 M נתרן הידרוקסיד למרכז המטריצה של העמודה. כאשר נתרן הידרוקסידי נספג, להוסיף 30 מ"ל של 1x PBS לעמודה ולתת לו לשטוף דרך.
  11. אם אתם מריצים דגימה נוספת, הוסיפו שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בגודל 1.5 מ"ל לקרוסלה וחזרו על שלבים 5.7-5.10.
  12. לאחר שתסיים עם כל הדגימות, בצע את השלבים הבאים כדי לשמר את העמודה לשימוש מאוחר יותר. לאחר שטיפת 30 מ"ל של PBS דרך העמודה כמתואר בשלב 5.10, הוסף 15 מ"ל של 0.05% נתרן אזיד לעמודה.
  13. השאירו כ 5 מ"ל של נתרן אזיד על החלק העליון של מטריצת העמודה. הסר את העמודה מה- AFC וצרף את האותיות העליונות והתחתונות. החזירו את העמודה ל-4 מעלות צלזיוס לאחסון (ניתן להשתמש בעמודה עד חמש פעמים).

6. אולטרה-סינון של EV ושברי חלבון

  1. השג שתי יחידות סינון אולטרה-סינון של 2 מ"ל, 3 kDa לכל דגימה. השתמש ביחידה אחת כדי לרכז את שברי EV (שברים 1-4), וביחידה השנייה כדי לרכז את שברי החלבון (שברים 5-8). כל יחידה מורכבת משלושה חלקים: חרוט, מסנן וצילינדר זורם; תייג כל חלק כראוי.
  2. בנה את יחידת האולטרה-סינון והוסף 1 מ"ל של 0.22 מיקרומטר מסונן 1x PBS לחלק המסנן ולמכסה עם חתיכת החרוט. צנטריפוגה יחידת אולטרה-סינון, בצד חרוט כלפי מעלה ב 3,500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C.
  3. הסר את ה- PBS המסונן מהצילינדר הזורם. הפוך את יחידת האולטרה-סינון במהופך (חרוט בצד כלפי מטה) ואת הצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 x g ב-4 °C. הסר את כל PBS הנותרים מן החרוט.
  4. הוסף את השברים המתאימים (כל נפח 500 μL) לכל יחידת סינון אולטרה (נפח כולל יהיה 2 מ"ל). עמודי צנטריפוגה בצד חרוט כלפי מעלה למשך שעה ו-45 דקות ב-3,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס, או עד שרמת ה-retentate מגיעה ל-100 μL.
  5. הסר את הגליל הזורם והשלך את הזרימה דרכו. הפוך את יחידת האולטרה-סינון במהופך (חרוט בצד כלפי מטה) ואת הצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 x g ב-4 °C.
  6. העבירו את ה-retentate בקונוס לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן של 1.5 מ"ל והביאו כל נפח דגימה ל-150 μL עם 0.22 מיקרומטר מסונן 1x PBS. מניחים את הצינורות ב-80°C- מקפיא.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

7. בקרות מדיה

  1. השג שתי צלוחיות של תרבית תאי T175. תייג פקד בקבוקון אחד ואת הטיפול השני. DMEM חם עם גלוקוז גבוה שהתרוקן מאקסוזומים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
  2. יש להוסיף 25 μL של תמיסת ציר טוניקמיצין (10 מ"ג/מ"ל) ל-25 מ"ל של מדיה ולשים את הטיפול עם הבקבוקון המסומן. הוסף 25 μL של DMSO ל 25 מ"ל של מדיה והכנס את הבקבוקון שכותרתו פקד. שמור צלוחיות באינקובטור תרבית תאים במשך 24 שעות.
  3. אסוף מדיה ותהליך כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים כמתואר בשלבים 3.2-3.8. לאחר מכן, בצע את כל השלבים המתוארים בסעיפים 5 ו-6.

8. כתם מערבי

  1. כימות חלבונים מליזאטים של תאים ושברי חלבון באמצעות בדיקת BCA
    הערה: כימות חלבונים הן מדגימות בקרה והן מדגימות שטופלו בטוניקמיצין מתבצע בשלבים הבאים.
    1. הפשרת תאים ושברים חלבוניים על קרח. לעשות שלושה צינורות דילול עבור כל דגימה; 1:2, 1:10 ו-1:100.
    2. יש לטעון במשולש על צלחת בדיקה בעלת תחתית שקופה היטב, 25 μL של תקני חלבון אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-25 μL מכל דילול דגימה. הוסף מגיב עובד של 200 μL לכל באר המכילה תקן או דגימה, באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    3. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן קראו את הצלחת עם קורא צלחות בספיגה של 562 ננומטר. חשב את ריכוז החלבון בכל דגימה וקבע את נפח הדגימה הדרושה להשגת 20 מיקרוגרם חלבון עבור ליזטים של תאים ו-15 מיקרוגרם חלבון עבור שברים של חלבונים.
  2. כימות חלבונים משברי EV באמצעות בדיקת microBCA
    1. הפשרת דוגמאות EV על קרח. בצע שני דילולים עבור כל דגימה: 1:50 ו- 1:100.
    2. טען במשולש על צלחת בדיקה בעלת תחתית ברורה היטב, 100 μL של תקני חלבון BSA ו-100 μL מכל דילול דגימה. הוסף 100 μL של מגיב עובד microBCA לכל באר המכילה תקן או דגימה, באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    3. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן קראו את הצלחת עם קורא צלחות בספיגה של 562 ננומטר. חשב את ריכוז החלבון בכל דגימה וקבע את נפח הדגימה הדרושה לקבלת 15 מיקרוגרם חלבון עבור שברים EV.
  3. כתם מערבי
    הערה: פרוטוקול הכתם המערבי בוצע באופן דומה לתיאורב-22, ושונה כמפורט להלן.
    1. הכינו 10% ג'לים פוליאקרילאמיד עם ערכה להכנת ג'ל, לפי הוראות היצרן.
    2. עבור אלקטרופורזה של ג'ל, הכינו דגימות ליזאט של תאים על ידי שילוב בצינור של 1.5 מ"ל, נפח הליזאט של התא הדרוש ל-20 מיקרוגרם חלבון, 5 מיקרון ליטר של חיץ לאמלי 4x, ונפח חיץ RIPA הדרוש כדי להביא את הנפח הכולל ל-20 μL.
    3. הכן דגימות שבר EV וחלבון על ידי שילוב בצינור של 1.5 מ"ל את נפח הדגימה הדרוש ל-15 מיקרוגרם חלבון, 5 μL של מאגר Laemmli 4x ומאגר RIPA לנפח של 20 μL.
    4. הכן דגימות בקרת מדיה על ידי שילוב בצינור של 1.5 מ"ל 15 μL של דגימה ו- 5 μL של 4x Laemmli buffer.
      הערה: בהתאם לנוגדנים שבהם יש להשתמש, ייתכן שמאגר Laemmli יצטרך להכיל או לא להכיל חומר מחזר, כגון 50 mM dithiothreitol (DTT).
    5. מרתיחים את כל הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מעבירים דגימות לקרח כדי להתקרר, ולזמן קצר צנטריפוגה במשך 30 שניות ב-10,000 x גרם, ואז מחזירים דגימות לקרח.
    6. הוסיפו ג'לים למיכל האלקטרופורזה והוסיפו חיץ פועל של אלקטרופורזה בג'ל 1x. טען 15 μL של סולם חלבונים ו 20 μL של דגימה. מפעילים את הג'ל ב-200 וולט למשך 30-50 דקות, או עד שהדגימות מגיעות לתחתית הג'ל, רגע לפני הריצה.
    7. מעבירים את החלבון לקרום PVDF עם חיץ העברה של 1x בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-100 וולט, או עד להשלמת ההעברה. איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור משלים 3 מציגים תמונות נטולות כתמים של כל כתם לאחר השלמת ההעברה.
    8. יש לחסום את הממברנה ב-5% חלב/TBS-Tween למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר. דגירה של קרום בתמיסת נוגדנים ראשונית למשך הלילה על שייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ראה טבלה 1 למידע על דילול נוגדנים.
    9. למחרת, הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף את הממברנה 3x עם TBS-Tween במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר.
    10. הכינו נוגדנים משניים מתאימים ב-5% חלב/TBS-Tween. ראה טבלה 1 למידע על דילול. יש להוסיף נוגדן משני לממברנה ולדגור על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף פי 3 עם TBS-Tween למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר.
    11. הוסיפו מצע כימילומינסנטי לממברנה ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. כתם תמונה באמצעות ניתוח colorimetric ו chemiluminescent. איור משלים 4, איור משלים 5 ואיור משלים 6 מציגים תמונות לא חתוכות של כל כתם.

9. הדמיית TEM

  1. פריקת זוהר23 400 רשתות מצופות פחמן/פורמבר כדי להסיר פחמימנים ולהפוך את הרשתות להידרופיליות.
  2. הוסף 5 μL של EV או דגימת שבר חלבון לרשתות. דגירה ברשתות בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
  3. הסר תמיסה עודפת על ידי פתיל עם נייר סינון. לשטוף את הרשתות עם 5 μL של מים nanopure ולהסיר את עודף על ידי פתילה.
  4. יש למרוח 5 μL של 1% אורניל אצטט מימי ומיד לנשף. אפשרו לרשתות להתייבש. רשתות תמונה ב-120 קילו-וולט במיקרוסקופ אלקטרונים משדרת ולוכדות תמונות באמצעות מצלמת מכשיר טעונה.

10. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (נת"ע)

  1. קבל דגימות שבר EV וחלבון מ -80 °C והפשרה על קרח.
  2. הפעל את המחשב ואת מכשיר ה- NTA. פתח את תוכנת NTA והיא תתחיל לאתחל באופן אוטומטי.
  3. בחר את המשאבה המתאימה המכילה מים ללא חלקיקים ולחץ על שטפו את המכשיר כדי לשטוף את התא. בזמן השטיפה, הזריקו 10-20 מ"ל של מים נטולי חלקיקים ליציאת ההזרקה בחזית המכשיר באמצעות מזרק והימנעו מבועות אוויר.
  4. מסך בדיקת איכות התא יופיע; לחץ על אישור ובדיקת איכות התא תתחיל. לאחר שהבדיקה עברה בהצלחה, יופיע המסך הקופץ של alignment אוטומטי המצהיר: אנא מלא את התא עם מתלה יישור של 100 ננומטר (דילול 1:250,000).
    1. הכן דילול 1 של תרחיף יישור על ידי הוספת 10 מ"ל של מים ללא חלקיקים ו-10 μL של חרוזי פוליסטירן 100 ננומטר לצינור (דילול 1:1,000). הפוך בעדינות כדי לערבב. דילול 1 יש חיי מדף של 2-3 ימים ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. צור דילול 2 של תרחיף יישור על ידי הוספת 20 מ"ל של מים נטולי חלקיקים ו- 80 μL של דילול 1 (1:1,000) לתוך צינור כדי ליצור דילול של 1:250,000. הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. לדילול 2 יש חיי מדף של 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מלא תא בדילול 2 מ"ל (1:250,000). לחץ על אישור והתוכנית תשלים יישור אוטומטי (מיקוד) ומיטוב מיקוד. לשונית הניתוח תפתח יצירת פרופיל המספק תוצאות של הניקיון והסימטריה של תא המדידה בפרבולה. מסך קופץ המציין: צפה במיקרוסקופ וידאו מוכן כעת לניסויים, יופיע; לחץ על אישור והתוכנית תחזור לכרטיסייה בדיקת תאים.
  6. שטפו את חרוזי הפוליסטירן מהתא על ידי הזרקת מים נטולי חלקיקים ליציאת ההזרקה כדי לשטוף את התא. ממשיכים לשטוף עד שמספר החלקיקים שזוהו הוא בין 0-10 (בדרך כלל בין 5-10 מ"ל). הוסף 1 מ"ל של PBS מסונן 0.22 מיקרומטר כדי להכין את התא לדגימה הראשונה.
  7. דלל את הדגימה הראשונה עם PBS מסונן 0.22 מיקרומטר (התחל עם דילול 1:1000) והזן את גורם הדילול לתוכנית. הכנס 1 מ"ל של דגימה לתוך התא והמתן 5 דקות עד שתנועת החלקיקים תאט, מכיוון שהם ינועו בתחילה במהירות רבה על פני המסך. הגדר את הרגישות והתריס ל-75.0 ו-100, בהתאמה.
  8. מספר החלקיקים שזוהו לדילול דגימה אידיאלי הוא 50-200 חלקיקים. אם מדווחים על פחות מ-50 או יותר מ-200 חלקיקים, התאימו את דילול הדגימה. אם נדרש דילול חדש, שטפו את התא במים נטולי חלקיקים עד שיהיו 0-10 חלקיקים שזוהו. חזור על הוספת דגימה מדוללת ושטיפה עד למציאת הדילול האידיאלי.
  9. בדוק את כל 11 מיקומי המצלמה כדי לדמיין שתנועת החלקיקים האטה וודא שמספר החלקיקים שזוהו דומה בין כל מיקומי המצלמה. אם מספר החלקיקים שונה מאוד בין מיקומי המצלמה, הוסף דגימה נוספת.
  10. לחץ על הכרטיסייה מדידה והפעל רכישת סרטונים. תחת הכרטיסיה רכישת וידאו, הזן שם מותאם אישית לדוגמה וזהה מיקום בטוח. סמן את תיבות השמירה האוטומטית.txt והשמירה האוטומטית.pdf כדי לשמור נתונים.
  11. הגדר את הטמפרטורה ל -25 °C, לחץ על 488 ננומטר כדי להגדיר לייזר, ולחץ על 11 עבור מיקומי מצלמה. לחץ על אישור כדי להפעיל איסוף נתונים. התוכנית תתחיל לנתח את מספר החלקיקים וגודלם בכל 11 המיקומים. תחת לשונית הניתוח, יופיע גרף עמודות עם קוטר/ננומטר על ציר ה-x וחלקיקים/מ"ל על ציר ה-y.
  12. לאחר איסוף הנתונים, יופיע מסך קופץ שכותרתו סקירת מיקומים המספק נתונים עבור כל אחת מ-11 העמדות. אם יש יותר משתי עמדות שהוסרו מהניתוח, חזור על ההליך עם מדגם נוסף. אם לא, לחץ על כפתור המשך . ייפתחו קובץ PDF ו-txt שיכילו את התוצאות. שמור את הקבצים במיקום בטוח.
  13. כדי להפעיל דוגמה אחרת, עבור אל הכרטיסיה בדיקת תא וחזור על שלבים 10.6 עד 10.12. אם נעשה זאת, יש לשטוף את התא במים נטולי חלקיקים עד שמספר החלקיקים שזוהו הוא 0-10 (כ-5-10 מ"ל). יש לשטוף את התא עם 1 מ"ל של PBS מסונן 0.22 מיקרומטר, לסגור את התוכנית ולכבות את המחשב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כתם מערבי חושף הפרדה נאותה של כלי רכב חשמליים מ-CCM
כדי להעריך את היעילות של ה-SEC להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים, הופעל כתם מערבי תוך שימוש בכל שבר בודד מדגימות הבקרה כדי לבחון את הביטוי של שלושת סמני ה-EV הקנוניים, CD9, CD63 ו-CD81, כמו גם GM130 ו-calnexin18, ששימשו כבקרות שליליות (איור 3). ביטוי אלבומין18 נבדק גם כדי להבטיח שניתן יהיה להפריד כראוי חלבונים חוץ-תאיים ב-CCM מרכבים חשמליים. ביטוי חזק של CD9, CD63 ו- CD81 נצפה בשברים 1-4, עם ביטוי מועט עד אפסי בשברים 5-8; לא GM130 ולא קלנקסין נצפו בשום שבר. אלבומין היה נוכח רק בשברים 6-8. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ששלפוחיות מתחממות בעיקר לשברים 1-4, ומשאירות שברים 5-8 להכיל חלבונים חוץ-תאיים. מסיבה זו, שברים 1-4 היו משולבים ומרוכזים ונחשבו לשבר EV, בעוד שברים 5-8 היו משולבים ומרוכזים ומכונים שבר החלבון.

לאחר מכן, הופעלו כתמים מערביים נוספים כדי להעריך את היעילות של ריכוז שברי EV וחלבון באמצעות סינון אולטרה הן בדגימות בקרה והן בדגימות מטופלות. ביטוי של CD9, CD63 ו-CD81 נצפה בליזאטים של תאים ובשברים של EV של דגימות בקרה וטוניקמיצין שטופלו, אך לא בשברים של חלבונים (איור 4). גן רגישות לגידול 101 (TSG101) קשור לקומפלקס המיון האנדוזומלי הדרוש להובלה (ESCRT)24 ומשמש בדרך כלל כסמן לאקסוזומים25. חלבון זה היה נוכח בליזאטים של תאים, אך לא בשברים של EV או חלבון. בנוסף, GM130 וקלקסין נצפו רק בדגימות ליזאט התא. לכן, הנתונים מצביעים על כך שרכבים חשמליים הופרדו למעשה ממדיה של תרביות תאים.

כדי להבטיח שהאות החיובי שנצפה בשברים של EV הגיע מרכבים חשמליים ששוחררו על-ידי התאים ולא מהמדיה עצמה, המדיה המדולדלת באקסוזום עברה את אותו פרוטוקול סינון אולטרה-סינון ו-SEC כמו CCM מותנה, ולאחר מכן נותחה באמצעות כתם מערבי (איור 5). הן מדיות המכילות קונטרול והן טוניקמיצין עובדו ותזוזות תאים שימשו כבקרה חיובית על הכתמים המערביים. לא נצפו סמני EV (CD9, CD63, CD81 או TSG101) בדגימות המדיה, אך היו נוכחים בליסאטות התא. ביטוי אלבומין נצפה בתוך שברי החלבון וביטוי מינימלי בליסאטות התא, ככל הנראה שאריות מהתקשורת. מכיוון שלא נצפה אות עבור אף אחד מסמני EV בשברי EV, נתונים אלה מראים כי מדיה מדולדלת אקסוזומים אינה מכילה כלי רכב חשמליים המסווים את האות של כלי רכב חשמליים שמקורם בתאים.

TEM מדגים מורפולוגיה צפויה של כלי רכב חשמליים
תמונות TEM צולמו הן של שברי EV וחלבון שטופלו בבקרה והן ב-tunicamycin (איור 6). מבנים כדוריים ניתן לראות בשברים EV של דגימות הבקרה ו tunicamycin מטופלים, המציין את נוכחותם של כלי רכב חשמליים. מבנים אלה אינם נצפים בשברי החלבון של שני סוגי הדגימות, אשר במקום זאת יש כתם כהה משמעותי, המעיד על חלבון בהדמיית EM.

נת"ע חושפת הבדלים בריכוזי השליטה והפלגים המטופלים
ריכוזי חלקיקים של בקרה ושברים של EV וחלבון שטופלו בטוניקמיצין (n = 3) כומתו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA; איור 7). איור 7A מראה ריכוזי חלקיקים עבור שברי EV שטופלו בטוניקאמיצין, כאשר מעט יותר חלקיקים נמצאים בטיפול בטוניקמיצין ביחס לבקרה. ריכוזי השיא של החלקיקים היו בין 105-165 ננומטר. איור 7B מראה ריכוזים של חלקיקים שזוהו בשבר החלבון של שברי חלבון שטופלו בבקרה ובטוניקמיצין. בחלק החלבון זוהו פחות חלקיקים באופן כללי ביחס לרכבים חשמליים (109 לעומת 10 13), וגם ריכוזי השיא היו קטנים יותר, בין 75-135 ננומטר. באופן מעניין, לשבר החלבון טוניקמיצין היו יותר חלקיקים מאשר לבקרה. רוב החלקיקים בגודל EV (כ-50-200 ננומטר) נצפים בחלק ה-EV של תאי הבקרה והטוניקמיצין המטופלים, מה שתומך עוד יותר בשימוש ב-SEC כאמצעי יעיל להפרדת EV ממדיה מותנית של תרביות תאים.

Figure 1
איור 1: צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-סינון של מדיה מותנית של תרביות תאים. תיאור סכמטי של שלבי הצנטריפוגה הדיפרנציאלית ואולטרה-סינון של מדיה שנאספה מתאים בתרבית 24 שעות לאחר הבקרה או טיפול בטוניקמיצין של 10 מיקרוגרם/מ"ל. המדיה היא צנטריפוגה ומרוכזת, ומשאירה 500 μL של retentate מרוכז מתאים ל- SEC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: כרומטוגרפיה של הרחקת גודל. סכימה של הפרדת כלי רכב חשמליים וחלבונים באמצעות SEC. 3 המ"ל הראשונים (שישה שברים של 500 μL כל אחד) מושלכים כנפח הריק. שברים 1-4 אלוטים כרכבים חשמליים, ואילו שברים 5-8 אלוטים כחלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח כתם מערבי מייצג של שברים בודדים של SEC. נפח של 15 μL משמש מכל חלק SEC בודד של תאי הבקרה ונבדק עבור CD9, CD63, CD81, GM130, calnexin וביטוי אלבומין. CD9, CD63 ו-CD81 נצפו בצורה החזקה ביותר בשברים 1-4 בעוד ש-GM130 וקלנקסין לא נצפו בשום שבר. אלבומין נצפה רק בשברים 6-8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תמונות כתם מערביות מייצגות עבור יצרני EV קנוניים. ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם חלבון מליזאטים של תאים ו-15 מיקרוגרם של חלבון מ-SEC EV (1-4) ושברים של חלבון (5-8) שעברו בקרה ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של תאים שטופלו בטוניקמיצין נבדקו עבור CD9, CD63, CD81, TSG101, calnexin ו-GM130. כל הסמנים היו נוכחים בליסאטות התא. CD9, CD63 ו-CD81 נצפו בכל שברי EV, בעוד ש-TSG101 לא. סמני EV שליליים calnexin ו- GM130 נעדרו בשברים EV וחלבון. ליזאט תאי בקרה מתייחס לליזטים של תאים שעברו טיפול בקרה, בעוד שליזאט תאי 10 מיקרוגרם/מ"ל מתייחס לליזטים של תאים שעברו טיפול בטוניקמיצין. שלט EV מציין כלי רכב חשמליים מדגימות בקרה. 10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. חלבון בקרה מרמז על חלבונים חוץ-תאיים שמקורם בדגימות בקרה, בעוד שחלבון של 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות כתמים מערביות מייצגות של מדיה של תרביות תאים מדולדלות באקסוזומים. אמצעי בקרה ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של תרבית תאים מדולדלת אקסוזום עברו סינון SEC ואולטרה-סינון. נפח כולל של 15 μL של שברים של SEC EV וחלבון, ו-20 מיקרוגרם של חלבון מליזאטים של תאים נבדקו עבור CD9, CD63, CD81, TSG101, קלנקסין ואלבומין. לא נצפו סמני EV בשברים של EV או חלבונים, אך נצפו בליזאטים של התא המשמשים כבקרות חיוביות. אלבומין נצפה בשברי החלבון אך לא בשבר EV. שלט EV מציין כלי רכב חשמליים מדגימות מדיית בקרה. 10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. חלבון בקרה מרמז על חלבונים חוץ-תאיים שמקורם בדגימות בקרה. חלבון של 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. ליזאט תאי בקרה מייצג תאים בטיפול הבקרה ששוכבו, בעוד שליזאט תאי מיקרוגרם /מ"ל פירושו שתאי ליזט הגיעו מטיפול בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תמונות TEM מייצגות למורפולוגיה של כלי רכב חשמליים. שברים של SEC 1-4 ו-5-8 אוחדו ורוכזו כשברים של EV וחלבון, בהתאמה, הן מתאי בקרה והן מתאי tunicamycin שטופלו ב-10 מיקרוגרם/מ"ל. כלי רכב חשמליים נצפים בשברי EV של דגימות הבקרה והטוניקמיצין כחלקיקים כדוריים קטנים בקוטר של פחות מ-200 ננומטר ואינם נצפים בדגימות החלבון. סרגלי קנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: גודל החלקיקים וריכוזיהם מניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. גודל וכמות החלקיקים ב-(A) שברי EV ו-(B) שברים חלבוניים מתאי בקרה ותאי tunicamycin שטופלו (n = 3). כלי רכב חשמליים לבקרה מציינים EV מדגימות בקרה, בעוד שרכבים חשמליים מטופלים מייצגים כלי רכב חשמליים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. חלבון בקרה מרמז על חלבונים חוץ-תאיים מדגימות בקרה, וחלבון מטופל מסמל חלבונים חוץ-תאיים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. קווי שגיאה הם ± סטיית תקן אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: תמונה נטולת כתמים של ממברנות PVDF מאיור 3. כל קרום PVDF צולם כדי לדמיין העברת חלבון מוצלחת בסיום שלב 8.3.7. שברי ה-SEC הבודדים (1-8) הודגמו עבור כתמים שנחקרו מאוחר יותר עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E), calnexin ו-(F ) אלבומין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תמונה נטולת כתמים של ממברנות PBDF מאיור 4. כל קרום PVDF צולם כדי לדמיין העברת חלבון מוצלחת בסיום שלב 8.3.7. כתמים נחקרו מאוחר יותר עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 ו- (F ) calnexin. ליזאט תאי בקרה מתייחס לליזטים של תאים מתאי בקרה שטופלו, בעוד שליזאט של תאי בקרה של 10 מיקרוגרם/מ"ל מתייחס לליזטים של תאים מהטיפול בטוניקמיצין. EV בקרה מציין כלי רכב חשמליים מדגימות בקרה ו-10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. חלבון בקרה מתייחס לחלבונים חוץ-תאיים מדגימות בקרה, וחלבון 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: תמונה נטולת כתמים של ממברנות PVDF מאיור 5. כל קרום PVDF צולם כדי לדמיין העברת חלבון מוצלחת בסיום שלב 8.3.7. מאוחר יותר נבדקו כתמים עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) calnexin ו-(F ) אלבומין. Control EV מציין כלי רכב חשמליים ממדיית בקרה ו-10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים ממדיה שטופלה בטוניקמיצין. חלבון בקרה מתייחס לחלבונים חוץ-תאיים ממדיית בקרה, וחלבון 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים ממדיה שטופלה בטוניקמיצין. ליזאט תאי בקרה מתייחס לליזטים של תאים מתאי בקרה שטופלו, בעוד שליזאט של תאי בקרה של 10 מיקרוגרם/מ"ל מתייחס לליזטים של תאים מהטיפול בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: תמונות כתמים מערביים לא חתוכים ששימשו ליצירת איור 3. תמונות כימילומינסנטיות וצבעוניות מרוכבות לא חתוכות של כתמים מערביים שנבדקו עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E) calnexin ו- (F) אלבומין עבור כל שבר SEC בודד (שברים 1-8). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: תמונות של כתמים מערביים לא חתוכים מאיור 4. תמונות כימילומינסנטיות וצבעוניות לא מרוכבים של כתמים מערביים שנבדקו עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 ו-(F ) calnexin. ליזאט תאי בקרה מתייחס לליזטים של תאים מתאי בקרה שטופלו, בעוד שליזאט של תאי בקרה של 10 מיקרוגרם/מ"ל מתייחס לליזטים של תאים מהטיפול בטוניקמיצין. EV בקרה מציין כלי רכב חשמליים מדגימות בקרה ו-10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. חלבון בקרה מרמז על חלבונים חוץ-תאיים שמקורם בדגימות בקרה, בעוד שחלבון של 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים מדגימות שטופלו בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6: תמונות של כתמים מערביים לא חתוכים מאיור 5. תמונות כימילומינסנטיות וצבעוניות מרוכבות לא חתוכות של כתמים מערביים שנבדקו עבור (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) calnexin ו-(F ) אלבומין. EV בקרה מציין כלי רכב חשמליים ממדיית בקרה בעוד ש-10 מיקרוגרם/מ"ל EV מייצגים כלי רכב חשמליים ממדיה שטופלה בטוניקמיצין. חלבון בקרה מרמז על חלבונים חוץ-תאיים שמקורם במדיית בקרה, וחלבון של 10 מיקרוגרם/מ"ל מסמל חלבונים חוץ-תאיים ממדיה שטופלה בטוניקמיצין. ליזאט תאי בקרה מתייחס לליזטים של תאים מתאי בקרה שטופלו, בעוד שליזאט של תאי בקרה של 10 מיקרוגרם/מ"ל מתייחס לליזטים של תאים מהטיפול בטוניקמיצין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

נוגדן מינים מארחים דילול
תקליטור9 עכבר 1 : 500
CD63 עכבר 1 : 1000
CD81 עכבר 1 : 500
GM130 ארנב 1 : 500
אלבומין ארנב 1 : 1000
TSG101* ארנב 1 : 1000
קלנקסין* ארנב 1 : 1000
נגד עכבר^ סוס 1 : 1000
נגד ארנב^ עז 1 : 1000

טבלה 1: דילולי נוגדנים. דילולים המשמשים לנוגדנים. נוגדני מלאי דוללו בחלב 5% ב-TBS-Tween. *מייצג נוגדנים הדורשים הפעלת דגימות בתנאים מפחיתים; ^ מייצג נוגדנים משניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SEC היא שיטה ידידותית למשתמש להפרדה נאותה של כלי רכב חשמליים מ-CCM מותנה. על מנת לבודד באופן ספציפי רכבים חשמליים שמקורם בתאים, יש לקחת בחשבון שיקול דעת זהיר של סוג CCM ותוספי התזונה שלו. מדיות רבות של תרביות תאים צריכות להיות משלימות FBS, המכילות כלי רכב חשמליים שמקורם בחיה שבה נקטף הסרום. כלי רכב חשמליים אלה בסרום עשויים להרוות ולהסוות כל אות המיוצר על ידי כלי רכב חשמליים שמקורם בתאים בתרבית26. לכן, בעת ביצוע ניסויים, יש להשתמש ב- FBS מדולדל EV במידת האפשר כדי להבטיח שניתן לייחס את כלי הרכב החשמליים שנמצאו לתאים המופקים, ולא לרכבים חשמליים שמקורם בקר, EVs זה ניתן לרכוש באופן מסחרי או מיוצר בתוך החברה באמצעות טכניקות שונות שנסקרו במקומות אחרים26,27.

בעת הפעלת דוגמאות דרך עמודת SEC, חובה להשתמש ב- PBS מסונן. אחרת, כל חלק יזוהם על ידי חלקיקים מה-PBS במקום רק על ידי כלי רכב חשמליים שמקורם בתאים וחלבונים חוץ-תאיים. על ידי סינון PBS דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני ניצולו עבור SEC, ניתן להבטיח שכל חלקיק בשברים הוא מהתאים עצמם ולא PBS מזוהם.

ניתן גם לשנות את הפרוטוקול המתואר כאן כדי לשנות את המספר והגודל של השברים שנאספו. לדוגמה, שברים יכולים להיות גדולים יותר (1 מ"ל לעומת 500 μL), או שניתן לאסוף שברים נוספים מכיוון שסביר להניח שישנם חלבונים חוץ-תאיים שעוברים את מה שנחשב לשבר 8 בפרוטוקול זה. זה נכון במיוחד עבור סוגי דגימות אחרים כמו פלזמה בדם, או קומפוזיציות עמודהאחרות 28,29. החלבונים החוץ-תאיים הקטנים האלה, שעשויים להיעלם בשברים המאוחרים יותר, עשויים להכיל מולקולות איתות חשובות שאינן נאספות או נבדקות במתודולוגיה הנוכחית. בנוסף, השימוש ב- AFC לאיסוף שברים מקל על כל שגיאות משתמש פוטנציאליות שעשויות להיות מוצגות באמצעות איסוף שברים ידני. מכיוון שהשברים מתחמקים טיפה אחר טיפה, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שכל טיפה נאספת לשבר המתאים, מה שיכול להיות מאתגר בעת ביצוע ידני.

מגבלה מרכזית אחת של SEC היא נפח המדגם המוגבל שניתן להריץ דרך העמודה. עם העמודות הזמינות מסחרית המשמשות בפרוטוקול זה, 500 μL של דגימה הוא אמצעי האחסון המרבי שניתן להשתמש בו. עמודים אחרים הזמינים מסחרית או עמודים תוצרת בית עשויים להכיל כרכים אחרים של מדגם, אולם אלה עדיין כרכים קטנים יחסית29,30. שיטות אחרות, כמו dUC למשל, יכולות להכיל נפחי דגימה גדולים יותר, אולם טכניקה זו אינה יכולה להפריד בקלות כלי רכב חשמליים מרכיבים חוץ-תאיים אחרים. שיפועים של סוכרוז או יודיקסנול יכולים להיות שימושיים להפרדת חלקיקים על בסיס צפיפות, אך טכניקה זו גוזלת זמן ודורשת ידיים יציבות וכישורי פיפטינג חזקים מאוד31,32.

באופן כללי, SEC היא שיטה חשובה למחקר EV המאפשרת הפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים מ-CCM מותנה. זה נכון במיוחד עבור עמודות מסחריות מכיוון שהן מאפשרות שכפול גדול יותר בין שכפולים ביולוגיים, וניתן להפוך את הפיצול לאוטומטי, מה שמקטין את הסיכוי לטעויות משתמש. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כי כלי רכב חשמליים מתמעטים בעיקר בשברים מוקדמים (1-4), בעוד שברים מאוחרים יותר מכילים חלבונים חוץ-תאיים. לאחר מכן ניתן לשלב שברים אלה ולעבור סינון אולטרה כדי לרכז ביעילות את הדגימה לניתוחים במורד הזרם, כולל כתם מערבי, הדמיית TEM וגודל וכימות חלקיקי NTA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לפן סטייט בהרנד ולקרן הבריאות Hamot על המימון, כמו גם למתקן המיקרוסקופיה של פן סטייט ביוניברסיטי פארק, פנסילבניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 183
כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, M. T., Manioci, S. W.,… More

Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter